Desarrollo

Los métodos de conservación para microorganismos se agrupan atendiendo a los factores tiempo
y características fisiológicas de la cepa en tres grandes grupos: Métodos a largo y corto plazo y
métodos alternativos.

1. Métodos de conservación a largo plazo.

Estos métodos garantizan al máximo la estabilidad genética, al evitar la aparición de
generaciones sucesivas y por tanto son los más utilizados en microorganismos que han
sido sujetos a manipulaciones genéticas las cuales los hacen diferentes de las cepas de
origen y permiten mediante ellas evaluar medicamentos con alto potencial genotóxico y
carcinogénico, a partir de la teoría bien abundada sobre las mutaciones, clasificándose
como cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son transmitidos a las generaciones
siguientes. Dentro de esta evaluaciones se encuentra el test de Ames, en el cual se utilizan
una serie de cepas his- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a nivel
genético-molecular, donde se evalúa el crecimiento de bacterias que hayan
experimentado reversiones. Por lo tanto es de vital importancia que el investigador
conozca las limitaciones de cada método para que de esta forma pueda obtener
resultados reales de gran veracidad investigativa. Entre estos métodos se encuentran la
congelación y la liofilización, siendo los más aplicables en cualquier laboratorio.

Conservación por congelación.

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se
guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se
congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay
crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan
subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos
de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y además existe el
peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura
durante el almacenamiento. También resulta ser el método más molesto para realizar el
envío de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las
células conservadas por este método son los siguientes: - Edad de las células: En la
mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase estacionaria de
la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo
vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible
alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en
algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos. Velocidad en la congelación y
descongelación: Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para
determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la
temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo
que para descongelar conviene poner las células a 37ºC. Temperatura de almacenamiento:
Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que
contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una
temperatura de –195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una
temperatura de –140ºC. En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores,
de los cuales los más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –
70ºC. Aquellos que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y – 40ºC, como ocurre con la
mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de
solutos que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja. El daño que se
produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones
y descongelaciones. Si se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol,
se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración
iónica. Para la conservación en armarios congeladores, las células se almacenan en
criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran
herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y
utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta manera se evita que las
cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto también se puede evitar empleando
tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la solución celular a
congelar), ya que para tomar una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin
necesidad de descongelar el resto. Este método no se debe emplear para la conservación
de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano Clostridium, ya
que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede
afectarse la viabilidad. Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del
daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación.
Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se
utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%. También se
pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa,
lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye el tipo de microorganismo que se
quiera conservar. La temperatura de almacenamiento seleccionada depende de las
facilidades disponibles, pero las temperaturas más bajas favorecen la viabilidad y la
estabilidad genética. La mayoría de los microorganismos (bacterias, hongos, virus,
bacteriófagos) sobreviven largos períodos el almacenamiento en estado de congelación
por la reducción marcada de su ritmo metabólico. Algunos protozoos, algas y células
humanas también pueden ser preservados por este método. Existen muchos factores que
pueden afectar la viabilidad y estabilidad de los cultivos durante el proceso de
congelación, por lo que deben realizarse pruebas de ajustes del grado de enfriamiento y
calentamiento, además de la adición de crioprotectores a la suspensión celular. El
almacenamiento de microorganismos por el método de congelación a temperaturas
extremadamente bajas es muy simple y se ha logrado estandarizar para la preservación de
un amplio rango de microorganismos. Con él se obtiene la más reducida pérdida de
viabilidad, un alto grado de estabilidad y períodos de sobrevivencia de más de 30 años. El
costo inicial del equipamiento puede ser alto pero la seguridad de este método justifica su
costo, sobre todo en cultivos difíciles de preservar por otros métodos. Sin embargo, el
nivel de nitrógeno líquido de los contenedores debe chequearse diariamente y
mantenerse constante la distribución del mismo en todo el recipiente. Este tipo de
método se hace difícil y costoso; y la penetración de nitrógeno líquido en ámpulas mal
selladas puede provocar explosiones cuando se trasladen del contenedor a otro lugar, por
lo que se recomienda utilizar recipientes de plástico o almacenamiento en la fase de vapor
del nitrógeno. Cuando se utiliza este método debe utilizarse protector para la cara, bata y
guantes de laboratorio como medidas de seguridad contra las salpicaduras y derrames de
nitrógeno líquido y la explosión de las ámpulas de vidrio.

Conservación por liofilización.

La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por
sublimación del hielo bajo vacío. Este proceso consta de tres etapas, la precongelación del
producto para asegurar una estructura completamente congelada; el secado primario con
el que se elimina la mayor parte del agua por sublimación; y el secado secundario con el
que se remueve el agua que queda ligada. En las células conservadas por este método no
hay crecimiento puesto que la actividad de agua es cero igual que en la congelación pero a
diferencia de la primera, los liófilos no tienen agua en el medio debido a la sublimación.
Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay
muchos modelos en el mercado. Sin embargo, este es un método muy recomendable por
su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez
conseguidos los liófilos pueden almacenarse a una temperatura ambiente de 18ºC-20ºC. El
medio de preservación es esencial para proteger las células de los daños producto de los
procesos de congelación y sobresecado. La elección del medio depende del
microorganismo de manera que se logre mantener la viabilidad y permitir un buen
recobrado posterior al proceso de liofilización. Usualmente el medio de preservación
contiene altos niveles de suero, proteínas, aminoácidos (ej: glutamato monosódico),
carbohidratos (ej: glucosa, sacarosa) o leche descremada. Entre los crioprotectores
recomendados se encuentran el inositol, para la mayoría de las bacterias; la leche
descremada para hongos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser
más convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-glutamato para
las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sin carne)
para bacterias anaerobias, etc. El éxito de la liofilización para la preservación de los
microorganismos no sólo depende de los pasos de esta técnica (congelación y
deshidratación) sino también de las características físico-químicas del medio de
suspensión, el tipo de microorganismo, el estado fisiológico del cultivo, las condiciones del
cultivo, la concentración de los microorganismos, entre otros. Los factores que influyen
específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación son:
1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microorganismos que no resisten la liofilización y
lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos hongos
filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay
que recurrir a otros métodos.
2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una
concentración del orden de 108-109 células/ml en el caso de las bacterias y algo inferior
en el caso de hongos filamentosos y levaduras, debido a que siempre se pierde alrededor
de 102 unidades formadoras de colonia (UFC) durante el proceso.
3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima
de –50ºC.
4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la
concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que
no es perjudicial.
 5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al
vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo,
como el oxígeno que puede dañar a las células.
6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente
a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad.
Este método es uno de los más eficaces para la conservación de muchos tipos de
microorganismos, como: bacterias, hongos, bacteriófagos y virus; algunos de ellos pueden
sobrevivir por períodos de más de 40 años. Es conveniente para la producción y
distribución masiva de cultivos, la viabilidad, pureza y estabilidad de los cultivos se
mantenga por largos períodos de tiempo, no se requiere de una atención constante
después de almacenarse los cultivos liofilizados y cientos de éstos pueden guardarse en un
pequeño espacio. Otro método dentro de la liofilización es utilizando capilares de vidrio
mediante el cual se reduce el espacio de almacenamiento y el costo de la distribución de
los cultivos. Sin embargo, el proceso es complejo y caro, pues aunque no necesariamente
requiere de un equipo sofisticado, se necesita al menos de un sistema de vacío, por lo que
no se puede aplicar en laboratorios con recursos limitados.

2. Métodos de conservación a corto plazo.

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección,
fundamentalmente por carecer de los equipos necesarios, porque la cepa microbiana no
resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos o porque las cepas
contengan construcciones genéticas trayendo consigo que estas pierdan elementos,
determinadas características especiales que se utilicen para medir el efecto del
medicamento o fármaco en la misma, desde el punto de vista tóxico. Conviene tener en
cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda
conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

Conservación por transferencia periódica o subcultivo.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que
ha crecido, consiste en la transferencia del cultivo a un medio de cultivo fresco a intervalos
que aseguren la viabilidad del mismo. Estos intervalos varían dependiendo de las
características del microorganismo en cuestión, algunas especies requieren ser
transferidas a nuevos medios después de días o semanas, y otras después de meses o
años. Esta frecuencia puede reducirse con el almacenamiento del subcultivo a
temperaturas relativamente bajas, en un refrigerador a 40C o en un freezer entre –100C y
–200C, bajo aceite mineral o agua. Sin embargo, estas células no pueden permanecer
indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del
metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares. Este es
el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células
creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se
están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no
conserven algunas de sus características. Es conocido que el riesgo de contaminación y de
cambios genéticos se incrementa a mayor número de transferencias; así como el peligro
de pérdida del cultivo sobre todo cuando se trabaja con microorganismos delicados y la
 posibilidad de que ocurra deshidratación del medio de cultivo, a estos inconvenientes se
suma además que cuando hay muchos microorganismos el trabajo es muy intenso y se
requiere un espacio grande para el almacenamiento. Si se va a utilizar este método es
aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto
se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de
inóculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando
en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento
en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos. Este
método es muy simple, con él se puede mantener la viabilidad de algunos
microorganismos por muchos años, y la recuperación de los cultivos activos es
relativamente fácil. En el caso de colecciones pequeñas, éste puede ser un método
económicamente factible en cuanto al equipamiento y al tiempo que se invierte.
Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. Es un método
alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste
en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se
pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la
concentración celular no debe ser superior a 104-105 células/ml en el caso de bacterias.
Los resultados obtenidos en laboratorios de microbiología en la conservación de
microorganismos por este método muestran altos porcentajes de viabilidad en períodos a
veces superiores a 5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es
buena, pero no se ha comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo y la preservación de transformantes genéticos.

3. Métodos alternativos de conservación.

En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es
necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados
que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros
bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citar se basan
en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células.
Estos métodos de secado son particularmente útiles para conservar microorganismos
productores de esporas y su acción se debe a la reducción drásticamente el metabolismo
de los mismos. Sin embargo, no todos los microorganismos sobreviven a estos métodos de
secado, por lo que se hace necesario añadir agentes protectores (leche descremada,
glutamato sódico al 10%). Una vez secos es importante mantener el producto sellado
(tapón de rosca, ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son higroscópicos.

Desecación sobre sustratos inertes.

El método de almacenamiento de microorganismos en estado de secado ha sido aplicado
como un método de preservación particularmente para bacterias y hongos que consiste
en la separación del agua y la prevención de la rehidratación. Para el desarrollo de los
métodos de desecación se han empleado como sustratos inertes: arena, tierra, zeolita,
sílica gel, discos y tiras de papel, tapones de algodón, discos de gelatina y cuentas de vidrio
y de porcelana.
Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una
solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es
posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se
utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células.
El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío
excesivo provoque evaporación brusca con ebullición.

Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método y
se sigue el método anteriormente descrito.

Desecación en bolitas de alginato.

Este es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de
alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas
sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en
agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a
temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo
contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.