ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE

TEJIDOS

Las actividades relacionadas con cultivo in vitro de tejidos deben

realizarse en ambientes asépticos, con iluminación y temperatura controladas,
para asegurar la optimización de las respuestas del material, tanto cualitativas
como cuantitativas, a estímulos termo y fotoperiódicos.
El elevado grado de asepsia es una condición indispensable, ya que
hongos, levaduras y bacterias proliferan en los mismos medios de cultivos
utilizados, impidiendo el crecimiento del material vegetal en estudio, por
contaminación y agotamiento del medio.
Los requerimientos enunciados se tornan más limitantes a medida que el
tamaño del laboratorio aumenta, ya que con el incremento de las actividades
crece también el riesgo de contaminación.
Una forma de garantizar mayor asepsia es compartimentalizar las actividades
dentro del laboratorio, separando las áreas donde se trabaja con material
contaminado de aquellas que incluyen material estéril y que requieren de
ambientes más asépticos. En estas últimas se debe evitar la circulación
innecesaria de personas.
Hay que señalar que la capacidad de producción de un laboratorio de
cultivo de tejidos está determinada por el tamaño de la cámara de cultivo,
siendo las demás dependencias accesorias y destinadas a la preparación de
medios de cultivo y acondicionamiento previo del material vegetal. Por tanto,
cuando se diseña un laboratorio de estas características, se debe comenzar
por dimensionar la cámara en función de la producción diaria, mensual o anual.

ESTRUCTURA DEL LABORATORIO:

Las actividades a desarrollar en un laboratorio de cultivo de tejidos se pueden

agrupar de la siguiente manera:

1-Sala de limpieza:

En este lugar se realizan las tareas de eliminación de residuos, limpieza

del material de vidrio, autoclavaje de agua, de medios de cultivo y utensilios
varios.
Está dotado de mesadas de trabajo, instalación de agua corriente y gas,
electricidad, desagües, armarios para almacenar material de vidrio limpio,
piletas de lavado, autoclave, destilador, desionizador, lavador de pipetas, horno
de microondas (opcional), lavavajillas (opcional), estufa de secado.

2-Sala de preparación:

Este lugar está destinado a la preparación de soluciones diversas, de los

medios de cultivo, a sí como el acondicionamiento previo del material vegetal
destinado a cultivo in vitro. Es el lugar de mayor circulación de personas y en
donde debe calcularse una puerta de entrada suficientemente grande para la
entrada de la campana de flujo laminar.
Está equipado con mesadas, armarios de diversos tamaños para
almacenar reactivos, material de vidrio, medios de cultivo, heladera, freezer,
balanza analítica, agitador magnético, peachímetro, instalación de agua,
electricidad y gas.

3-Sala de transferencia:

Es el lugar donde se manipula asépticamente el material vegetal. Debe

ser un lugar exclusivo para la instalación de la campana de flujo laminar y
estanterías destinadas al almacenamiento temporario de envases con medio
de cultivo y otros materiales esterilizados destinados al uso inmediato.
Instalación de lámpara Ultravioleta.
Esta área debe ser de acceso restringido, en lo posible con puerta
vidriada, para permitir la comunicación visual con las área de preparación y de
cultivo, evitando la circulación innecesaria de personas. En zonas cálidas es
preferible contar con aire acondicionado.

4-Sala de cultivo:

Es el área donde los cultivos se mantienen hasta el momento de

retirarlos de los frascos (rusticación). Las paredes de la sala y las estanterías
serán de material que permita su fácil limpieza y desinfección.
La iluminación se logra verticalmente, desde el techo del estante
superior, o lateralmente desde la pared, por medio de tubos fluorescentes,
cuyas reactancias deben ser colocadas fuera de la cámara para no aportar
calor adicional. El fotoperíodo es mantenido a 16 h por medio de dispositivos
electrónicos, con una irradiancia próxima de 60 nmol m-2.seg.-1. Cuando algún
cultivo requiere oscuridad se cubre con tela negra o es colocado dentro de
cajas herméticas.
La temperatura se fija en 27ºC (dependiendo de la especie), por medio
de equipos de aire acondicionado.
En el mismo cuarto de cultivo debe instalarse los agitadores orbitales
(shaikers), necesarios para algunas prácticas especiales.
Es aconsejable que los controles de temperatura se sitúen fuera del
cuarto y que alguna puerta del mismo posea visor de vidrio para permitir la
observación externa y limitar la entrada de visitantes.

¾ Otras dependencias:

La instalación de compartimentos de apoyo a las actividades principales,

como invernaderos, escritorios, instalación sanitaria y depósitos está
condicionada al tamaño y tipo de actividades desarrolladas en el laboratorio.
Cuando la actividad principal es la investigación, la cantidad de material
manipulado es escasa en comparación con un laboratorio comercial. En este
último caso debe preverse la instalación de cámaras de niebla asépticas,
semicubiertos de media-sombra e invernaderos capaces de albergar el material
durante la aclimatación y hasta el momento de su comercialización.
EQUIPAMIENTO:

♦ Agitador magnético
♦ Agitador orbital
♦ Aparato para vacío
♦ Autoclave
♦ Balanza de precisión
♦ Balanza granataria
♦ Campana de flujo laminar
♦ Carrito de laboratorio
♦ Desecador
♦ Desionizador
♦ Destilador
♦ Dispensador de medios de cultivo
♦ Esterilizador de instrumental
♦ Estufa de secado
♦ Freezer
♦ Heladera
♦ Lavadora de pipetas
♦ Lavavajillas
♦ Lupa binocular
♦ Mechero de Bunsen
♦ Medidor de pH
♦ Microscopio estereoscópico

Utensilios varios

♦ Algodón
♦ Frascos de cultivo
♦ Frascos para agua destilada
♦ Frascos para reactivos
♦ Material de vidrio (pipetas, buretas, erlenmeyers, cajas de Petri, etc.)
♦ Papel de aluminio
♦ Parafilm
♦ Pisetas
♦ Soporte de tubos de ensayo
♦ Termómetros
Autoclave:
La esterilización de tanto del material como de los medios de cultivo, se
efectúa con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves.
El autoclave es en esencia, un recipiente en el que se consigue exponer
el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua,
gracias a aumentar la presión.
El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de
diferentes fases:
- Fase de purgado: a medida que la resistencia calienta el agua,
se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir
por la válvula de purgado que esta abierta. Esta fase termina
cuando se alcanza la temperatura de esterilización.
- Fase de esterilización: una vez cerrada la válvula de purgado y
alcanzada la temperatura previamente seleccionada se inicia el
proceso de esterilización que se extiende por un tiempo
previamente determinado (20 min. A 1 atm. )
- Fase de descarga: finalizada la fase anterior deja de funcionar la
resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la
presión y temperatura comienzan a bajar poco a poco.
Cámara de flujo laminar:
Para disponer de una superficie de trabajo estéril que no ponga en
peligro a los cultivos se usan las cámaras de flujo laminar.
Una cámara de flujo laminar es un receptáculo con una única cara libre
(la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de
trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace
circular a través del interior de la cámara una corriente de aire que
previamente ha sido microfiltrada para eliminar toda partícula extraña.
Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cámara de flujo sin
pasar previamente por los filtros se procura que la presión interior sea
ligeramente superior a la presión exterior, con lo cual el aire siempre
circula de adentro hacia fuera y nunca al revés.
Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar según sea la forma en la
que se hace circular el aire: cámaras de flujo horizontal y cámaras de
flujo vertical.