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Maria Legaz
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INTRODUCCIÓN
VM Ldc2/2; tM Ldc2/2F
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Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, 2011.
ISSN: 1989-3620
N 3.500 L (cm)/dp ( m)
El agua es más polar que cualquier compuesto que contenga alguno de los
anteriores grupos funcionales. La retención se puede incrementar añadiendo más agua
a la fase móvil; haciendo la afinidad del analito hidrofóbico por la fase estacionaria
hidrofóbica, más afín que por la fase móvil, ahora más hidrofílica. De igual manera, la
retención puede disminuir añadiendo mayor cantidad de disolvente orgánico a la fase
móvil. El mecanismo de fase reversa opera con el principio de fuerzas hidrofóbicas de
tal manera que el ligamiento del analito a la fase estacionaria es proporcional a la
superficie de contacto alrededor del segmento apolar del analito en asociación con el
ligando en la fase móvil acuosa. Este efecto se denomina solvófobo (Fig. 1). La teoría
del efecto solvófobo, propuesta por Horvath et al. (1976), propone que el soluto,
debido a la alta tensión superficial de la fase móvil y a su propia hidrofobicidad, es
expulsado de la fase móvil contra las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria.
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ISSN: 1989-3620
Momento Dipolar,
Grupo Funcional
(debyes)
Amina -N= 0,8 a 1,4
Éter -O- 1,2
Sulfuro -S- 1,4
Tiol -SH 1,4
Ácido Carboxílico -COOH 1,7
Hidroxilo -OH 1,7
Halógenos -F
-Cl 1,6 a 1,8
-Br
-I
Éster -COO- 2,3
Aldehído -CHO- 2,5
Cetona -CO- 2,7
Nitro -NO2- 3,2
Nitrilo -C=N- 3,5
Sulfóxido -SO- 3,5
REDUCCIÓN DE CAVIDAD
EN EL DISOLVENTE
Figura 1. Ilustración esquemática de la asociación entre una molécula de un soluto que contiene una
parte polar y otra apolar con una cadena hidrocarbonada de la fase estacionaria, efecto solvófobo. Las
flechas rellenas en color gris indican las fuerzas que tienden a unir y las flechas vacías, las fuerzas que
tienden a separar.
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- 0,5 k’ 20
- Rs 2
- P 15 MPa (150 bar)
- 0,9 factor asimetría (As) 1,5
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CONCENTRACIÓN
FINAL DE
1
A EN (A+B)
3
4
6
7
8
9
CONCENTRACIÓN
INICIAL DE
A EN (A+B) TIEMPO
Figura 2. Diferentes tipos de gradientes de fase móvil. A, representa el disolvente más fuerte y B, el
disolvente más débil en términos de fuerza extractiva de los solutos.
A los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos, a menudo se les
denomina disolventes “fuertes”. Para descubrir cuantitativamente la polaridad de los
disolventes se han desarrollado varios índices. El más útil en cromatografía de reparto
es el “índice de polaridad”, desarrollado por Snyder (P’). También se utilizan el
parámetro de solubilidad de Hildebrand ( ), (Hildebrand y Scott, 1962) y la fuerza
eluotrópica como disolvente ( o). A continuación se describe brevemente cada uno de
ellos.
Utilizando los datos de Rohrschneider (1969), Snyder en 1978, calculó los nuevos
“coeficientes de reparto corregidos” (Kg”) para interacciones dispersivas y efectos de la
masa molecular. Sabiendo que:
Ks = ss / sm
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= ( Evap/ V)1/2
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Límite Parámetro
Punto de Viscosidad a Fuerza Fuerza
Índice de inferior de de Índice de
Disolvente ebullición 20 ºC (cP) eluotrópica eluotrópica
refracción transparencia Hildebrand polaridad (P’)
( C) ( oenAl2O 3) ( o en SiO 2)
en el UV
(η) ( )
iso-octano 1,404 197-210 99,2 0,5 7 0,4 0,01 0,01
n-hexano 1,375 195 68,9 0.313 7,3 0 0,01 0,03
ciclohexano 1,427 200 80,7 0,98 8,2 0 0,04 0,04
n-decano 1,412 210 174,1 0,92 7,8 0,3 0,04
tetracloruro de
1,466 265 76,5 0,97 8,6 1,7 0,18 0,12
carbono
iso-propil éter 1,368 220 68,3 0,33-0,37 7,3 2,2 0,28 0,22
tolueno 1,496 285 101,6 0,59 8,9 2,3 0,29 0,23
benceno 1,501 280 80,1 0,65 9,2 3 0,32 0,25
cloroformo 1,443 245 61,2 0,57 9,2 3,4-4,4 0,36-0,4 0,26
diclorometano 1,424 232 40 0,44 9,6 3,4 0,4 0,32
cloruro de
1,424 233 39,8 0,44 9,7 3,4 0,42 0,32
metileno
tetrahidrofurano 1,408 212-230 66 0,55 9,1 4,2 0,45 0,35
dicloruro de
1,445 230 83,5 0,79 9,7 3,7 0,49 0,38
etileno
metil etil cetona 1,379 330 80 0,43 9,3 4,5 0,51 0,39
Acetona 1,359 330 56,3 0,32 9,6 5,4 0,56-0,58 0,47-0,53
Acetonitrilo 1,344 190 81,6 0,37 11,7 6,2 0,55-0,65 0,46
Acetato de etilo 1,37 256 77,1 0,46-0,47 9,1 4,3 0,58 0,41
o
Tabla 2. Algunas propiedades de los disolventes más utilizados en HPLC. Los parámetros η, , P’ y
definidos en el texto. Tomada de http://www.sanderkok.com/techniques/hplc/
eluotropic_series_extended.html.
o o
(sílice)= 0,77 (alúmina)
Siempre y cuando los disolventes sean miscibles (ver Tabla. 3), se pueden hacer
combinaciones binarias, ternarias o incluso cuaternarias variando las proporciones de
cada uno de ellos con objeto de obtener una amplia gama de valores de o. Aunque
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o o o
mezcla %mezcla= 1 %1 + 2 %2
o
Queda lo suficientemente claro que a mayor valor de , mayor es la polaridad
del disolvente pero conviene recordar que:
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c) Si una vez realizado el paso anterior, se elige hacer un gradiente, eliminar las
porciones de éste, anterior a la elución del primer pico y posterior a la elución
del último pico. Hacer entonces el mismo gradiente mencionado en b).
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OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Se calcularán los siguientes parámetros: k’, Rs, y N para cada pico (o pareja de
picos contiguos) obtenido y se discutirá cuál de los gradientes planteados por los
alumnos es mejor y por qué. Por último, deberá discutirse y justificarse el orden de
elución de las seis substancias separadas.
MATERIAL Y MÉTODOS
Fase estacionaria.
Columna: Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain).
Tipo: Fase Reversa.
Longitud (L): 120 mm.
Diámetro de partícula (dp): 5µm.
Diámetro interno (di): 4,6 mm.
Temperatura. 25oC.
Fase móvil.
Reservorio A: Acetonitrilo (ACN).
Reservorio B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q.
Fase móvil: Según se especifique en cada condición.
Flujo de fase móvil: Según se especifique en cada condición, en (mL·min –1).
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O OH
HO
OH
HO O
OH
OH
Ácido clorogénico
(M.M.=354,31)
CH=CH-COOH COOH
OH OH
HO
OH OH OH
Figura 3. Estructura molecular de los ácidos clorogénico, ferúlico, siríngico, p-hidroxibenzoico, cafeico
y p-cumárico.
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Composición cuantitativa
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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-1
Figura 4. Espectro de absorción del ácido clorogénico a una concentración de 5 g·mL disuelto en 4%
ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los
máximos de absorción a 235 nm y 330 nm respectivamente.
-1
Figura 5. Espectro de absorción del ácido ferúlico a una concentración de 5 g·mL disuelto en 4%
ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los
máximos de absorción a 240 nm y 325 nm respectivamente.
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-1
Figura 6. Espectro de absorción del ácido siríngico a una concentración de 5 g·mL disuelto en 4%
ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el número 1 representa el máximo
principal de absorción a 280 nm.
-1
Figura 7. Espectro de absorción del ácido p-hidroxibenzoico a una concentración de 5 g·mL disuelto
en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el número 1 representa el
máximo principal de absorción a 256 nm.
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-1
Figura 8. Espectro de absorción del ácido cafeico a una concentración de 5 g·mL disuelto en 4%
ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los
máximos de absorción a 235 nm y 325 nm respectivamente.
-1
Figura 9. Espectro de absorción del ácido p-cumárico a una concentración de 5 g·mL disuelto en 4%
ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los
máximos de absorción a 235 nm y 310 nm respectivamente.
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Una vez escogida la longitud de onda de análisis, 280 nm, sin modificar la fase
estacionaria, se procede a trabajar con diferentes fases móviles. Según se comentó,
estas fases pueden ser constantes en su composición a lo largo del tiempo de análisis
(procedimiento isocrático) o variar a lo largo del tiempo (procedimiento en gradiente).
Si vamos de lo más sencillo a lo más complejo, debemos empezar por los análisis
isocráticos.
1. Análisis isocráticos
Tabla 5. Análisis isocráticos planteados. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q.
El análisis isocrático nº 1 tiene una fase móvil con una fuerza de arrastre muy
grande, pues el acetonitrilo (ACN) está en una alta proporción. Los análisis isocráticos
nº 2 y nº 3 tienen menor proporción de ACN en la mezcla y, por tanto, la fuerza
eluotrópica de la fase móvil es menor. La diferencia de proporción de ACN entre el
70% y el 80% puede ser importante a la hora de la separación.
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Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
Figura 10. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis
isocrático nº 1, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q) (70:30, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mL·min .
Tabla 6. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del
análisis isocrático nº 1, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q
-1
(70:30, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 mL·min .
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Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
Figura 11. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis
isocrático nº 2, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (30:70, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mL·min .
Tabla 7. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del
análisis isocrático nº 2, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q
-1
(30:70, v/v) y un flujo 0,7 mL·min .
En las condiciones del análisis isocrático nº 3 (Fig. 12 y Tabla 8), aparecen cinco
picos, aunque la resolución entre el segundo y el tercero no es buena. Al haber
disminuido la fuerza eluotrópica de la fase móvil, los solutos son capaces de
interaccionar más tiempo con la fase estacionaria y retenerse más en ella, logrando así
una mejor separación.
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Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
Figura 12. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis
isocrático nº 3, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (20:80, v/v)
-1
y una velocidad de flujo 0,7 mL·min .
Tabla 8. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del
análisis isocrático nº 3, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q
-1
(20:80, v/v) y un flujo 0,7 mL·min .
Tabla 9. Resultados de los análisis isocráticos. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de ácido acético en agua
Milli-Q.
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2. Análisis en gradiente
50
40
% A en (A+B)
30 re-equilibrado Gradiente 1
Gradiente 2
20 Gradiente 3
re-equilibrado
10
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (minutos)
TIEMPO Flujo
%A %B
(min) (mL·min -1)
0 5 95 0,7
10 10 90 0,7
15 15 85 0,7
20 25 75 0,7
30 40 60 0,7
45 5 95 0,7
Tabla 10. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente nº 1. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de ácido acético en agua Milli-Q.
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Gradiente nº 1
Figura 14. Cromatograma del análisis en el gradiente nº 1 de la mezcla de los seis fenoles.
Tabla 11. Tabla del cromatograma del análisis en el gradiente nº 1 de la mezcla de los seis fenoles.
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Figura 15. Ampliación del cromatograma del análisis en el gradiente nº 1 para la triangulación de
picos.
Gradiente nº 2
TIEMPO %A %B Flujo
(min) (mL·min -1)
0 0 100 0,7
30 30 70 0,7
45 0 100 0,7
Tabla 12. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente nº 2. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de ácido acético en agua Milli-Q.
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Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
Figura 16. Cromatograma del análisis en el gradiente nº 2 de la mezcla de los seis fenoles.
Tabla 13. Tabla del cromatograma del análisis en el gradiente nº 2 de la mezcla de los seis fenoles.
Figura 17. Ampliación del cromatograma del análisis en el gradiente nº 2 para la triangulación de
picos.
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Gradiente nº 3
TIEMPO %A %B Flujo
(min) (mL·min -1)
0 0 100 0,7
2 0 100 0,7
25 20 80 0,7
40 20 80 0,7
55 0 100 0,7
Tabla 14. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente nº 3. A: Acetonitrilo (ACN) y B:
4% de ácido acético en agua Milli-Q.
Tiempo (minutos)
Figura 18. Cromatograma del análisis en el gradiente nº 3 de la mezcla de los seis fenoles.
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Tabla 15. Tabla del cromatograma del análisis en el gradiente nº 3 de la mezcla de los seis fenoles.
Tabla 16. Tiempos de retención de cada uno de los seis picos de la mezcla de seis fenoles, obtenidos
en cada uno de los tres gradientes realizados.
Nota importante
Los valores que se muestran en las Tablas 17 y 18, se han obtenido como
resultado de la triangulación de cada uno de los seis analitos de la muestra problema
en los diferentes gradientes, una vez ampliado el cromatograma (Figs 15 y 17), para
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Gradiente 1
ωb ωb tR tM tR tR’
pico (mm) (min) (min) (min) (mm) (mm) k’ N 2:1 Rs (1) Rs (2)
1 7,5 0,44 15,24 3,46 262,09 11,78 3,41 19.539 --- --- ---
2 8 0,47 16,46 283,04 13 3,76 20.028 1,1 2,68 2,54
3 8 0,47 19,01 327,06 15,56 4,5 26.742 1,2 5,42 5,58
4 7,5 0,44 21,14 363,61 17,68 5,12 37.607 1,14 4,68 5,68
5 6 0,35 26,15 449,75 22,69 6,57 89.898 1,28 12,68 14,23
6 5,5 0,32 27,91 480 24,45 7,07 121.865 1,08 5,26 5,66
*1 min =17,2 mm
*1min = 17,2 mm
Tabla 17. Cálculo de algunos parámetros cromatográficos relacionados con la retención, resolución y
eficiencia de los solutos, analizados según las condiciones de fase móvil del gradiente nº 1.
(1), Cálculo de Rs según la ecuación: Rs = (2ΔtR) / (ωb1 + ωb2).
(2), Cálculo de Rs según la ecuación: Rs = (√N / 4) ( / -1)(k’2 /1+ k’2).
Gradiente 2
ωb ωb tR tM tR tR’
pico (mm) (min) (min) (min) (mm) (mm) k’ N 2:1 Rs (1) Rs (2)
1 8 0,59 17,8 4,61 242,13 13,19 2,86 14.657 --- --- ---
2 7 0,51 19,75 168,64 15,15 3,29 23.565 1,15 3,54 3,84
3 7 0,51 21,64 294,37 17,04 3,7 28.295 1,12 3,7 3,54
4 7 0,51 23,74 322,93 19,14 4,15 34.052 1,12 4,12 3,98
5 8 0,59 28,85 392,31 24,24 5,26 38.476 1,27 9,29 8,76
6 8 0,59 31,18 424,02 26,57 5,77 44.948 1,1 3,95 4,11
*1 min =13,6 mm
*1min = 13,6 mm
Tabla 18. Cálculo de algunos parámetros cromatográficos relacionados con la retención, resolución y
eficiencia de los solutos, analizados según las condiciones de fase móvil del gradiente nº 2.
(1), Cálculo de Rs según la ecuación: Rs = (2ΔtR) / (ωb1 + ωb2).
(2), Cálculo de Rs según la ecuación: Rs = (√N / 4) ( / -1)(k’2 /1+ k’2).
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La resolución (Rs), entre las parejas de picos contiguos, es siempre superior a 1,5
lo que indica que los picos están resueltos hasta línea base en ambos tipos de
gradiente. Excepto el valor de Rs, calculada como Rs = (2ΔtR) / (ωb1 + ωb2) entre los
picos 1º y 2º (3,54) en el gradiente nº 2, en el resto de los casos siempre es mayor en
el gradiente nº 1.
La eficiencia de todos los picos (N), excepto el del que eluye en primer lugar, es
siempre superior en el gradiente nº 1 que en el gradiente nº 2, por tanto, las
condiciones de fase móvil empleadas en el gradiente nº 1 permiten separaciones más
eficientes que en el gradiente nº 2.
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Por una razón semejante a la descrita, el ácido siríngico debería ser el tercer
analito eluido. Sin embargo, dos grados de metoxilación no sólo aumentan su
apolaridad sino también su masa molecular. Jugaría a favor suyo un sustituyente
carboxilo monocarbonado, más polar que la misma función en una cadena 3C
insaturada. En resumen, el ácido cafeico, de masa molecular 180,2, un núcleo
bencénico y una cadena insaturada de 3C, pero con tres funciones polares y ningún
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A partir de este tercer analito, el efecto solvófobo aumenta con los diferentes
grados de metoxilación, por lo que será necesario un aumento de la apolaridad de la
fase móvil para compensar tal efecto. De los tres analitos restantes, el ácido siríngico
es el único que no aumenta de forma notable su superficie de interacción con la fase
estacionaria apolar al no poseer una cadena 3C insaturada. Por ello, debería ser el
siguiente en eluir de la columna cuando el incremento en la proporción de ACN en la
fase móvil sea suficiente. De hecho, la separación experimental demuestra que el
ácido siríngico es el metabolito que eluye en cuarta posición (t R = 21,14 min), ya
netamente distanciado de los anteriores (Tabla 17). Nótese que el acido cafeico es
eluido unos minutos antes de que se alcance aproximadamente el 70% del incremento
total del contenido en ACN de la fase móvil, proporción ésta que prácticamente
coincide con la elución del ácido siríngico.
De los dos últimos analitos que restan por salir de la columna el orden no es
dudoso. El ácido ferúlico es más apolar que el ácido p-cumárico gracias a una función
metoxilo suplementaria. El ácido p-cumárico eluye en quinta posición (tR = 26,15 min)
y, por último, el ácido ferúlico (tR = 27,91 min); ver Tabla 17. En la Tabla 19 se
muestran los seis analitos objeto de separación, sus masas moleculares y el orden de
elución obtenido en el gradiente nº 1.
Tabla 19. Orden de elución de los seis analitos de la muestra problema en las condiciones de análisis
del gradiente nº 1.
BIBLIOGRAFÍA
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Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, 2011.
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RECURSOS ELECTRÓNICOS
Shula Levin's WebSite of HPLC and LC-MS. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible
en: http://www.forumsci.co.il/HPLC/program.html
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