Universidad Central de Venezuela.

Facultad de Ciencias.
Escuela de Biología.
Departamento de Biología Celular
Laboratorio de Biología Celular
Integrantes: Maria Lourdes Acosta
Ilad Gabriel Vivas Lopez

TRANSPORTE CELULAR

Caracas, 2 de julio de 2015

 INTRODUCCION

La organización de la actividad química de todas las células de los organismos

superiores depende en gran medida de la compartamentalización provista por las
membranas biológicas. La primera función de todas las membranas consiste en separar el
medio intracelular del extracelular; dentro de las células las membranas sirven para aislar
las reacciones químicas que tienen lugar en los organelos y están constituidas por una
cantidad variable de lípidos.

Las membranas biológicas son estructuras vectoriales formadas por una bicapa de
fosfolípidos, con sus componentes distribuidos asimétricamente entre las dos superficies,
en el caso de los eritrocitos, los aminofosfátidos, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina se
localizan principalmente en la monocapa citoplasmática de la bicapa, en tanto que los
derivados de la colina fosfatidilcolina y esfingomielina se presentan en la monocapa
externa.

La membrana plasmática es una barrera de permeabilidad selectiva entre la célula y

el medio extracelular. Sus propiedades de permeabilidad aseguran que las sustancias
esenciales, como la glucosa, los aminoácidos y los lípidos, entren en la célula con facilidad,
que los intermediarios metabólicos permanezcan en la célula y que los componentes de
desechos la abandonen.

La bicapa fosfolipídica es esencialmente impermeable a la mayor parte de las

sustancias hidrosolubles, como la glucosa y los aminoácidos, y a los iones; el transporte de
estas moléculas e iones a través de todas las membranas celulares es mediado por proteínas
transportadoras asociadas con la bicapa subyacente.

La permeabilidad de la membrana para una sustancia es la tasa a la que la sustancia

penetra la membrana pasivamente en unas condiciones determinadas; la difusión pasiva es
el paso de sustancias desde las regiones de concentraciones elevadas hacia las de menor
concentración, la velocidad de difusión está dada por una modificación de la ley de Fick,
que indica que la velocidad de difusión a través de una membrana es directamente
proporcional al coeficiente de permeabilidad y a la constante de difusión. Las moléculas
apolares pueden difundir con facilidad a través de la fase lipídica de la membrana, el agua
y algunas moléculas polares pequeñas difunden a través de canales acuosos transitorios
creados por movimientos térmicos. La difusión de algunas sustancias tiene lugar mediante
moléculas que forman complejos con la sustancia, facilitando su transporte a través de la
membrana.

El transporte activo de una sustancia tiene lugar mediante transportadores y requiere

energía metabólica, normalmente proporcionada por el ATP. Este transporte es responsable
del movimiento de una sustancia a través de una membrana, en contra de un gradiente de
concentración.
2
 Los iones, las hexosas, los aminoácidos y a veces el agua no pueden difundir a
través de una bicapa fosfolipídica con velocidad suficiente como para satisfacer las
necesidades de la célula y son transportados por un grupo de proteínas integrales de la
membrana que incluyen los canales, los transportadores y las bombas iónicas impulsadas
por ATP.

En 1748, Abbé J. señaló que si colocamos agua pura a un lado de una membrana
animal y una solución acuosa que contienen electrólitos u otras moléculas en otro lado, el
agua pasa hacia la solución a través de la membrana. Este movimiento del agua a favor de
su gradiente de concentración se denominó ósmosis; la presión osmótica es igual a la
presión hidrostática necesaria para contrarrestar el flujo osmótico. La tonicidad de una
solución se define por la respuesta de las células o los tejidos inmersos en la solución. Se
considera que una solución es isotónica si la célula o el tejido inmersos en ella no se
arrugan ni se hinchan; si el tejido se hincha, se dice que la solución es hipotónica para él; si
se arruga, se dice que la solución es hipotónica para él. Estos efectos resultan del
movimiento de agua a través de la membrana celular en respuesta a las diferencias de
presión osmótica entre el interior celular y la solución extracelular.

Los eritrocitos son células sanguíneas cuya función principal es transportar oxígeno
a los tejidos. Durante el proceso de maduración de estas células, la hemoglobina producida
se disuelve en el citoplasma y alcanza concentraciones muy altas (cerca del 34% del peso
del eritrocito); las estructuras y organelos intracelulares como núcleo, retículo
endoplasmático y mitocondrias se pierden. Los eritrocitos son entonces vestigios de células,
destinadas a sobrevivir, en caso de vertebrados como el ratón, por unos 120 días. Las
características antes descritas hacen de los eritrocitos, un modelo de estudio de la
permeabilidad de las membranas, ya que alteraciones en las mismas que conduzcan a lisis
celular, se reflejan como salida de hemoglobina al medio extracelular (hemólisis). Esta
salida de hemoglobina se observa como una coloración roja del solvente en que se
encuentran los eritrocitos. De esta forma, midiendo los tiempos de hemólisis, se puede
comparar la permeabilidad de una serie de moléculas orgánicas. A su vez, la presencia de
hemólisis al añadir diferentes agentes químicos permitirá evidenciar cómo la interacción de
los mismos con la membrana puede tener efectos irreversibles en su estructura. Cuando la
hemólisis no se hace presente la solución será de color rojizo pero opaca, y no se podrá leer
un texto a través del un tubo de ensayo, en el caso de presencia de hemólisis la solución se
irá aclarando progresivamente hasta hacerse completamente clara y transparente, momento
en que se podrá leer un texto a través del tubo de ensayo. Si una membrana es permeable al
soluto, provocará la lisis celular. La razón de ello es que el soluto penetra por difusión al
interior de la célula, provocando la entrada de agua y ruptura final de la membrana. El
tiempo que tarde en producirse la lisis será inversamente proporcional a la permeabilidad
de la membrana para el soluto en cuestión. Durante la ruptura de la membrana se produce
un cambio en el índice de refracción (n) entre el interior celular y la solución externa.
Inicialmente estos son diferentes pero se igualan cuando ocurre la hemólisis, este cambio se
monitorea haciendo incidir un rayo de luz sobre la preparación en un espectrofotómetro que
mide la dispersión de luz que ocurre por el paso de los diferentes (n).

3
OBJETIVO

Reconocer a la membrana plasmática como la principal estructura involucrada en

los procesos biofísicos básicos involucrados en el intercambio de material entre la célula y
su medio ambiente mediante la utilización de células sanguíneas (eritrocitos).

METODOLOGIA

Experimento 1. Calibración del espectrofotómetro

Previamente colocar el espectrofotómetro a 500nm

Preparar 2 suspensiones de eritrocitos (0% y 100%

hemolisis)

Suspensión 0% hemolisis. Suspensión 100% hemolisis.

Tomar 0,5mL de suspensión de Tomar 0,5mL de suspensión de

eritrocitos eritrocitos

Completar el volumen con Añadir 10 mL de agua destilada

solución salina NaCl(150mM)
isotónica hasta 30mL

Completar hasta un volumen de

30mL con solución salina
NaCl(258mM) hipertonica

Añadir 6mL de cada solución en

cubetas y medir la densidad
óptica (DO) de ambas
suspensiones ajustando el valor
de DO a cero4con la suspensión
100% hemolisis
 Experimento 2. Construcción de la Curva de calibración

Preparar 6mL de suspensiones de 25%, 50 % y 75% de

hemolisis mezclando las suspensiones de 0% y 100%
hemolisis

Suspensión 25% hemolisis. Suspensión 50% hemolisis. Suspensión 75% hemolisis.

Mezclar 4,5mL de suspensión al Mezclar 3mL de suspensión al Mezclar 1,5mL de suspensión al

0% hemolisis con 1,5mL de 0% hemolisis con 3mL de 0% hemolisis con 4,5mL de
suspensión 100% hemolisis suspensión 100% hemolisis suspensión 100% hemolisis

Medir la densidad óptica de todas

las suspensiones preparadas y
anotarlas

Realizar una curva de calibración

(DO Vs. %Hemolisis) con los
datos obtenidos

5
 Experimento 3.1. Preparación de soluciones de NaCl

Rotular 12 tubos de ensayo con las respectivas

concentraciones de NaCl (0, 30, 60, 90, 120 y 150mM)
por duplicado

Preparar 14mL de soluciones de NaCl a concentraciones

de 0, 30, 60, 90, 120 y 150mM a partir de una solución
madre de NaCl (150mM)

NaCl 0mM NaCl 90mM

NaCl 30mM NaCl 120mM

Añadir 14mL de Añadir 5,6mL

agua destilada de agua
NaCl 60mM NaCl 150mM
en un tubo de destilada y
ensayo 8,4mL de
solución madre
Añadir 11,2mL Añadir 2,8mL
de NaCl en un
de agua de agua
tubo de ensayo
destilada y destilada y
2,8mL de 11,2mL de
solución madre solución madre
de NaCl en un de NaCl en un
tubo de ensayo Añadir 8,4mL tubo de ensayo Añadir 14mL de
de agua solución madre
destilada y de NaCl 150mM
5,6mL de en un tubo de
solución madre ensayo
de NaCl en un
tubo de ensayo

6
Experimento 3.2. Construcción de una curva de fragilidad

Colocar 5,9mL de las soluciones preparadas en el

experimento #3.1 en su respectivo tubo de ensayo rotulado

Añadir a cada tubo 0,1mL de suspensión de eritrocitos y

mezclar por inversión

Medir la densidad óptica de las suspensiones y anotar los

valores obtenidos

Dejar reposar los tubos por espacio de 10 minutos

Determinar el % de hemolisis obtenido en cada solución

de acuerdo a la densidad óptica, utilizando la curva de
calibración del experimento #1

Realizar la curva de fragilidad en papel milimetrado,

representando el % de hemolisis Vs. Concentración de
NaCl utilizada

Experimento 4.1. Ensayo de permeabilidad selectiva de la membrana de los eritrocitos

(método cualitativo)

Tomar una placa de microtitulación de 96 pocillos y

colocar sobre un papel periodico

Colocar una gota de sangre con una pipeta Pasteur en

cuatro pocillos (una gota en cada pocillo)

Añadir a cada pocillo 5 gotas de su respectivo soluto con

pipetas Pasteur

Observar los pocillos hasta que se logre leer el papel que

se encuentra debajo de la placa de microtitulación

7
 Clasificar los solutos usados de acuerdo al tiempo (rápido,
lento o intermedio) que se tardan para que podamos leer a
través de ellos el papel que se encuentra debajo de la placa
de microtitulación
Experimento 4.2. Ensayo de permeabilidad selectiva de la membrana de los eritrocitos
(método cuantitativo)

Calibrar el espectrofotómetro a cero con la solución 100%

hemolisis

Preparar suspensiones con 5,9mL de cada soluto asignado

(solo solutos intermedios y lentos) y 0,1mL de eritrocitos

Medir la densidad óptica de cada suspensión a 500nm

Solutos intermedios Solutos lentos

Medir la densidad óptica Medir la densidad óptica en

en intervalos de un intervalos de cinco minutos
minuto hasta alcanzar el (3 veces) y luego en
100% de hemolisis intervalos de diez minutos
hasta alcanzar el 100% de
hemolisis

Tomar nota de los valores de

densidad óptica obtenidos en cada
medición

8
 RESULTADOS

Curva de Calibración y construcción de la curva de fragilidad.

A continuación se presenta la curva de calibración obtenida en la parte a, realizando

las medidas de DO a una longitud de onda de 500nm.

% de hemólisis Densidad óptica (500nm)

0 0,741
25 0,583
50 0,415
75 0,254
100 0,00
Tabla 1. Lecturas de densidad óptica para la curva de calibración

Figura 1 Curva de calibración de eritrocitos

Las DO medidas en el transcurso de la práctica se pasaron a valores de % de

hemólisis extrapolando los valores de absorbancia sobre la curva de calibración.

9
 Una vez terminado de realizar el Experimento 3.2 los resultados que se obtuvieron
fueron los siguientes:

[NaCl] (mM) D.O (500 nm) % de hemólisis

0 0 100
0
30 0 100
0
60 0,013 100
0,012
90 0,542 25,7
0,529
120 0,854 15,6
0,846
150 1,045 12,5
1,050
Tabla 2. Porcentajes de hemólisis para las densidades ópticas medidas

A continuación con estos valores, se realizó la siguiente curva de fragilidad para la

suspensión de eritrocitos que se suministró para la práctica.

120

100

80
% de hemólisis

60

40

20

0
0 30 60 90 120 150
[NaCl] (mM)

Figura 2. Curva de fragilidad de los eritrocitos, muestra como varía él % de hemólisis de los eritrocitos con
las concentraciones de NaCl utilizadas.

10
Ensayo de permeabilidad selectiva de la membrana de los eritrocitos.

Los solutos que fueron sometidos a la determinación cualitativa de su permeabilidad

en la membrana de los eritrocitos fueron el acetato de sodio, cloruro de amonio, glicerol y
la muestra problema, según los resultados obtenidos estos se clasifican como se indica en la
Tabla 3

Soluto Rápido ------------------

Soluto Intermedio SULFATO DE AMONIO
Soluto Lento MANITOL
Soluto Problema -------------------
Tabla 3. Determinación cualitativa.

Para el desarrollo de la determinación cuantitativa según los resultados de la Tabla 3

se escogieron el sulfato de amonio como soluto intermedio y Manitol como solutos lentos.
Los resultados de % H obtenidos se expresan en la Figura 3, 4 y 5.

Tiempo (min) D.O (500 nm) % de hemólisis

10 0,672 10,3
20 0,578 25,7
30 0,529 25,7
40 0,384 50,3
50 0,212 70,4
60 0,00 100

Tabla 4.1. Determinación cuantitativa soluto intermedio

Tiempo (min) D.O (500 nm) % de hemólisis

10 0,797 0.9
20 0,694 10,3
30 0,694 10,3
40 0,685 10,3
50 0,674 10,3
60 0,649 10,3

11
 Tabla 4.2.Determinación cuantitativa soluto lento

120 40
35
100

% de hemólisis
30
% de hemólisis

80 25
60 20
40 15
10
20
5
0 0
0 2 4 6 8 10 0 50 100 150
Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 3. a) Curvas porcentaje de hemólisis Figura 3. b) Curvas porcentaje de hemólisis vs

vs tiempo para cada solución utilizada tiempo para cada solución utilizada (Acetato de
(Cloruro de Amonio) Sodio)

Figura 3: a) solución de cloruro de amonio soluto intermedio muy permeable a la

membrana de los eritrocitos, alcanza el 50% de hemólisis antes de un minuto. b) solución
de Acetato de Sodio soluto poco permeable a la membrana de los eritrocitos, a los 115
minutos que fue hasta donde se midió todavía no se alcanzó el 50% hemólisis, se alcanzaría
el 50% a las 3 horas 28 minutos. c) solución problema soluto lento ocurre 100% hemólisis
en las células pero muy lentamente, alcanza el 50% de hemólisis a los 36 minutos.

12
 DISCUSIÓN

Curva de Calibración y construcción de la curva de fragilidad.

Según Karp (1998) las moléculas de agua se mueven con mayor rapidez a través de
la membrana celular que los iones disueltos o los pequeños solutos orgánicos polares, que
son incapaces de penetrar. A causa de esta diferencia en la penetrabilidad del agua en
comparación a los solutos, se dice que las membranas son semipermeables. El agua se
mueve con facilidad a través de una membrana semipermeable de una región con menor
concentración de solutos a una región con mayor concentración de solutos. Este proceso se
llama ósmosis y es fácil de demostrar si se coloca una célula en una solución que contenga
un soluto no penetrante con una concentración diferente a la presente dentro de cada célula.
Cuando se coloca una célula en una solución hipotónica, muy pronto la célula capta agua
por ósmosis y se hincha. En medio hipertónico, la recuperación se logra cuando la célula
obtiene iones del medio. Una vez que la concentración interna de solutos (que incluye una
alta concentración de proteínas disueltas) iguala a la concentración externa de solutos, ya
no se produce desplazamiento de agua hacia adentro o fuera de la célula. La membrana de
los eritrocitos es semipermeable y cuando son colocados en una solución hipotónica el
líquido penetra osmóticamente a ellos, hasta que alcanza el equilibrio osmótico o hasta que
se rompen, a esta ruptura se le denomina hemólisis.

Los Valores obtenidos experimentalmente presentan la tendencia esperada

teóricamente, en la que la DO y % de hemolisis son inversamente proporcionales, es decir,
a medida de quela DO disminuye el % de hemolisis aumenta, a su vez esto se debe a que al
ocurrir hemolisis de los eritrocitos liberándose su contenido, se produce un cambio en el
índice de refracción, entre el interior celular y el de la solución externa, originándose una
dispersión si se hace incidir en la muestra un rayo de luz, lo cual se puede medir en el
espectrofotómetro, entonces a mayor % de hemolisis la medición del rayo de luz será
menor debido a la dispersión del mismo, por el contenido liberado de los eritrocitos, cuyo
valor se midió a esa longitud de onda (500 nm) ya que a esa longitud de onda los eritrocitos
tienen menor absorbancia.

La Figura 2 representa la hemólisis de una población de eritrocitos, el hecho de que

las células hemolizan en un rango bastante amplio de concentraciones puede describirse
diciendo que la tonicidad del medio no es la adecuada para producir la hemólisis, la
tonicidad del medio necesaria para su ruptura osmótica es un medio hipotónico. Esta curva
además nos permite conocer la concentración del medio exterior apropiada para que no se
produzca hemólisis de los eritrocitos, es decir en este caso, la concentración de NaCl
necesaria para alcanzar un medio isotónico.

Al alcanzar los valores del 100% de hemolisis, se puede decir que las células de
eritrocitos se encontraban en un ambiente hipotónico, donde la cantidad de solutos presente
en el exterior celular era menor que en el interior, por lo que se da un flujo neto de agua
hacia el interior de la célula provocando su hinchamiento y ya que las paredes no son
rígidas y presentan un límite de elasticidad, se origina posteriormente su rompimiento. Se
puede observar claramente en la Figura 2 que el 100% de hemólisis no se da en un punto
específico si no durante todo un intervalo de concentración de NaCl, que van desde 0 a 60
13
nM. Por otra parte se observó que a medida que la concentración de NaCl va aumentando,
la concentración en el exterior se va igualando a la del interior de la célula hasta alcanzar,
finalmente un % hemólisis cercano a cero, donde la preparación de eritrocitos se encuentra
en una solución isotónica, es decir, la concentración de solutos en el interior era casi igual
al exterior y por ende no se obtuvo casi flujo neto de agua entre el interior y el exterior
celular.

Ensayo de permeabilidad selectiva de la membrana de los eritrocitos.

Solutos rápidos e intermedios:

En soluciones isotónicas de solutos permeables, la entrada de material a la célula

trae como consecuencia un flujo de agua hacia el espacio intracelular de los eritrocitos,
provocando de esta manera la lisis celular o hemólisis. La permeabilidad de los solutos
determina la rapidez de difusión. Según (Eckert, 2002), la permeabilidad de la membrana
para una sustancia es la tasa a la que sustancia penetra la membrana pasivamente en unas
condiciones determinadas. Una mayor permeabilidad estará acompañada de un flujo mayor
si los otros factores permanecen constantes. Por tal razón el 100 % de hemólisis se alcanza
en mayor tiempo con el CH3COONa.

Con el Glicerol se alcanza la hemolisis en un menor periodo de tiempo de tiempo

esto se debe a que la membrana plasmática de los eritrocitos es permeable a pequeñas
moléculas polares sin carga.

En el caso del cloruro de amonio (NH4Cl) la velocidad de entrada del mismo se

hace un poco más lenta, debido a que depende de la migración de NH3 así como del
intercambio de Cl- por OH-, debido a que las concentraciones internas del cloruro son
menores que en el exterior. La membrana es permeable al NH3, por lo que permite su
entrada en la célula para combinarse con el agua y formar NH4OH; luego el ión OH- se
intercambia con el Cl-, resultando así la entrada de cloruro de amino bajo condiciones de
altas concentraciones de Cl- y NH4+.

Solutos lentos:

Se considera que un soluto lento tarda más de 15 minutos en que los globulos rojos
alcancen un 100 % de hemólisis. Las membranas son impermeables a la mayoría de los
solutos polares y permeables a los solutos no polares. En general, a mayor número de
grupos polares (-OH, -O, -NH2) en una molécula polar, menor será su permeabilidad a
través de una membrana. Por lo tanto, para el intercambio de la mayoría de los solutos
polares existen mecanismos controlados que pueden implicar inversión de energía. (F.
Montero, F. Morán. 1992) Otro factor que afecta la permeabilidad de una molécula es su
tamaño o peso molecular. A mayor peso, la molécula es menos permeable.
14
 Si una membrana es permeable al soluto, provocará la lisis celular. La razón de ello
es que el soluto penetra por difusión al interior de la célula, provocando la entrada de agua
y ruptura final de la membrana. El tiempo que tarde en producirse la lisis será inversamente
proporcional a la permeabilidad de la membrana para el soluto en cuestión. (F. Montero, F.
Morán. 1992)

En el caso del acetato de sodio (CH3COONa), la permeabilidad es reducida por lo

cual la entrada de iones sodio y acetato a través de la membrana ocurre en un intervalo de
tiempo muy amplio con respecto a los otros solutos utilizados. Esta baja permeabilidad se
debe a que la membrana es impermeable al ion acetato y debido a las altas concentraciones
extracelulares del ion sodio y al interior de la membrana negativo, existen canales de sodio
abiertos regulados para el movimiento de iones sodio hacia el interior celular para ayudar
en la inversión del potencial de membrana, aunque este siempre se mantendrá negativo por
la salida libre de iones potasio. Con el acetato de sodio se obtuvo un porcentaje de
hemolisis menor al 50% con casi dos horas, por lo que el ion sodio solo es permeable solo
si la membrana posee canales abiertos u ocurre un mecanismo mecánico con gasto de
energía que ayude a la entrada del ion

En el caso de nuestro soluto problema obtuvimos que es un soluto semipermeable a

la membrana plasmática, esto se debe a que ocurre la entrada de solutos hacia el interior
celular provocando el aumento en el porcentaje de hemolisis, pero ocurre en un amplio
rango de tiempo, lo que indica que el soluto solo es permeable a la membrana con el paso
del tiempo. Con este soluto se obtuvo un porcentaje de hemolisis superior al 50% lo que
indica que una gran cantidad de soluto atravesó la membrana plasmática.

CONCLUSIONES

 La curva de fragilidad de los eritrocitos permite identificar la resistencia que tienen una
población de estas células en un medio hipotónico, así como también determinar a que
concentración salina se llega a 0% de hemólisis que representa un medio isotónico.

 El acetato de sodio (CH3COONa) difunde más lento que el cloruro de amonio (NH4Cl)
en membranas de eritrocitos.

 La muestra problema era de gran tamaño esto se le atribuye que requiere de mayor
tiempo en contacto con el eritrocito para que se produzca un 100% de hemólisis.

 La velocidad de difusión depende de la permeabilidad del soluto en la membrana del

eritrocito.

15
 El % de hemólisis está determinado por la velocidad en que difunde un soluto a través de
una membrana.

 El transporte de solutos a través de la membrana está directamente relacionado con la

permeabilidad de dicha membrana a cada uno de estos solutos. A su vez, estos
movimientos se rigen por la difusión libre, flujo transmembrana y por ósmosis.

 El paso de solutos a través de la membrana también es determinado por la estructura y/o

composición de los solutos en sí. En este aspecto se toma en cuenta propiedades como
peso molecular, polaridad, tamaño y conformación de la estructura.

BIBLIOGRAFÍA

Eckert R., Randall D. 2002. Fisiología Animal. 4ta Edición. Interamericana Mc Graw Hill.
España.

F. Montero, F. Morán. 1992. Biofísica. Procesos de autoorganización en Biología. Eudema,

Madrid.

Karp, Gerald. 1998. Biología celular. McGraw-Hill, 1a edición. México

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