Durante la iniciación de la transcripción in vitro, la ARN polimerasa puede

participar en la iniciación abortiva: la síntesis y liberación de transcritos de ARN

cortos, de 2 a 15 nucleótidos, antes del inicio productivo. Eso no se sabe si la
iniciación abortiva ocurre in vivo. Usando hibridación con bloqueado sondas de
ácido nucleico, detectamos directamente transcripciones abortivas in vivo y, por lo
tanto, muestran que abortivo la iniciación ocurre in vivo. Además demostramos
que la iniciación abortiva in vivo es un determinante del promotor fuerza, un
determinante de la función de la ARN polimerasa, y un objetivo de regulación por
factor de transcripción GreA. Las transcripciones abortivas pueden tener funciones
funcionales, fisiológicamente importantes en la regulación de genes expresión in
vivo.

Durante la transcripción, la ARN polimerasa (RNAP) sintetiza los primeros ~ 8-15

nucleótidos (nt) de ARN como un complejo de transcripción inicial del promotor de
RNAP (1-3) [utilizando un "crujido" mecanismo (4)]. Tras la síntesis de una
transcripción de ARN de una longitud umbral de ~ 8-15 nt, RNAP rompe sus
interacciones con el ADN del promotor, escapa del promotor y entra en el proceso
síntesis de ARN como un complejo de elongación de transcripción RNAP-ADN (1-
3) [utilizando un Mecanismo de "escalonamiento" (5)]. En reacciones de
transcripción in vitro, el iniciador RNAP inicial complejo de transcripción puede
participar en decenas a cientos de ciclos de síntesis y liberación de corto
Transcripciones de ARN ("iniciación abortiva") (1-3,6-8). La iniciación abortiva
compite con iniciación productiva in vitro y, como tal, es un determinante crítico de
la fuerza del promotor y una objetivo de la regulación de la transcripción in vitro (1-
3,7-13). Se ha propuesto que abortivo la iniciación también ocurre in vivo (6,8). En
apoyo de esta propuesta, los factores que afectan los rendimientos de Las
transcripciones completas in vitro a través de los efectos sobre la iniciación
abortiva también afectan los rendimientos de transcripciones completas en vivo (9-
14). Sin embargo, no hay evidencia directa de que la iniciación abortiva ocurre in
vivo ha sido presentado.
El promotor del bacteriófago T5 N25 y su derivado N25anti son sistemas modelo
clásicos para
el estudio de la iniciación abortiva y el escape del promotor (9,11-14). N25 y
N25anti difieren solo en
sus secuencias transcritas iniciales (posiciones +3 a +20) pero exhiben
radicalmente diferente
características in vitro con respecto al abortivo: relación productiva (APR; 40 para
N25; ~300
para N25anti), el tamaño máximo de las transcripciones abortivas (10 nt para N25,
15 nt para N25anti) y la cinética del escape del promotor (kclear ~1.7 por minuto
para N25; ~0.06 por minuto para N25anti).
Para determinar si la iniciación abortiva ocurre in vivo, buscamos detectar
transcripciones abortivas
generado durante la transcripción de una copia plasmida de N25anti en
Escherichia coli, usando
sondas de ácido nucleico bloqueadas desarrolladas para la detección de
microARN basada en la hibridación (15,
dieciséis). Pensamos que la APR relativamente alta de N25anti facilitaría la
acumulación de
cantidades detectables de transcripciones abortivas y que el tamaño máximo
relativamente alto de las transcripciones abortivas de N25anti facilitarían la
hibridación eficiente del núcleo bloqueado
sondas ácidas. Para validar el método, realizamos reacciones de transcripción in
vitro usando E.
coli RNAP y una plantilla de ADN que lleva el promotor N25anti, una unidad de
transcripción de 100 nt,
y el terminador tR2 (N25anti-100-tR2). Realizamos reacciones paralelas usando
radiactivo
NTP con análisis por autorradiografía (Fig. 1A, izquierda) y uso de NTP no
radiactivos con
análisis por hibridación (Fig. 1A, derecha). La hibridación fue capaz de detectar
transcripciones abortivas
teniendo longitudes de 11-15 nt.

Para detectar transcripciones abortivas in vivo, presentamos un plásmido que lleva

N25anti-100-tR2 en células, ARN aislado, ARN electroformado en geles de urea-
poliacrilamida, y visualizados transcripciones por hibridación (Fig. 1B). Muestras
de ARN de las células con el plásmido que lleva N25anti-100-tR2 (pero no de
células con un plásmido de control que carece de N25anti-100-tR2) exhibido
transcripciones correspondientes a la movilidad a los 11-15 nt transcripciones
abortivas observadas in vitro (Fig. 1B). Los transcritos de 11-15 nt generados in
vivo se observaron con ambos N25anti-100-tR2 llevado en un plásmido de
múltiples copias (Fig. 1B) y N25anti-100-tR2 llevado en una sola copia, derivado
de Fplasmid, plásmido (Fig. S1).

Para demostrar que las transcripciones de 11 a 15 nt detectadas in vivo son

transcripciones abortivas, demostramos que exhiben tres características distintivas
de transcripciones abortivas como se define in vitro: (1) alterar las interacciones
entre RNAP y el ADN del promotor alteran los rendimientos de los transcritos de
11-15 nt (Figs. S2, S3) (ver 1, 3, 10, 13, 17), (2) alterar las interacciones entre
RNAP y la iniciación de la transcripción el factor σ altera los rendimientos de las
transcripciones de 11-15 nt (Figuras S4, S5) (véase 18, 19), y (3) transcripción
factor de elongación GreA altera los rendimientos de los transcritos 11-15 nt (Fig.
S6) (ver 1, 3, 9). Concluimos que la iniciación abortiva ocurre in vivo (Figuras 1,
S1-S7).
Concluimos que la iniciación abortiva es un factor determinante de la potencia del
promotor (Figuras S2, S3), un determinante de RNAP función (figuras S4, S5) y un
objetivo de regulación de la transcripción in vivo (figura S6). Los resultados se
obtuvieron con RNAP bacteriana. Sin embargo, debido a que la iniciación abortiva
ocurre in vitro con todos los RNAP caracterizados (bacterianos, de arqueas,
eucariotas y bacteriófagos) lo consideramos es probable que la iniciación abortiva
ocurra in vivo con todos los RNAP. Análisis de la región transcrita inicial
secuencias de promotores de E. coli definidos experimentalmente indican que
hasta ~ 4000 diferentes tránscritos abortivos 2-10 nt pueden generarse in vivo
(Tabla S1).
El descubrimiento de que las transcripciones abortivas se generan in vivo y se
acumulan a niveles detectables in vivo, plantea la posibilidad de que las
transcripciones abortivas puedan desempeñar funciones funcionales. Por ejemplo,
una transcripción abortiva producida a partir de un primer promotor podría
funcionar como una secuencia específica cebador para la iniciación de la
transcripción en un segundo promotor o podría funcionar como un efector
antisentido contra un ARN específico. Las prioridades clave serán definir el
conjunto completo de transcripciones abortivas producido in vivo (el "aborto"), y
para definir roles funcionales de transcripciones abortivas en vivo.
GENÉTICA: BEADLE Y TA TUM
A este respecto, se debe tener en cuenta que el factor de presión de selección
probablemente también varíe donde surja tal aislamiento, así como el de la
población tamaño, para las poblaciones se llevará a cabo en entornos algo
diferentes. Se puede notar al cerrar que aquí hay un factor fisiológico que actúa
sobre Mecánica de la población que no depende del cambio genético para
cambios en su especificidad de acción; a este respecto, es similar al recorrido
reacción en salmón4 y aves, "a las preferencias de apareamiento condicionado de
pájaros6 y a las reacciones de las hormigas hacia los compañeros de colonia.7

Desde el punto de vista de la genética fisiológica, el desarrollo y

funcionamiento de un organismo consiste esencialmente en un sistema integrado de
reacciones químicas controladas de alguna manera por los genes. Es enteramente
se puede suponer que estos genes, que a su vez son parte de la
sistema, controlar o regular reacciones específicas en el sistema ya sea por
actuando directamente como enzimas o determinando las especificidades de las enzimas ".
Dado que es probable que los componentes de dicho sistema estén interrelacionados en
formas complejas, y dado que la síntesis de las partes de los genes individuales son
presumiblemente dependiente del funcionamiento de otros genes, parecería
que debe haber órdenes de control directo del gen que van desde
relaciones simples de uno a uno con relaciones de gran complejidad. En la investigación
las reglas de los genes, el genetista fisiológico usualmente intenta
determinar las bases fisiológicas y bioquímicas de las ya conocidas
rasgos hereditarios Este enfoque, como se hizo en el estudio de la antocianina
pigmentos en plantas, 2 la fermentación de azúcares por levaduras3 y un número
de otras instancias, 4 ha establecido que muchas reacciones bioquímicas son
de hecho, controlado de maneras específicas por genes específicos. Además, las investigaciones
de este tipo tienden a apoyar la suposición de que el gen y la enzima las especificidades son del
mismo orden.5 Sin embargo, hay una serie de
limitaciones inherentes a este enfoque. Quizás el más serio de estos
es que el investigador debe, en general, limitarse a un estudio de no letal
personajes hereditarios. Tales personajes probablemente involucren más o
menos llamadas reacciones "terminales" no esenciales.5 La selección de estos
para el estudio genético fue quizás responsable de la ahora desapareciendo rápidamente
creencia de que los genes solo se preocupan por el control de lo "superficial"
caracteres. Una segunda dificultad, no sin relación con la primera, es que el
enfoque estándar para el problema implica el uso de personajes con
manifestaciones visibles. Muchos de estos personajes implican morfología
variaciones, y es probable que se basen en sistemas de bioquímica
reacciones tan complejas que hacen que el análisis sea extremadamente difícil.
Consideraciones como las que acabamos de delinear nos han llevado a investigar
el problema general del control genético de desarrollo y metabólico reacciones al
revertir el procedimiento ordinario y, en lugar de intentar para calcular las bases
químicas de los caracteres genéticos conocidos, para establecer determinar si y
cómo los genes controlan las reacciones bioquímicas conocidas. los ascomycete
Neurospora ofrece muchas ventajas para tal enfoque y es adecuado para estudios
genéticos.6 En consecuencia, nuestro programa ha sido construido alrededor de
este organismo. El procedimiento se basa en la suposición que el tratamiento con
rayos X inducirá mutaciones en los genes relacionados con el control de
reacciones químicas específicas conocidas. Si el organismo debe ser capaz de
llevar a cabo una cierta reacción química para sobrevivir en un medio dado, un
mutante incapaz de hacer esto obviamente será letal en este medio. Tal un
mutante puede mantenerse y estudiarse, sin embargo, si crecerá en un medio al
cual se ha agregado el producto esencial de la genética reacción bloqueada. El
procedimiento experimental basado en este razonamiento

puede ilustrarse mejor si se considera un ejemplo hipotético.

Normal las cepas de Neurospora crassa pueden usar sacarosa como fuente de
carbono, y Por lo tanto, son capaces de llevar a cabo el control específico y
enzimáticamente controlado
reacción implicada en la hidrólisis de este azúcar. Asumiendo esta reacción
para ser controlado genéticamente, debería ser posible inducir un gen para mutar
a una condición tal que el organismo ya no podría llevar a cabo la sacarosa
hidrólisis. Una cepa que lleve este mutante no podrá crecer en un medio que
contenga sacarosa como única fuente de carbono, pero debería poder crecer en
un medio que contenga algún otro carbono normalmente utilizable fuente. En otras
palabras, debería ser posible establecer y mantener tal cepa mutante en un medio
que contiene glucosa y detectar su incapacidad de utilizar sacarosa transfiriéndola
a un medio de sacarosa. Se pueden desarrollar procedimientos esencialmente
similares para una gran cantidad de metabolismo procesos. Por ejemplo, la
capacidad de sintetizar factores de crecimiento (vitaminas), aminoácidos y otras
sustancias esenciales se deben perder a través de mutación genética si nuestras
suposiciones son correctas. Teóricamente, cualquiera de tales la deficiencia
metabólica puede ser "pasada por alto" si la sustancia que falta puede ser
suministrado en el medio y puede pasar las paredes celulares y las membranas
protoplásmicas.

En términos de práctica experimental específica, hemos ideado un procedimiento

en el que se establecen cultivos de esporas únicas con rayos X en un llamado
"completo" medio, es decir, uno que contiene tantos de los normalmente
sintetizados constituyentes del organismo como sea posible. Posteriormente estos
son probado transfiriéndolos a un medio "mínimo", es decir, uno que requiere
organismo para llevar a cabo todas las síntesis esenciales de las cuales es capaz.
En la práctica, el medio completo está hecho de agar, sales inorgánicas, malta
extracto, extracto de levadura y glucosa. El medio mínimo contiene agar
(opcional), sales inorgánicas y biotina, y un disacárido, grasa o más fuente de
carbono compleja. Biotina, el único factor de crecimiento de tipo salvaje Las cepas
de Neurospora no pueden sintetizarse, 7 se suministra en forma de un comercial
concentrado que contiene 100 microgramos de biotina por cc.8 Cualquiera pérdida
de la capacidad de sintetizar una sustancia esencial presente en el medio y
ausente en el medio mínimo está indicado por una cepa que crece en el primero y
no crece en el segundo medio. Tales tensiones son luego probado de manera
sistemática para determinar qué sustancia o sustancias no pueden sintetizar Estas
pruebas subsiguientes incluyen intenta cultivar cepas mutantes en el medio
mínimo con (1) conocido vitaminas añadidas, (2) aminoácidos agregados o (3)
glucosa sustituida para el fuente de carbono más compleja del medio mínimo. Las
cepas de ascosporas individuales se derivan individualmente de la peritecia de N.
crassa y N. sitophila radiografiadas antes de la meiosis. Entre aproximadamente
2000 de tales cepas, se encontraron tres mutantes que crecen esencialmente
normalmente en el medio completo y escasamente en el mínimo medio con
sacarosa como fuente de carbono. Una de estas cepas (N. sitophila) demostró ser
incapaz de sintetizar la vitamina Be (piridoxina). UN segunda cepa (N. sitophila)
resultó ser incapaz de sintetizar vitamina B1 (tiamina). Pruebas adicionales
muestran que esta cepa es capaz de sintetizar la mitad pirimidina de la molécula
B1 pero no la mitad tiazol. Si tiazol solo se agrega al medio mínimo, la cepa crece
esencialmente normalmente. Se ha encontrado que una tercera cepa (N. crassa)
no puede para sintetizar ácido para-aminobenzoico. Esta cepa mutante parece ser
completamente normal cuando se cultiva en el medio mínimo al que p-
aminobenzoico ácido ha sido agregado. Solo en el caso del "pyridoxinless" cepa
tiene un análisis de la herencia del defecto metabólico inducido sido investigado
Por esta razón cuentas detalladas de la tiamina deficiente y las cepas deficientes
en ácido p-aminobenzoico serán diferidas.
Los estudios cualitativos indican claramente que el mutante piridoxidable, cultivado en un medio
que contiene un microgramo o más de vitamina sintéticaClorhidrato de BB por 25 cc. del medio, se
aproxima mucho en velocidad y
Característica de las cepas normales de crecimiento cultivadas en un medio similar con no B6. Las
concentraciones más bajas de B6 dan tasas de crecimiento intermedias. UN
investigación preliminar de la dependencia cuantitativa del crecimiento de
el mutante en vitamina B6 en el medio dio los resultados resumidos en
Tabla 1. Experimentos adicionales han dado resultados esencialmente similares
pero en un acuerdo cuantitativo aproximado con los del cuadro 1.
Está claro que el estudio adicional de los detalles de las condiciones de cultivo es
necesario antes de que la tasa de aumento de peso de este mutante se pueda usar como
ensayo preciso de vitamina B6.
Se ha encontrado que la progresión de la frontera de micelios de
Neurospora a lo largo de un tubo de cultivo de vidrio horizontal medio lleno con un agar
medio proporciona un método conveniente de investigar lo cuantitativo
efectos de los factores de crecimiento.
Tubos de aproximadamente 13 mm. diámetro interior y unos 40 cm. de longitud se utilizan.
Segmentos de unos 5 cm. en los dos extremos se giran hacia arriba en un ángulo de
aproximadamente 45 °. El medio Agar se vierte para para llenar el tubo aproximadamente a la
mitad y se le permite establecer con el segmento principal del tubo en una posición horizontal. Los
extremos girados del tubo son taponado con tapones de algodón. Las inoculaciones se realizan en
un extremo del agar superficie y la posición del frente de avance grabado en conveniente
intervalos. La frontera formada por el avance de los micelios es notable bien definido, y no hay
dificultad para determinar su posición dentro de un milímetro o menos. La progresión a lo largo de
tales tubos es estrictamente lineal con el tiempo y la velocidad es independiente de la longitud del
tubo (hasta 1,5 metros). los la velocidad no cambia al reducir el diámetro del tubo interior a 9
mm., o sellando uno o ambos extremos. Por lo tanto, parece que la difusión de gas está en no hay
forma de limitar en tales tubos. Los resultados del crecimiento de la cepa piridoxinless en tubos
horizontales en que el medio de agar contenía cantidades variables de B6 se muestran
gráficamente en las figuras 1 y 2. La tasa de progresión es claramente una función de
concentración de vitamina B6 en el medio.10 También es evidente que no hay una diferencia
significativa en la tasa entre el mutante suministrado con B6 y la cepa normal crece en un medio
sin esta vitamina. Estos resultados son consistentes con la suposición de que el fisiológico primario
diferencia entre las cepas piridoxinless y normal es la incapacidad del primero para llevar a cabo la
síntesis de vitamina B6. Ciertamente más de un paso en esta síntesis y, en consecuencia, el
diferencial genético involucrado está supuestamente preocupado con solo un paso específico en la
biosíntesis de vitamina Bo.

Con el fin de determinar la herencia del personaje piridoxinless, cruces entre

cepas normales y mutantes se hicieron. Las técnicas para la hibridación y el
aislamiento de ascosporas se han elaborado y descrito por Dodge, y por
Lindegren.6 Las ascosporas de 24 ascos de la cruz fue aislada y sus posiciones
en las asci registradas. Para algunos razón desconocida, la mayoría de estos no
pudieron germinar. De siete asci, sin embargo, una o más esporas germinaron.
Estos se cultivaron en un medio conteniendo glucosa, extracto de malta y extracto
de levadura, y en esto todos creció normalmente Las culturas normales y
mutantes fueron diferenciadas por cultivándolos en un medio deficiente B6. En
este medio, el mutante las culturas crecieron muy poco, mientras que las no
mutantes crecieron normalmente. los los resultados se resumen en la tabla 2. Está
claro de estos bastante limitados datos de que esta incapacidad para sintetizar
vitaminas B6 se transmite como debería ser si fue diferenciado de lo normal por un
solo gen.
Los resultados preliminares resumidos anteriormente nos parecen indicar que
el enfoque esbozado puede ofrecer una promesa considerable como método de
aprender más sobre cómo los genes regulan el desarrollo y la función. por
ejemplo, debería ser posible, encontrando una cantidad de mutantes incapaces de
llevar a cabo un paso particular en una síntesis dada, para determinar si solo
un gen generalmente se ocupa de la regulación inmediata de un determinado
reacción química específica.
Es evidente, desde el punto de vista de la bioquímica y la fisiología, que
el método esbozado es de valor como una técnica para descubrir
sustancias de importancia fisiológica. Desde el medio completo
utilizado se puede preparar con extracto de levadura o con un extracto de extracto
Neurospora, es evidente que si, a través de la mutación, se pierde la capacidad
para sintetizar una sustancia esencial, se pone a disposición una cepa de prueba
para usar al aislar la sustancia. Puede, por supuesto, ser una sustancia no
previamente se sabía que era esencial para el crecimiento de cualquier
organismo. Así
podemos esperar descubrir nuevas vitaminas, y de la misma manera, debería
ser posible descubrir aminoácidos esenciales adicionales, si es que existen.
Nosotros
de hecho, han encontrado una cepa mutante que puede crecer en un medio
contiene extracto de levadura Difco pero no puede crecer en ninguno de los
medios que hemos probado hasta ahora. Evidentemente algún factor de
crecimiento presente en
La levadura y hasta ahora desconocida para nosotros es esencial para
Neurospora.

Resumen. Se describe un procedimiento mediante el cual, usando Neurospora,

uno puede descubrir y mantener cepas mutantes inducidas por rayos X que se
caracterizan por su incapacidad para llevar a cabo procesos bioquímicos
específicos. Siguiendo este método, se han establecido tres cepas mutantes. En
uno de estos la capacidad de sintetizar vitamina B6 ha sido total o perdió. En un
segundo la capacidad de sintetizar la mitad de tiazol de la vitamina La molécula B1
está ausente, y en el tercer ácido para-aminobenzoico no está sintetizado Por lo
tanto, está claro que todas estas sustancias son esenciales
factores de crecimiento para Neurospora-11
Crecimiento del mutante sin piridoxina (un mutante incapaz de sintetizar
vitamina B6) es una función del contenido de B6 del medio en el que se encuentra
crecido. Se describe un método para medir el crecimiento siguiendo
progresión lineal de los micelios a lo largo de un tubo horizontal medio lleno con
un
medio de agar.
La incapacidad de sintetizar la vitamina B6 aparentemente se diferencia por un
solo
gen de la capacidad del organismo para elaborar este crecimiento esencial
sustancia.