UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL

40191
LABORATORIO No. 1
Determinación de Bacterias Coliformes y Escherichia coli en frutas y verduras

Introducción
Los microorganismos presentes en la superficie de frutas y verduras comprenden tanto la flora propia
como la que proviene de suelo, aire, agua y animales. Dentro de esta flora pueden existir
microorganismos patógenos provenientes del agua de riego, del estiércol o de los manipuladores, como
por ejemplo, las enterobacterias Escherichia coli O157:H7 y Salmonella. Al consumirse sin ningún tipo de
cocción, las frutas y verduras constituyen un riesgo de producir infección o intoxicación alimentaria.
Las enterobacterias son bacilos gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, que fermentan la
lactosa produciendo ácido y gas a temperaturas entre 30 y 37°C. Se encuentran en el intestino del
hombre y de animales, como también, en otros ambientes.
Los coliformes totales incluyen los géneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella. Dentro de
este grupo, los coliformes fecales son los de mayor importancia en alimentos. Estos se desarrollan a
temperaturas entre 43.5- 45.5°C y son capaces de crecer en presencia de sales biliares.
Generalmente, los coliformes fecales son considerados indicadores de contaminación fecal y pobre
calidad higiénica y sanitaria en la manipulación de alimentos. Se considera a los coliformes fecales como
presuntos de Escherichia coli.

Objetivos
 Determinar el número de bacterias coliformes y la presencia de Escherichia coli en muestras de
frutas y verduras.
 Analizar si las muestras cumplen con el criterio microbiológico establecido por ley.

Materiales
 Cajas petri  Agua peptona 0.1%
 Pipetas graduadas 1ml y 10ml  Agar Bilis Rojo Violeta
 Pipeteadores  Muestras de frutas y verduras
 Tubos de ensayo  Balanza
 Erlenmeyer  Licuadora

Procedimiento

 Marque todas las botellas y tubos de dilución y cajas petri con el factor de dilución,
identificación de grupo, tipo de muestra y fecha.
1. Pesar 10g de la muestra y añadirlo a 90 ml de agua peptonada estéril 0,1% (diluyente).
Homogenizar por 2 minutos en licuadora. Esta dilución corresponde a 10-1.
2. Transferir 1 ml de la dilución 10-1 a un tubo que contiene 9 ml del diluyente. Esta dilución
corresponde a 10-2. Mezclar 25 veces por inversión por aprox. 7 segundos en un arco de 30 cm
(en caso de tubos tapa rosca) o mezclar con otra pipeta. Seguir diluyendo como en este paso
hasta alcanzar una dilución de 10-4. (Con la pipeta que se mezcla se puede preparar la siguiente
dilución).
3. Inocular 1 ml de cada dilución en una caja petri previamente marcada con la dilución
correspondiente (hasta 10-4).

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 4. Verter 12-15 ml de agar Bilis Rojo Violeta (debe estar a una temperatura de 44C a 46C) en
cada caja petri. Mezclar haciendo movimientos circulares con el plato a favor y en contra de las
manecillas del reloj 5 veces, teniendo cuidado de no formar burbujas y no ensuciar la tapa.
5. Dejar que el agar solidifique e incubar las cajas petri invertidas a 32C por 24  2 horas.
6. Contar las colonias rojo purpuras rodeadas de una zona de precipitación de sales biliares color
violeta en aquellos platos que contengan entre 30 y 150 colonias aisladas y reportar como UFC/g
o ml (Unidades Formadoras de Colonias/gramo o mililitro) de enterobacterias lactosa positiva
de acuerdo a las reglas del recuento de colonias. (Las colonias contadas deben irse marcando
para evitar contarlas otra vez).
7. El número de recuento de colonias multiplicado por el factor de dilución de la placa da como
resultado el recuento de bacterias totales por mililitros de muestra.

10 g o mL 1 mL 1 mL 1 mL

Muestra
10-1 10-2 10-3 10-4

90 ml agua 9 ml 9 ml 9 ml
peptonada diluyente diluyente diluyente
0.1%

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10-1 10-2 10-3 10-4

Figura 1. Procedimiento de diluciones seriadas

Prueba de confirmación de Escherichia coli

Las colonias típicas de enterobacterias se subcultivan en caldo lactosado verde brillante con campana
Durham para detectar la presencia de gas.
1. Inocular colonias típicas con un asa bacteriológica previamente esterilizada en el tubo con caldo
lactosado verde brillante.
2. Incubar los tubos a 44.5°± 1°C por 24 y 48 horas.
La temperatura es selectiva para Escherichia coli. Se presume que todo tubo que presente gas después
de la incubación contiene Escherichia coli.

Preguntas de investigación

1. ¿Cuál es la utilidad de la determinación de coliformes y Escherichia coli en alimentos?

2. ¿Cuál fue el recuento de coliformes y E. coli en la muestra bajo estudio? Compare su resultado
con el criterio microbiológico establecido por ley para la muestra y establezca un análisis de la
calidad sanitaria e inocuidad del alimento.
3. ¿Qué otras pruebas de confirmación son utilizadas para la investigación de Escherichia coli en
alimentos?
4. De acuerdo a la composición del medio agar bilis rojo violeta, ¿se considera un medio selectivo o
diferencial? ¿Cuáles son los componentes presentes y que funciones tiene cada uno?
5. Explique la diferencia entre infección alimentaria e intoxicación alimentaria.

2
FECHA LABORATORIO NO.
CÓDIGO CURSO-GRUPO GRUPO INTERNO TRABAJO
PRÁCTICA
MUESTRA MICROORGANISMO
INTEGRANTES
1.
2.
3.
4.

RESULTADOS

1. Describa la morfología de las colonias aisladas.

_________________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________________

2. Cuente las colonias en cada uno de las diluciones y reporte.

Dilución No. colonias

3. Realice el cálculo para el recuento total del microorganismo en el alimento.

4. Reporte el número de UFC/g o ml del microorganismo.

Recuento total de microorganismo: ____________________________________________________