Disertación Spin:

CONTENIDO DE TIOL EN CERVEZAS: ESTUDIO CINETICO DEL RADICAL 1

HIDROXIETIL

DIAPO 2

INTRODUCCIÓN:

La cerveza es la bebida alcohólica más consumida en el mundo y es conocida por

ser sensible a los cambios de calidad durante el almacenamiento, especialmente con
respecto a su aroma y sabor.

Oxidación no enzimática es una de las principales causas del desarrollo de sabores

desagradables durante el envejecimiento. Por lo tanto, los cambios químicos durante
el almacenamiento deben ser controlados para asegurar la calidad sensorial del
producto y evitar el rechazo de los consumidores que pondrá en peligro el valor
económico del producto.

Diapo 3

Fabricacion de la cerveza:

1. Germinación de la semilla

2. Secado y tostado:eliminar toda el agua de la semilla

3. Molienda:facilita el acceso de las enzimas a las reservas de glúcidos

4. Maceración:Proceso en el cual las enzimas promovidas por la Tº y el PH del

agua hidrolizan el almidón de los granos

5. Fermentación:Proceso en el cual la levadura convierte los glúcidos primarios

en etanol y dióxido de carbono

6. Filtración
Diapo 4 mostrar esquema

Diapo 5 SULFITO PRESENTE EN LA CERVEZA

• Es un conservante.

• Evitar que se oxiden,para mantener el color original de los alimentos y para

que no acaben estropeándolos colonizados por mohos, levaduras o bacterias.

En la cerveza aparecen de forma natural ,esto ocurre en alimentos que han sufrido
un proceso de fermentación, como el vino, la cerveza, la sidra o incluso el
pan. Durante este proceso, como las levaduras quieren quedarse todo el azúcar para
ellas producen sulfitos y así detienen el crecimiento de sus competidores.

Diapo 6

El radical 1-hidroxietil ha sido reconocido como el radical intermediario clave en las

reacciones oxidativas en la cerveza.

El radical 1-hidroxietilo tiene un potencial de reducción moderado E=0,98 V vs NHE

¿?. Se han informado reacciones oxidativas de iso-alfa-ácidos del lúpulo en
presencia del radical 1-hidroxietil, que contribuyen a la pérdida de la calidad del sabor
de la cerveza.

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Entre los compuestos de la cerveza que potencialmente puede inhibir las reacciones
oxidativas son los que tienen tiol (RSH) los cuales han recibido una atención
creciente en los últimos años-.

Los grupos tiol los podemos encontrar en aminoácidos, péptidos y en la proteína de

la cerveza (LTP1).

DIAPO 8

Materiales y métodos: PPT

Resultados y discusión:
DIAPO 9

Estudios cinéticos competitivos:

se midió la reactividad del tiol hacia el radical 1-hidroxietilo con espectroscopia de

resonancia paramagnética electrónica.

El espectro EPR de spin aducto 1-hidroxietil/4-POBN, es caracterizado por un triplete

de dobletes, una constante hiperfina de acoplamiento para el nitrógeno AN: 15.6 G
y una constante hiperfina de acoplamiento para el hidrógeno AH: 2.6 G

Grafico 1

Se puede apreciar que a distintas concentraciones de la proteina de cerveza,

el espectro va disminuyendo su intensidad esto se debe a que en a hay uan
menor concentracion y en c una mayor debido a esto el atrapamiento
disminuye, ya que al tener mas proteina tenemos mas tiol

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𝐹
De la expresión (𝐹−1) 𝑘2 𝑥 [4 − 𝑃𝑂𝐵𝑁]

F: porcentaje de inhibición de la formación del spin aducto

Grafico 2

Se espera que la correlación sea lineal a medida que la concentración del tiol es
añadida a la reacción. k2 tiene el valor de 3,1 × 107 L mol-1 s-1

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Tabla 1

Los aminoácidos que no contienen azufre oxidable como la histidina, serina y

triptófano presentan reactividad moderada con constantes de velocidad de segundo
orden como vemos en la tabla.
Ahora bien, los compuestos con tiol oxidados, tales como la cistina y el glutatión
oxidado (GSSG)(2 glutation unidos con S-S) y los compuestos con un grupo tiol
bloqueado, S-metil-L-cisteína y metionina, no muestran ningún tipo de reactividad
hacia el radical 1-hidroxietilo. Esto demuestra que el grupos tiol libres son los sitios
reactivos hacia la 1-hidroxietil radicales.

La proteína LTP1 de cerveza que contiene tiol no reaccionó con los radicales 1-
hidroxietilo, lo que sugiere que los grupos tiol en la cadena lateral de la proteína
están oxidados para formar enlaces Disulfuro (R-S-S-R), como es el caso en LTP1
nativa a partir de cebada.

La Proteína de la cerveza fue aislada y se sometió a una reducción selectiva de los

cuatro enlaces de disulfuro mediante la adición de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina).
La proteína reducida, se espera que tenga grupos tiol disponible, ha demostrado ser
reactivo frente a radical 1-hidroxietilo con una k2 constante de velocidad de segundo
orden = 6,1 ×109 L mol-1 s-1.

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El efecto cinético isotópico para la reducción del radical 1-hidroxietil por tioles se
investigó el uso de cisteína y glutatión como las sustancias que contienen tiol en
medio deuterado (D2O/CH3CH2OD)

Se observó una clara disminución en la actividad para la reducción del radical 1-

hidroxietilo en medios deuterado, resultando en constantes de velocidad de segundo
orden inferiores.

Diapo 13

La relación EIC (efecto isotópico cinético) :kH / kD de 2.2 y 2.3 por cisteína y glutatión,
respectivamente. Las magnitudes alrededor de 2 sugieren un efecto isotópico
cinético primario, que está de acuerdo con un mecanismo en el que la etapa
determinante de la velocidad de la reducción del radical por tioles es la extracción
del átomo de hidrógeno del grupo RSH(tiol) en lugar de una de transferencia de
electrones.
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Oxidación productos del glutatión

Para identificar el producto mayor de oxidación de la reacción del compuesto que

contiene tiol con el radical 1-hidroxietilo, la reacción que contiene glutatión y el radical
es analizado por espectrometría de masa exacta.(espectro).

Diapo xx

El espectro ESI-MS reveló la presencia de dos compuestos principales con iones

cuasi molecular [M - H] - en m / z 306.0769 y 611.1454 correspondiente a glutatión
(calculado para [C10H17O6N3S - H] - = 306,0759) y glutatión oxidado (calculada
para [C20H32O12N6S2 - H] - =611.1441).

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El mecanismo sugerido anteriormente en la literatura, la reacción es iniciada porla

transferencia de un átomo de hidrógeno del grupo tiol (RSH) al radical 1-hidroxietil,
dando lugar a la formación de un radical tiilo (RS•), que produce el compuesto
disulfuro respectivo (RSSR) (Esquema 1).

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Cuantificación total de tiol y del tiol reducido en cerveza

La cuantificación del nivel de tioles reducidos en diferentes cervezas se llevó a cabo

mediante el empleo del reactivo de derivatización ThioGlo-1, un aducto fluorescente

La cuantificación del nivel total de tioles en la cerveza se logró mediante la reducción

previa de los enlaces disulfuro en la cerveza por la adición de TCEP como reductor
y siguiendo ThioGlo-1 derivatización y posterior análisis de HPLC.

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Los dos primeros picos (A y B) son asignado a los derivados de sulfito (Esquema 2a,
b), mientras que el pico C corresponde a un subproducto formado por la presencia
de TCEP en exceso. Pico D que eluye a 18,4 min se refiere al tiol en la cerveza.

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Las concentraciones totales de compuestos de tiol reducidos en diferentes cervezas

fueron estudiadas después de la reducción con diversas cantidades de TCEP
(Figura 6)

Se observaron correlaciones casi lineales para el nivel total de tiol como una función
de TCEP añadido. En todas las cervezas se alcanzó un nivel máximo de tioles,
indicando que todos los enlaces disulfuro fueron reducidos a tioles. Se encontró que
las concentraciones necesarias de TCEP para promover la reducción de la máxima
cantidad de compuestos de disulfuro fueron diferentes para cada cerveza, pero
parecía ser proporcional a la cantidad inicial de compuestos de tiol en la cerveza.
Curiosamente, una disminución en el contenido de tiol total se observó mediante la
adición de TCEP en gran exceso.

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Experimentos adicionales se llevaron a cabo mediante la adición de TCEP a

muestras de cerveza comerciales y se evaluó el efecto sobre la estabilidad oxidativa
de la cerveza. Se sondeó la fase de latencia para la formación del spín aducto 1-
hidroxietilo / 4-POBN en la cerveza con adición de POBN y sometido a un estrés
oxidativo térmico. Como muestra en la Figura 8, el aumento de la concentración de
TCEP se añadió a una muestra de cerveza comercial redujo claramente la fase de
latencia para la formación de radicales bajo condiciones de envejecimiento acelerado
(60,0 ± 0,2°C).

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Conclusiones:
El principal efecto cinético isotópico observado sugiere que la reducción del radical
1-hidroxietil se rige por un mecanismo de extracción de hidrógeno, produciendo
radicales tiilo que produce el compuesto disulfuro respectivo.

La concentración de tiol que contiene las proteínas se correlaciona con la estabilidad

oxidativa del producto, lo que sugiere que la inducción de un mayor contenido
proteico en la cerveza puede resultar en un producto con una mayor estabilidad a la
oxidación.

http://repositorio.uchile.cl/bitstream/handle/2250/112050/barriga_ge.pdf?sequence=
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