alcalino, generalmente esta carga es negativa, con lo que medio cargado se mueve hacia el ánodo,

y para contrarrestar esto las moléculas de agua cargadas positivamente (H30+) se mueven hacia el
cátodo. Este movimiento de agua no afecta a la capacidad de fraccionamiento (Wieme, 1965),
aunque pueden producirse pérdidas de agua en los reservorios, alterando la homogeneidad del
campo eléctrico.

En general, las soluciones con fuerza iónica alta provocan la disminución de la movilidad
comparadas con las de la fuerza iónica baja, aunque las primeras dan bandas o zonas más
discretas. El pH tiene un efecto dramático en la movilidad de los enzimas en un campo eléctrico.
Las proteínas so zwitterionicas y por lo tanto existen tres formas iónicas, dependientes del punto
isoeléctrico (pI) de la proteína y del pH de la solución. Una proteína a un pH igual al pI deberá ser
eléctricamente neutra (NH3+RCOO-) y no migrara en un campo eléctrico. Si el medio es acido
respecto a su pI la proteína estará cargada positivamente (NH3+RCOO-) y si es básico estará
cargado negativamente (NH2RCOO-).

El número de técnicas electroforéticas disponibles para trabajar a gran escala es bajo, y en la

mayoría de los casos se evita por el coste del equipo o del tiempo implicado en el fraccionamiento,
ya que solo excepcionalmente pueden mejorar la purificación conseguida con otros métodos
alternativos. Entre las técnicas preparativas disponibles solo una o dos constituyen métodos
auténticamente a gran escala.

Existen varias técnicas electroforéticas preparativas, algunas ya mencionadas. Utilizando varias

tecinas electroforéticas preparativas, algunas ya mencionadas. Utilizando electroforesis en
columna en gel de poliacrilamida se pueden fraccionar más de 10 g de proteínas (Shaw, 1969),
mientras que la electroforesis en cortina continua permite la aplicación de 15 – 20 mg de proteína
por hora. La electroforesis de flujo forzado ha sido utilizada en la purificación y concentración de
varias vacunas veterinarias de origen bacteriano (Wiene, 1965), con una capacidad proyectada de
uno 9 litros/h aproximadamente. La electroforesis de zona continua fue iniciada ya por Grassman
Hannig (1949); Thompson et al. (1980) introdujeron una modificación de la técnica de
electroforesis de libre preparativa continua de Philpot (Philpot, 1973). Este aparato tiene una
velocidad de flujo de 0,5-1,5 litros/hora (50 mg/ml) por día de trabajo y la recuperación del enzima
varía entre el 80 y el 100%.

Enfoque isoeléctrico. La técnica de enfoque isoeléctrico en capas de Sephadex o de agarosa

granulada es una idea atractiva, aunque el calor generado cuando se usan capas de gel gruesas
limita la cantidad de proteínas hasta 1g, que no es suficiente para trabajar realmente a gran escala
(Frey y Radola, 1982).

Electrodecantación con multimenbranas. Aunque en la actualidad rara vez se utiliza en la práctica,

el fenómeno de la Electrodecantación fue observado hace ya años por Pauli y Valko (1929), y
posteriormente Gutfreund (1943) aplico la técnica a la separación de proteínas. Polson (1953)
desarrollo un aparto de Electrodecantación con multimenbranas que puede usarse para fraccionar
mezclas de proteínas tanto en procesos continuos como discontinuos.
El método consiste en la colocación de una proteína en una célula que tiene un cierto número de,
membranas semipermeables, ajustándose el pH de la solución hasta el punto isoeléctrico de la
proteína a purificar, y haciendo pasar la corriente a través de la solución mediante dos electrodos.
Como la proteína a purificar está en su punto isoeléctrico, permanece estacionario en el campo
eléctrico, mientras que las demás, al estar cargadas, se moverán hacia el cátodo o el ánodo,
movimiento que cesa cuando las proteínas que migran alcanzan las membranas semipermeables.
La acumulación de proteínas en la superficie de la membrana da lugar a un aumento de la
densidad, por lo que la solución se dirige hacia el fondo de la célula, para facilitar el procesos de
decantación se crea un gradiente de temperatura entre los electrodos inclinados, haciendo que la
viscosidad de la solución sea mayor en el fondo de la célula puede separarse, quedando la
proteína buscada en al célula. Después se puede añadir solución quedando la proteína buscada en
al célula. Después se puede añadir solución fresca a la célula para un nuevo llenado, y el procesos
se puede repetir para conseguir una mayor purificación, en un procesos en continuo, se colocan
una serie de células juntas que reducen la perdida de la proteína en la corriente de salida.

Mediante esta técnica se ha fraccionado la toxina del tétanos (Largier, 1956), el toxoide de la
difteria (Largier, 1957), y las seroglobulinas humanas (Polson, 1953). Mathies (1952) obtuvo
fosfatasa alcalina 3 veces más pura y Polson (1953, 1956) fracciono la tripsina y la
desoxirribonucleasa, aunque se observó en cada caso una considerable perdida de actividad
enzimática. Fleetwod y Milne (1967) obtuvieron anticuerpos y globulinas con un rendimiento del
80% y con un aumento en la purificación de 659 veces, Brummelhuis y Krijen (1970) prepararon
globulinas antilinfocitos, agente inmunosupresor, a partir de suero de caballo antilinfocitos
humanos. Winchester et al. (1971) usaron esta técnica para purificar 1-D-glucoxidasa bovina,
acetilglucosaminidasa y una proteasa bacteriana. En las dos primeras obtuvieron una purificación
de 10 veces y la proteasa obtenida resulto homogénea en electroforesis en gel de poliacrilamida.
La velocidad e paso es de 0,5-1,0 litros de enzima bruto (2% p/v) por hora, con la única limitación
del bloqueo de las membranas después de un periodo no especificado de funcionamiento
continuo.

La Electrodecantación con multimenbranas parece ser un método adecuado para la purificación

de enzimas a gran escala, aunque hasta la fecha el método ha sido relativamente poco usada. Sin
embargo, según se disponga de más información y se obtenga más experiencia, el método puede,
en el futuro, ser utilizado más habitualmente para el fraccionamiento de enzimas a gran escala.

2.4.12. Cromatoenfoque

Aunque empleado como una técnica cromatográfica, el cromatoenfoque es una forma de enfoque
isoeléctrico realizado en un lecho de resinas cambiadoras de iones especiales, llevando a cabo la
elución con soluciones anfóteras (Sluyterman y Wijdnes, 1978; Sluyterman y Elgerma, 1978;
Sluyterman, 1982).

El cromatoenfoque combina el poder de resolución del enfoque isoeléctrico con la comodidad de

la cromatografía, por lo que es muy adecuado para trabajar a gran escala, aunque todas las
aplicaciones descritas sea solo a pequeña escala. El cromatoenfoque se ha usado para el
fraccionamiento de hexoquinasas de levaduras (Koetzke y Entian, 1982) y, en presencia de urea
6M, para el fraccionamiento del cristalino del ojo bovino (Bloemendal y Groenwoud, 1981).

2.4.13. Separación en dos fases acuosas

Los sistemas en dos fases acuosas pueden formarse mezclando soluciones de polietilenglicol y
dextrano o polietilenglicol y ciertas sales, especialmente sulfato de amónico o fosfato potásico, las
proteínas y los restos celulares se reparten entre dos fases, de tal manera que la localización
exacta de una proteína en particular depende de parámetros tales como su pesos molecular, el pH
y la fuerza iónica de la mezcla y al presencia de iones polivalentes (Kula, 1979). Desgraciadamente
las condicione óptimas de reparto de cada proteína deben establecer empíricamente. Los sistemas
en dos fases pueden aplicarse para eliminar eficazmente los restos de células homogeneizados
consiguiendo al mismo tiempo un cierto grado de purificación.

En algunos casos las dos fases pueden separarse en un tanque de sedimentación, aunque se
puede conseguir una separación más rápida y eficaz mediante centrifugación, como con
frecuencia es más fácil separar líquidos de diferente densidad que sólidos líquidos,
particularmente a gran escala, esta técnica puede ser ventajosa en la preparación de enzimas a
gran escala (Kroner et al., 1978). Sin embargo, a pesar de las aparentes ventajas del reparto en
fase acuosa, rara vez utiliza, debido quizás al costo del dextrano y del polietilenglicol (no
recuperables) empelados, aunque un reciente informe sugiere que se puede empelar dextrano
bruto, con unos considerables ahorros en los costos (Kroner et al., 1982).

La separación en dos fases se ha utilizado para separar y purificar a gran escala pululan.6.glucan
hidrolasa y 1,4-α-glucan fosforilasa a partir de pasta (5 kg) de células de Klebsiella pneumoniae,
(Hustedt et al., 1978), y RNA polimerasa y glutamina sintetasa de E. coli (Takahashi y Adachi,
1982).

Acoplando un ligando al polietilenglicol se puede aumentar el coeficiente de reparto de una

proteína en favor de la fase polietilenglicol. Así, utilizando azul de Cibacrón se puede conseguir
una purificación 58 veces superior en dos etapas de fosfofructoquinasa de levadura
(Koperschalager y Johansson, 19829).

REFERENCIAS

Ackers, G. K. (1970) Adv. In Protein Chemistry 23 343-446.

Amaranth, T., Fridkin, M., & Koch, Y. (1982) Eur. J. Biochem. 127 647-650.

Anderson, T.F. (1049) Bot. Rev. 15 464-505.

Andrews, P. (1970) Meth. Biochem. Anl. 18,1-53.

Atkinson, A. (1973) Process Biochem. 8 9-13.

Atkinson, A., Bradford, P.A. & Selmes, 1.P. (1973) J. Appl. Chem. Biotechnol. 23 517-529.
Atkinson, A. (1973) Process Biochem. 8 9-13.

Atkinson, A. & Jack, G. (1973) Biochim. Biophys. Acta 308 41-52.

Atkinson, A., Phillips, B. W., Callow, D.S., Stones, W.R. & Bradford, P.A. (1972) Biochem. J. 127 63-
64.

Atkinson, A., Banks, G. T., Bruton, C. J., Comer. M. J., Jakes, R., Kamalagharon, T., Whitaker, A.R. &
Winter, G. (1979) J. Appl. Biochem. 10247-258.

Atkinson, A., McArdell, J.E., Scaween, M.D., Sherwood, R.F., Small, D.A.P., Lowe,C,R & Bruton, C.J.
(1982) In affinity Chromatography and related Techniques. Pp. 399-410. Ed. By T.C.J. Gribnau, J,
Visser and R.F.J. Nivard, Elsevier, Amsterdam.

Axen, R., Porath, J. & Ernbach, S. (1967) Nature 214 1302-1304.

Baydoun, H., Hoppe. J., Freist, W. & Wagner. K.G (1982) J. Biol. Chem 257 1032-1036.

Bechold, H. (1907) Kollold Z. 23 and 33.

Bergmann. L. & Hartielfd, H.S. (1988) Ultrasonies Wiler, New York.

Bernardi. G. (1971) Methods Enzymol. 22 325-339.

Bernardi. G. Guo, M.G & Gaillard. C (1972) Biochim. Biophys. Acta 278 409-420.

Bernardi. G. S., Ayres. I.S., Hearn. M. T. W. & hancock, W.S. (1982) S. Chromstogr. 219 353-359.

Bingham. A.H.A, Sharman, a.F. & Atkinson, A. (1977) FEBS Lett. 2 250-256.

Blatt. W. F., Feinberg. M.P., Hoppenberg, H.B. & Saravis, C.A. (1965) Science 150 224-225.

Bloemendal, H. & Groenwnd, G. (1981) Anal. Biochem. 117 327-329.

Boorh, B.H. & Green, D.E. (1938) Biochem. J. 32 855-861.

Boseo. G. (1956) J. Inf. Dis. 99 270-274.

Brewer. J. (1971) Process Biochem. 6 39-42.

Brewer. S J. Berckeley, R.C.W. & Melling. J. (1973) Biochem. Soc. Trans. 1 1093-1095.

Brummelhulis, H.G.J. & Krijnen, H.W. (1970) in Inter. Symp. On Anti-Lymp. Serum. Varsalles. Symp.
Series Inmmuno. Biol. Standard vol. 16 pp. 145-152 karget.

Bruton, C.J., Jakes. R. & Atkinson. A. (1975) Eur. J. Biochem 59 327-333.

Buchner., E. & Hahn. H. (1903) Die Zymasse Garun. Oldenburg. Munich.

Bucke, C. (1983) in Principles of Biotechnology pp. 151-170. (Ed. By A. Wiseman), Surrey University
Press.

Buckland, B.C., Richmond, W., Dunnill, P. & Lly, M. D. (1974) In Idustrial Aspects of Biochemistry
FEBS vol. 30. Pp. 65-79. Ed. By B. Spencer. North Holland Publishing Co., Amsterdam and London.

Burgess, R. R. (1969) J. Biol. Chem. 244 6160-6167.

Burgess, R. R., Trevers, A.A., Dunn, J.J. & Baurz, E.K.F. (1969) nature 221 43-46.

Cedar. H. & Schwarts, J.H. (1967) J. Biol. Chem. 242 3753.3755.

Charm, S.E. & Matteo. C.C. (1971) Metods Enzymol. 22 476-556.

Cohn, E.J., Strong, L.E., Hughes, W.L., Mulford, D.J., Ashworth, J.N., metin, M. & Taylor, H.L.(1946)
J. Am. Chem. SOc. 68 459-475.

Cowman, S.e. & Speck, M.L. (1969) Crybiology 5 291.299.

Curran, H.R. & Evans, F.R. (1942) J Bacteriol. 43 125-138.

Darbyshire. J. (1981) In Topics in Enzyme and fermentation Biotechnology. Vol. 5. pp. 147-186 Ed.
By A. Wiseman. Ellis Horwood.

Davidson, J.N. (1965) In the Biochemistry of the Nucleic Acids, 5th Ed. Methuen & Co. Ltd.

Davidson, R.B:, Abrham. E.P. & melling. J.(1974) Biochem. J. 143 115-127.

Davies, R.B., Abraham, E.P. & Melling, J. (1974) Biochem. J 143 115-127.

Dean, P.D:G: & Watson, D.H. (1979) J. Chromatogr. 165 301-319-

Determann, H. (1964) Agnew. Chem. 76 635-644

Dixon, M. & Webb, E.C. (1961) Adv. In protein Chem. 16 197-219.

Dixon, M. & Webb, E.C. (1979) in Enzymes, Longmans, London.

Dizdaroglu, M., Krutzsch, H.C. & Simic, M.G. (1982) Anal. Biochem. 123 192-193.

Dinovick, R., Bayan, A:P:, canales, P: & Pansy, J. (1948) J. Bacteriol. 56 125-137.

Dunnill. P. & Llly, M.D. (1972) Biotechnol, Bioeng. Symp. No. 3. p. 103.

Dunnill. P. & Llly, M.D. (1972) in Enzyme Engineering. Pp. 101-113.

Eaton, N.R. (1962) J. Bacteril. 83 1359-1360.

Edebo, L. (1969) In Fermentation Advances. Pp. 249-271. Ed. By D. Perlman, Academic Press, New
York.

Edwards, C.D. & Neller, E.C: (1964) Proc. Okla. Acad. Sce. U.S.A. 44 196-200.

Elsworth, R., Meaking, L.R.P., Pirst, S.J. & capell, G.H. (1956) J. Appl. Bact. 19 264-278.

Erel, Z., Zaidenzaig, Y. & Dhaltiel, S. (1972) Biochem. Biophys. Res. Commun. 49 383-390.

Falsold, H., Gundlach, H. G. &Turba, F. (1961) IN Chromatography, p. 406. Ed. By T. Heftman,

Reinhold, ney York.

Fleetwood, J G. & Milne, G.R. (1967) Protides og Biolg. Fluids 15 545-550.

Follows, M., Hetherington, P.J., Dunnill, P. & lly, M.D. (1971) Biotechnol. Bioeng. XIII 549-560.

Foster, P. & Watt, J.G, (1980) In Methods of Plasma Protein Fractionntion, pp. 17-31. Ed. By J.M.
Curling. Academic Press.

Fraser. D. (1951) Nature 167 33-34.

Fery, M.D. and Radola, B.J. (1982) Electrophor. 3 216

Gieser, A. (1957) Nature 179 1297-1299.

Gorill, R.H. & McNell, E.M. (1960) J, Gen. Microbiol. 22 437-442.

Cospodarnadez. D., Ge-Mung Lut & Cheng. J. (1982) J. Biot. Chem. 257 12266-12276.

Grassman, W. & Hannig. K. (1949) DPB503 399 May 24th.

Gary. G. W. & Willsinson. S.G. (1965) K. Gen. Microbiol. 39 385-399.

CAPITULO 4

PRINCIPIOS DE INMOVILIZACION DE ENZIMAS

Profesor J. E. KENNEDI, research laboratory for the chemistry of bioactive carbohydrate and
proteins, departamento of chemistry, university of Birmingham B15 2TT, inglaterra y the north
East Wales Institute, Deeside, Clwyd CH5 4 BR, wales y Dr. C. A. WHITE, Vincent Kennedy Ltd, 47
Conchar Road, Sutton Coldfield, B72 1LL, Inglaterra.

4.1 CLASIFICACION DE LOS ENZIMAS ENMOVILIZADOS

Existen diversas formas de clasificar los distintos tipos de enzimas inmovilizadoras, que
dependen en cierta medida de la definición utilizada para describirlos. El concepto de enzima
inmovilizado incluye:

a) Enzimas modificadas mediante técnicas adecuadas hasta hacerlos insolubles en agua

b) Enzimas solubles utilizados en reactores equipados con membranas de ultrafiltración
semipermeables, que permiten el paso de los productos de reacción resultantes de la
hidrolisis de substratos de peso molecular elevado, reteniendo las moléculas de enzima
dentro del reactor.
c) Enzimas cuya movilidad ha sido restringida al unirlos con macromoléculas, pero de forma
que la molécula global formada sea aun soluble en agua.

La clasificación debe basarse sobre todo en el tipo de interacción responsable de la

inmovilización y la naturaleza del soporte. La figura 4.1 muestra el sistema de clasificación
utilizado en este libro y los métodos individuales que van a ser discutidos en este capítulo
(con más detalle en la parte B)

4.2 TECNICAS DE INMOVILIZACION DE ENZIMAS (véase parte B)

En los últimos años el número de métodos disponibles para la inmovilización de enzimas
se ha incrementado drásticamente. En las siguientes secciones se van a describir los métodos
generales utilizados, en función del sistema de clasificación descrito previamente.
 Fig. 4.1. Clasificación de los métodos de inmovilización de enzimas

4.2.1. Atrapado

Este método de inmovilización se basa en la localización de una enzima dentro de la red especial
de una matriz polimérica o de una membrana, de forma que se evite la liberación de la proteína
sin impedir la penetración del substrato. Esto restringe inmediatamente la aplicación del proceso a
aquellas reacciones en las que las moléculas del producto y del substrato sean relativamente
pequeñas. Puesto que el enzima no está unido de ninguna forma al gel o la membrana, el método
puede aplicarse más generalmente que cualquier otro para el atrapado de cualquier tipo de
enzimas, células microbianas y orgánulos de diferentes tamaños y propiedades
independientemente de sus propiedades y con poca perdida de la actividad biológica. En este
método se incluye el atrapado en geles y en fibras y el microencapsulado.

4.2.1.1. Atrapado en geles

El método de atrapado en geles se basa en la localización de los enzimas dentro de los espacios
intersticiales de geles poliméricos entrecruzados insolubles en agua. La oclusión en geles de
poliacrilamida entrecruzados fue la primera técnica de atrapado empleada, y con ella Bernfeld y
Wan (1963) inmovilizaron tripsina (EC 3.4.21.1), papaína (EC 3.4.22.2), β-amilasa (EC 3.2.1.2) y D-
fructuosa biofosfato aldolasa (EC 4.1.2.13). El método usual para la formación del gel consiste en
polimerizar la acrilamida en una solución acuosa del enzima soluble, con un agente de
entrecruzamiento, por ejemplo la N,N-metilnobis (acrilamida). El gel resultante puede dispersarse
mecánicamente en partículas del tamaño deseado. La amplia distribución de tamaños de los poros
del gel da lugar inevitablemente a pérdidas del enzima atrapado incluso después de un lavado
inicial prolongado (Bernfeld y Wan, 1963), mientras que la generación de radicales libres durante
la reacción puede influir en la actividad de las moléculas de enzima atrapada. Se han utilizado
otras matrices para atrapar una gran variedad de enzimas, como puede comprobarse en la Tabla
4.1.
4.2.1.2. Atrapado en fibras

Dinelli y colaboradores (Dinelli, 1972; Dinelli et at, 1978) desarrollaron un método de

inmovilización de enzimas por atrapado dentro de las microcavidades de las fibras sintéticas, de
forma que las moléculas de enzima pudieran quedar atrapadas en fibra producidas continuamente
mediante técnicas convencionales de hilado en húmedo destinadas a las manufactura de fibras
sintéticas, utilizando aparatos muy similares a los de la industria textil.

Este método tiene varias ventajas con respecto al anterior, puesto que utilizando fibras muy finas
se puede conseguir una gran área de unión para el enzima; además, las fibras soportan los medios
ácidos y básicos débiles, las fuerzas iónicas altas y algunos solventes orgánicos y, dependiendo del
polímero usado, son resistentes a los ataques microbianos. También se puede inmovilizar más de
una enzima de forma que se obtengan sistemas mutienzimáticos, aunque la elección de dichos
enzimas está restringida a aquellos que requieran substratos con peso molecular bajo y que no se
desactiven en los disolventes de polímeros inmiscibles con el agua. El polímero usado más
comúnmente es el acetato de celulosa, debido a su bajo costo y su buena resistencia biológica y
química, en el que se han inmovilizado con éxito muchos enzimas (véase tabla 4.2)

4.2.1.3. Microencapsulado

El microencapsulado de enzimas consiste en atrapar al enzima en membranas poliméricas

semipermeables esféricas cuyos diámetros oscilan entre 1 y100u. Los enzimas inmovilizados de
esta forma están contenidos físicamente dentro de la membrana y las moléculas de producto y
sustrato deben difundir a través de ella libremente siempre que sus tamaños sean los
suficientemente pequeños para que esto sea factible.

Aunque el encapsulado de tintes, drogas y otros compuestos químicos era ya conocido desde
hac9ia algún tiempo, no se empleó como método de inmovilización de enzimas hasta comienzos
de los años 60 (Chang, 1964). A partir de entonces se han inmovilizado por encapsulado un gran
número de enzimas (véase Tabla 4.3) usando distintos materiales y métodos de preparación de
las microcapsulas (véase Parte B)

Además de las principales desventajas de este método comentadas ya, existen otras como son la
ocasional inactivación del enzima durante la operación de microencapsulado, la alta concentración
de enzima requerida y la posibilidad de incorporación de enzima dentro de las paredes de la
membrana y la subsecuente liberación posterior cuando se usan algunos de los métodos de
microencapsulado existentes. Las principales ventajas son la existencia de una gran superficie de
contacto entre el enzima y el substrato para un volumen relativamente pequeño y la posibilidad
real de inmovilizar simultáneamente muchos enzimas en una sola etapa.
 Tabla 4.1. Ejemplos de enzimas atrapados en geles

Material Enzimas Referencias

Poliacrilamida
Acrilamida/Glicidilmetacrilato
Etilenglicol/2-hidroxi etilmetacrilato
2-Hidroxietilmetacrilato
α-Carragenano
Acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7.) Ngo & Luidier (1978)
Quimiotripcina (EC 3.4.21.1.) Martinek et al. (1977 & 1980), Kuan et al. (1980).
Halwachs et al (1978)
Asparraginasa (EC 3.5.1.1.) Mori et al. (1976)
D-Glucosa Deshidrogenasa (EC 1.1.1.47.) Chen et al. (1979)
Alcohol Deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) Chen et al. (1979)
βD-Galactosidasa (EC 3.2.1.23) Danielson et al. (1979)
Fenol-2-Monooxigenasa (EC 1.14.13.7.) Kjellén & Neujahr (1979 & 1980)
Ureasa (EC 3.5.1.5.) Sada et al. (1980)
β-D-Fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26.) Adachi et al. (1980)
Penicilin Amidasa (EC 3.5.1.11) Szewezuk et al. (1979)
Calactasa (EC 1.11.1.6.) Buchholz & Coldelmann (1978)
D-Gluco oxidasa(EC 3.2.1.3.) Buchholz & Coldelmann (1978) Sada et al. (1981)
Glucosaamilasa (EC 3.2.1.3.) Moriyama et at. (1980)
AMP-diaminasa (EC 3.5.4.6.) Karube et al. (1977)
β-D-Fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26.) Fukui et al. (1978)
D-Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5.) Fukui et al. (1978)
α-Amilasa (EC 3.2.1.1.) Kumakura et at. (1977), Kaestsu et al. (1979)
Glucosamilasa (EC 3.2.1.3.) Kaetsu et al. (1979)
Celulasa (EC 3.2.1.4.) Kaetsu et al. (1979)
α-D-Glucosidasa (EC 3.2.1.20.) Kaetsu et al. (1979)
D-Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4.) Kaetsu et al. (1979)
Fumarato hidratasa (EC 4.2.1.2.) Tosa et al. (1979)
Aspartato amonioliasa (EC 4.3.1.1.) Tosa et al. (1979)
Amiloacilasa (EC 3.5.1.14) Tosa et al. (1979)
 Tabla 4.2. Ejemplos de enzimas atrapados en fibras

Material Enzimas Referencias

Acetato de celulosa
Alcohol pilovinilico y celulosa
Amiloacilasa (EC 3.5.1.14.) Bartoli et at. (1978)
Fumarato hidratasa (EC 1.2.1.2.) Marconi et at. (1975)
Glucoamilasa (EC 3.2.1.3.) Corno et at. (1972)
D-Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5.) Giovenco et at. (1973)
Dihidropirimidasa (EC 3.5.2.2.) Snamprogetti (1976)
β-D-Fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26.) Marconi et at. (1974)
Triptofano sintetasa Morisi et at. (1973)
Penicilín amidasa (EC 3.5.1.11.) Marconi et at. (1973)
β-D-Galactosidasa (EC 3.2.1.23.) Marconi et at. (1974b), Zaffaroni et at. (1975)
Dipeptidil peptidasa (EC 3.4.14.1/2) Pardin et at. (1977)
Ureasa (EC 3.5.1.5) Kitano et at. (1980)
Urato oxidasa (EC 1.7.3.3) Kitano et at. (1980)

Tabla 4.3. Ejemplos de enzimas microencapsulados

Material Enzimas Referencias

Métodos de separación de fase
Nitrocelulosa β-D-Galactosidasa (EC 3.2.1.23.)
Asparraginasa (EC 3.5.1.1)
Colodión Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.9.1)
Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)
Catalsa (EC 1.11.1.6)
Piruvato quinasa (EC 2.7.1.40)
Hexoquinasa (EC 2.7.1.40)
β-D-Galactosidasa (EC 3.2.1.23.)
Ureasa (EC 3.5.1.5)
Métodos de polimerización interfacial
Nylon β-D-Galactosidasa (EC 3.2.1.23.)
Asparraginasa (EC 3.5.1.1)
Wadiak & Carbonell (1975)
Chang (1973)
Campbell & chang (1976)
Campbell & chang (1976)
Mogensen & Vieth (1973)
Campbell & chang (1975)
Campbell & chang (1975)
Paine & Carbonell (1975)
Mogensen & Vieth (1973)
Ostergaard & Martiny (1973)
Mori et al. (1973)
 Poliurea Asparraginasa (EC 3.5.1.1)
Métodos de membrana liquida
Glucoamilasa (EC 3.2.1.3.)
Nitrato reductasa (EC 1.7.99.4)
Métodos de secado liquido
Etil-celulosa Triacilglicerol lipasa (EC 3.2.1.3)
Catalasa (EC 1.11.1.6)
Poliestireno Triacilglicerol lipasa (EC 3.2.1.3)
Ureasa (EC 3.5.1.5)
Mori et al. (1973)
Gregoriadis et al. (1971)
Mohan & Li (1974)
Kitajema et al. (1969)
Kitajema et al. (1969)
Kitajema et al. (1969)
Kitajema et al. (1969)
4.2.2. Unión a un soporte

4.2.1. Atrapado

La unión de una enzima a un soporte insoluble es el método más antiguo (Nelson y Griffin, 1916) y
común de inmovilización de enzimas. Aunque este es el método que le viene directamente a uno a
la mente cuando se considera la inmovilización de enzimas, y sea probablemente el más
investigado, no debemos olvidar que descubierto a comienzos de este siglo. Además, como sucede
con mucha frecuencia, “la naturaleza lo había hecho primero”, pudiendo decirse que en el cuerpo
humano la mayor parte de sus moléculas biológicamente activas se encuentran en algún momento
en forma inmovilizada.

La inmovilización artificial de enzimas se puede subclasificar, en función del modo de unión físico
del enzima, en inmovilización por adsorción física, iónica, quelación o unión metálica y covalente,
en cualquiera de estos métodos la selección del soporte insoluble, así como el método de unión
tiene una importancia máxima. El soporte ideal para una aplicación dada es aquel que aumente la
interacción con el substrato, disminuya la inhibición por el producto, cambie el pH aparente
optimo hasta el valor deseado, frene el crecimiento microbiano y sea fácilmente recuperable para
poder volver a utilizarlo. En el caso de que se emplee en un reactor, el soporte deberá ser estable
en solución y no deteriorarse en las condiciones de reacción; además, cuando se emplea en
reactores de lecho fijo, deberá ser rígido mecánicamente y tener un grado de compactación bajo
en operaciones continuas a velocidades de flujo altas. Cuando el enzima inmovilizado se utilice en
aplicaciones médicas, el soporte no deberá provocar respuestas inmunes o reacciones de
coagulación. Messing (1975) indica un método de selección de soportes apropiados para usos
industriales considerando todas estas propiedades.

Entre los muchos soportes orgánicos e inorgánicos, naturales o sintéticos, que se han sugerido
para la inmovilización de enzimas, parece como apropiados para usos médicos la silicona o el
metacrilato, mientras que para las aplicaciones industriales son preferibles los soportes
inorgánicos. El mayor interés de los soportes inorgánicos proviene de la facilidad de unión con los
enzimas, aunque en muchas aplicaciones está limitado su uso debido a su baja estabilidad
dimensional y, en al mayoría de los casos, a su incapacidad para permitir la regeneración del
catalizador mediante métodos simples, cuando se usan técnicas de adsorción física o de enlaces
iónicos se pueden utilizar soportes orgánicos, por ejemplo en la producción industrial de L-
aminoácidos mediante aminoacilasa (EC 3.5.1.14) inmovilizada en DEAE-Sephadex® (Tossa et al.,
1966). Sin embargo, en algunos casos especiales se han utilizado enlaces covalentes reversibles
para permitir la unión covalente reversible del enzima y por lo tanto su posterior regeneración,
por ejemplo mediante puente disulfuro (Kennedy y Zamir, 1975).

Como ya se ha indicado, los soportes se pueden clasificar en inorgánicos y orgánicos, que a su vez
se pueden subdividir en polímeros naturales y sintéticos (la Tabla 4.4. muestra una lista de algunos
de los soportes más empleados), aunque esta clasificación no da una descripción completa del
soporte, ya que en ella no se han tenido en cuente parámetros como la superficie y el diámetro
del poro, que influyen en la unión del enzima, por lo que, teniendo en cuenta su morfología, se
pueden clasificar también en soportes poroso y no porosos.

Tabla 4.4. Ejemplos de soportes insolubles

Clasificación Soportes
Soportes orgánicos naturales Carbón activada
Agar
Agarosa
Albumina
Celulosa
Quitina
Quitosano
Colágeno
Dextrano
Piel
Almidón
Soportes orgánicos sintéticos Polímeros basados en acrilamida
Copolímeros basados en ác. acrílico/metacrilico
Copolímeros del anhídrido maleico
Nylon
Poliestireno
Alcohol polivinílico
Soportes inorgánicos Alúmina
Bentonita
Fosfato de calcio
Celita
Oxohidróxidos de metales
Hidroxilapatito
Caolinita
Magnetita
Pumita
Arena
Gel de sílice
Titanio
Zirconio