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农 业 生 物 技 术 学 报　 Ｊ
ｏｕｒ
ｎａｌ
　ｏｆ
　Ａｇｒ
ｉｃｕ
ｌｔｕ
ｒａｌ
　Ｂ［
ｏｔｅ
ｃｈｎ
ｏｌｏ
ｇｙ　

３；；
一　
新城疫北京 强毒株融合糖 蛋 白（ Ｆ）
基 因的　
克 隆及 序 列 分 析　

墅 　
（
中 国农业大学生物学 院生物化学与生物分子学 系 ，
北京 １
０００
９４）
　

摘 要：
　 ＮＤＶ 北 京强 毒株 Ｆ４８
Ｅ９经 ＳＰＦ鸡 胚增 殖 。
超逮 离心纯 化 ，
异硫氰 酸胍 法提 取病毒 ＲＮＡ　
后，
用 ＲＴ—
ＰＣＲ扩增 。
得 到其融合糖蛋 白（
Ｆ）基因　 将扩增 产物与　 ＥＭ＠ Ｔ载体相连接 转化 。
经过 Ａｍｐ
—　
Ｉ
ＰＴＧ—
ｘＥａ
Ｉ（ＡＩ
Ｘ）平 板筛选 、
Ｈｉｎ
ｄ　ｌ酶切及 ＰＣＲ鉴定，
初步获得 了含 Ｆ基因 的阳性克隆 。用渐近法 （
Ｐｒｉｍｅｒ
　
ｗａ
ｌｋｉ
ｎｇ）
对克隆 片段进 行全序列分析 ，
证 明得到了全长 １
　７４４十核 苷酸 的 ＮＤＶＦ蛋白基因 ：
所 获得 Ｆ基 因　
与 国外 已报道的 ６个 强毒 株序列进行 比较 ，
可知 Ｆ４
８Ｅ９与 其它毒株均 有一定差异 （
氪基酸 差异在 ２６
／５５３￣　
４４
／５５
３），
但较接近 于 Ａｕｓ
ｔｒａ
ｌｉ
ａ—Ｖｉ
ｃｔｏ
ｒａ毒株 （
氪基酸 差异为 ２６
／５５
３）　
关蕾词 新城疰病毒 ；融合糖蛋白 ；ＲＴ—
’— — — —
ＰＣＲ；基因克隆 ；序 列分析　
一 — — — — 一
、 — — 一 — — —
～ 　

新 城疫 病毒 （
Ｎｅｗｃａ
ｓｔｌ
ｅ　ｄｉ
ｓｅａｓ
ｅ　Ｖｉ
ｒｕｓ：
ＮＤＶ）
是 有 囊 膜的单 股 负 链 ＲＮＡ 病 毒 ，
共 有 Ｎｐ、
Ｐ、Ｍ 、Ｆ、
　
ＨＮ 和 Ｌ　６种蛋 白 ，
其 中位 于囊 膜表 面 的 ＨＮ 和 Ｆ为糖 蛋白 ，与新城 疫的 发生发 展 密切 相关 。
ＨＮ 蛋白　
具 有血 凝 素和 神经 氨酸 酶两 种 活性 ，
主要 与病 毒 的 吸 附过 程 有关　 。Ｆ蛋 白具 有融 合 功能 ，
主要 参 与　
病 毒囊 膜 与宿 主细 胞膜 的融 合 及细 胞膜 之间 的融合 ，
使病 毒侵 入宿 主 细胞 或在 细胞 问扩散　。］
。同 时 ，
　
Ｆ蛋 白还是 诱 导机体 产生 中和性 抗 体 的主 要病 毒蛋 白 ，在机体 抗感 染 免疫 中 起着 重要作 用　］
。　
１
　９８６年 Ｃｈａ
ｍｂｅ
ｒｓ［
　。和 ＭｅＧｉ
ｎｎｅｓ
［　等 人采 用 亚 克 隆 方 法 分 别 测 定 了 Ｂｅ
ａｕｄｅ
ｔｔｅ
　ｃ和 Ａｕｓ
ｔｒａ
ｌｉ
ａ—　
Ｖｉ
ｃｔｏｒ
ｉａ 毒 株 的 Ｆ 基 因 全 序 列 。 日 本 的 Ｔｏｙｏｄａ（１９８７、１９８９）
　 、美 国 的 Ｓｃ
ｈａｐｅ
ｒ（１
　９８８）
　Ｊ，Ｓ
ｅａｌ
　
（１９９５）＿
１０
　和英 国 的 Ｍｉ
ｎａｒ（１９８８）
ｌ１
　，Ｃｏｌｉ
ｎｓ（１９９６）
［ｔ２
３等 人相 继测 定 了不 同毒 株的 Ｆ基 因　 基于 Ｆ蛋　
白具 有 的 良好免疫 原 性 ，
近 年 来 国外学 者 又用 Ｆ基 因作 为 目的基 因构 建一 系列 重组 病 毒　 ］
，以期　
用于 新城疫 的免疫 防治 。
　
我 国早在 ４ｏ年代 就 分离 到 了 ＮＤＶ 中国毒 株 ，
并 对其 生 物学 特性 进行 了大 量研究 。但 有关 其分　
子 生物 学方 面 的研 究报 道 较 少 ，尤其是 对 Ｆ基 因的全 序列 分析 尚未 见到 报道　 本研 究 采用 ＲＴ—
ＰＣＲ　
方 法获 得 了 ＮＤＶ北 京 强 毒株 的 Ｆ基 因 ，
并对 其进 行 了克 隆及 全 序列 分 析 ，为进 一 步研 究 ＮＤＶ 的致　
病 机理 ，
毒株 间差 异 的分子 基础 提 供依据 。
　
Ｉ 材 料和 方 法　
Ｉ．Ｉ 毒株 ＮＤＶ北 京 强毒 株 毒号 ＡＶ１
　６１１代次 Ｆ４８Ｅ９，由中国兽 医药 品检 察所提 供 。本研 究 进行　
序 列 比较时 ，
参 比了以 下 ６个 ＮＤＶ 强 毒株 的 Ｆ基 囡序 列 ，
分 别 为 Ｂｅ
ａｕｄｅ
ｔｔｅＣ／４５（
ＢＥＡ／４５）
口一，
Ｔｅｘａｓ
　
Ｇ．Ｂ／４８（
ＴＥＸ／４８）
［　，
Ａｕｓｔ
ｒａｌ
ｉａ—
Ｖｉｃ
ｔｏｒ
ｉａ／３２（
ＡＵＳ／３２）［
　，Ｍｉ
ｙａｄｅ
ｒｕ／５１（ＭＩ
Ｙ／５１）：
　，Ｈｅ
ｒｔｓ
／３３ （
ＨＥＲ／
　
３３）［
　，ｈａ
ｌｉｅｎ／４５（Ｉ
ＴＡ／４５）
［　。
　
Ｉ，２ 载体 及 毒拣 ｐＧＥＭ￣－
Ｔ 载体 购 自 ｐｒ
ｏｍｅ
ｇａ公 司，
ｐＵＣ１８载体 及 ＤＨ５２菌 株 由本 实验 室提 供 。
　
１．３
　 ＳＰＦ种 蛋 购 自中国兽 医药 品检 察所 ，
本 实验 室 自行孵 育 。
　
Ｉ．４
　 酶及 试 剂　 Ｍ—
ＭＬＶ 反 转录 酶 购 自 ＧＩ
ＢＣＯ 公 司 ，
Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ　Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ　２．０
　ＤＮＡ　
Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ　
Ｋｉｔ购　
自 ＵＳＢ，
Ｔａｑ
　ＤＮＡ 聚合 酶 由中国 农业 大学农 业生 物技 术 国家 重点 实验 室提供 。
　

龙 飞 ：男 ．
１９６９—
０１生 ，
主 要 从 事 薛扁 病 毒 分 子 生 物 学 方 面 的研 究　
＊ 眭 系 凡　
收 稿 日期 ：
ｉ９９
８　０２
　２７
　
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农 业 生 物 技 术 学 撤　

１．５ ；Ｊ物设 计 据文献［

８］报道 资料 ．用 ＯＬＩ
Ｇ０５
．０软 件设 计 ５个 引物 ，
其 序列 、
位置 和 用途 如下　
弓｝
物名张 序 列　 位 置　 作 用　
Ｐｌ
　 ５’ＧＣＡＡＧＣＴＴ　
ＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＴＧＧ ３’（一 ）
　 １～ ２１
　 ＲＴ　ＰＣＲ　

Ｐ２
　 ５’
ＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＡＴ３’（一 ）
　 １
　７２８～ １７４４
　ＲＴ　ＰＣＲ　

Ｐ３
　 ５’
ＧＧＧＡＡＴＴＣ　
ＧＣＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡ３’
（＋ ）
　 ３４～４９
　 ＰＣＲ 鉴 定　
Ｐ４　 ５’
ｃＧＧＡＧＣＴｃ　ＧｃＡＴＴｃＡｃＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＧＧ３’（）
　 １
　６８３～１７０３
　ＰＣＲ 鉴 定　

Ｐ５
　 ５’
ＣＣＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧｃＣＴ３’（＋ ）
　 ７ｌ３～ ７３４　 Ｉ
则序　

其 中 Ｐ１、Ｐ３、
Ｐ４的 ５端 分别 引入 Ｈｉ
ｎｄⅢ、
ＥｃｏＲ　Ｉ和 Ｓａｃ
　Ｉ酶 切 位点及 两 个保 护碱 基 。以上 引物均　
由赛 百盛 生 物工 程公司 合成 。
　
１．６ 塥 毒 增 殖 及 基 因 组 ＲＮＡ 的提 取　
将 毒种 １００倍 稀释 后 ，
接 种于 １０日龄 ＳＰＦ鸡 胚尿 囊腔 （
Ｏ．２
　ｍＬ／胚 ）。
收 集 ３６￣４８
　ｈ死 亡鸡 胚的　
尿囊 液 。然后 按 文献 ［１６］所述 方法纯 化病 毒 。ＮＤＶ 基 因组 ＲＮＡ 的提 取 参 照文 献 ［１
　７］进 行 ，
即取 ２００
　
Ｌ尿囊液 ，
加 ５
　 蛋 白酶 Ｋ，３７
　Ｃ　１０　ｒ
ａｉｎ．
加 ４００　 Ｉ
　异 硫氰 酸 胍变 性液 ［２５
　ｇ异硫 氰 酸胍 ．
３３　ｍＩ
　
ＣＳＢ（０．８３
　 Ｎ一十二烷 基 肌 氨酸 ，
４２　ｍｍｏｌ
／Ｌ柠 檬 酸钠 ，
０．２
　ｍｍｏｌ
／Ｌ　 巯 基 乙醇 ）］，冰浴 １ｊ
　ｒａｉ
ｎ．加　
６
Ｏ　 ２ 　ｍｏ ｌ
／Ｌ　ｐＨ４．０乙酸钠 ， 冰浴 ５～１０　ｒ
ａｉｎ，
加等体积酚 （ 水饱和）： 氯仿 ：异戊醇（ ２５：２４：１ ）
冰　
浴１　
５　ｒ
ａｉｎ。１２　０００　ｒ
／ｒ
ａｉｎ室温 离心 １０
　ｒａｉ
ｎ．取 上清重 复 上述 操 作一 次 。其上 清再 用 等体 积氯 仿 ：异戊　
醇（
２４：１）抽提 一 次 。而 后取 上清 加等 体 积 异丙 醇 置 一２０　
Ｃ　２
　ｈ。１３
　０００　ｒ／ｒ
ａｉｎ室温 离 心 １
　５　ｒ
ａｉｎ．
　
７Ｏ
　 乙醇 （
ＤＥＰＣ水 处理 ）洗沉 淀一 次 ，
凉干 后溶 于 １
　０
　 Ｌ　ＤＥＰＣ水 中 。
　
１．７　 ＲＴ —ＰＣＲ　

取 ＲＮＡ　９
　 Ｌ，加 ＲＮａｓ
ｉｎ　１
　 ．ＤＴＴ　２
　 Ｌ，５× 反 转 录 酶 缓 冲 液 ４
　 ．ｄＮＴＰｓ
　１．５
　 Ｌ　
（
１０　ｍｍｏｌ
／Ｌ），
引物 Ｐ　１．５
　Ｉ　，Ｍ—
ＭＩ　
Ｖ 反 转录 酶 １
　 Ｌ，
３７Ｃ温育 １．５
　ｈ。
　
取上 述 反转录 产 物 ５止 加 入 ｄＮＴＰｓ
　２　 （１０　ｒ
ｅｔ
ｏｏｌ
／Ｌ）引物 Ｐ１、
Ｐ２各 ２
　 Ｌ，１
　０×ＰＣＲ 缓 冲液　
５
　 Ｌ，
最 后 用 灭 菌 双 蒸水 定 容 至 ５Ｏ　ｐＬ。９５
　Ｃ变 性 ５
　ｒａｉ
ｎ后 ，
加 入 ０．５
　 Ｔａ
ｑ　ＤＮＡ 聚 合 酶 （５
　ｕ／
　
），
按 ９４
　Ｃ　３５
　ｓ、５
２　Ｃ　５６
　ｓ、７２
　Ｃ　１１０　ｓ的条件 完成 ３Ｏ个循 环反 应 ，
最后 ７２
　Ｃ延伸 １０
　ｒａｉ
ｎ。反应 结　
束 后取 ５
　 进 行 ０．９
　 琼 脂糖 凝胶 电泳观 察 。
　
１．８
　 ＰＣＲ 产 物 的兑 隆及 鉴定　
将 ＰＣＲ 产物 用 ０．５
　 低 溶 点琼 脂糖 回收 纯 化 后 ．
按 ｐＧＥＭ￣－
Ｔ载 体操 作手 册 进 行连 接 和转 化 。
　
３７
　Ｃ过 夜培 养后 ，
挑取 白色菌 落转接 到 ２
　ｍＬ　
ＬＢ培 养液 中　 碱裂 解 法提 取 质粒 ，先后用 Ｈｉ
ｎｄ　Ｒ
Ｉ酶切　
鉴 定和 用 Ｐ１、
Ｐ２及 内侧 引物 Ｐ３、
Ｐ４进 行 ＰＣＲ 鉴 定 。
　
１
．９ 酶 切 图谱 分 析　
将 筛 选 到 的 阳性 克 隆 用 Ｈ觚ｉⅡ和 Ｓａｃ
　Ｉ双 酶 消 化 并 回收切 下 片段 。据 文 献［７，
８］选 用 ＰｖｕⅡ、
　
Ｂａ
ｍＨ　
Ｉ、Ｐｓ
ｔ　Ｉ、
Ｓｍａ　
Ｉ、Ｅｃ
ｏＲ　
Ｉ、Ｋｐｎ
　Ｉ、
Ｈ　 Ｉ等酶分别消化回收的克隆片段 。而后取样进行琼脂糖　
凝胶 电泳观 察酶 切谱带　
１．１０ 序 列 分 析　
选 取一 株经 Ｈｉ
ｎｄⅢ酶 切及 ＰＣＲ 鉴定后 的阳性 克 隆进 行 序列分 析 。为确 保 测序 的准 确性 和 有效　
性，
先进 行 人工 部分 测序 ，
再 用 ＡＢ１
３７７自动测 序仪 测 定全基 因 。
　
人工 测序 时 ，为 了一次 能读 取 更 长 的 目的基 因序 列 ，
将 插 入 Ｔ载 体 中 的外 源 片段 用 Ｈｉ
ｎｄⅢ、Ｓａｃ
　
Ｉ双 酶 切下 ，回收纯 化并连接 到同 一酶 切后纯 化的 ｐＵＣ１８中 ．
构 建 成 ｐＵＣ１８
　２，
再 以此 作 为测 序模板　
进 行 人工部 分测 序 。自动 测序 时采 用渐近 法 （
Ｐｒｉ
ｍｅｒ
　ｗａｌ
ｋｉｎｇ），
即５　
端 和 ３’端分 别先 用通 用 引物 进 行　
反应 ，
而 后 依据 两端测 出序 列 ，另外设 计 中 间段 测序 引物 （
Ｐ５），
再 进 行 测序 反应　 用三 段 测序结 果 拼　
接 出 Ｆ基 因全 序列 。
　
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第 ４期　 霍龙 Ｅ等 ：新城 痤北京强 毒株融合糖蛋 白（

Ｆ）基因的克隆ｌ
及序列分析　 ３３
５　

删 序时模 板的 制 各采用 ＰＥＧ 法 。

　
２ 结果　
Ｉ）
应 用 引物 Ｐｌ、Ｐ２对 ＮＤＶ 基 因组 ＲＮＡ 进 行 ＲＴ　
ＰＣＲ．反 应 产物 经 ０．９
　 琼脂 糖 凝 腔 电 泳 检　
测，
得 到 约 １．８
　ｋｂ的扩 增 片段 ，
与预 期 的 ＮＤＶ　
Ｆ基 因片段 大 小一致 （见图 １）。
　
２）
ＰＣＲ 产物 经 回收纯 化 与 Ｔ载 体连 接 后 ，
通过 ＡＩ
Ｘ平 板 筛选 ，
ＨｉｎｄⅢ酶 切及 ＰＣＲ 鉴 定 ，
得 到 阳　
性 克 隆质 粒 ｐＧＦＳ１
８（见 图 ２），用 原引物 对 Ｐｌ、
Ｐ２及 内侧 引物对 Ｐ３、
Ｐ４分 别扩 增此 克 隆质 粒 ，
均 获得　
约 １．７
　ｋｂ左右 扩增 片段 ．
说 明所克 隆 片段是 完整 的 ＰＣＲ产物 （见 图 ３）。
　
３）
ｂｇ用 ７种 限制 性 内切 酶对 克 隆 片段 进 行 酶 切分 析 ，电泳 检 测 结 果显 示 ，已克 隆 片段 存 在 Ｈａｅ
　
Ⅱ、
Ｐ　“Ｉ、
Ｐｓｔ
　Ｉ等酶 位 点 ，
而 无 Ｅｃ
ｏＲ　
Ｉ、Ｋｐｎ
　Ｉ、Ｓｍａ　
Ｉ等酶 位 点 （见 图 ４）。此 结果 除 Ｓｍａ　Ｉ外 ，
均与　
文 献 ［７．８］中 报道 的 ＮＤＶ　Ｆ基 因相 符　 Ｔｏｙｏｄａ等 人　 的 资 料 显 示 ，
Ｓｍａ　Ｉ在 ＮＤＶ　Ｆ基 因 上 的约　
１
　２００核 苷 酸 处 有 相 当 保守 的识 别 序 列 ．而 本 实 验 的 结 果 表 明 可 能 由于 点 突 变 造 成 此 毒 株 Ｆ基 因　
Ｓｍａ　
Ｉ位 点 的丧 失　 本 实验 的测 序结 果也 证实 了这 一推 测　
４）人工 测 序时 ，
采用 二抗 上样 技 术　 自动 测 序时 引物 Ｐ５的 测序结 果 与 ５
　端 正 向及 ３
　端 反 向测序　
结 果分 别重 叠 ９０余 个和 １８０余个 核苷 酸 。３次 反应 结果 拼读 出 了克 隆 的 Ｆ基 因全 片段 ，
共 １
　７４４个　
核 苷酸 （见 图 ５）
　由此 Ｆ基 固 编码 区推 导 出的 Ｆ蛋 白为 ５５３个氨 基 酸（见图 ６）
　将此 中国毒 株 Ｆ蛋 自　
的 基围 序列及 氡 基酸 序 列与 国外 毒 株进 行 比较 ，
发 现其 棱苷酸 差 异在 １
　０２．
／
＇１７０７（５．９
８％ ）至 １８６／１
　７０７
　
（１０．９
　）之间 ．
而 氯基酸 蔗异在 ２６
　ｊ５３（４．７
　 ）至 ４４／５５３（７．９５
　）之 间 （见表 １）
　
Ａ
　 Ⅵ
　 表 １
　Ｆ４
８Ｅ９与其它 ＮＤＶ强毒株 Ｆ蛋 白基 因序列 殛　
氨基酸序　ｑ
差异性比较　
ＴａｂＪ
ｅ　ｌ
　 Ｔ ｈｅ
　ｄｉ
ｆｆｅｒ
ｅｎｃｅｓ
　ｃｏｍｐａｒ
ｉｓｏｎ　ｏｆ
　ｎｕｅｌ
ｅｏｔ
ｉｄｅ　

ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ
　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ
　ａｍｉ
ｎｏ　ａｃｉ
ｄ　ｓｅ
ｑｕｎｃｅ
　ｏｆ
　Ｆ　
ｐｒｍｅ
ｉｎｓ
　

ｂｅｔ
ｗｅｅｎ　Ｆ４８
Ｅ９　ａｎｄ
　ｏｔ
ｈｅｒ
　ＮＤＶ　
ｖｉｒ
ｕｌｅｎｔ
　ｓｔｒ
ａｉｎｓ
　

株　 ！
竺！　
ｓ
ｔ
　ｎｓ
　 璧
　荒　个
　 芎
　 十
　
圈ｌ
　 ＮＤＶ　
Ｆ４８Ｅ９
Ｆ摹固的 ＲＴ—
ＰＣＲ扩增　
Ｆｉ
ｇ．１
　 Ａｍｐｌ
ｉ｛ｉ
ｃａｄｏｎ　ｏｆ
　Ｆ　ｇｅｎｅ
　ｏｆ
　ＮＤＶ　

ｓ
ｔｒａｉ
ｎ　Ｆ４８Ｅ９　
ｂｙ　ＲＴ　
ＰＣＲ　

Ｍ．Ｍ）ＮＡ　
ＥｃｏＲ １，
　 ｄ Ⅲ标 准分 子 量　
Ｍ．
　 ＤＮＡ　ＥｒｏＲ　１－
　 Ⅲ ｍａ＊ｋｅｒ
　

Ａ　 ＲＴ　
ＰｃＲ 严 物　
Ｒ　
ｒ　ＰＣ Ｒ　ｐ＊ｏｄｕ￣‘
　

Ａ　 Ｂ　 Ｃ　

２
　ｐＧＦ５１
８的 Ｈｉ
ｎｄⅢ、
ＳａｃＩ酶切鉴定　

一　
Ｆｉ
ｇ．２　 Ｒｅｓｔ
ｒｉｃｔ
ｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉ
ｇｅｓｔ
ｉｏｎ　ｔ
ｏｒ　ｉ
ｎｄｅｍ ｉ
ｆｉｃａｉ
ｔｏｎ　

ｏｆ
　ｐｏｓ
ｔｉｖｅ
　ｐ［
ａｓｍｉ
ｄ　ｐＧＦ５
　ｌ　

Ａ　 Ｉ
弱性 质 粒 ｐＧＥＭ＠ Ｔ载悼 Ｎｅ
ｇａｔ
￣ｅ　
ｐＬｓ
ｍｉｄ
　 ［Ｍ＠ Ｔ　 。
ｒ　
阳性质粒 ｐＧＦＳ１
　
８　Ｐａｓ
ｔｉ
ｍｅ　
ｐｌｍ
．ｍｉ
ｄ　 Ｗ５１
８　
（
、 Ｐ
ＧＦ５１
　
８　ＨｍｄⅢ 、
岛 ｆ【酶 切 结 枭 Ｐ￣ｓ
ｍｉｄ
　ｐＧＦ５１
８　ｄｉ
ｇｅｓ
ｔｅｄ
　 ．
ｈ　
１ｈ．ｄ１ ．ｎｄ　 Ｉ
　

Ｄ　Ａ Ｅｃ
ｏＲＩ
　 胁 ｄＩ标 准 丹 干 量　 ＤＮＡ 丘　Ｒ 【一
　 ｄⅢ …ａ
ｒｋ　
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农 业 生 物 技 术 学 报　

ｔ　

Ｆｉ

Ａ．引物 Ｐ１、
图 ３ 阳 性 克 隆 ｐＧ＇
ｇ．３　 Ｉ
ｎｄｅｎｔ
ｉｆｉ
ｅａｔ

Ｐ２扩 增 产 物
ｉｏｎ　
ｏｆ
Ｆ５１８的 ＰＣＲ 鉴 定　
　０ｐｏｓ

Ｐｒ
ｏｄｕｃ
ｔ
ｉｔｉ
ｖｅ

　ｏｆ
　
　ｃｌ
ｏｎｅ

ＰＣＲ　
ｕｓ
　ｂｙ　ＰＣＲ　

ｉ
ｎｇ　
ｐｒｉ
ｍｅｒ
ｓ　
图４
　ｐ
Ｆｉ
ｇ．４
　

ｍｅｎｔ
　ｉ
一　
ＧＦ５
１８克 隆片段的限制性 内切酶 电泳 图　

ｎｓｅ
Ａｇｒｏｓ

ｒｔｅ
ｄ　ｉ
ｅ　ｇｅｌ

ｎ　ｐＬ
ａｓ
　ｅｌ

ｍｉ
ｄ
ｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒ
ｅｓｉ
ｓ

　ｐＧＦ５１８　ｄｉ
　ｏｆ

ｇｅ
　ｔ

ｓｔ
ｈｅ
　ｆ

ｅｄ　ｗｉ
ｔ
ｌ ａｇ—

ｈ　
　

Ｐ１
　ａｏ
ｄ 　ＰＺ　 ｔ
ｈｅ　ｆ
ｏＲｏｗｉ
ｎｇ　ｅ
ｎｚｙｍｅｓ
　
１
３－ 引物 Ｐ３、Ｐ４扩 增 产物 Ｐｒ
ｄ ｕｃ
ｏ ｔ　ｏ
／ＰＣＲ　ｕｓ
ｉｎｇ　
ｐｒｉ
ｍｅｒ
ｓ　 ． Ｋ卸 Ｉ
　 Ｂ．ＥｃｏＲ Ｉ
　 Ｃ　 Ｓｍａ１　 Ｄ．Ｄ　 Ｐｓ打 Ｉ
　
Ｐ３　ａｒ
ｍ　Ｐ４　 Ｅ ．Ｂ 删 Ｈ　Ｉ
　 Ｆ． Ｐ　 Ⅱ
　 Ｇ　 １　

Ｃ 阴性 对 照 Ｎｅ
ｇａｔｉ
ｖｅ　
ｅｏｎｔ
ｒ￣　 Ｍ ．ＸＤＮＡ　
ＥｅｏＲ 【／Ｈｉ
ｎｄＩ标 准分 子 量　
Ｍ．２
￣ＤＮＡ ＥｍＲＩ／Ｈｉ
ｎｄＩ标准分子　 Ｍ 　 ＤＮＡ　ＥｃｏＲ 【／　 ｄＩ 眦 ｋｅｒ　
ＸＤＮＡ ￡ｃｏＲ　Ｉ／　 Ⅲ ｍ ａｒｋｅｒ
　

３ 讨 论　
本 实验 采用 人工 部分 测序 与 自动 测序 相 结 台 ，
保 证 了被 测 样 品 的准确 性 。同时 测 序时 未 做 亚 克　
隆 ，而 用渐近 法 （
Ｐｒｉ
ｍｅｒ
　ｗａｌ
ｋｉｎｇ）直接 对 约 １．７５
　ｋｂ的 Ｆ基 因进 行 测 序 。此法 省 去 了进 行 亚 克隆 ，
酶　
切 、筛选 等 繁琐工 作 ，
而显得 省时 、省力 。
正 因 为渐近 法 测序的 高效 性 ，目前 已被 广 为采 用 ，尤其 被用 于　
酶 切 图谱 不 清或 酶切位 点不 适 的长 片段 基 因的 序列 分析　
通过 ＰＴ—
ＰＣＲ和 序列 分析 ，
获 得 了 Ｆ４８Ｅ９毒 株 的 Ｆ基因 序列 共 １
　７４４个 核 苷酸 ，
该序 列包 含 了 启　
始密码 子 和终 止 密码子 在 内的 １
　６６２个 碱基 的 Ｆ蛋 白编码 序 列　 启始 密码 子上 游 尚有 ３７个 核 苷酸 ，
　
终 止 密码子 下游 亦有 ４５个核 苷酸 ，因此本 实验 已获得 了完 整 的 Ｆ基 因 。由此 Ｆ基 因推 导 出的 Ｆ蛋 白　
长 ５５３个 氨 基酸 ，与 已报 道 的 １２株 ＮＤＶ　
Ｆ蛋 白长 度 一致 口’
　］。本 实验 所 测 的 Ｆ蛋 白基 因序 列 已被　
Ｇｅ
ｎｅＢａ
ｎｋ接 受 ，
序号 为 Ｂａｎｋｉ
ｔ　１５９７３７。
　
ＮＤＶ 的 Ｆ 蛋 白首 先 以无 活性 的前 体蛋 白（
　 ）形式 合成 ．
经 蛋 白酶裂 解 为二硫 键相 连 的 Ｆ２一Ｆ１两　
个多肽 后 ，
才表 现 出生 物学 活性 。根据 Ｔｏｙｏｄａ（１９８７）
口一，
Ｇｌｉ
ｅｋｌ
ｍａｎ（１９８８）７
埘和 Ｇｏｒｍａｎ（１９９０）
［”　等 人　
的报 道 ，
ＮＤＶ 强 弱毒 株 的 Ｆ。蛋 白 在裂 解 位 点 （】１
２～ １１７位氨 基 酸残 基 ）处 存在 明显 不 同 的保 守 序　
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列 。弱 毒株 多为 ＧＲ／Ｋ　
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而强 毒 株则 为 ＲＲＱＲ／ＫＦ。由本 实验 获得 的 Ｆ基 固推 导出 的 Ｆ。蛋　
白，
其 １１２～ １１
　７位的氨 基酸 残基 与 已报 道 的强 毒 株裂 解位 点 处 的保 守序 列 完全 相 同 ，
这 与 Ｆ４８Ｅ９毒　
株在 临床上 表 现出 强致 病性 是一 致 的　
通 过 核 苷酸 序 列 和 氨 基酸 序 列 的 比 较 ，可 以看 出 ，
Ｆ４８Ｅ９与 澳 大 利亚 毒株 ＡＵＳ／３２的差 异 最 小　
（分别 为 １０２／１７０７、２６／５５３），
而 与 ＴＥＸ／４８（
美 国 株）的 差异 最 大 （
Ｓｔ别 为 １８６／１７０７
　４４／５５３）。此结 果　
表明 ，
北京 强毒珠 Ｆ４８Ｅ９与 ＡＵＳ／３２的亲 缘关 系较 近 ．而 与 ＴＥＸ／４８的关 系较 远 。
　
由 核 苷 酸 序 列 推 导 出 的 Ｆ４８Ｅ９
　Ｆ。蛋 白氨 基 酸 序 列 中 有 １３个 位 点 （２５、７６、１９９、３３８、３４７、３６２、
　
３７０、
３９４、
３９９、
４０１、
４２４、５１４、５２３）出现 半胱 氨 酸残 基 。其 中有 １２个 位点 的半肮 氨 酸残 基与 报道 的其 它　
　
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霍 龙 飞 等 ：新 城 疫 北 京 强 毒 株 融 合 糖 蛋 白（
Ｆ）基 因 的 克隆 及 序 列分 析　 ３３
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３３８　 农 业 生 物 技 术 学 报　 １９９８笠　

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７个 ＮＤＶ 毒 株 Ｆ基 因 的 核 苷 酸 序 列　
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只列出 Ｆ４８Ｅ９的 Ｆ基因核苷酸序列 。

其它毒株 只列 出与其 不同的核苷酸，划线部分 为启始密码子和终止密码子 。此　
Ｆ４８Ｅ９毒株核苷酸序 列已被 Ｇｅ
ｎｅＢａｎｋ接受 ，
序号为 Ｂａｎｋｉ
ｔ　１
５９７３７
　
Ｏｎｌ
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ｈｅ　ｎｕｍ ｂｅｒ
　ｉｓ　Ｂａｎｋｉ
ｔ　１５９７３７　
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第 １期　 霍龙飞等 ：新城 疰北 京强 毒株融合糖蛋 白（

Ｆ）基因的克隆及序列分析　

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图６
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Ｆ０蛋 白氪基酸序列的 比较　
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图中全部列 出Ｆ４８Ｅ９ＦＯ蛋白的氨基酸序列 ，
其 它毒株只列出 与Ｆ４８Ｅ９不 同的氪基酸 。
框 内标 出了 Ｎ一末端信号序　
列，
Ｆ１的 Ｎ一
末端 融合诱 导序列及 ｃ＿
末端跨膜区。阴影部分代表半胱氨酸残基及潜在椿基化位点　
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６个 强毒 株 完全 一致 ，
只有 第 ５１４位 的半肮 氨酸 残 基略有 变化 。据 Ｔｏｙｏｄａ
　 等人报 道的 资料 ，
ＮＤＶ　
Ｆ。　
蛋 白中第 ２７位 氨基 酸在 弱毒 株 多为半 胱 氨酸 ，
在 强毒 株则 多 为荷正 电的精 氨酸 或组 氨酸 。本 实验 所　
得 Ｆ。蛋 白氨基酸 序 列在 ２７位 亦为精 氨酸 ，
这进 一 步佐证 了 Ｔｏｙｏｄａ等 人的 资料 。从本 实验 的结果 可　
看 出 ，ＮＤＶ　
Ｆ蛋 白中的 半胱 氨 酸残 基是 高 度保 守 的 ，
这 些半 胱 氨 酸可 能在 维 持 Ｆ蛋 白高级 结 构 及　
功能 方 面起着 重要 作用 。另外 ，
Ｆ４８Ｅ９
　Ｆ蛋 白中 的 ５个 潜在 糖基 化位 点 ，与其 它 ６个强 毒株 一样 亦 具　
高度 保守性 。Ｍｃ
ｇｉｎｎｅ
ｓ￣
。　 等人最近 报道 ，
ＮＤＶ　
ＨＮ 蛋 白中 的半肮 氨酸 残基 能直 接 影 响邻近 潜 在糖 基　
化位点的糖基化作用。在本研究列举的七株 ＮＤＶ　
Ｆ蛋白的氨基酸序列中，
可以看出半肮氨酸残基位　
点及 潜在 糖基 化位 点在 Ｆ蛋 白中均 具有高 度 保守性 ，
这 一点似 乎 说 明二者 亦有 某种联 系 。不 过 ，
对 于　
ＮＤＶ 的 Ｆ蛋 白 ，
是 否真 的存在 如 Ｍｃｇｉ
ｎｎｅｓ所述 的影 响关 系，尚有 待研 究证 明 。
　
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３４０
　 农 业 生 物 技 术 学 报　 １９９８正　

参　 考　 文　 献　

１
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１９７３，
　
１１：２８３～ ２７１
　

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４９４～ ５０８
　

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４５：２６３￣ ２７２
　
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１０９：
９４～ １０５
　

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２６８５￣ ２６９４
　
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３４３～ ３８６
　

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２４２～ ２４７　

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１３
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１９８７，９５：
７９～ ９５
　

１４
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８５８～ ８７０　

１５　Ｈｅｃｋｅｒ
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１７７：
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第 ４期　 霆龙 飞等 ：新城疫北京 强毒 株融合糖 蛋 白（

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