Manual Practico de Bacteriologia LUZ

1
Índice General
Página
Introducción .................................................................................................................... 7
Unidad I. Introducción al Trabajo Práctico de Bacteriología .................................. 9

Objetivos terminales........................................................................................................ 9
Actividad Práctica 1.1: Introducción al Trabajo Práctico de
Bacteriología ................................................................................................................ 10
Objetivos específicos .................................................................................................... 10
Normas de seguridad en el Laboratorio de Bacteriología ............................................. 10
Material y equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriología ....................... 13
Actividad a realizar ....................................................................................................... 25
Ejercicios de auto-evaluación ....................................................................................... 25
Actividad Práctica 1.2: Observación de Bacterias y otros
Microorganismos in vivo ............................................................................................ 27
Objetivo específico........................................................................................................ 27
Observación de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de
diferentes ambientes naturales: agua, suelo, alimentos, otros ....................................... 27
Resultados ..................................................................................................................... 29
Actividad Práctica 1.3: Examen al Fresco y técnica de la Gota Pendiente ............ 31
Objetivos específicos .................................................................................................... 31
Examen microscópico ................................................................................................... 31
Examen al fresco ........................................................................................................... 32
Técnica de la Gota Pendiente ........................................................................................ 33
Resultados ..................................................................................................................... 34
Unidad II: Morfología y Ulltra-Estructura de la Célula Bacteriana ..................... 36

2
Objetivos terminales...................................................................................................... 36
Actividad Práctica 2.1: Técnicas de Coloración. Examen microscópico
de Preparaciones Coloreadas ...................................................................................... 37
Objetivos específicos ..................................................................................................... 37
Colorantes ...................................................................................................................... 37
Coloraciones................................................................................................................... 38
Etapas del proceso de coloración ................................................................................... 39
Técnicas de coloración ................................................................................................... 42
Coloración de Gram ....................................................................................................... 42
Actividad a realizar ........................................................................................................ 46
Resultados ...................................................................................................................... 47
Coloración de Ziehl-Neelsen.......................................................................................... 48
Resultados ...................................................................................................................... 51
Coloración de gránulos metacromáticos ........................................................................ 51
Resultados ...................................................................................................................... 54
Coloración de cápsula .................................................................................................... 55
Resultados ...................................................................................................................... 58
Coloración de flagelos.................................................................................................... 59
Resultados ...................................................................................................................... 63
Coloración de esporas .................................................................................................... 64
Resultados ...................................................................................................................... 67
Ejercicios de auto-evaluación ........................................................................................ 67
Unidad III: Nutrición y Crecimiento Bacteriano ...................................................... 71

Objetivos terminales ...................................................................................................... 71
Actividad Práctica 3.1: Técnicas de Siembra y Morfología Colonial ...................... 72
Técnicas de siembra o Inoculación ................................................................................ 72
3
Técnicas de aislamiento de colonias en medios sólidos................................................. 75
Morfología colonial........................................................................................................ 77
Características de las Colonias Bacterianas en Medios de Cultivo
Diferenciales, Selectivos y Enriquecidos ....................................................................... 78
Resultados ...................................................................................................................... 78
Actividad Práctica 3.2: Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano............... 82
Objetivo específico......................................................................................................... 82
Factores Físicos .............................................................................................................. 82
Temperatura ................................................................................................................... 83
Resultados ...................................................................................................................... 84
Concentración de hidrogeniones (pH) ........................................................................... 84
Resultados ...................................................................................................................... 85
Tensión de oxígeno y potencial de óxido-reducción...................................................... 85
Resultados ...................................................................................................................... 89
Presión osmótica ............................................................................................................ 90
Resultados ...................................................................................................................... 91
Actividad Práctica 3.3.: Medición del Crecimiento Bacteriano ............................... 94
Cuantificación del crecimiento bacteriano ..................................................................... 94
Contaje en placas............................................................................................................ 95
Turbidimetría.................................................................................................................. 97
Resultados .................................................................................................................... 101
Ejercicios de auto-evaluación ...................................................................................... 103
4
Unidad IV: Metabolismo Bacteriano ....................................................................... 105
Objetivo terminal ........................................................................................................ 105
Actividad Práctica 4.1: Pruebas Bioquímicas utilizadas en la Identificación de
Bacterias en el Laboratorio ....................................................................................... 106
Objetivos específicos ................................................................................................... 106
Generalidades ............................................................................................................... 106
Identificación utilizando métodos convencionales ...................................................... 106
Identificación utilizando sistemas multipruebas .......................................................... 157
Actividad a realizar ...................................................................................................... 162
Resultados .................................................................................................................... 162
Unidad V. Genética Bacteriana ................................................................................ 170

Actividad Práctica 5.1: Transferencia de Material Genético por
Conjugación Bacteriana ............................................................................................ 171
Objetivo específico....................................................................................................... 171
Generalidades ............................................................................................................... 171
Ejercicios de auto-evaluación ..................................................................................... .173
Unidad VI: Control del Crecimiento Bacteriano .................................................... 175

Actividad Práctica 6.1: Evaluación de Métodos Físicos para el Control
del Crecimiento Bacteriano ....................................................................................... 176
Calor ............................................................................................................................. 176
Resultados .................................................................................................................... 179
Radiaciones .................................................................................................................. 179
Resultados .................................................................................................................... 182
Ejericicios de auto-evaluación ..................................................................................... 182
5
Actividad Práctica 6.2: Evaluación de Desinfectantes y Antisépticos ................... 184
Generalidades ............................................................................................................... 184
Resultados .................................................................................................................... 186
Actividades de auto-evaluación ................................................................................... 186
Actividad Práctica 6.3: Pruebas de Susceptibilidad y Resistencia
Bacteriana a los Antibióticos ..................................................................................... 187
Generalidades ............................................................................................................... 187
Métodos para determinar la susceptibilidad bacteriana a los antibióticos ................... 189
Método de dilución en caldo ........................................................................................ 189
Resultados .................................................................................................................... 194
Método de dilución en agar .......................................................................................... 195
Método de difusión del disco en agar .......................................................................... 197
Resultados .................................................................................................................... 201
Método de E-test .......................................................................................................... 202
Resultados .................................................................................................................... 204
Otras pruebas................................................................................................................ 204
Resultados .................................................................................................................... 208
Unidad VII: Interacción Bacteria-Hospedero ......................................................... 212

Actividad Práctica 7.1: Flora Normal ...................................................................... 213
Generalidades ............................................................................................................... 213
Flora normal del cuerpo humano ................................................................................. 214
6
Resultados.................................................................................. .................................. 220
Unidad VIII: Control de Calidad en el Laboratorio de Bacteriología .................. 222

Objetivo Terminal ....................................................................................................... 222
Actividad Práctica 8.1: Preparación y Control de Calidad de Medios de
Cultivo ......................................................................................................................... 223
Objetivos Específicos .............................................................................................. 223
Generalidades ............................................................................................................... 223
Medios de cultivo ......................................................................................................... 224
Técnica de preparación de medios de cultivo .............................................................. 226
Control de calidad de medios de cultivo ...................................................................... 229
Resultados .................................................................................................................... 233
Ilustraciones ................................................................................................................. 236

Anexos.......................................................................................................................... 283
Referencias Bibliográficas ........................................................................................... 315
7
Introducción
El presente Manual Práctico está dirigido fundamentalmente a los

estudiantes que se inician en el fascinante mundo de los microorganismos y contiene
una serie de experimentos estrechamente relacionados con los temas tratados en el
Programa de Bacteriología General, asignatura obligatoria para los estudiantes de
Bioanálisis de la Facultad de Medicina de LUZ.
Los contenidos han sido organizados en ocho unidades, divididas en un

máximo de tres sesiones prácticas por unidad. Cada una de estas sesiones prácticas
contiene los fundamentos teóricos básicos y esquemas explicativos, así como también
figuras e ilustraciones para facilitar aún más la comprensión de las instrucciones
presentadas en cada una de las actividades prácticas.
La Unidad I consiste en tres sesiones prácticas: la primera, orientada

hacia el conocimiento de las normas de seguridad que rigen el trabajo en el
laboratorio; así como también, los materiales y equipos a utilizar en las prácticas de
Bacteriología General y Clínica. La segunda, está relacionada con la observación
directa de microorganismos vivos, en muestras de diferente origen.
La Unidad II consta de dos sesiones prácticas: la primera, relacionada con

la observación de los microorganismos in vivo y la segunda, describe las técnicas de
elaboración de frotis o extendidos y los diferentes métodos de coloración de uso
común en el laboratorio.
En la Unidad III, los contenidos han sido organizados en tres sesiones

prácticas. La primera, dirigida hacia la aplicación de las técnicas de siembra y los
métodos de aislamiento de bacterias; así como la visualización de los diferentes tipos
morfológicos de colonias bacterianas en diversos medios de cultivo. La segunda, está
relacionada con el reconocimiento de la influencia de factores físicos en el
crecimiento bacteriano. La tercera, describe las diferentes técnicas utilizadas para
cuantificar el número de bacteria presentes en un cultivo bacteriano.
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Los contenidos de la Unidad IV han sido organizados en una única sesión
práctica, que incluye una selección de pruebas bioquímicas específicas que reflejan
los procesos metabólicos que se llevan a efecto en la célula procariota. Ha sido
diseñada con la finalidad de proporcionar al estudiante las herramientas básicas para
la ejecución, lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas utilizadas de rutina
para la identificación de bacterias en el laboratorio.
Los contenidos de la Unidad V, han sido organizados en una única sesión

práctica orientada hacia el conocimiento de los posibles mecanismos de transferencia
de material genético entre las bacterias, especialmente, mediante la conjugación
bacteriana y su implicación en la diseminación de la resistencia antimicrobiana entre
las diferentes especies de bacterias.
Los contenidos de la Unidad VI han sido organizados en tres sesiones

prácticas, la primera se refiere al estudio de los métodos físicos para el control del
crecimiento bacteriano; la segunda, a la evaluación de desinfectantes y antisépticos y,
la tercera, a las pruebas de susceptibilidad y resistencia de las bacterias a los
antibióticos.
En la Unidad VII, los contenidos han sido organizados en una sesión

práctica, relacionada con la observación de las bacterias y otros microorganismos que
forman parte de la flora normal de diferentes sitios del cuerpo humano.
La Unidad VIII ha sido organizada en una sesión práctica con la finalidad

de proporcionar al estudiante nociones generales sobre la preparación y control de
calidad de los medios de cultivo utilizados en el aislamiento e identificación
bacteriana.
Esperando que esta obra constituya un valioso aporte a la enseñanza de la

Bacteriología General y que sea de provecho para los alumnos, a quienes va dirigido
este trabajo.
Los autores
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Unidad I
Introducción al Trabajo Práctico de Bacteriología
Objetivos Terminales:
Al finalizar la Unidad, el participante estará en capacidad de:
 Aplicar las normas de seguridad que rigen el trabajo en el Laboratorio de

Bacteriología.
 Diferenciar los materiales y equipos de uso frecuente en el Laboratorio de
Bacteriología.
 Verificar la presencia de bacterias y otros microorganismos vivos en diferentes
tipos de muestras.
 Reconocer la motilidad bacteriana en preparaciones al fresco.
10
Actividad Práctica 1.1
Introducción al Trabajo Práctico de Bacteriología
Objetivos Específicos:
1. Aplicar las normas de seguridad en el Laboratorio de Bacteriología.

2. Identificar los materiales y equipos de mayor utilidad en el Laboratorio de
Bacteriología.
Normas de Seguridad en el Laboratorio de Bacteriología
Los laboratorios de Bacteriología son ambientes especiales con respecto a

la seguridad de las personas que trabajan en los mismos. Las muestras recibidas para
su estudio representan un riesgo potencial para el personal, debido a los agentes
infecciosos que pueden contener. La educación del personal que manipula a diario los
agentes potencialmente infecciosos, así como de aquéllos que sólo tienen una
exposición limitada al ambiente del laboratorio, tales como personal de
mantenimiento, personal que entrega las muestras y visitantes, debe estar dirigida al
conocimiento de las medidas para prevenir las infecciones adquiridas en el
laboratorio. Los riesgos de un laboratorio de esta área pueden extenderse a los
laboratorios adyacentes y a las familias del personal.
Además del riesgo por infección, los laboratorios de Bacteriología

también están expuestos a todos los riesgos asociados con cualquier ambiente de
laboratorio o institucional, como: incendios, riesgos eléctricos, químicos, situaciones
ambientales, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos y peligros
dependientes de desastres naturales.
Los riesgos biológicos existentes en el laboratorio microbiológico son los

de interés en este caso. Las normas de seguridad son un conjunto de medidas
preventivas, destinadas a proteger la salud de los trabajadores y la comunidad frente a
riesgos por agentes biológicos en el laboratorio. A continuación se indican las normas
generales que deben cumplirse en el Laboratorio de Bacteriología:
1. El Laboratorio de Bacteriología representa un gran peligro para las personas no
entrenadas, por lo tanto, el acceso debe estar limitado al personal que labora en él.
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Deben evitarse las visitas, especialmente de niños. Ciertas áreas de alto riesgo,
como las secciones de Micobacteriología, deben estar cerradas al público.
2. El estudiante, al igual que el resto del personal que allí labora, debe usar una bata
de laboratorio. La misma deberá ser larga (que cubra la ropa de calle), manga
larga y estar completamente cerrada. Debe quitársela antes de abandonar el
laboratorio.
3. Es indispensable usar guantes de goma o látex cuando se manipulan materiales

potencialmente patógenos. Como el riesgo de contaminación por aerosoles es
grande, es necesario utilizar mascarilla.
4. Dentro de las áreas de trabajo está absolutamente prohibido comer, beber, fumar y
aplicarse cosméticos. Bajo ninguna circunstancia, utilice la cristalería o los
envases del laboratorio para ingerir líquidos o sustancias alimenticias.
5. Se recomienda no llevarse los objetos o las manos, a la cara o la boca, durante su

permanencia en el laboratorio; sino después de minucioso lavado con agua, jabón
y cepillo.
6. Todas las operaciones hechas con pipetas deben ser practicadas con el empleo de
propipetas o gomas de succión. Nunca pipetee con la boca.
7. Está terminantemente prohibido utilizar teléfonos celulares dentro del laboratorio

para evitar distracciones que puedan ocasionar accidentes y disminuir el riesgo de
contaminación.
8. Mantenga su mesón de trabajo despejado. Disponga únicamente, los materiales

estrictamente necesarios para realizar su trabajo. Todo artículo que no sea
indispensable para la ejecución de las actividades deberá ser guardado fuera del
área para evitar su contaminación.
9. En caso de cualquier accidente, por pequeño que éste sea, notifíquelo de

inmediato a su superior para tomar las acciones pertinentes.
10. Muchos de los microorganismos estudiados en el laboratorio son patógenos para

el hombre; por lo tanto, todas las muestras y cultivos que se procesan deben ser
considerados potencialmente patógenos y ser tratados como tales.
12
11. Rotule convenientemente todas las muestras procesadas. Nunca incube cultivos
no identificados.
12. No realice experimentos o trabajos sin autorización de su superior.
13. Una vez terminado el trabajo, devuelva a su lugar todos los reactivos y equipos
utilizados. Su área de trabajo debe quedar totalmente despejada. Descarte todos
los cultivos, las muestras y la cristalería utilizados (excepto pipetas) en el
recipiente destinado a tal fin. Una vez depositado un objeto en el recipiente, nunca
debe ser retirado del mismo.
14. Deposite las pipetas utilizadas en los recipientes correspondientes. Nunca coloque
pipetas contaminadas sobre su mesa de trabajo.
15. No desplazarse dentro del laboratorio con material contaminado, por ejemplo:
pipetas que hayan sido utilizadas. Asegurarse de tener disponible el recipiente de
descarte antes de usar materiales como pipetas, hisopos u otros.
16. Los microorganismos desecados o fijados sobre láminas portaobjetos no

necesariamente están muertos; manipúlelos con cuidado y al descartarlos, hágalo
en el recipiente correspondiente.
17. Nunca saque material contaminado (por ejemplo: cultivos bacteriológicos) del
laboratorio sin haber obtenido las instrucciones pertinentes.
18. No interrumpa a quienes están trabajando; pues se pueden ocasionar graves

errores o accidentes.
19. Trabaje siempre cerca del mechero para evitar la contaminación de los cultivos.
De igual manera, no hable mientras está inoculando las muestras en sus
correspondientes medios de cultivo.
20. Las personas que tienen el cabello largo, deben recogérselo para prevenir
accidentes.
21. Las sandalias o zapatos descubiertos no ofrecen protección adecuada a los pies;
por lo tanto, se recomienda el uso de calzados cerrados.
22. Lave cuidadosamente sus manos con agua y jabón al terminar cada sesión de
trabajo y antes de salir del laboratorio.
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23. El laboratorio debe mantenerse limpio y ordenado, retirando del mismo cualquier
material que no tenga relación con el trabajo.
24. Las superficies de trabajo se descontaminarán al terminar cada actividad

específica.
25. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite, en lo

posible, la formación de aerosoles.
26. Durante el trabajo se mantendrán cerradas las puertas del laboratorio.
“Cumpliendo a cabalidad las normas anteriormente descritas, el laboratorio de

Bacteriología puede constituir un área segura para trabajar y aprender”.
Material y Equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriología
Con fines didácticos, el material de uso en el Laboratorio de Bacteriología

puede dividirse en dos partes:
A.- Material de vidrio
B.- Instrumentos, equipos y otros materiales microbiológicos.
A) Material de vidrio:
Debe cumplir con ciertos requisitos especiales; como:

1. Ser resistente al calor seco y húmedo.
2. Resistir lavados frecuentes
3. El vidrio debe ser neutro (que no altere el pH de los medios que
contengan)
4. Resistentes a los ácidos y álcalis.
El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriología está

representado por:
Cilindros graduados: También denominados Probetas graduadas, son recipientes de

vidrio grueso, forma cilíndrica y diámetro uniforme, provistos de una base o pie para
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darles estabilidad. No son aptos para calentar ni para efectuar reacciones químicas.
Poseen una escala graduada en mililitros (ml) y calibrada a 20ºC. Generalmente,
tienen una capacidad entre 25 y 2.000ml. Se usan para medir líquidos. En
bacteriología, se emplean durante la preparación de medios de cultivo, colorantes,
reactivos, etc (Figura 1).
Embudos: Son conos de vidrio o de material plástico con punta de longitud variable
terminada en bisel. Se utilizan para filtrar reactivos, colorantes, medios de cultivo,
etc. para lo cual deben ser preparados previamente con papel de filtro. Otro de sus
usos es facilitar el trasvasado de líquidos y sólidos hacia recipientes de cuello
estrecho. Para obtener una buena filtración, es mejor utilizar un embudo de buena
calidad con un ángulo de 58º exactamente (Figura 2).
Espátulas en forma de “L”: Son varillas de vidrio que miden 22 x 25mm. de largo,
dobladas en uno de sus extremos en ángulo de 90º. Se utilizan para la diseminación
de material sobre la superficie de los medios de cultivo (Figura 3).
Fiolas o Erlenmeyers: Son recipientes de vidrio de forma cónica, cuello corto y fondo
plano. Su capacidad está entre 25 y 5.000 ml. Se utilizan para la preparación de
medios de cultivos y soluciones (Figura 4).
Frascos goteros: Son frascos de vidrio que poseen una ranura que al ser colocada de
manera que coincida con otra presente en la tapa, permiten la salida del líquido en
forma lenta (gota a gota). Adicionalmente, existen frascos de plástico o vidrio con un
orifico o un dispositivo, que permite dispensar líquidos gota a gota. Por lo general,
tienen una capacidad de 25 a 50ml (Figura 5).
Frascos para hemocultivo: Son frascos redondeados o rectangulares, de vidrio

transparente con tapa de baquelita, generalmente con una capacidad de 120 ml. Se
utilizan para el cultivo de microorganismos a partir de muestras de sangre (Figura 6).
Láminas cubreobjeto (laminillas): Son laminillas delgadas de vidrio con forma

cuadrada, rectangular o redonda que cubren las preparaciones microscópicas
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colocadas sobre los portaobjetos. Miden entre 15 y 22 mm. de largo por 0.13; 0,17 a
0.20 mm. de espesor (Figura 7).
Láminas excavadas: Son rectángulos de vidrio con tamaños variables, algunas veces
iguales a los portaobjetos; otras veces, de mayor tamaño (110 x 55- 15 x 40mm.) que
presentan en su superficie una, dos, tres o más excavaciones. Se utilizan para
observar la motilidad de los microorganismos por el método de la gota pendiente
(Figura 8).
Láminas portaobjeto: Son rectángulos de vidrio utilizados para realizar extendidos a

ser observados al microscopio (llevan la preparación microscópica). Las de uso
frecuente miden 75mm. de largo por 25mm. de ancho con 1mm. de espesor. Pueden
poseer o no, bordes esmerilados (Figura 9).
Matraces o balones: Son recipientes de forma esférica con un cuello cilíndrico, largo
y de fondo plano. Su capacidad está entre 50 y 5.000ml. Algunos son aforados; es
decir, poseen una marca circular que indica que a ese nivel contiene un volumen
exacto. Se utilizan para la preparación de soluciones (Figura 10).
Mechero de alcohol: Consta de un envase de vidrio o metal, provisto de una mecha, la

cual se encuentra en contacto con el alcohol contenido en el recipiente. Posee una
tapa para evitar la evaporación del alcohol cuando no se encuentra en uso. Se utiliza
en algunos procedimientos de coloración que requieren calentamiento y para crear un
ambiente estéril durante la toma de muestra de sangre para hemocultivos (Figura 11).
Pipetas: Son tubos de vidrio con longitud y capacidad variable que terminan en una
extremidad afilada. Presentan una graduación exterior que indica su capacidad a
20ºC; algunas veces, la graduación llega hasta la punta (pipetas terminales) y en otras,
termina por arriba de ella (pipetas no terminales). Las más usadas tienen una
capacidad de 0.1; 0.2; 1; 2; 5 y 10 ml. Las hay también de plástico (desechables). Se
emplean para transferir un volumen determinado de líquido o solución. Existen
también las Pipetas volumétricas, calibradas para dispensar volúmenes fijos de un
16
líquido. Existen de diferentes capacidades que varían en un rango de 1 a 100 ml
(Figura 12).
Pipetas Pasteur: Se obtienen comercialmente, o pueden prepararse en el laboratorio.

Poseen un extremo afilado que puede ser largo o corto. Presentan también, un
estrechamiento en la parte superior para facilitar el taponamiento. Se utilizan para la
inoculación de medios de cultivo, separar sobrenadantes, añadir reactivos, entre otros
usos (Figura 13).
Placas de Petri: Están compuestas por dos platillos que difieren en su diámetro de
manera que uno encaje perfectamente sobre el otro. Existen de varios tipos y
tamaños. El diámetro de las más utilizadas es de 100 x 15mm y de 150 x 25mm.
Algunas están divididas en secciones o cuadrantes que permiten estudiar varios
cultivos simultáneamente o efectuar contaje de colonias. Pueden ser de vidrio o de
material plástico (desechables, no resisten el autoclave). Se utilizan para contener los
medios de cultivo donde se inocularán los microorganismos a estudiar (Figura 14).
Tubos de centrífuga: Son tubos de ensayo, cuyo extremo cerrado termina en forma de
cono. Se utilizan en los procesos de centrifugación de muestras, por ejemplo, orina
para obtener un sedimento urinario. Algunos poseen una escala graduada que permite
medir, la cantidad de sedimento obtenido. Pueden ser de material plástico o vidrio y
tener o no, tapa de baquelita. Los más usados tienen 15 y 30ml de capacidad (Figura
15).
Tubos de ensayo: Son tubos de vidrio, cerrados por un extremo, con reborde o sin él,
de diámetro variable. Los más utilizados son de: 160 x 15mm., 150 x 15mm., 125 x
15mm. y 100 x 13mm. Algunos llevan tapa de baquelita. Se usan principalmente para
contener medios de cultivo y reactivos, así como también para efectuar pruebas
bioquímicas (Figura 16).
Tubos de fermentación (Durham): En bacteriología se usan para el estudio de los

procesos de fermentación de los carbohidratos por parte de las bacterias. Permiten
detectar la producción de gas a través del desplazamiento del líquido en el interior del
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tubo. Generalmente miden 6 mm de diámetro x 50mm de alto y suelen colocarse
invertidos dentro de otro tubo de mayor diámetro (Figura 17).
Varillas de vidrio: Son cilindros de vidrio con extremos redondeados, de longitud y

tamaño variables (20–25cm. de longitud x 3–5mm. de ancho, respectivamente). Se
utilizan para la siembra y aislamiento de colonias en placas. También para trasvasar
líquidos y mezclar sustancias (Figura 18).
Vasos de precipitado (beakers): Son recipientes de forma cilíndrica, poseen una
depresión en el borde que facilita el vaciamiento de los líquidos. La capacidad, por lo
general, es entre 25 y 2.000 ml. Se utilizan para transferencia de líquidos (Figura 19).
B) Instrumentos, Equipos y otros Materiales usados en Bacteriología
Agitador tipo vórtex: Es un aparato formado por una base de aluminio fundido que
brinda durabilidad y estabilidad para su uso. Posee una copa de caucho suave para el
mezclado de un tubo de ensayo único. Presenta dos modos de operación: operación
continua y encendido constante; y encendido al tacto, el cual se activa al tocar el
accesorio de copa con un tubo de ensayo (Figura 20)
Asas bacteriológicas: Están formadas por un mango de Kolle unido a un alambre de

platino puro u otro metal que le permite flexibilidad y calentamiento o enfriamiento
rápido. Por su flexibilidad, se le pueden dar las formas de aguja (asa en punta) o en
aro (asa en argolla o aro). El elevado punto de fusión del metal con que se elabora el
asa, le permite que sea esterilizado al calor directo de la llama sin que se funda, y su
rápido enfriamiento evita la muerte del microorganismo cuando es tocado por el asa
para ser inoculado a otro medio. Este alambre está sujeto a un mango o cuerpo que
generalmente, es de material liviano (aluminio) y es un buen conductor del calor. Está
protegido en su extremidad posterior por una cubierta de ebonita (aislante). Se
emplean para la inoculación de microorganismos en los medios de cultivo. En
ocasiones, las asas suelen estar calibradas para dispensar un volumen determinado de
inóculo, por ejemplo 0.001ml (Figura 21).
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Autoclave: Aparato diseñado para la esterilización de materiales por vapor de agua a
presión. Está provisto de una llave y un manómetro para regular la presión, y por
consiguiente, la temperatura a la que se desea someter los microorganismos. Formado
por una cámara de vapor de doble pared equipada con dispositivos, que permiten que
la cámara se llene a saturación de vapor y se mantenga a la temperatura y presión
deseada. El autoclave es una pieza indispensable en todo laboratorio de
microbiología. Se utiliza para la esterilización de la mayoría de los medios de cultivo
durante su preparación; así como, para material contaminado. Opera a una presión de
15 libras a 121ºC de temperatura por un tiempo de 15 minutos (Figura 22).
Balanza: Equipo que permite pesar cualquier compuesto necesario para el trabajo
diario de un laboratorio. Existen en el mercado muchos modelos, algunos son de
brazo, mecánicas, electrónicas o digitales (Figura 23).
Bandejas para esterilizar: Son recipientes, con o sin tapa, para descartar el material
utilizado en el laboratorio para luego esterilizarlo en el autoclave. Pueden ser de acero
inoxidable o de propileno y su capacidad es variable (Figura 24).
Baños de María: Son aparatos que poseen una doble pared de acero inoxidable, y una
capa central de asbesto, poseen un termostato para regular la temperatura, un control
del nivel de agua y un termómetro. Son eléctricos y el calor es suministrado por una
resistencia. Se utilizan para verificar reacciones de los microorganismos a
temperaturas controladas. También se emplean en la estabilización de los medios de
cultivo después de ser esterilizados en el autoclave durante su preparación (Figura
25).
Campana o jarra de microaerofilia: Son recipientes formados por un cuerpo y una

tapa que cierra herméticamente. El cuerpo está constituido por material de vidrio o
plástico de boca ancha; en cuyo interior se colocan las placas de Petri y tubos de
ensayo contentivos de los microorganismos en cultivo para su incubación en
atmósferas especiales (5–10% de CO2). Esta atmósfera especial se logra insertando
una vela encendida en el interior del recipiente o un sobre generador de la mezcla de
gases deseada (Figura 26).
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Campana o jarra de anaerobiosis: Sistema usado para crear una atmósfera anaeróbica.
La que se emplea con mayor frecuencia es la Campana de Gaspak, la cual consiste en
una campana de plástico transparente con una tapa hermética, la cual es ajustada por
una abrazadera. La introducción de una mezcla de gases que contiene H2 es seguida
por la reacción catalítica del oxígeno con el hidrógeno para formar agua,
estableciéndose así, la anaerobiosis. Se emplea preferiblemente un catalizador frío
compuesto por partículas de alúmina recubiertas con paladio, ya que no tiene riesgo
de explosión (Figura 27).
Campana de extracción: Sistema de seguridad, compuesto por un extractor centrífugo

con motor y protegido de los vapores por una ventana tipo guillotina con vidrio de
seguridad, posee cuatro llaves de servicios localizadas a cada lado para suministrar
gas, agua, aire y vacío, además de toma-corrientes. Permite la manipulación de
cultivos bacteriológicos y muestras clínicas evitando la propagación de aerosoles
(Figura 28).
Centrífugas: Son instrumentos metálicos de distintas capacidades, con envoltura de

aluminio. Poseen un motor que opera generalmente con 110-115 voltios y un reóstato
que regula las revoluciones por minuto. En su interior se encuentra un cabezal donde
van colocados unos cilindros metálicos que sirven de receptores a los tubos de
centrífuga. Existen también centrífugas refrigeradas con un compresor que controla la
temperatura. Poseen un rango de temperatura entre -20ºC a + 40ºC. Son aparatos
utilizados para la centrifugación; es decir, la aplicación de la fuerza centrífuga para
separar partículas en suspensión. Se emplean generalmente, para concentrar o
precipitar los elementos celulares contenidos en un líquido normal o patológico
(Figura 29).
Cestas: Son recipientes de tejido metálico o plástico resistente al calor, de diferentes

formas y tamaños. Se usan para el almacenamiento de los tubos de ensayo y para su
esterilización (Figura 30).
20
Contador de colonias: Aparato que consta de una fuente de luz, una lupa y un vidrio
cuadriculado que facilita el contaje de las colonias presentes en un cultivo (Figura
31).
Destilador de agua: Es un equipo que permite obtener agua de alta calidad, libre de
pirógenos e iones metálicos a partir de agua potable proveniente directamente de la
tubería de suministro municipal. Está formado por resistencias, condensadores y una
caldera, entre otras partes. Algunas presentan diferentes dispositivos que interrumpen
la energía eléctrica cuando el nivel de agua disminuye (Figura 32).
Dispensador: Es un dispositivo que se utiliza para repartir volúmenes pequeños de

líquido a partir de frascos grandes. Éstos deben ser exactos y reproducibles en la
dosificación. Además, no deben causar desperdicios de reactivos. Están conformados
por una válvula de seguridad, tubo telescópico para adaptarse a frascos de diferente
altura y controlador para ajustar el volumen de forma precisa y sencilla (Figura 33).
Encendedor para mecheros: Pieza metálica accionada por un resorte que lleva en un
extremo un carbón reemplazable, el cual es friccionado sobre una superficie irregular,
produciéndose chispas que hacen encender los mecheros (Figura 34).
Espátulas: Instrumentos planos, obtusos, semejantes a un cuchillo que se emplean

para agregar sustancias; como por ejemplo: constituyentes de medios de cultivo que
van a ser pesados. Son de material inoxidable con mango de madera u otro material
de hoja flexible, resistente al calor y a los agentes químicos (Figura 35).
Estufas o incubadoras: Son instrumentos metálicos que poseen una doble pared de
aluminio revestida por una sustancia refractaria al calor. El calor es proporcionado
por una resistencia eléctrica y la temperatura es graduada por medio de un
termómetro que se maneja desde la parte externa. En la parte superior, posee un
orificio donde se inserta el termómetro e indica la temperatura existente en el interior.
La temperatura usada en estos aparatos está entre 5 y 50ºC. Se utilizan para proveer
21
de manera constante, temperaturas apropiadas para favorecer el crecimiento de los
microorganismos (Figura 36).
Frascos lavadores o picetas: Son recipientes plásticos utilizados para dispersar agua u
otras sustancias contenidas en ellos, permitiendo lavar o arrastrar cualquier material.
Se usan para transvasar material sólido y para lavar los recipientes, sin tocar las
paredes. También se emplean en el lavado de preparaciones coloreadas (Figura 37).
Gomas de succión: Son bulbos de goma que se utilizan, al igual que las propipetas,
para pipetear líquidos, reactivos, etc (Figura 38).
Guantes de látex para laboratorio: Son prendas de tamaño variable y ambidextros.

Hechos de látex y disponibles en forma estéril y no estéril, con polvo (almidón de
maíz) y sin polvo. Se emplean para proteger las manos cuando se trabaja con agentes
infecciosos o químicos peligrosos (Figura 39).
Guantes de seguridad: Son prendas utilizadas para manipular objetos calientes

provenientes del autoclave u horno. Se fabrican de tejido de algodón puro o de
asbesto. Son lavables y resistentes al calor hasta 232ºC (Figura 40).
Gradillas: Soportes especiales de madera, metal o plástico, empleados para colocar

los tubos de ensayo (Figura 41).
Horno de aire caliente: Es una cámara rectangular de doble pared, de tamaño variable,
con amianto para evitar la pérdida de calor por radiación, con un espacio aéreo entre
ambas paredes. El calor es proporcionado por electricidad. No puede utilizarse para
líquidos ya que se agotarían por ebullición, ni para telas, ni gomas que se quemarían.
Se utilizan para esterilizar cristalería. Este material debe estar limpio, completamente
seco y debidamente envuelto antes de ser esterilizado al calor seco del horno. Opera
generalmente a una temperatura de 170–180ºC durante 60–120 minutos para destruir
todos los microorganismos. El más utilizado es el Horno Pasteur (Figura 42).
22
Hisopos: Son aplicadores de madera que llevan algodón en uno de sus extremos. Son
utilizados en forma estéril para la toma de muestras bacteriológicas y algunas veces,
para efectuar siembras (Figura 43).
Lápiz con punta de diamante: Se usan para marcar vidrios y otras superficies. El
diamante es montado en bronce y colocado al final de un mango de aluminio (Figura
44).
Lápices grasos: Son lápices especiales que sirven para escribir en vidrios o
superficies muy pulidas. Los hay de diferentes tipos, colores y marcas. Poseen en su
composición, un porcentaje graso que permite la adhesión de éste en la superficie lisa.
Para usarlos, es necesario que la superficie donde se va a escribir esté completamente
limpia y seca (Figura 45).
Lentes de seguridad: Son instrumentos ópticos panorámicos que tienen como función
proteger los ojos del usuario ante cualquier accidente que pueda ocurrir en el
laboratorio. Son de policarbonato claro y existen variados modelos en el mercado
(Figura 46).
Mascarillas: Son caretas faciales compuestas por tres capas de propileno fundido
poroso que contiene en su parte intermedia, un filtro del mismo material. Estas
mascarillas aseguran una filtración de bacterias del 99% (Figura 47).
Mecheros de Bunsen: Son tubos de metal que sirven para la combustión del gas
natural. Antes de producir la llama para la oxidación completa del gas, se requiere
mezclar el gas con aire. Se componen de las siguientes partes: a) Pie: sirve de soporte,
b) Válvula para la regulación de la mezcla aire-gas natural y c) Cuello del mechero.
Se utilizan para la esterilización de las asas bacteriológicas y para el flameado de la
boca de los tubos que contienen cultivos, durante su manipulación (Figura 48).
Microincinerador: Es un aparato eléctrico que cumple las funciones de un mechero de

Bunsen. Además, lleva adaptado lateralmente, una cámara tubular para incinerar los
microorganismos, evitando de esta forma, el peligro de contaminación de la
23
atmósfera y del operador. Se les conoce popularmente como mecheros eléctricos
(Figura 49).
Microscopio: El microscopio compuesto de luz, ampliamente utilizado en la

actualidad, es un instrumento óptico constituido por un conjunto de lentes y partes
mecánicas, que permite la observación de especímenes diminutos, invisibles al ojo
humano, revelando detalles de su estructura. Existen otros tipos de microscopio, tales
como: Campo Oscuro, Contraste de Fase, Inmunofluorescencia, Electrónico, entre
otros (Figura 50).
Mortero con mazo: Es un recipiente que sirve para macerar cualquier compuesto
químico o material que se desea utilizar para la preparación de una solución y que se
encuentre en estado sólido. Existen de diferente capacidad, comúnmente se fabrican
de porcelana (Figura 51).
Papel de filtro: Material compuesto por microfibrilla de vidrio que se utiliza para la
retención de partículas finas con una alta velocidad de flujo, durante los procesos de
filtración (Figura 52).
pHmetro: Instrumento que tiene como finalidad medir el pH de soluciones químicas

en el laboratorio. Está formado por un electrodo y su soporte, el cual es el sensor que
produce la lectura. Este equipo debe calibrarse con el empleo de una solución buffer o
tampón. Existen muchos modelos en el mercado, algunos pueden presentar
dispositivos para determinar otras características, tales como: temperatura,
conductividad y concentración (Figura 53).
Pinzas: Tenacillas de metal o acero inoxidable que sirven para varios usos. Por
ejemplo: se utilizan para colocar los discos de antibióticos en las pruebas de
susceptibilidad y resistencia a los antimicrobianos, para sujetar hisopos a fin de no
tomarlos con la mano y para retirar el papel de filtro durante las coloraciones, entre
otros (Figura 54).
24
Pipeta automática: Es un dispensador de líquidos automático, exacto y preciso.
Presenta un eyector de punta para evitar el desprendimiento accidental de la puntilla.
Existen en el mercado diversidad de modelos y capacidades (Figura 55).
Plancha de calentamiento: Es un instrumento que tiene como finalidad el

calentamiento rápido de sustancias químicas, para facilitar la preparación de
soluciones. Presentan una placa de calentamiento metálica, además de controladores
de temperatura. Algunos modelos traen incorporado un agitador con control ajustable
(Figura 56).
Propipetas: Son dispositivos de goma que poseen tres válvulas de presión que operan
independientemente para controlar la entrada y salida de líquidos. Poseen un orifico
inferior donde se inserta la pipeta que va a ser utilizada. Poseen también tres botones:
uno superior (A) que se utiliza para extraer el aire contenido en el interior del bulbo;
uno inferior (S) para succionar el líquido al interior de la pipeta y otro, lateral (E)
que extrae el líquido de la pipeta. Se usan para pipetear líquidos peligrosos (Figura
57).
Puntillas para pipetas automáticas: Son boquillas de propileno que se colocan en la

parte inferior de las pipetas automáticas y su función es tomar la cantidad de líquido a
dispensar. Existen de diferentes capacidades adaptables a cada modelo de pipeta
(Figura58).
Rejilla metálica: De forma cuadrangular, es una red constituida por finos alambres
entrecruzados que llevan en su centro un área circular de amianto o asbesto. Este
material dispersa el calor con uniformidad. Generalmente, se colocan sobre anillos o
trípodes cuando van a calentarse instrumentos o material de vidrio que no deben
recibir calor directo (Figura 59).
Reloj de laboratorio: Es un instrumento que se utiliza para medir el tiempo de todos

los procesos y reacciones que se verifican en el laboratorio. Pueden ser mecánicos o
digitales (Figura 60).
25
Soporte para coloración: Dispositivo en forma de “U” hecho de metal u otro material
resistente, sobre el cual se colocan las láminas portaobjetos que contienen extendidos
fijados que van a ser sometidos a procesos de coloración (Figura 61).
Termómetro: es un instrumento que permite el registro permanente de la temperatura.

Existe una gran variedad de modelos, desde manuales hasta digitales (Figura 62).
Trípodes: Son instrumentos metálicos, hechos generalmente de hierro, provistos de

un aro y tres patas que le sirven de soporte. Se usan para sostener recipientes que van
a ser sometidos a ebullición. Por lo común, se coloca sobre el aro una rejilla metálica
(Figura 63).
Actividad a Realizar
Proceda a identificar el material que se ha colocado sobre el mesón y

relaciónelo con su utilidad práctica.
Ejercicios de Auto-evaluación
1. Defina Normas de Seguridad.
2.-Explique la importancia del cumplimiento de las normas de seguridad en el

Laboratorio de Bacteriología.
3.- Enumere seis normas de seguidad a cumplir en el Laboratorio de Bacteriología.

26
4.- Aparee los siguientes materiales y equipos de laboratorio con su correspondiente
utilidad práctica.
Material y Equipo Utilidad Práctica

Asa de Platino____ a) Estudio del proceso de fermentación
Placa de Petri_____ b) Preparación de soluciones
Estufa_____ c) Contener medios de cultivo

Horno_____ d) Verificar reacciones químicas
Autoclave___ e) Inoculación de medios de cultivo
Mechero de Bunsen____ f) Esterilización de asas bacteriológicas
Pipetas____ g) Esterilización de materiales por vapor de agua a
presión
Láminas excavadas ____ h) Esterilización de cristalería
i) Instrumento utilizado para el contaje de colonias
j) Proveer temperaturas apropiadas para el
crecimiento bacteriano
k) Transferir líquidos
l) Pesar reactivos y medios de cultivo
m) Observación de motilidad bacteriana
27
Observación de Bacterias y otros Microorganismos Vivos
Objetivo específico:
1. Observar la presencia de bacterias y otros microorganismos en diferentes tipos de
muestras.
Observación de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de

diferentes ambientes naturales: agua, suelo , alimentos y otros
La Microbiología se ocupa del estudio de organismos tan pequeños que no

pueden observarse a simple vista. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el
microscopio tiene una importancia crucial, ya que la mayor parte de los
conocimientos sobre los microorganismos han sido descubiertos con el uso del
microscopio.
La primera persona que observó y describió los microorganismos fue el

microscopista aficionado Anthony Van Leeuwenhoek, quien con sus lentes creó una
forma de iluminación (campo oscuro) que permitió observar claramente diferentes
formas de vida microbiana.
Las bacterias fueron los primeros organismos vivos del planeta, viven
prácticamente en cualquier lugar donde la vida sea posible, se encuentran en mayor
cantidad que otra clase de organismos, y constituyen probablemente el componente
mayoritario de la biomasa terrestre.
En este trabajo práctico, el estudiante examinará al microscopio,

preparaciones realizadas con diversos tipos de muestras con la finalidad de observar
la gran cantidad de organismos vivos existentes en la naturaleza (Figuras 64- 70).
28
Materiales
 Láminas portaobjeto
 Laminillas cubreobjeto
 Pipetas Pasteur
 Mango de Kolle con asa en aro
 Aplicadores de madera
 Solución salina fisiológica (SSF)
 Agua estéril
Muestras
 Diversos alimentos como: quesos no pasteurizados, jugos de frutas

naturales, yogurt, entre otros.
 Suelo.
 Agua estancada.
 Muestras clínicas: heces, orina, hisopado de piel, entre otras.
 Cultivo bacteriano.
Procedimiento
1. Colocar sobre una lámina portaobjeto limpia y desgrasada, una gota de la

suspensión realizada con la muestra a observar.
2. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto.
3. Observar al microscopio óptico con el objetivo seco de mayor aumento (40X).
Actividad a realizar
1. A cada grupo de estudiantes, se les asignará una de las muestras seleccionadas

para el ejercicio práctico.
2. Con la muestra a observar, preparar una suspensión en SSF estéril.
3. Colocar una gota de la suspensión en una lámina portaobjeto y cubrir con una
laminilla. Alternativamente, la suspensión de la muestra puede prepararse
29
directamente sobre la lámina portaobjeto con ayuda del asa o un aplicador de
madera.
4. Efectuar la observación al microscopio de la preparación.
5. Realizar anotaciones sobre lo observado en cada muestra.
Resultados
1.- En la siguiente tabla indique la cantidad relativa de microorganismos observados

en cada preparación. Reporte según los siguientes criterios: abundante,
moderado, escaso o ausente.
Muestra Cantidad de Microorganismos Observados
2.- Realice un dibujo de lo observado en cada muestra
Muestra:_____________
Muestra:_____________
30
Muestra:_____________
1. Indique cuál muestra tiene mayor cantidad de microorganismos. Explique

brevemente por qué.
2. ¿De dónde provienen los microorganismos observados?

31
Examen al Fresco y Técnica de la Gota Pendiente
1. Distinguir las bacterias de otros elementos presentes en un examen al fresco.
2. Ejecutar correctamente la técnica de la gota pendiente para la observación de la

motilidad bacteriana.
3. Diferenciar entre motilidad verdadera y movimiento browniano en las bacterias.
Examen Microscópico
El examen microscópico es usualmente el primer paso para la identificación

de una bacteria desconocida. Las bacterias pueden, tentativamente, ser colocadas en
uno u otro grupo, cuando se han observado sus características morfológicas y sus
reacciones tintoriales. Las características morfológicas de importancia son:
a) Tamaño
b) Forma
c) Agrupación
d) Estructuras especiales:
Flagelos
Endosporas
Cápsula
Gránulos metacromáticos.
Existen dos formas en las cuales los microorganismos pueden ser examinados
bajo un microscopio: En estado vivo (in vivo) o en estado de fijación.
32
Observación “in vivo”:
Este tipo de observación puede hacerse necesaria cuando el microorganismo no

es fácil de colorear o cultivar o cuando se desea estudiar su morfología no
distorsionada por la fijación.
Existen dos variantes:
1. Examen al fresco (montaje húmedo con solución salina fisiológica, S.S.F)
2. Técnica de la Gota Pendiente.
1. Examen al Fresco:
Procedimiento
1. Colocar sobre una lámina portaobjeto limpia y libre de grasa, una asada de un
cultivo puro en caldo (utilizando para ello un asa de platino previamente
esterilizada a la llama del mechero).
2. Cubrir con una laminilla y observar al microscopio óptico con objetivo de

40x, bajando el condensador para disminuir la cantidad de luz permitida.
3. Si el examen al fresco se realiza a partir de un cultivo en medio sólido,

colocar una gota de S.S.F. estéril en una lámina portaobjeto y resuspender en
ella una colonia del cultivo, y repetir el procedimiento anterior.
Esta preparación también puede ser examinada mediante microscopía de

campo oscuro o de contraste de fase. Además, puede hacerse un examen al fresco
a partir de muestras clínicas, tales como: orina, secreción vaginal, líquidos estériles
entre otras. Con la finalidad de observar si existen bacterias y otras estructuras
(cilindros, leucocitos, glóbulos rojos)
33
2. Técnica de la Gota Pendiente
Este método se utiliza para la observación de la motilidad de las bacterias

aeróbicas estrictas, por ejemplo: los Bacilos Gram negativos no fermentadores de
la Glucosa (BGNNF). Tiene la ventaja de eliminar la distorsión ocasionada por el
peso del cubreobjeto y se puede obtener un campo de foco más profundo dentro de
la gota.
Procedimiento:
1. Colocar, con ayuda de un aplicador de madera, una pequeña cantidad de vaselina

alrededor de una depresión de la lámina excavada.
2. Colocar una suspensión de una colonia en S.S.F. o una gota de un cultivo en caldo
(4 a 6 horas de incubación) en un cubreobjeto. No mover la preparación.
3. Colocar la lámina excavada sobre la laminilla de manera que la gota del cultivo
quede en el centro de la cavidad. Presionar ligeramente; pero de manera firme para
que se fije.
4. Invertir rápidamente la preparación de manera que la gota penda del cubreobjeto

en la cámara.
5. Observar al microscopio óptico con objetivo seco de mayor aumento o con

objetivo de inmersión para evidenciar la motilidad; asegurándose de no confundir
el Movimiento Browniano con la verdadera motilidad que es mostrada por las
bacterias que se desplazan en direcciones opuestas y llegan a cruzarse; en el
movimiento browniano, las bacterias oscilan alrededor de su propio eje.
Alternativamente, puede agregarse la vaselina a la lámina cubreobjeto y

proceder como se muestra en el siguiente esquema (Figuras 71-74)
34
A cada grupo le será suministrado un cultivo puro en caldo y agar. Realice un

examen al fresco entre lámina y laminilla y una motilidad por el método de la gota
pendiente. Observe detenidamente y registre los resultados.
Resultados
Muestra:_____________
Muestra:_____________
Ejercicios de Auto-Evaluación
1. ¿Qué valor práctico tienen estas técnicas?
2. ¿Cómo puede distinguirse la motilidad verdadera del movimiento browniano

de las bacterias?
35
3. ¿Qué métodos pueden utilizarse para determinar la motilidad de las bacterias

en el laboratorio?
4. ¿Cuál es la ventaja que tiene el método de la gota pendiente sobre el montaje

húmedo?
5. ¿Para qué se usa la vaselina en el método de la gota pendiente?
6. ¿Por qué son difíciles de observar los microorganismos en montajes

húmedos?
36
Unidad II
Morfología y Ultra-estructura de la Célula Bacteriana
Objetivos Terminales:
 Reconocer la morfología microscópica de las bacterias en preparaciones

coloreadas.
 Explicar los fundamentos y procedimientos de diferentes coloraciones.
37
Técnicas de Coloración. Examen Microscópico de Preparaciones
Coloreadas
1. Interpretar los fundamentos de las coloraciones de uso más frecuente en

Bacteriología.
2. Practicar las técnicas de coloración de uso frecuente en Bacteriología.
3. Examinar al microscopio diversas preparaciones bacterianas.
4. Interpretar los resultados del examen microscópico de las coloraciones realizadas.
Colorantes
Debido a su elevada refringencia, la mayoría de los microorganismos son

visibles al microscopio óptico cuando se examinan en vivo y en suspensión acuosa,
pero este examen al fresco, importante para observar la motilidad de las bacterias, no
permite apreciar los detalles de su estructura. En general, son necesarios
procedimientos de Tinción o Coloración para visualizar los microorganismos y
demostrar los detalles finos de sus estructuras internas. A tal fin, es necesario el
empleo de sustancias colorantes.
Los Colorantes son sustancias que, por procedimientos apropiados, tienen la

capacidad de transmitir su color a otros cuerpos. Generalmente, son sales de anilina
que al disociarse originan iones cargados positiva y negativamente. Uno de estos
iones es el que imparte la propiedad cromógena y se denomina, entonces, Cromóforo.
El otro, se denomina Auxocromo y es el que permite que el colorante se una a las
fibras o tejidos.
En términos amplios, de acuerdo con su comportamiento químico, los colorantes

se consideran ácidos o básicos; lo cual no necesariamente indica su reacción en
solución (pH); sino más bien, si una parte significativa de la molécula es aniónica o
38
catiónica. Si el cromóforo es el ión positivo, el colorante se denomina Básico
(Catiónico), y si es el negativo, Ácido (Aniónico).
Las bacterias, a un pH 7.0; tienen una carga ligeramente negativa por ser ricas
en ácidos nucléicos, los cuales poseen cargas negativas en forma de grupos fosfato,
por lo tanto, cualquier colorante que vaya a ser utilizado para teñir este tipo de
microorganismos, debe ser un colorante básico, los cuales incluyen: cristal violeta
(también denominado violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina básica
y verde de malaquita, entre otros.
Los colorantes ácidos, como la eosina, tinta china y nigrosina, son poco
utilizados, debido a que su cromóforo (ión negativo) repele las cargas negativas de la
superficie bacteriana. Se usan generalmente, cuando se desea teñir estructuras
citoplasmáticas o efectuar tinciones negativas.
Coloraciones
El estudio de la forma y disposición celular de los microorganismos se efectúa a

través de preparaciones coloreadas.
La introducción de tinciones a mediados del siglo XIX representa, en gran

medida, el fundamento de los principales avances que se han producido en la
Microbiología durante los últimos cien años. Hoy en día, se emplean tanto, que es
difícil comprender cómo pudo haber progresado el estudio de los microorganismos,
antes de su aplicación rutinaria en el Laboratorio.
Las tinciones consisten en aplicar soluciones acuosas o alcohólicas de colorantes a

los microorganismos, tejidos vegetales y animales y otras sustancias de importancia
biológica. Colorear significa, simplemente, teñir los microorganismos para enfatizar
ciertas estructuras.
39
Etapas del Proceso de Coloración
En el proceso de coloración se cumplen siempre las siguientes etapas:
1.-Preparación del frotis o extendido.

2.-Fijación del frotis o extendido.
3.-Aplicación de colorantes o coloración propiamente dicha.
1. Preparación del Frotis o Extendido
Consiste en colocar el material a examinar sobre el portaobjeto. El extendido

debe ser delgado, uniforme y no llegar hasta los bordes de la lámina. Debe dejarse
secar al aire.
Técnica de Preparación:
1. Colocar una gota de solución salina fisiológica (0.85%) estéril en el centro de un

portaobjetos limpio y libre de grasa.
2. Con un asa, previamente esterilizada a la llama del mechero, tocar la superficie del
crecimiento bacteriano (colonia).
3. Resuspender la pequeña cantidad de material retirado del cultivo, en la solución
salina. Utilizar el asa para esto. Con la ayuda del asa, extender la suspensión
bacteriana sobre un área pequeña del portaobjeto (1 cm. aproximadamente)
4. Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero.
5. Permitir que el material se seque espontáneamente al aire (Figuras 75-76).
Si el frotis o extendido se va a preparar a partir de un cultivo en caldo: con asa

en aro, colocar una o dos asadas del caldo que contiene el microorganismo en la
lámina portaobjeto. Extender con la misma asa. Los otros pasos de la elaboración son
exactamente iguales al anterior.
40
2. Fijación del Frotis o Extendido
La fijación o segunda etapa de la coloración se efectúa con la finalidad de

adherir los microorganismos al portaobjeto de tal manera que no se desprendan
durante los pasos subsiguientes de la coloración. Puede hacerse por medio de agentes
físicos como el calor moderado, que es el más frecuentemente usado; o por agentes
químicos, entre los que se encuentra el alcohol.
Técnica de Fijación por Calor: Una vez que el extendido se ha secado al aire, debe
fijarse pasándolo ligeramente varias veces (3 ó 4) sobre la zona azul de la llama del
mechero, evitando el sobrecalentamiento. Compruebe la temperatura alcanzada,
colocando la cara limpia del portaobjeto sobre la eminencia tenar de la mano. La
temperatura alcanzada no debe ser superior a los 45ºC, la cual es tolerada
adecuadamente por la piel del operador.
Alternativamente, puede calentarse la preparación en un dispositivo adecuado

(plancha de calentamiento) a 60ºC por diez minutos para inactivar cualquier patógeno
que pudiera estar presente (Figura 77).
Técnica de Fijación por Métodos Químicos: Una vez que el frotis se ha secado al
aire, se procede a aplicar alcohol (metanol al 95%), cubriendo completamente la
lámina portaobjeto. Se deja actuar el alcohol por dos minutos. Luego se escurre el
exceso de alcohol y se deja secar al aire antes de proseguir con la coloración.
4. Coloración Propiamente dicha
Es la aplicación del o los colorantes sobre el frotis ya fijado (Figura 78).
Al aplicar colorantes ácidos o básicos, los microbiólogos, usualmente emplean

tres técnicas diferentes de coloración:
 Coloraciones simples.
 Coloraciones diferenciales.
41
 Coloraciones especiales.
Una coloración simple es la que emplea únicamente un (1) colorante que se

aplica al frotis en una sola operación. Su uso revela la morfología y disposición
celular de las bacterias; sin embargo, no muestra detalles finos de su estructura
interna. El tiempo necesario para la coloración varía con la dilución del colorante.
Una vez teñidos, los extendidos son lavados brevemente con agua para eliminar el
exceso de colorante, secados al aire o con papel secante y después de ello, quedan
listas para ser observadas al microscopio óptico con objetivo de inmersión (100x).
Las coloraciones simples más utilizadas en bacteriología son: azul de

metileno, safranina, fucsina y violeta de genciana.
Una coloración diferencial es aquella que emplea 2 ó más colorantes juntos o

separados, según la técnica que se trate. Permite distinguir entre dos clases diferentes
de microorganismos o entre dos partes diferentes de un mismo organismo.
En frotis previamente elaborados y fijados, típicamente, se utilizan cuatro

componentes de manera progresiva: colorante primario, mordiente, solución
decolorante y colorante de contraste.
El colorante primario, usualmente, tiñe del mismo color, todos los

componentes celulares y microorganismos presentes en el espécimen.
Ocasionalmente, se añade un químico a la solución para intensificar la tinción. Tal
aditivo se conoce como mordiente y su función es incrementar la afinidad del
colorante por la muestra biológica. Otra función sería la de recubrir estructuras, por
ejemplo, los flagelos, para hacerlos más gruesos y fáciles de visualizar después de
teñidos. Son ejemplos de mordientes: calor, lugol y fenol. Los agentes decolorantes,
típicamente, son alcoholes y ácidos. La remoción del colorante primario por acción
del decolorante permite la tinción, con el colorante de contraste, de las células que
fueron decoloradas; así como también del fondo. Esta segunda tinción diferencia
entre tipos de bacterias, como por ejemplo, organismos violeta intenso y rojizos
42
vistos con la Coloración de Gram; o entre los microorganismos y el fondo, tales como
los Bacilos Ácido Resistentes (BAR) que se tiñen de rojo sobre un fondo azul.
Las dos coloraciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, son sin

lugar a dudas, la coloración de Gram y la coloración de Ziehl-Neelsen.
Una coloración especial o estructural es una coloración diferencial que, como
su nombre lo indica, permite colorear, de manera particular, estructuras especiales de
la célula bacteriana, como por ejemplo: cápsula, flagelos, endosporas, gránulos
metacromáticos y otros constituyentes intracelulares de las células bacterianas.
Técnicas de Coloración
Coloración de Gram
La tinción de Gram, descrita hace poco más de cien años por Hans Christian
Gram, se usa con mucha frecuencia para el examen microscópico directo de muestras
y subcultivos.
Fundamento: Aunque se han propuesto varias explicaciones sobre los resultados de

la reacción de la tinción de Gram, parece probable que la diferencia entre las bacterias
Gram negativas y Gram positivas se deba a la naturaleza química de sus paredes
celulares.
La diferencia fundamental radica en la cantidad de lípidos presentes en los dos

tipos de paredes celulares. Cuando se agrega el mordiente durante el proceso de la
coloración, el cristal violeta y el iodo forman complejos que se encuentran sobre todo
en el interior de la célula. Como la pared celular Gram positiva tiene, hasta cierto
punto, una baja concentración de lípidos; pero una capa gruesa de peptidoglucano, el
agente decolorante alcohol-acetona deshidrata la pared celular y atrapa los complejos
cristal violeta-iodo en el interior celular, lo que le confiere a la bacteria un color
violeta. En contraste, la pared celular Gram negativa, está formada por lípidos,
lipopolisacáridos y lipoproteínas, presentes en su membrana externa. Además, poseen
una delgada capa de peptidoglucano. La solubilidad de los lípidos en el alcohol
43
permite que el decolorante extraiga el colorante primario de la membrana externa sin
que la pared celular constituya una barrera impermeable. Por tanto, en ese momento,
sale el cristal violeta del interior de la bacteria y es preciso volver a teñir la célula con
safranina para poder visualizarla, apareciendo entonces, coloreadas de rojo-rosado.
No obstante, ninguna composición química exclusiva de la pared bacteriana

parece explicar la coloración con Gram; ya que las gruesas paredes de las células de
levadura, que también se tiñen como Gram positivas, tienen una composición química
y una estructura diferente de las bacterias Gram positivas.
Colorantes de Gram (Modificación de Hucker)
1. Colorante primario: Cristal violeta Solución Madre

Cristal violeta(85%) ................................................................................20.00g.
Etanol (95%) ..................................................................................... 100.00 ml.
Solución Madre de Oxalato
Oxalato de Amonio ..................................................................................1.00 g.
Agua Destilada .................................................................................. 100.00 ml.
Solución de Trabajo: Diluir la solución madre de cristal violeta 1:10 con agua
destilada y mezclar con 4 volúmenes de la solución madre de oxalato. Conservar
en una botella con tapón de vidrio.
2. Mordiente: Solución de Iodo de Gram
Cristales de yodo ......................................................................................1.00 g.
Ioduro de Potasio......................................................................................2.00 g.
Disolver completamente en 5 ml. de agua destilada, luego agregar:
Agua destilada ................................................................................... 240.00 ml.
Bicarbonato de sodio, solución acuosa al 5% ..................................... 60.00 ml.
Mezclar y conservar en una botella de vidrio color ámbar.
3. Solución Decolorante: Alcohol–Acetona
Acetona ............................................................................................. 250.00 ml.
Etanol (95%) ..................................................................................... 250.00 ml.
Mezclar y conservar en una botella con tapón de vidrio.
44
4. Colorante de Contraste: Safranina
Safranina .............................................................................................. O2.50 g.
Etanol (95%) ..................................................................................... 100.00 ml.
Solución de Trabajo:
Diluir la solución madre 1:5 ó 1:10 con agua destilada. Conservar en una botella
con tapón de vidrio.
Técnica de la Coloración de Gram
Previamente, se debe elaborar un frotis y fíjar al calor. Colocar la lámina que

contiene el extendido sobre un soporte para coloración para mantenerlo en posición
horizontal. Proceder entonces a:
1. Cubrir la lámina con cristal violeta. Dejar actuar por un minuto (Figura 79). Lavar
con agua corriente (Figura 80).
2. Cubrir la lámina con lugol. Dejar actuar por un minuto (Figura 81). Lavar con
agua corriente (Figura 82).
3. Sobre la lámina, dejar correr el decolorante orgánico (alcohol-acetona) hasta que la
solución de lavado no salga teñida con el colorante violeta. Si lo prefiere, puede
mantener la lámina sujeta entre el dedo pulgar e índice y colocarla de manera que
se obtenga un ángulo de 45º. Por lo general, el tiempo requerido para la
decoloración oscila entre 10-20 segundos (Figura 83). Lavar de nuevo con agua
corriente (Figura 84).
4. Cubrir el frotis con una solución de safranina Dejar actuar por 30 segundos (Figura
85). Lavar con agua corriente (Figura 86).
5. Colocar la lámina con el frotis en posición vertical para escurrir el exceso de agua
y permitir que seque espontáneamente al aire. En su defecto, se puede emplear
papel secante.
6. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al

microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x, lo cual resulta en un aumento
total de 1.000x.
45
Interpretación
Esta coloración diferencial permite observar la morfología, disposición y afinidad

tintorial de las células bacterianas. Basados en la coloración de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grandes grupos: bacterias Gram positivo, que se tiñen con el
cristal violeta y aparecen de color violeta intenso y, Gram negativo, las que se tiñen
con la safranina y aparecen de color rojo-rosado (Figuras 87 – 93).
Algunas bacterias no pueden clasificarse mediante la tinción de Gram; ya sea

por su difícil tinción o porque carecen de pared celular. Los micoplasmas carecen de
pared celular y por lo tanto, no son susceptibles a la tinción por el procedimiento de
Gram. Las micobacterias son muy difíciles de teñir porque sus envolturas celulares
contienen grandes cantidades de ceras.
Existen microorganismos que se tiñen indiferentemente como Gram positivos

o Gram negativos y son denominados Gram variable. Se cree que son bacterias que
han perdido la habilidad de reaccionar en forma diferencial a esta coloración. Esto
generalmente sucede en cultivos viejos (con más de 48 horas de incubación). Se
asume que este fenómeno ocurre debido a modificaciones en la pared celular
provocadas por la edad del cultivo. En consecuencia, se recomienda que los frotis
sean elaborados a partir de cultivos de no más de 24 horas de incubación.
Forma de reportar:
1. Morfología: Cocos
 Bacilos
 Cocobacilos
2. Afinidad Tintorial:
 Gram positivo.
 Gram negativo.
46
3. Disposición:
 Cocos en racimos
 Cocos en cadenas
 Cocos en pares
 Cocos en tetradas (grupos de cuatro)
 Cocos en sarcinas (grupos de ocho)
 Cocos aislados
Limitaciones
La coloración de Gram no permite identificar específicamente ciertas

estructuras bacterianas, tales como: la cápsula, los flagelos o las esporas; así como
tampoco proporciona buenos resultados en la investigación de micobacterias y
hongos, salvo en el caso de algunas especies de levaduras.
Estas limitaciones no son absolutas y como ya se ha demostrado, en ocasiones

pueden observarse la cápsula o las esporas (aunque no sean teñidas en forma
específica). Por otra parte, las micobacterias, pueden ser vistas como bacilos; pero se
hace necesario realizar la coloración de Ziehl-Neelsen o de Kinyoun para demostrar
su carácter ácido-resistente.
Finalmente, es conveniente destacar que existen numerosas modificaciones de

las fórmulas de las soluciones utilizadas en la técnica de coloración e incluso, del
tiempo empleado en cada uno de los pasos señalados. Realmente, lo importante es el
empleo de un procedimiento similar en cada laboratorio para evitar variaciones en los
resultados.
Elabore un frotis con cada uno de los microorganismos que le suministre su

profesor. Fíjelos y coloréelos según la técnica de Gram, obsérvelos al microscopio
con objetivo de inmersión. Anote los resultados y elabore los gráficos
correspondientes.
47
Resultados
Forma:_______________________ Forma:_______________________
Afinidad tintorial:_______________ Afinidad tintorial:_______________
Agrupación:____________________ Agrupación:____________________
Forma:_______________________ Forma:_______________________
Agrupación:____________________ Agrupación:____________________
Forma:_______________________ Forma:_______________________
Agrupación:___________ Agrupación:____________________
______
___
48
Coloración de Ziehl-Neelsen
Fundamento
Las paredes celulares de ciertos géneros bacterianos clínicamente importantes,

como: Nocardia y Mycobacterium que incluye el agente causal de la tuberculosis (M.
tuberculosis) y la lepra (M. leprae) contienen una elevada concentración de ceras en
forma de ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de
carbono). Esta gruesa capa de lípidos los provee de una cubierta casi impenetrable,
que hace que la célula sea difícil de colorear. Sin embargo, una vez teñidos poseen la
propiedad de resistir la decoloración con ácidos minerales o alcohol ácido. Por este
motivo, a estos microorganismos se les denomina Bacilos Ácido Resistentes (BAR),
un fenómeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1.882.
La cubierta cérea de estas bacterias presenta además un problema adicional, y

es que las células tienden a adherirse unas a otras y formar agregados en los
extendidos, en vez de extenderse uniformemente.
Es necesario un tratamiento especial para que el colorante primario, fucsina

fenicada, atraviese el material céreo de los bacilos ácido resistentes. En la técnica
convencional de Ziehl-Neelsen se usa calor (coloración en caliente). El decolorante
consiste en una mezcla de alcohol y ácido, la cual es capaz de remover
completamente el color rojo de la fucsina de todos los organismos, excepto de los
BAR. El empleo de una coloración de contraste con azul de metileno tiñe todo lo que
no sea resistente al ácido; mientras que los BAR permanecen rojos.
La modificación de Kinyoun se denomina “método en frío” porque utiliza un

detergente activo de superficie, como Tergitol, en lugar de calor. Utiliza un
decolorante más débil (0.5–1% de H2SO4) en lugar de alcohol-ácido al 3%. Esto
ayuda a diferenciar entre organismos que son débiles o parcialmente ácido-
resistentes, particularmente, Nocardia sp., cualquiera de los dos métodos es
satisfactorio.
49
Colorantes de Ziehl-Neelsen
1. Colorante primario: Fucsina fenicada de Ziehl

Solución I:
Fucsina Básica (Acetato de pararrosanilina) ............................................0.30 g.
Etanol (95%) ....................................................................................... 10.00 ml.
Disolver y agregar:
Solución II:
Fenol, cristales.......................................................................... 5.00 ml ó 5.00g.
Agua destilada ..................................................................................... 95.00 ml.
Solución de Trabajo:
Mezclar las dos soluciones (I y II). Dejar en reposo por varios días antes de
usar. Guardar en frasco ámbar. Filtrar antes de usar.
2. Solución Decolorante: Alcohol-Ácido

Etanol (95%) ....................................................................................... 97.00 ml.
HCl concentrado.................................................................................... 3.00 ml.
Mezclar y conservar en un frasco ámbar.
3. Colorante de Contraste: Azul de Metileno

Azul de metileno ......................................................................................0.30 g.
Disolver el colorante en el agua. Guardar en frasco ámbar.
Técnica
1. Elaborar un frotis a partir de un cultivo puro de M. tuberculosis. (Usar

portaobjetos nuevos y libres de grasa).
2. Fijar el frotis, utilizando para ello, una plancha de calentamiento (60ºC) durante 10
minutos como mínimo; y dos horas, como máximo).
3. Aplicar un papel de filtro sobre el portaobjetos con el frotis y colocar la lámina
sobre un soporte de metal para la coloración.
50
4. Cubrir la preparación con la fucsina fenicada (colorante primario), calentando a la
llama de un mechero por debajo de la lámina (durante 5 a 10 minutos) hasta
obtener la emisión de vapor (3 veces). (El calor actúa como mordiente). Evite que
la lámina se seque, agregando más colorante si es necesario (Figura 94).
5. Retirar el papel de filtro (con ayuda de una pinza) y lavar el portaobjetos con agua
hasta que el colorante deje de salir. Sacudir el exceso de líquido (Figura 95).
6. Cubrir el portaobjetos con solución decolorante (alcohol-ácido) durante 1 minuto
aproximadamente. Comprobar que no se desprende más color rojo al escurrir el
portaobjetos. Decolorar hasta que apenas quede una traza de color rosado (Figura
96).
7. Lavar con agua y eliminar el exceso (Figura 97).
8. Cubrir la lámina con el colorante de contraste (azul de metileno) y dejar en
contacto por 1 ó 2 minutos (Figura 98).
9. Lavar con agua corriente. Escurrir y dejar secar al aire. No secar con papel
absorbente (Figura 99).
10. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión (100 x).
Interpretación
Los microorganismos ácido-resistentes aparecerán de color rojo intenso;

mientras que otros elementos celulares y bacterias no ácido resistentes, se tiñen de
azul con el colorante de contraste. Las micobacterias, frecuentemente, aparecen como
bacilos ligeramente curvos que muestran la propiedad de ácido-resistencia (BAR).
Pueden presentar gránulos más oscuros y dar la impresión de estar fragmentados
(Figura 100).
Coloree los frotis de M. tuberculosis que le han sido entregados y dibuje lo

observado. (Debido a la elevada patogenicidad de este microorganismo, los frotis, les
serán suministrados ya fijados).
51
Resultados
Estructura observada: ______________________

Coloración:_______________________
Coloración de Gránulos Metacromáticos (Azul de Metileno de Löeffler)
Continuamente, muchas bacterias presentan inclusiones citoplasmáticas en

forma de gránulos. Estos son gránulos de volutina formados principalmente por
polifosfatos, que desempeñan un importante papel en el metabolismo bacteriano. Al
parecer, los polifosfatos proporcionan el fósforo y la energía requerida para la síntesis
de los ácidos nucléicos.
La volutina tiene una notable afinidad por los colorantes básicos (azul de
toluidina o azul de metileno), y con frecuencia se presenta con un color distinto o más
intenso que el del colorante aplicado. Por su capacidad de teñirse
metacromáticamente, se denominan gránulos metacromáticos.
Colorantes
Azul de Metileno de Löeffler

Azul de metileno ........................................................................................0.3 g.
Etanol (95%) ....................................................................................... 30.00 ml.
Una vez disuelto, agregar:
Agua destilada ................................................................................. . 100.00 ml.
Guardar bien tapado en frasco de vidrio.
52
Técnica
1. Elaborar un frotis de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae en medio de

Löeffler o de cualquier otra bacteria productora de gránulos metacromáticos.
2. Dejar secar al aire. Fijar el frotis a la llama del mechero.
3. Cubrir la lámina con una solución alcohólica de azul de metileno. Dejar actuar
por cinco (5) minutos (Figura 101).
4. Lavar la preparación con agua corriente. Escurrir la lámina y dejar secar al aire
(Figura 102).
5. Observar la preparación con objetivo de inmersión (100x).
Interpretación
Esta es una coloración simple en la que los gránulos metacromáticos aparecen

de color azul intenso y el resto de la bacteria de color azul claro (Figura 103) .
Coloración de Albert (Modificada por Laybourn)
Otra coloración que puede utilizarse para colorear gránulos metacromáticos es

la coloración de Albert.
1. Solución I:
Azul de Toluidina ................................................................................ O0.15 g.
Verde de Malaquita .....................................................................................0.2g.
Etanol (95%) ........................................................................................ .2.00 ml.
Ácido Acético Glacial ........................................................................... 1.00 ml.
Agua Destilada ................................................................................. 100.00 ml.
Disolver los colorantes en el alcohol y luego agregar el agua destilada conteniendo

el ácido acético glacial. Dejar madurar por 24 horas y luego filtrar. Guardar en frasco
ámbar.
53
2. Solución II:
Yodo ...........................................................................................................2.0 g.
Ioduro de Potasio........................................................................................3.0 g.
Agua destilada ........................................................................................ 300ml.
Disolver el yodo y el ioduro de potasio en el agua destilada.
Técnica
1. Preparar y fijar el frotis o extendido.

2. Cubrir el portaobjeto con el azul de toluidina-verde de malaquita. Dejar actuar por
3-5 minutos (Figura 104).
3. Lavar con agua corriente. Escurrir (Figura 105).
4. Aplicar la solución II (Iodo). Dejar actuar por 1 minuto (Figura 106).
5. Lavar con agua corriente (Figura 107).
6. Secar con papel absorbente o dejar secar al aire.
7. Observar con objetivo de inmersión.
Interpretación
Esta es una coloración estructural que tiñe los gránulos metacromáticos de color
azul-negro y el citoplasma bacteriano, de verde (Figura 108).
A cada grupo le serán entregados frotis de un cultivo de C. diphtheriae

cultivado en un medio de Löeffler. Coloréelos según la técnica de Löeffler y de
Albert y observe los gránulos metacromáticos. Registre sus resultados.
54
Resultados
Estructura observada: _____________________

Coloración:_______________________

Coloración:_______________________
Coloración de Cápsula
La virulencia de los microorganismos patógenos, a menudo se correlaciona

con la producción de cápsula. Por ejemplo, las cepas virulentas de Streptococcus
pneumoniae y Klebsiella sp. producen abundantes polímeros capsulares que protegen
a la bacteria de la fagocitosis. La pérdida, por mutación, de la capacidad de formar
una cápsula, se asocia con la pérdida de la virulencia y el aumento de la facilidad de
destrucción por los fagocitos; pero no afecta la viabilidad. Es decir, que las cápsulas
son prescindibles, al igual que otros apéndices bacterianos.
Estas son estructuras mucilaginosas extracelulares que rodean a algunas

bacterias. Se cree que todas las bacterias poseen más o menos un material capsular,
fácilmente demostrable cuando son teñidas de forma adecuada. La mayoría de las
cápsulas están formadas por polisacáridos.
55
Las cápsulas son difíciles de colorear y además, son fácilmente destruidas o
disueltas. Se utilizan dos métodos para visualizarlas al microscopio de luz: Las
coloraciones de Anthony o Hiss, que utilizan cristal violeta o fucsina básica, para
teñir la célula, y una sal de cobre que es depositada en la parte exterior de la cápsula.
Otro método consiste en el empleo de una coloración negativa, con la cual, las células
quedan suspendidas en tinta china o nigrosina, que va a teñir el fondo, pero no las
células.
Coloración de Hiss
Colorantes de Hiss
1.-Cristal Violeta:
Cristal violeta ...........................................................................................1.00 g.
Disolver el cristal violeta en el agua destilada. Mezclar bien y conservar en frasco
ámbar.
Alternativamente, puede utilizarse una solución acuosa de fucsina al 0.5%.
2.- Sulfato de Cobre (20 %):

CuSO4 5 H2O ..................................................................................... 200.00 g.
Agua destilada. ................................................................ ..................800.00 ml.
Disolver completamente el sulfato de cobre en el agua destilada. Conservar en
frasco ámbar.
Técnica
1. Preparar una suspensión bacteriana en solución salina fisiológica, a partir de un

cultivo puro de Klebsiella pneumoniae.
2. Preparar un extendido, mezclando una asada de la suspensión bacteriana con una
gota de suero normal sobre un portaobjetos limpio y libre de grasa. Dejar secar al
aire y fijar por calor.
56
3. Cubrir el extendido con cristal violeta. Calentar hasta desprendimiento de vapores
durante un minuto aproximadamente.
4. Enjuagar con sulfato de cobre. Nunca con agua.
5. Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical.
6. Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100x).
Interpretación
Las cápsulas aparecerán como un área de color violeta claro alrededor de la
célula bacteriana que toma un color violeta intenso (Figura 109).
Coloración de Hiss Modificada por Anthony
Esta coloración utiliza los mismos colorantes que la coloración de Hiss, sólo
que la técnica ha sido ligeramente modificada.
Colorantes de Anthony
1.-Cristal Violeta:
Cristal violeta ...........................................................................................1.00 g.
Disolver el cristal violeta en el agua destilada. Mezclar bien y conservar en frasco
ámbar.
2.- Sulfato de Cobre (20 %):

CuSO4 5 H2O .....................................................................................200.00 g.
Disolver completamente el sulfato de cobre en el agua destilada. Conservar en
frasco ámbar.
57
Técnica
1. Elaborar un extendido delgado en una lámina portaobjeto, a partir de un cultivo

puro de Klebsiella pneumoniae en leche descremada. Dejar secar al aire. No fijar
con calor.
2. Cubrir la preparación con una solución acuosa de cristal violeta (1%). Dejar actuar
por 2 minutos.
3. Lavar la preparación con una solución de sulfato de cobre al 20%.
4. Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical.
5. Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100x).
Interpretación
Las cápsulas aparecerán como un área de color violeta claro, alrededor de las
bacterias que se tiñen intensamente. Si se utiliza fucsina, las cápsulas aparecerán
como un halo rosado claro alrededor de las bacterias que se tiñen de color rojo
intenso (Figura 110).
Coloración Negativa o por Contraste
Se utiliza cuando el microorganismo (o una parte de él, como la cápsula) se

resiste a tomar los colorantes. En este método, la cápsula desplaza las partículas
coloidales de carbón presentes en la tinta china y se presenta como un halo claro,
alrededor del microorganismo; es decir, el entorno del microorganismo aparece
teñido por efecto del colorante, dejando al organismo incoloro.
Técnica
1. Colocar una pequeña gota de solución salina fisiológica sobre un portaobjetos

limpio y agregar una cantidad muy pequeña de un cultivo joven proveniente de un
cultivo en agar.
58
2. Mezclar bien y luego agregar una pequeña gota de tinta china y cubrir
inmediatamente con un cubreobjetos delgado dejando que la gota se extienda
como una película fina debajo del mismo.
3. Examinar inmediatamente con objetivo de inmersión y bajando el condensador
para reducir la luz en forma marcada.
Interpretación
Las cápsulas se observan como halos claros contra un fondo oscuro (Figura
111).
Nota: No todos los tipos de tinta china son adecuados. Se recomienda la tinta china
Pelikan preparada por Gunther Wagner de Hanover, Alemania. Agregar timerosal al
0.3% (Sigma Chemical Co.) como conservador.
Elabore convenientemente, varios frotis de K. pneumoniae y aplique las

técnicas de coloración para la cápsula. Obsérvelos al microscopio y registre los
resultados.
Resultados

Coloración:_______________________
59

Coloración:_______________________

Coloración:_______________________

Coloración:_______________________
Coloración de Flagelos
Muchas bacterias mótiles poseen flagelos, cuya forma, número y disposición

son características importantes para la diferenciación de especies, en particular,
cuando las reacciones bioquímicas son débiles o equívocas.
La coloración de flagelos no es fácil, es un arte que debe desarrollarse con la

experiencia. Los flagelos son muy frágiles y tienden a desprenderse de la superficie
60
bacteriana durante la manipulación. Muchas células en cultivo pueden no producir
flagelos y la tinción a veces, fracasa.
Coloración de Leifson
En los laboratorios clínicos es más común que se emplee la técnica de Tinción

de Leifson (o una modificación) y no es difícil de llevar a cabo, siempre y cuando se
sigan los detalles exactos en cada paso del procedimiento.
Fundamento
Los flagelos bacterianos pueden teñirse por medio de soluciones alcohólicas

de colorantes de rosanilina que forman un precipitado a medida que el alcohol se
evapora en el procedimiento de tinción. La fucsina básica (acetato de pararrosanilina)
sirve como tinción primaria, con el agregado de ácido tánico a la solución como
mordiente. Puede usarse una contra-tinción, como azul de metileno, para visualizar
mejor las bacterias; en casos en que la tinción primaria resulta débil.
Colorantes de Leifson
1. Solución A: Fucsina Básica al 1.2% en Alcohol al 95%.

Fucsina básica (certificada para tinción) ..................................................... 6.0g
Alcohol etílico (95%) ........................................................................... 50.00ml.
Agregar a la fucsina, el alcohol y agitar 18–24 horas con un agitador magnético
para disolver la fucsina.
2. Solución B: Ácido Tánico al 3% en solución acuosa

Cloruro de sodio .......................................................................................0.37 g.
Ácido tánico .............................................................................................0.75 g.
61
La suspensión debe tener color amarillo claro para ser satisfactoria. Se agrega
fenol con una concentración 1:200 para evitar la aparición de mohos durante el
almacenamiento.
Mezclar cuidadosamente las soluciones A y B. Ajustar el pH con NaOH 1.0

N. Envasar el colorante en un frasco ámbar, bien tapada y dejar durante tres días en el
refrigerador (4ºC) antes de usar, para estabilizar.
El colorante de Leifson puede conservarse durante un mes en refrigeración y

un año o más en congelación. A temperatura ambiente se deteriora rápidamente.
Para el proceso de tinción usar sólo el sobrenadante claro, no agitar el

sedimento que se deposita en el fondo de la botella. Antes de usar, retirar un pequeño
volumen de la solución colorante y dejar que alcance temperatura ambiente.
Descartar la fracción de colorante que pueda sobrar luego de la tinción.
Técnica
1. Usando un cultivo joven en un medio de agar libre de carbohidratos, preparar una

suspensión bacteriana equivalente al tubo 5 del nefelómetro de MacFarland.
(Utilizar agua destilada o desionizada estéril).
2. Colocar dos gotas de la suspensión bacteriana en el extremo de un portaobjetos,
previamente tratado con una solución ácida. Se deja secar al aire. Con un lápiz
graso, trazar una línea perpendicular en la superficie de vidrio hacia el extremo
opuesto a la suspensión seca.
3. Colocar el portaobjeto sobre una rejilla inclinada y cubrir la preparación con una
delgada película del colorante. La marca hecha con el lápiz graso, impide que el
colorante se corra del extremo de la lámina.
4. Teñir durante 5 a 15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que
se evapora el alcohol. El tiempo de coloración disminuye si el colorante es fresco,
si la temperatura ambiente es alta, si hay corrientes de aire en el laboratorio y si la
capa de colorante es delgada. Las condiciones opuestas incrementan el tiempo de
tinción.
62
5. Cuando se forma un precipitado, enjuagar suavemente con agua destilada, escurrir
el exceso de agua y se deja secar al aire.
6. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Interpretación
Deben observarse flagelos de color rojo a azul-negro (Figura 112).
Nota: Los portaobjetos utilizados para esta coloración deben ser sumergidos en
solución de HCl concentrado (3%) en alcohol etílico (95%) durante 4 días. Lavar con
agua corriente (dejar correr el agua sobre las láminas, previamente colocadas en una
jarra de Coplin durante 10 minutos) y luego, enjuagar con varios cambios de agua
destilada. Colocar los portaobjetos en posición vertical para que se sequen al aire.
Inmediatamente antes de usarlos, páselos por la llama del mechero.
Coloración de Ryu
Para la observación de los flagelos, también se aconseja el uso de la tinción de

Ryu, que es fácil de llevar a cabo y da buenos resultados.
Colorantes de Ryu
Solución I:
Fenol al 5% ......................................................................................... 10.00 ml.
Ácido tánico en polvo ..............................................................................2.00 g.
Sulfato de potasio y aluminio saturado con 12 H2O............................. 10.00ml
Agua destilada .................................................................................... .100.00ml
Solución II:
Cristal violeta ..........................................................................................12.00 g
Alcohol etílico (95%) ......................................................................... 100.00ml.
Esta es una solución saturada. Se mezclan 10 partes de la solución I (mordiente)
con una parte de la solución II y se almacena en un frasco plástico a temperatura
ambiente.
63
Procedimiento:
1. Colocar dos gotas de solución salina fisiológica hacia un extremo de un

portaobjetos escrupulosamente limpio.
2. Preparar el frotis tomando parte de un cultivo joven en un medio libre de
carbohidratos (agar nutritivo), tocando suavemente el centro de cada una de las
dos gotas de solución salina fisiológica previamente colocadas. Dejar secar las
gotas a temperatura ambiente.
3. Cubrir los frotis ya secos con la solución colorante durante 1 a 5 minutos (pueden
ser necesarias algunas pruebas para determinar el tiempo que produce la mejor
coloración de los flagelos; pero evitando restos excesivos en el fondo). Quitar el
exceso de colorante con agua.
4. Una vez que los frotis se han secado, examinar con el objetivo de inmersión del
microscopio óptico, comenzando desde la periferia hacia el centro.
Interpretación
Las bacterias y sus flagelos se tiñen de color violeta (Figura 113).
A cada grupo le será entregado un cultivo bacteriano en agar nutritivo.

Proceda a efectuar la coloración de flagelos y registre sus resultados.
Resultados
Estructura observada: ______________________

Coloración:_______________________
64
Coloración de Esporas
Dos géneros bacterianos, Clostridium y Bacillus se caracterizan por producir

esporas. Estas constituyen formas de resistencia más no son estructuras de
reproducción como en los hongos. Pueden tener una localización variable en la célula
bacteriana y estar colocadas en el centro, en la parte terminal o sub-terminal de la
bacteria. Su contenido hídrico es sumamente bajo; por lo tanto, resisten condiciones
de deshidratación que destruyen a las células vegetativas. Contienen ácido
dipicolínico y calcio, los cuales son, al parecer, los responsables de la termo-
resistencia de la espora.
Las esporas son impermeables a los colorantes, y así, pueden ser vistas
ocasionalmente, como áreas incoloras en preparaciones teñidas con Gram. Debido a
la poca permeabilidad de la espora es necesario calentar suavemente el colorante para
que penetre.
Coloración de Wirtz-Conklin
Colorantes de Wirtz-Conklin
1. Verde de Malaquita
Verde de malaquita ..................................................................................5.00 g.
Disolver el verde de malaquita en agua destilada.
2. Safranina
Safranina ....................................................................................................0.5 g.
Disolver la safranina en el agua destilada.
Técnica:
1. Colocar un frotis seco no fijado sobre un soporte para coloración, someter a

calentamiento sobre un vaso de precipitado conteniendo agua hirviente
65
(Alternativamente, puede colocarse la lámina sobre un soporte para coloración y
utilizar un mechero). Permitir que el agua de condensación forme gotas en el
reverso de la lámina. (Es importante no fijar el frotis antes, ya que el vapor facilita
la penetración del colorante. La fijación de la espora previa a la tinción, no permite
la acción del vapor).
2. Cubrir la preparación con verde de malaquita (Figura 114)
3. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante 3 a 6 minutos. Agregar más
colorante para evitar que se seque la preparación (Figura 115).
4. Dejar enfriar y lavar con agua corriente (Figura 116).
5. Colorear con safranina durante 30 segundos (Figura 117).
6. Lavar, dejar secar al aire y examinar con objetivo de inmersión (Figura 118).
Interpretación
Las esporas se presentan como esferas verdes dentro de bacilos rojos (Figura
119).
Nota: Esta coloración es similar a la descrita por Schaeffler y Foulton variando sólo
los tiempos de coloración: verde de malaquita: 5 minutos; lavar por 30 segundos y
safranina, un minuto.
Coloración de Dorner (Modificada)
Colorantes de Dorner
1. Fucsina fenicada
Fucsina Básica ..........................................................................................4.00 g.
Etanol (95%) ....................................................................................... 20.00 ml.
Fenol, cristales fundidos........................................................................ 5.00 ml.
Disolver la fucsina básica en el alcohol y agregar lentamente el agua mientras se
agita. Agregar el fenol a la solución de fucsina.
66
2. Nigrosina
Nigrosina. ............................................................................................ 10.00 ml.
Diluir la nigrosina para obtener una solución al 10%, calentar hasta ebullición y
filtrar.
Técnica
1. En un tubo de ensayo que contiene solución salina fisiológica, preparar una

suspensión concentrada del microorganismo y agregar un volumen igual de
fucsina fenicada recientemente filtrada.
2. Colocar el tubo en un baño con agua en ebullición durante 5-10 min.
3. Sobre un portaobjetos limpio, mezclar una gota de la suspensión anterior con una
gota de solución de nigrosina.
4. Extender y secar rápidamente con calor suave.
5. Examinar con objetivo de inmersión.
Interpretación
Las esporas se tiñen de color rojo y las células bacterianas aparecen casi
incoloras contra un fondo gris oscuro.
Elabore un frotis de un microorganismo esporulado y coloréelo, según las técnicas

descritas. Obsérvelos al microscopio y registre sus observaciones.
67
Resultados

Coloración:_______________________

Coloración:_______________________
1. Complete los siguientes enunciados:
a) Una suspensión bacteriana hecha sobre una lámina portaobjeto se

denomina______________.
b) La coloración de Gram es un ejemplo de una coloración______________.
c) Las esporas usualmente aparecen_______________ en preparaciones

coloreadas con Gram.
d) Las reacciones a la coloración de Gram son confiables sólo para cultivos de

_________ horas o menos.
e) El paso más crítico en la tinción de Gram es _______________________.
f) La coloración de Ziehl Neelsen se utiliza para identificar___________..
2.¿Por qué un organismo Gram positivo puede aparecer como Gram negativo?.
68
3.¿Puede agregarse el lugol antes que el colorante primario en la coloración de
Gram?¿Por qué?.
4.¿Por qué se utiliza sulfato de cobre para lavar durante la coloración de cápsula y no
agua?.
5.¿Qué tipo de medio de cultivo debe utilizarse para incrementar el tamaño de la

cápsula?.
6.En la siguiente tabla, liste los pasos de la coloración de Gram, en orden, e indique el
color de las bacterias Gram positiva y Gram negativa después de cada paso.
Paso Reactivo Apariencia
Gram(+) Gram(-)
8
69
7. ¿Qué importancia tienen los gránulos metacromáticos en la práctica clínica?
8. Señale las diferencias existentes entre las coloraciones para gránulos

metacromáticos.
9.En la siguiente tabla, liste en orden, los cambios en los BAR y no BAR durante
cada paso de la coloración de Ziehl Neelsen.
Paso Reactivo Apariencia
BAR No BAR
10. Complete la siguiente tabla mostrando los cambios en bacterias esporuladas y no

esporuladas en cada paso de la coloración de Wirtz-Conklin.
70
Paso Químico Apariencia
Esporas Células vegetativas
11.¿Por qué los medios donde crecen bacterias para realizar coloración de flagelos
deben estar libres de carbohidratos?.
12. ¿Qué utilidad tiene el ácido tánico en la coloración de flagelos?.

71
Unidad III
Nutrición y Crecimiento Bacteriano
Objetivos Terminales
 Realizar las técnicas asépticas de transferencia de bacterias en el laboratorio.

 Reconocer la morfología colonial bacteriana en diferentes medios de cultivo.
 Analizar la influencia de las condiciones físico-químicas sobre el crecimiento
bacteriano.
 Cuantificar el crecimiento bacteriano utilizando diferentes métodos.
72
Técnicas de Siembra y Morfología Colonial
1. Realizar las técnicas de inoculación en diferentes medios de cultivo.
2. Ejecutar adecuadamente las diferentes técnicas de aislamiento de colonias en
medios de cultivo.
3. Reconocer las características macroscópicas de las colonias bacterianas en medios
de cultivo enriquecidos.
4. Relacionar la morfología colonial bacteriana en medios diferenciales y selectivos
con la actividad metabólica del microorganismo.
Técnicas de Siembra o Inoculación
En Bacteriología se entiende por Siembra o Inoculación, al acto de colocar el

material que se va a investigar en medios de cultivo apropiados, para favorecer el
crecimiento de las bacterias existentes en una muestra.
Es importante la práctica de técnicas asépticas que permitan la transferencia e

inoculación de los medios de cultivo, sin que se produzca contaminación de los
cultivos por microorganismos no deseados.
El equipo necesario para la inoculación primaria de muestras es relativamente

simple: a) asa bacteriológica (en aro o en punta), b) hisopos o varillas de vidrio, c)
pipetas Pasteur o serológicas. y d) medios de cultivo en tubos o en placas
Las técnicas para efectuar una siembra varían según se trate de medios sólidos,
líquidos o semisólidos.
73
1) Inoculación de medios líquidos
Para la transferencia e inoculación aséptica del material se procede de la

siguiente forma:
a) Se esteriliza el asa de inoculación a la llama directa del mechero hasta que el
alambre quede al rojo vivo y se deja enfriar en la zona estéril alrededor del
mechero (Figura 120).
b) Con una mano tome el tubo con crecimiento microbiano y destápelo, sostenga
el tapón entre los dedos meñique y anular y la palma de su otra mano (Figura
121).
c) Esterilice la boca del tubo pasándolo ligeramente por la llama del mechero
(flameado) (Figura 122)
d) Introduzca el asa y tome el inóculo (Figura 123).
e) Esterilice de nuevo la boca del tubo y tápelo.
f) Los medios líquidos en tubo se inoculan introduciendo el asa de inoculación

en forma perpendicular en el tubo y haciendo un ligero movimiento de vaivén
en el líquido. Se debe flamear la boca del tubo antes y después de inocular el
medio (Figura 124).
g) Una vez inoculado el medio, el asa debe esterilizarse nuevamente.
Si la siembra es de un medio líquido a otro, también puede hacerse “boca a boca”

directamente de tubo a tubo.
Si la siembra es a partir de crecimiento en una placa de agar se toma el

inóculo tocando una colonia aislada
2)Inoculación en medios sólidos y semi-sólidos en tubo
a) Repita los procedimientos de la “a” hasta la “e”.

74
 Medios en taco:
b) Los medios semisólidos, como la motilidad, se siembran por punción del taco con
un asa en punta, sin llegar al fondo. La inoculación debe realizarse en el centro del
medio de cultivo. Es importante que el alambre de inoculación sea retirado a lo
largo de la misma trayectoria que se usó para atravesar inicialmente el medio. Un
movimiento en abanico puede dar como resultado un patrón de crecimiento a lo
largo de la línea de inoculación que puede interpretarse erróneamente como
motilidad bacteriana (Figura 125).
 Medios en taco y bisel:
c) Como por ejemplo, el TSI, se inoculan por punción del taco y rayado del bisel. La
inoculación de un pico de flauta (planos inclinados o biseles) se hace con un asa de
inoculación en punta. Primero, se atraviesa el agar con el alambre hasta el fondo
del tubo y luego, éste se retira con un movimiento en “S” ó zig-zag a través del
agar en el bisel para diseminar el inóculo. Alternativamente, puede rayarse
primero el bisel y luego punzar el taco (Figura 126a y 126b).
En ocasiones, se inocula sólo el bisel o plano inclinado, sin punzar el taco.

Este es el caso del Agar Nutritivo (AN) y ciertos medios para pruebas bioquímicas
que se estudiarán posteriormente.
d) Esterilice el asa una vez inoculado el medio.
3) Inoculación de medios en placa
El inóculo primario puede colocarse con asa (en aro), hisopo o pipeta. Una
vez colocado dicho inóculo, con el asa se disemina el material en la placa, haciendo
estrías con un movimiento en zig-zag sobre la superficie de la placa (Figura 127).
Nota: Si la muestra a inocular es líquida puede utilizarse una pipeta y luego se
disemina el inóculo con el asa.
75
Evite hablar mientras efectúa la siembra, pues puede contaminar los cultivos.
Técnicas de Aislamiento de Colonias en Medios Sólidos
En los medios de cultivo sólidos (en placas), los microorganismos de una misma
especie pueden ser separados en pequeñas agrupaciones llamadas Colonias.
Para aislar colonias en los medios sólidos pueden utilizarse varios métodos:
 Aislamiento por vaciado
 Aislamiento por extensión
 Aislamiento por agotamiento
1) Aislamiento por vaciado
Este método consiste en inocular una muestra líquida o un homogeneizado sobre el

agar cuando todavía se encuentra líquido (45ºC), y luego se vacía sobre la Placa de
Petri estéril. En esta forma se obtienen colonias a través del medio y sobre la
superficie. La técnica será descrita detalladamente en la actividad práctica de
medición del crecimiento bacteriano.
Nota: Esta técnica se utiliza para el recuento (contaje) de colonias a partir de
muestras de agua y alimentos.
2) Aislamiento por extensión
Este método consiste en inocular una muestra líquida o un homogeneizado sobre

la superficie del agar y luego se distribuye uniformemente con la finalidad de obtener
colonias aisladas sobre la superficie del medio de cultivo. La técnica será descrita con
más detalles en la actividad práctica de medición del crecimiento bacteriano.
76
Nota: Esta técnica se utiliza para el recuento de colonias a partir de muestras de agua
y alimentos. También se aplica para la cuantificación de bacterias en muestras de
orina.
3) Aislamiento por agotamiento
Consiste en sembrar los microorganismos por rayado sobre un medio sólido,

partiendo de inóculos concentrados de bacterias con el objeto de obtener colonias
aisladas.
Técnica
1. Seleccione de una placa, la colonia deseada o tome con el asa una porción del
crecimiento.
2. La placa se inocula en cuatro cuadrantes. Raye el primer cuadrante haciendo tantas
estrías como sea posible.
3. Esterilice el asa y déjela enfriar, gire la placa hacia el segundo cuadrante, estríe
tocando una pequeña área del sector inoculado anteriormente.
4. Esterilice el asa y déjela enfriar, gire la placa hacia el tercer cuadrante, estríe
tocando una pequeña área del segundo sector.
5. Esterilice nuevamente el asa y deje enfriar, gire hacia el cuarto cuadrante, raye
tocando una pequeña porción del tercer sector inoculado, luego estríe el área
remanente de la superficie del agar teniendo cuidado de no hacer contacto adicional
con las partes ya inoculadas.
6. Después de incubar las placas a una temperatura, atmósfera y tiempo adecuados, en
el último cuadrante inoculado aparecerán colonias aisladas (Figura 128).
A cada grupo se le entregará una variedad de medios de cultivo. Practique las

diferentes técnicas de siembra explicadas anteriormente, utilizando para ello los
cultivos que le serán suministrados. En caso de duda, consulte a su asesor.
77
Morfología Colonial
La observación de las características macroscópicas de las colonias,

habitualmente se lleva a cabo por medio de la inspección visual del crecimiento en la
superficie de placas de agar. Para ello se sostiene la placa en una mano y se observa
la superficie del agar en busca de crecimiento bacteriano.
Cada placa debe estudiarse con cuidado porque las bacterias inicialmente
recuperadas de muestras, a menudo crecen produciendo cultivos mixtos; por lo tanto,
pueden observarse tipos variados de colonias. En ocasiones, colonias puntiformes de
bacterias que crecen lentamente pueden pasar inadvertidas entre colonias más
grandes, en particular, si el crecimiento tiene tendencia a diseminarse sobre la
superficie de la placa.
Durante la observación, las placas deben inclinarse en diversas direcciones, con

una iluminación directa y brillante, de modo que la luz se refleje desde varios
ángulos. Es aconsejable el uso de una lupa para detectar las colonias diminutas y
observar mejor sus características.
En medios enriquecidos como Agar Sangre (AS) y Gelosa Chocolate (GC) se

pueden visualizar características de las colonias que son útiles para una
identificación bacteriana preliminar, tales como:
 Tamaño: diámetro en mm.
 Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiformes.
 Elevación: plana, elevada, convexa, pulvinada (en forma de cojín),
umbonada, umbilicada.
 Borde o Margen: entero, ondulado, lobulado, erosionado, filamentoso,
rizado.
 Color: gris, blanco, amarillo, negro, marrón, naranja.
 Superficie: regular e irregular.
 Opacidad (densidad): opaca, traslúcida, transparente, brillante.
 Consistencia: cremosa, mantecosa, quebradiza, viscosa, membranosa, seca,
mucosa (Figura 129).
78
En medios diferenciales como Mac Conkey (MC) y en medios selectivos como
Xilosa-Lisina-Desoxicolato(XLD),Salmonella-Shigella agar (SSA) y Agar Tiosulfato-
Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS); además de las características antes mencionadas, se
pueden observar propiedades metabólicas útiles para la identificación bacteriana
(fermentación de carbohidratos, decarboxilación de aminoácidos, entre otras).
Características de las Colonias Bacterianas en Medios de Cultivo

Diferenciales, Selectivos y Enriquecidos (Figuras 130-145)
A cada grupo de estudiantes se le suministrará una serie de medios de cultivo

en placas que contienen diferentes microorganismos. Examine las características
de las colonias en los diferentes medios de cultivo.
Resultados
Anote las características de las colonias bacterias, haciendo énfasis en las

propiedades más resaltantes.
Bacteria: ___________________________________
Medios de Cultivo: ___________________________
Características:______________________________
Actividad metabólica:_________________________
Bacteria: ___________________________________
Bacteria: ___________________________________
79
Actividad metabólica:________________________
Bacteria: ___________________________________
Bacteria: ___________________________________
Bacteria: ___________________________________
Bacteria: ___________________________________
Bacteria: ___________________________________
Bacteria: ___________________________________
80
1. ¿Por qué es importante utilizar técnicas asépticas para la inoculación de medios de

cultivo?
2. ¿Cuál es el propósito de flamear el asa antes y después de su uso?
3. ¿Señale la importancia de enfriar el asa antes y después de tocar un cultivo?
4. ¿Qué es un cultivo puro?
5. ¿Cómo puede determinarse si una colonia es un contaminante en una placa

rayada?
6. ¿Cuál es la finalidad de inocular un microorganismo en un medio en taco, en taco

y bisel, en bisel y en caldo?.
7. Indique 5 características útiles para la descripción de las colonias bacterianas.
8. ¿Qué utilidad tiene la observación de la morfología de las colonias bacterianas?

81
a) El término utilizado cuando un cultivo se coloca a una temperatura específica

por un tiempo determinado es________________.
b) Una masa de células creciendo en la superficie de un agar se
denomina________________.
c) Un __________ es un microorganismo no deseado en un cultivo puro.
d) Cuando se desea obtener colonias aisladas se inocula un
medio________________________
82
Factores Físicos que afectan el Crecimiento Bacteriano
Objetivo Específico:
1. Demostrar la influencia que ejercen diversos factores físicos sobre el crecimiento

bacteriano.
Factores Físicos
Los procariotas son microorganismos extremadamente adaptables, pueden

sobrevivir en casi todos los ambientes naturales y son capaces de crecer bajo amplios
rangos de condiciones físicas, tales como: tensión de oxígeno, concentración de
hidrogeniones (pH) y temperatura.
Los factores ambientales que pueden influir sobre el crecimiento de las

bacterias se dividen en físicos y químicos. Los factores físicos ejercen su influencia a
través de la constitución química de la célula o influyendo en la química del medio
ambiente. Así, la temperatura, la presión y la radiación se considerarán claramente
como físicos, mientras que los antisépticos y desinfectantes son agentes químicos. No
obstante, la presión osmótica puede ser considerada como factor físico o como fisico-
químico; pero, en cualquier caso, no puede ser relegado de los efectos químicos
debido a que interviene en los niveles de concentración iónica.
Así como las bacterias varían ampliamente en sus requerimientos

nutricionales, también muestran respuestas diversas a las condiciones físicas del
medio. Estas condiciones incluyen: temperatura, concentración de hidrogeniones
(pH), potencial de oxido-reducción, tensión de oxígeno, presión osmótica,
concentración salina, entre otras.
83
1. Temperatura
Las bacterias se dividen en tres grupos, teniendo como base su temperatura

óptima de crecimiento:
a) Psicrófilas o Criófilas: crecen en un rango de temperatura que va de 5°C a 30°C,

con una temperatura óptima de crecimiento de 10 a 20ºC.
b) Mesófilas: crecen en un rango de 10 a 45ºC, con una temperatura óptima de 20 a
40ºC.
c) Termófilas: crecen en un rango de 25 a 80ºC, con una temperatura óptima de 50
a 60ºC.
Las bacterias patógenas para el hombre crecen, generalmente, entre 35-37ºC; es

decir, a temperaturas similares a la corporal (mesófilas).
Es conveniente resaltar que algunas especies bacterianas no muestran las

mismas características fenotípicas, cuando se desarrollan a diferentes temperaturas.
Por ejemplo, algunas bacterias producen un pigmento característico a bajas
temperaturas; pero no lo producen o lo hacen en muy poca cantidad a altas
temperaturas. Tal es el caso de Serratia marcescens que produce un pigmento rojo a
25ºC; más no a 35ºC.
a) Para verificar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de las bacterias, a

cada grupo de trabajo le será entregada una cepa de Campylobacter sp. Esta
bacteria se inoculará en tres caldos tioglicolato (1 ml), los cuales serán incubados a
diferentes temperaturas: 25ºC, 35ºC y 42ºC. Incube los caldos por 24 horas en
condiciones de microaerofilia y observe el crecimiento. Registre e interprete los
resultados obtenidos.
b) Para poner en evidencia el efecto de la temperatura sobre la expresión de ciertas

características fenotípicas de las bacterias, se entregarán a cada grupo dos placas
84
de AN. Cada una de estas placas será inoculada con una cepa de Serratia
marcescens para luego ser incubadas, una a temperatura ambiente (25ºC) y la otra
a 35ºC (en estufa), por 24 horas. Transcurrido este tiempo proceda a leer la prueba
e interpretar los resultados.
Resultados
En las tablas siguientes, anote los resultados observados en relación con la

influencia de la temperatura sobre la producción de pigmento y el crecimiento
bacteriano.
Producción de Pigmento a 25ºC Producción de Pigmento a

S. marcescens 35ºC
Crecimiento a Campylobacter
25ºC
35ºC
42ºC
Clasificación según temperatura óptima de crecimiento
2. Concentración de hidrogeniones (pH)
La mayoría de las bacterias crecen bien a pH entre 6.0 y 9.0 y toleran cambios
de pH de hasta 3 unidades; pero, todo cambio superior a una unidad, afecta el
crecimiento. Sin embargo, existe un pH óptimo de crecimiento bacteriano.
Las bacterias pueden ser clasificadas como: acidófilas, alcalófilas o basófilas y

neutrófilas. Las bacterias acidófilas crecen en un rango de pH entre 0 y 5.4. Las
neutrófilas crecen a un rango de pH entre 5.4 y 8.5. A este grupo pertenecen la
85
mayoría de las bacterias que causan enfermedad en el hombre. Las bacterias
alcalófilas, crecen en un rango de pH entre 7.0 y 11.5.
Para determinar el efecto del pH sobre el crecimiento de los microorganismos,

a cada grupo le serán suministradas placas de Agar Nutritivo (AN), cuyos pH han
sido ajustados a 3, 5, 7 y 9. Proceda a dividir el fondo de la placa en cuatro (4)
cuadrantes e inocule en cada sector, uno de los microorganismos siguientes:
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis.
Incube las placas a 35ºC por 24 horas, en aerobiosis. Observe el crecimiento, registre
e interprete los resultados.
Resultados
En la tabla anexa anote e interprete los resultados de la influencia del pH sobre el

crecimiento bacteriano.
Crecimiento a Microorganismo
pH E.coli S.aureus B.subtilis A.faecalis
3
5
7
9
Clasificación
según pH óptimo
de crecimiento
3. Tensión de oxigeno y potencial de óxido-reducción
El oxígeno es un componente universal de las células y casi siempre es

suministrado por el agua en gran cantidad. El requerimiento de oxígeno de una
bacteria en particular, refleja el mecanismo empleado para satisfacer sus necesidades
86
energéticas. Basándose en los requerimientos de oxígeno, las bacterias pueden
dividirse en cinco grupos:
a) Aerobios estrictos (obligados): requieren del oxígeno para crecer. Su

metabolismo es siempre aeróbico (respiración aeróbica). Ej: Mycobacterium
tuberculosis.
b) Anaerobios estrictos (obligados): crecen solo bajo condiciones de alta

intensidad reductora; el oxígeno es tóxico para estas bacterias. Su metabolismo
es de tipo anaerobio (fermentación o respiración anaeróbica) Ej: Clostridium
tetani.
c) Anaerobios facultativos (aerobios faculativos): son capaces de crecer, en

presencia o ausencia de oxígeno. En anaerobiosis utilizan la fermentación o la
respiración anaeróbica, pero en presencia de oxígeno cambian a respiración
aeróbica Ej: Escherichia coli.
d) Anaerobios aerotolerantes: son aquellos anaerobios que no mueren por

exposición al oxígeno, pero su metabolismo es siempre fermentativo. Ej:
bacterias ácido lácticas.
e) Microaerofílicos: crecen en presencia de bajas concentraciones de oxígeno libre,

y son inhibidas por altas tensiones de este gas. Ej: Campylobacter sp.
Las bacterias anaerobias estrictas, sólo se podrán desarrollar si se toman

precauciones especiales para expulsar todo el oxígeno atmosférico del medio. Se
puede obtener un ambiente de anaerobiosis por cualquiera de los siguientes métodos:
a) Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, por ejemplo, tioglicolato

de sodio o cisteína, para disminuir el contenido de oxígeno.
b) Eliminando el oxígeno de los envases cerrados que contienen el medio de cultivo
por procedimientos mecánicos, el aire se expulsa por bombeo y se reemplaza con
nitrógeno, helio o una mezcla de nitrógeno y dióxido de carbono.
87
c) Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de
cultivo inoculado, para combinar el oxígeno libre con otro compuesto; esto puede
conseguirse con el empleo de la Campana de Gaspak, en cuyo interior se crea un
ambiente de anaerobiosis a través de un sobre de Gaspak (BBL)® que contiene en
su interior dos pastillas: a) Borohidrato de sodio y b) Bicarbonato de Sodio y
Ácido Cítrico. La campana está provista en su tapa de Palladium, el cual actúa
como catalizador de la reacción. A este sobre, se le añaden 10 ml. de agua para
que libere hidrógeno que se combina con el oxígeno presente en el medio dando
origen a la formación de gotitas de agua en la campana de Gaspak.
2 H2 + O2 2 H2O
Se recomienda el empleo de indicadores, tales como el azul de metileno, que

en presencia de oxígeno se muestra de color azul y, en condiciones de anaerobiosis es
incoloro.
Existe otro sistema para crear una atmósfera de anaerobiosis, el Anaerocult

A (Merck) que contiene componentes que fijan químicamente en forma completa el
oxígeno dentro de breve tiempo y producen un medio exento de O 2 (anaerobio). Las
almohadillas contienen tierra silícea, hierro en polvo, ácido cítrico y carbonato
sódico. Para su empleo deben añadirse uniformemente 35 ml. de agua, dentro de 15-
20 segundos, sobre el papel especial de anaerocult ; teniendo la precaución de
mantener la almohadilla lo más horizontalmente posible. Inmediatamente después,
introducir la almohadilla humedecida en la campana de anaerobiosis, de manera que
la página impresa esté dirigida hacia las placas. Humedecer una tira de anaerotest 
con una gota de agua y fijarla en la campana, la zona reactiva de la tira indicadora
debe quedar colgando libremente en el aire. Cerrar inmediatamente la campana. La
condición de anaerobiosis es indicada por el viraje de color de la tira de anaerotest 
de azul a blanco tras aproximadamente 4 horas.
d) Si se trata de medios líquidos puede crearse un ambiente anaeróbico cubriéndolos

con vaselina, parafina o aceite mineral estéril.
88
Para el crecimiento de las bacterias microaerofílicas se requiere el empleo de
ambientes con una concentración ente 5 y 10% CO2. Para esto, se colocan los medios
inoculados en una jarra o campana en cuyo interior se enciende una vela blanca. Se
tapa la campana y se espera a que la vela se apague. Cuando esto sucede se ha creado
un ambiente microaerofílico en el interior de la campana. (Método de la Vela).
El potencial de óxido reducción (Eh) es un factor crítico para determinar si

habrá o no crecimiento de un inóculo bacteriano cuando éste sea transferido a un
medio fresco. Es una medida cuantitativa de la capacidad del sistema de aceptar o
ceder electrones en forma reversible, con referencia al electrodo de hidrógeno
estándar. Un potencial más positivo que otro, tiene mayor tendencia a aceptar
electrones; es decir, es un agente oxidante más fuerte. Para la mayoría de los medios
en contacto con el aire a pH 7.0, el Eh es aproximadamente + 0.2 a 0.4 v (+200 a +
400 mv).
Según el grupo de bacterias se tienen los siguientes Eh:

a) Aerobios estrictos:+300 mv a-50 mv.
b) Anaerobios facultativos:+300 mv a–420 mv.
c) Anaerobios aerotolerantes:+180 mv a-350 mv.
d) Anaerobios estrictos:-150 mv a-420 mv.
a) A fin de verificar el efecto de la tensión de oxígeno y el potencial redox sobre el

crecimiento bacteriano proceda a inocular dos placas: una de Agar Sangre
Humana (ASH) y otra de Agar Sangre Anaerobiosis (ASA) con los siguientes
microorganismos: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Clostridium sp.
(Divida cada placa en tres partes iguales). Incube la placa de ASH en aerobiosis y
la de ASA en condiciones de anaerobiosis, por 24 horas a 35ºC. Transcurrido el
tiempo de incubación, proceda a observar el crecimiento de los microorganismos
y clasifíquelos de acuerdo a sus requerimientos de oxígeno. Un microorganismo
aerobio estricto crecerá solamente en la placa de ASH incubada en presencia de
oxígeno; un microorganismo anaerobio estricto, crecerá sólo en la placa incubada
89
anaeróbicamente y uno anaerobio facultativo, crecerá en ambas placas por igual.
El efecto de la tensión de oxígeno también puede verificarse en medios líquidos.
A este fin, proceda a inocular con cada uno de los microorganismos utilizados en
la parte a, un caldo tioglicolato. Incube los tubos herméticamente cerrados, en la
estufa a 37°C por 24 horas. Un microorganismo anaerobio estricto crecerá sólo
en el fondo del tubo; un aerobio estricto lo hará solamente en la parte superior y
un anaerobio facultativo, crecerá por igual a todo lo largo de la columna del
caldo.
Resultados
Observe el crecimiento de los microorganismos en los diferentes medios de

cultivo, anote los resultados y clasifique los microorganismos convenientemente.
Microorganismo
Crecimiento en
E. coli Ps. aeruginosa Clostridium sp.
ASH
ASA
CT (en el fondo
del caldo)
CT (en todo el
caldo)
CT (en la
superficie del
caldo)
Clasificación
según tensión de
O2
b) Para verificar la influencia de la tensión de oxígeno sobre el crecimiento de los

microorganismos microaerofílicos proceda de la siguiente manera: inocule dos
placas de GC con una cepa de Haemophilus sp. Incube a 37ºC por 24 horas, una
placa en condiciones de aerobiosis y la otra, en ambiente microaerofílico por el
90
método de la vela (5–10%CO2). Observe el crecimiento obtenido e interprete los
resultados.
En la tabla anexa anote e interprete el resultado de acuerdo al crecimiento del

microorganismo bajo diferentes tensiones de oxígeno.
Crecimiento en H. influenzae
Aerobiosis
5-10% CO2
Clasificación según tensión de O2
4. Presión osmótica
Ósmosis es la difusión de un solvente a través de una membrana

semipermeable que separa dos soluciones de diferentes concentraciones. Al término
de la difusión, la concentración es igual en ambos lados de la membrana. Por
ejemplo, si una célula bacteriana está suspendida en una solución que contenga 20%
de NaCl (medio hipertónico), el agua pasará a través de la membrana celular (que es
semipermeable) de la región de menor concentración de sustancias disueltas (el
interior de la célula) a la solución que rodea la célula y, como resultado la célula se
deshidratará. A este fenómeno se le denomina Plasmólisis.
Si la situación se invierte y las bacterias se colocan en una solución con una

concentración menor del 1% (medio hipotónico), la corriente se invertirá, y el agua
pasará de la solución al interior de la célula, se produce una gran presión osmótica
por la cantidad de agua acumulada en el interior. Esto se conoce como Plasmoptisis.
Las bacterias poseen paredes muy rígidas y, generalmente, no presentan

cambios aparentes de tamaño o forma cuando ocurre plasmólisis o plasmoptisis.
Algunas bacterias se han adaptado muy bien a elevadas presiones osmóticas y son
capaces de crecer en un medio de alta concentración salina; incluso, algunos
necesitan grandes cantidades de sal o azúcar para desarrollarse. Tales organismos se
denominan Osmófilos, cuando son capaces de desarrollarse en medios con alta
91
concentración de azúcar o Halofílicos, cuando requieren grandes cantidades de sal
para su desarrollo.
Existe otro grupo de bacterias capaces de crecer a concentraciones moderadas e

incluso en ausencia de NaCl, las Halotolerantes.
Para determinar el efecto de la presión osmótica y la concentración de sal sobre

el crecimiento de las bacterias, se procederá de la siguiente manera:
a) A cada grupo se le hará entrega de placas de AN con diferentes concentraciones de

sucrosa: 0, 5, 15, 30 y 60%, respectivamente. Divida cada placa en cuatro
cuadrantes e inocule en cada uno un microorganismo de los siguientes:
Escherichia coli; Bacillus subtilis; Staphylococcus aureus y Alcalígenes faecalis.
Incube las placas a 37ºC por 24 horas. Lea e interprete los resultados obtenidos.
b) Proceda de manera semejante a inocular cuatro placas de AN con diferentes
concentraciones de NaCl (0; 0.5; 5; 15 y 25%, respectivamente). Incube de la
misma manera. Lea e interprete los resultados obtenidos.
Resultados
Interprete el comportamiento del microorganismo según la presión osmótica.

Reporte el grado del crecimiento bacteriano de la siguiente forma: ausente, escaso,
moderado, abundante.
92
Crecimiento en E. coli S. aureus A. faecalis B. subtilis
Sucrosa al 0%
Sucrosa al 5%
Sucrosa al 15%
Sucrosa al 30%
Sucrosa al 60%
Interpretación
Crecimiento en E. coli S. aureus A. faecalis B. subtilis

NaCl al 0%
NaCl al 0,5%
NaCl al 5%
NaCl al 15%
NaCl al 25%
Interpretación
1. Compare una bacteria aerotolerante y una anaerobia estricta en términos de su

capacidad para crecer en presencia de O2
2. ¿En qué se diferencia un microorganismo anaerobio aerotolerante de un

microaerofílico?
3. ¿Por qué las bacterias que infectan al hombre crecen a temperaturas cercanas a la
corporal?
4. ¿Cómo se puede lograr un ambiente anaerobio utilizando métodos químicos?

93
5. ¿Explique el fenómeno que sucede cuando las bacterias se colocan en un medio
hipotónico?
6. Indique tres factores físicos que pueden influir en las características de crecimiento
de una bacteria en un medio que contiene agar.
1. Las bacterias que crecen en el fondo de un caldo de cultivo son referidas

como______________.
2. Las bacterias____________ crecen a temperaturas que oscilan entre 20-40°C.
3. Las bacterias ______________ requieren del oxígeno para su crecimiento.
4. Las bacterias___________ crecen a pH ácido.

94
Medición del Crecimiento Bacteriano
1. Realizar el contaje de colonias bacterianas, previa dilución de la muestra.

2. Efectuar mediciones turbidimétricas de un cultivo bacteriano.
3. Relacionar el contaje de colonias con la absorbancia mediante la elaboración de un
gráfico.
Cuantificación del Crecimiento Bacteriano
No solamente es importante el aislamiento de las bacterias, sino también,

conocer el número o masa de células en una muestra. Existen muchas formas de
cuantificar el crecimiento bacteriano para determinar la velocidad de crecimiento y el
tiempo de generación. Se puede medir tanto la masa como el número celular en la
población, porque el crecimiento origina un incremento en ambos.
En la actualidad se dispone de un gran número de métodos directos para medir

el crecimiento bacteriano: determinación del numero más probable (NMP), contaje
microscópico directo, contadores automáticos de células, contaje en placa,
determinación del peso seco. Además, existen métodos indirectos tales com:
mediciones turbidimétricas de un cultivo líquido y medición de un componente
celular importante, como las proteínas.
En la presente actividad práctica se aplicarán dos métodos ampliamente

utilizados para medir el crecimiento bacteriano: contaje en placa (directo) y
turbidimetría (indirecto), y se relacionarán ambos parámetros a través de la
elaboración de un gráfico, que nos permitirá determinar la concentración celular de
un cultivo puro de un microorganismo.
95
Contaje en Placas
Se dice que una célula es viable cuando es capaz de dividirse para dar lugar a
descendencia.
El contaje en placas se lleva a cabo determinando el número de células

capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio sólido. Por esta razón, a
menudo a este método se le denomina contaje de colonias. Este tipo de contaje se
basa en que cada célula viable puede dar lugar a una colonia.
El número original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse

a partir del número de colonias formadas y la dilución de la muestra. Por ejemplo, si
1 ml de una dilución de 1x10-6 produce 150 colonias, la muestra original contendría
alrededor de 1,5x108 células/ml. Normalmente, el recuento es más exacto si se utiliza
un contador especial de colonias (Figura 146).
Se pueden emplear dos técnicas de siembra para realizar el contaje en placas:

siembra por extensión y siembra en profundidad (vaciado). En la técnica de siembra
por extensión, un volumen no mayor de 0,1 ml de la dilución de la muestra, se
extiende por toda la superficie del medio utilizando una varilla de vidrio estéril,
doblada en forma de L. La placa se incuba bajo las condiciones de tiempo,
temperatura y atmósfera apropiadas.
En la técnica de siembra en profundidad, se coloca 1 ml de la dilución de la

muestra en un medio de cultivo previamente fundido y enfriado hasta
aproximadamente 40–45°C; después de mezclado se vierte rápidamente en una placa
de Petri estéril, se deja solidificar y se incuba (Figura 147).
Con los dos métodos anteriores el número de colonias que se desarrollan en

las placas no debe ser muy elevado para poder contar adecuadamente y, por otra
parte, el número de colonias no debe ser muy bajo para que el contaje tenga
significado estadístico. La práctica habitual es que el número de colonias oscile entre
30 y 300 por placa.
96
Por lo general, para obtener el número apropiado de colonias la muestra debe
ser diluida. Debido a que habitualmente no se conoce la carga microbiana de la
muestra, es necesario realizar diluciones seriadas, generalmente en base 10 (ejemplo:
10-1, 10-2, 10-3) (Fig. 3). Mientras mayor sea la carga microbiana de la muestra
(alimento, agua, suelo) mayor será el número de diluciones a preparar para conseguir
el número apropiadas de colonias para el contaje (entre 30 y 300) (Figura 148).
Fuentes de error en el método de contaje en placa
 El número de colonias obtenido en un contaje en placa depende no solamente del

tamaño del inóculo; sino también, del medio de cultivo y las condiciones de
incubación empleadas. El recuento será bajo si el medio de cultivo empleado no
puede respaldar el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes
en la muestra.
 En la siembra en profundidad, si la temperatura del agar fundido es elevada (por

encima de 45ºC) puede dañar o destruir células sensibles; por ello, la siembra por
extensión ofrece a veces recuentos superiores en comparación a la técnica en
profundidad.
 En relación con el tiempo de incubación, no todas las colonias se desarrollan al

mismo tiempo, de modo que si el tiempo de incubación es corto se obtendrá un
recuento más bajo que el real.
 El tamaño de las colonias varía ampliamente de modo que colonias muy

pequeñas pudieran pasar inadvertidas y no ser contadas.
 Debido a que existen muchas fuentes de error en el contaje en placa, se debe

sembrar por duplicado cada dilución.
Para representar el resultado más claramente, el contaje de células viables se

expresa como unidades formadoras de colonias (UFC) en lugar de número de
microorganismos (ya que una colonia contiene más de una célula).
97
A pesar de las dificultades asociadas con el recuento de colonias en placas,
este procedimiento es ampliamente utilizado en la industria alimentaria y
farmacéutica; así como también, en la microbiología acuática.
Este método posee una alta sensibilidad puesto que muestras con escasa
cantidad de microorganismos pueden ser procesadas; además, la disponibilidad de
medios de cultivos altamente selectivos permite realizar el recuento de un tipo
particular de microorganismo a partir de muestras heterogéneas.
Turbidimetría
Este método mide la reducción de la transmisión de luz debida a las partículas

en suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.
Es una técnica sensible y rápida que se basa en la capacidad de las células

bacterianas de dispersar la luz que incide sobre éllas. Como el tamaño de las células
en una población es casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la
concentración de células presentes. Cuando la concentración de las bacterias alcanza
casi 10 millones de células por ml, el medio aparece ligeramente turbio. Un aumento
de la población produce un incremento de la turbidez y una disminución de la luz
transmitida a través del medio.
Se puede medir el grado de dispersión de la luz con un espectrofotómetro y

prácticamente se observa una relación lineal con la concentración bacteriana hasta un
cierto nivel de absorbancia (Figura 149).. Por ello, el crecimiento de una población
microbiana puede medirse mediante técnica de espectrofotometría, siempre que la
población sea lo suficientemente grande y se pueda medir la turbidez. Sin embargo,
antes de utilizar la turbidez como método de contaje, es necesario realizar una curva
estándar que relacione un método directo (contaje microscópico directo, recuento en
placas, peso seco) con uno indirecto como la turbidimetría. Tales curvas contienen
datos para número de células o la masa celular, permitiendo la estimación de ambos
parámetros a partir de una sola medida de la turbidez.
98
Materiales
 Cultivo en caldo de E. coli (18-24 horas).
 5 tubos de ensayo con 2 ml de Caldo Soya Tripticasa (CST) cada uno.
 6 tubos con Agar Nutritivo (AN)
 6 placas de Petri estériles.
 Pipetas estériles de 1 y 2 ml.
 4 Frascos de dilución con 99 ml de CST cada uno.
 Espectrofotómetro
 Contador de colonias
Procedimiento
A. Determinación del Contaje Bacteriano por unidad de volumen.
Se procede a determinar el número de UFC/ml a partir del cultivo original del

microorganismo en estudio.
1. A partir del caldo de cultivo de E. coli preparar una serie de diluciones como se
muestra en la figura 3.
2. Fundir los 6 tubos con AN, luego enfriar hasta 45°C en Baño de María.
Mantener a esta temperatura hasta el momento de utilizarlos.
3. Con una pipeta de 1 ml., transferir 1 ml. del cultivo original de E. coli al primer
frasco de dilución marcado como 10-2. Descartar la pipeta. Mezclar por
inversión durante 7 segundos. Guardar el cultivo original.
4. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml. de la primera dilución (10 -2) al segundo
frasco marcado como 10-4. Descartar la pipeta y mezclar la dilución como se
indicó en el paso anterior.
5. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml. de la segunda dilución (10 -4) al frasco
marcado como 10-6. Descartar la pipeta. Mezclar.
6. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml. de la tercera dilución (10 -6) al frasco
marcado como 10-8.Mezclar.
99
7. Tome dos placas rotuladas como 10-6 y transfiera 1 ml de la dilución marcada 10 -
6
a cada una de ellas. Luego coloque 0,1 ml de la misma dilución en dos placas
estéril marcada como 10-7. Descartar la pipeta.
8. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml. de la cuarta dilución (10-8) a dos placas
marcada como 10-8
9. Vaciar el contenido de un tubo con AN dentro de cada placa de Petri y rotar
suavemente para mezclar el agar y la muestra. Mover lentamente, para evitar
que el agar salpique la tapa de la placa.
10. Invertir e incubar las placas a 37°C durante 24-48 horas.
B. Mediciones Turbidimétricas
Ahora se determinará la absorbancia de una serie de diluciones del cultivo

original y se graficará una curva. Al medir la absorbancia de un cultivo desconocido
del mismo microorganismo en el mismo medio de cultivo, se puede determinar el
número de células por unidad de volumen a partir de la curva.
1. Con el remanente del cultivo original de E. coli procesar como se indica en la

figura.
2. Obtener 5 tubos de CST conteniendo 2 ml. cada uno.
3. Transferir 2 ml. del cultivo original de E. coli; al primer tubo con CST. Mezclar.
Rotular un tubo como 1:2. No descartar el cultivo original.
4. Transferir 2 ml. del tubo 1:2 al otro tubo. Mezclar y rotular como 1:4.
5. Transferir 2 ml del tubo 1:4 a otro tubo. Mezclar y marcar como 1:8.
6. Transferir 2 ml. del tubo 1:8 a otro tubo. Mezclar y marcar como 1:16.
7. No transferir al último tubo y rotular como "Blanco" o "Control".
8. Usando un espectrofométro, ajustar la longitud de onda a 525 nm.
9. Colocar el blanco dentro del receptáculo y tapar. Ajustar el galvanómetro a 0% de

Absorbancia (100% Transmitancia). De esta manera se mide la absorbancia de un
tubo no inoculado del medio de cultivo y se fija la absorbancia a cero. Todos los
100
cambios en la absorbancia en otros tubos son producto de la turbidez debida a las
células bacterianas en suspensión.
10. Comenzar con el tubo del cultivo original de E. coli, insertar cada dilución
preparada dentro del receptáculo y anotar la absorbancia de cada tubo en la hoja de
datos (Figura 150).
C. Reglas para el Contaje de Colonias
1. Finalizado el período de incubación, se seleccionan las placas donde aparezcan

entre 30 y 300 colonias. Con la ayuda de un contador de colonias se cuentan todas
las colonias, incluyendo las que se observan como pequeños puntos y se anota la
dilución correspondiente. Debe evitarse contar como colonias, partículas de
muestra, pequeñas burbujas, etc.
2. Si las placas de todas las diluciones tienen más de 300 colonias, se seleccionan
aquellas que tengan el valor más cercano a 300.
3. Si las placas de todas las diluciones tienen menos de 30 colonias, se seleccionan
aquellas que tengan el valor más cercano a 30.
4. El número de colonias promedio de las dos placas de una misma dilución se
multiplican por la dilución correspondiente y este será el resultado final.
5. Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, se
multiplica cada recuento por la dilución correspondiente, se establece el promedio
y este será el resultado final. Si el recuento más alto es el doble del más bajo, se
descarta el primero y se toma como resultado el valor más bajo.
Expresión de los resultados
1. Los resultados se expresan como UFC por mililitro o gramo de muestra.

2. El número de colonias obtenido en el contaje, se multiplica por la dilución
correspondiente y se expresa como "Estimado del recuento estándar".
3. Si no hay colonias en ninguna de las placas, el recuento se reporta como "menos de
1" multiplicado por la primera dilución de la muestra y se expresa como "Estimado
del recuento estándar".
101
D. Relación Contaje de Colonias- Absorbancia.
1. De los resultados obtenidos en el paso C.4, registrar el contaje promedio, la

dilución correspondiente y el contaje final por ml. (UFC/ml) del cultivo original de
E. coli en la hoja de datos (parte A). Colocar este mismo contaje en el aparte B en
el espacio identificado como UFC/ml correspondiente al cultivo "no diluido" y
también en el gráfico sobre el espacio marcado como "ninguna" dilución.
2. Conociendo que se realizaron diluciones al doble, calcular el contaje por ml. para
cada dilución. Por ejemplo, en la dilución 1:2 el contaje será la mitad del obtenido
en el cultivo no diluido, en 1:4 el contaje será la cuarta parte del obtenido en el no
diluido, etc. Colocar estos valores en la tabla (parte B) y en el gráfico.
3. Ahora, graficar la absorbancia versus la dilución colocando una marca en el punto
apropiado sobre la gráfica y luego conectar los puntos con una regla. Idealmente la
unión de los puntos deberían formar una línea recta.
Resultados
A. Determinación del Contaje Bacteriano por Unidad de Volumen

1. Contaje:_______________
2. Dilución contada:_______________
3. UFC/ml:_______________
B. Absorbancia vs. Contaje Bacteriano
Dilución Absorbancia UFC/ml

No diluida
1:2
1:4
1:8
1:16
102
Gráfico
1.0
0.8
ABSORBANCIA
0.6
0.4
0.2
Sin Dilución 1:2 1:4 1:8 1:16
_______ _______ ______ _______ _____ UFC/ml

103
Complete los siguientes enunciados:
1. El número de bacterias es directamente proporcional a la _______________ e

inversamente proporcional a la __________.
2. La forma correcta de reportar 5.365.000 bacterias/ml es ____________________.
3. Si el promedio de colonias obtenidas en la dilución 10 3 fue de 189, el total de

UFC/ml de la muestra original es____________.
4. Si ninguna dilución presentó entre 30-300 colonias; pero la dilución 10-1 presenta
25 colonias, el total de UFC/ml es________.
5. Si un cultivo contiene 2 x 109 UFC/ml, la dilución 1:4

contiene__________UFC/ml.
6. Con los siguientes valores de absorbancia determine el número de UFC/ml,

utilizando la curva elaborada durante el ejercicio práctico:
ABSORBANCIA UFC/ml
0.8
0.5
0.1
7. En una prueba de contaje en placa se obtuvo los siguientes resultados:
Número de Colonias
Dilución Placa 1 Placa 2
10-1 Incontable Incontable
10-2 270 330
10-3 100 150
Reporte los resultados________________

104
8. En una prueba de contaje en placa se obtuvo los siguientes resultados:
Número de Colonias
Dilución Placa 1 Placa 2
10-1 Incontable Incontable
-2
10 350 400
10-3 50 60
Reporte los resultados_____________

105
Unidad IV
Metabolismo Bacteriano
Objetivo terminal
Al finalizar la unidad, el estudiante estará en capacidad de:
 Ejecutar adecuadamente las pruebas bioquímicas usadas para el estudio del

metabolismo bacteriano, interpretando sus resultados.
106
Pruebas Bioquímicas utilizadas en la Identificación de
Bacterias en el Laboratorio
1. Explicar los fundamentos de las pruebas bioquímicas más utilizadas en la

identificación bacteriana.
2. Realizar correctamente las pruebas bioquímicas de uso frecuente en la
identificación bacteriana.
3. Interpretar adecuadamente los resultados de las pruebas bioquímicas utilizadas
para la identificación de bacterias en el laboratorio.
4. Reconocer las ventajas de los sistemas comerciales multipruebas y automatizados
en comparación con los métodos convencionales de identificación bacteriana.
Generalidades
Para la identificación de las bacterias en el laboratorio, pueden utilizarse gran

variedad de métodos, de los cuales tres serán estudiados en la presente actividad
práctica:
 Métodos convencionales
 Sistemas multipruebas
 Sistemas automatizados
Identificación utilizando Métodos Convencionales
En el laboratorio de bacteriología, las pruebas usadas para evaluar la actividad

bioquímica o metabólica de las bacterias, por medio de la cual puede hacerse la
identificación final de especie, se llevan a cabo mediante el subcultivo del aislamiento
primario en una serie de medios diferenciales e indicadores, cuyos resultados pueden
interpretarse después de un día o más de incubación.
107
Debido a que muchas bacterias presentan morfología colonial y celular
similar, se requieren características adicionales para lograr su identificación. A este
fin, se recurre al estudio del metabolismo bacteriano, tomando en consideración el
(los) sustrato(s) que utiliza una determinada bacteria y los productos finales que
genera. En consecuencia, se han diseñado pruebas de laboratorio con la finalidad de
determinar las enzimas presentes en una bacteria.
La identificación por métodos convencionales requiere la ejecución de una

serie de pruebas bioquímicas especificadas en un esquema predeterminado que
contiene las características bacterianas claves. Estas pruebas deben ser efectuadas en
una secuencia específica para poder llegar a la identificación final. Es labor del
bacteriólogo, elegir conjuntos apropiados de características diferenciales que
permitan la identificación de cada grupo de bacterias. A continuación se estudiarán
detalladamente algunas de las pruebas bioquímicas que pueden utilizarse en el
laboratorio para la identificación de especies bacterianas.
Indol
Fundamento:
El indol es un benzil-pirrol producto de la degradación metabólica del

aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa (complejo
enzimático) son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con la producción de
indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía. Así, el propósito de la prueba es
determinar la producción de indol a partir del triptofano.
La prueba se basa en la combinación del indol liberado con el aldehído que

contiene el reactivo de Kovacs o el de Erlich para dar un color rojo. Esta reacción
ocurre por hidrólisis ácida de las proteínas contenidas en el medio provocado por el
HCl concentrado. La capa alcohólica concentra la quinona (complejo coloreado de
rojo).
108
Medios y reactivos:
Medio: Caldo triptófano (1%) o agua peptonada con cloruro de sodio.
Agua peptonada con NaCl

Peptona o digesto pancreático de caseína (tripticasa) ................................2.0 g.
Cloruro de sodio .........................................................................................5.0 g.
pH final: 7.0 + 0.2
Caldo Triptófano (1%)

Peptona de carne ....................................................................................10.00 g.
DL-triptófano .............................................................................................1.0 g.
Agua destilada ...................................................................................... 100.0ml.
pH final: 7.2 + 0.2
Reactivo de Kovacs:
Alcohol amílico o isoamílico .............................................................. 150.0 ml.
-dimetil-amino-benzaldehído .................................................................10.0 g.
Ácido clorhídrico concentrado .............................................................. 50.0 ml.
Reactivo de Erlich:
Alcohol etílico absoluto ...................................................................... 190.0 ml.
-dimetil-amino-benzaldehído ...................................................................2.0 g.
Ácido clorhídrico concentrado .............................................................. 40.0 ml.
Procedimiento:
1. A partir de un cultivo puro con 18 a 24 horas de incubación, inocular un caldo

triptófano o agua peptonada con NaCl.
2. Incubar a 35ºC por 24–48 horas en aerobiosis.
109
3. Transcurrido este tiempo, añadir 15 gotas del reactivo de Kovacs y agitar
suavemente el tubo. Si se va utilizar el reactivo de Erlich, previamente se debe
agregar 1 ml. de xilol, agitar suavemente el tubo y agregar luego el reactivo de
Erlich (15 gotas).
Lectura e interpretación: (Figura 151)
 Prueba positiva: el desarrollo de un color rojo (anillo rojo) en la capa alcohólica,

dentro de segundos posteriores a la adición del reactivo es indicativo de la
presencia de indol y la prueba es positiva
 Prueba negativa: no se produce color en la capa alcohólica (toma el color del

reactivo).
Ureasa
Fundamento:
La ureasa es una enzima constitutiva que hidroliza la úrea con la producción

de dióxido de carbono, agua y amoníaco. El amoníaco reacciona en solución para
formar carbonato de amonio, lo que da como resultado alcalinización del medio,
haciendo virar el indicador (rojo de fenol) a un color fucsia intenso.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Urea de Christensen

Peptona .....................................................................................................1.00 g.
Glucosa .....................................................................................................1.00 g.
Fosfato monopotásico ..............................................................................8.00 g.
Urea ........................................................................................................20.00 g.
Rojo de fenol ..........................................................................................0.012 g.
Agar ........................................................................................................15.00 g.
110
Agua destilada ................................................................................ 1.000.00 ml.
pH final: 6.8 + 0.2
Procedimiento:
Sembrar sólo la superficie del bisel con un inóculo denso del microorganismo
de prueba. No debe hacerse punción del taco porque éste sirve para control del color.
Incubar a 35ºC por 24-48 horas.
 Prueba positiva: se observa un color fucsia intenso en todo el medio o sólo en el

bisel provocado por la liberación de amoníaco a partir de la úrea.
 Prueba negativa: no se produce cambio de color (el medio permanece amarillo
pálido).
Citrato
Fundamento:
Algunas bacterias pueden obtener energía de manera diferente a la

fermentación de carbohidratos, usando el citrato (ácido cítrico) como única fuente de
carbono. El uso del citrato como única fuente de carbono se comprueba en un medio
que lo contenga por la aparición de productos alcalinos. El medio incluye citrato de
sodio, un anión, como única fuente de carbono y, azul de bromotimol como indicador
de pH. En este medio sólo crecerán los organismos capaces de usar el citrato como
única fuente de carbono. Cuando el ácido cítrico es metabolizado se produce un
exceso de iones amonio y sodio que provocan la elevación del pH, haciendo cambiar
el indicador de verde a azul intenso, indicando condiciones alcalinas.
111
Medios y reactivos:
Medio: Agar Citrato de Simmons

Fosfato monoamónico ..............................................................................1.00 g.
Fosfato dipotásico ....................................................................................1.00 g.
Citrato de sodio ........................................................................................2.00 g.
Sulfato de magnesio .................................................................................0.20 g.
Agar ........................................................................................................15.00 g.
Azul de bromotimol .................................................................................0.08 g.
pH final: 6.9.+ 0.2
Procedimiento:
Inocular la superficie del bisel del medio de citrato. Incubar a 35ºC por 24–48 horas.
A veces es necesaria una incubación más prolongada.
Resultados e interpretación: (Figura 153)
 Prueba positiva: crecimiento con la aparición de un color azul intenso en el

bisel.
 Prueba negativa: no se observa crecimiento, ni cambio de color (el medio se
observa verde).
Motilidad
Fundamento:
Determinar si un organismo es mótil o no. Generalmente, las bacterias son

mótiles debido a la presencia de flagelos, los cuales son más frecuentes en bacilos;
aunque existen cocos mótiles. Las bacterias no mótiles, carecen de flagelos. La
112
presencia y disposición de los flagelos es una característica útil para la identificación
de bacterias en el laboratorio.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Motilidad

Triptosa .....................................................................................................10.0g.
Agar ............................................................................................................5.0 g.
Agua destilada .................................................................................. 1.000.0 ml.
pH final: 7.2 + 0.2
Procedimiento:
Utilizando un cultivo puro del microorganismo en estudio y con ayuda de un

asa en punta, inocular el medio por punción vertical del taco en la parte central del
agar sin llegar al fondo, teniendo la precaución de retirar el asa siguiendo la misma
trayectoria por donde se introdujo. La temperatura de incubación es fundamental,
generalmente, es de 35ºC por un tiempo de 24–48 horas. Algunas bacterias expresan
la motilidad a temperatura ambiente y no a 35ºC.
La prueba de motilidad se interpreta por medio de un examen macroscópico

del medio en busca de una zona difusa de crecimiento que se ensancha a partir de la
línea de inoculación.
 Prueba positiva: los organismos mótiles migran de la línea de siembra y

difunden en el medio provocando turbidez.
 Prueba negativa: sin motilidad, crecimiento sólo en la línea de inoculación. El

medio se mantiene claro.
113
Decarboxilación de Aminoácidos (Lisina, Arginina y Ornitina)
Fundamento:
Esta prueba mide la capacidad enzimática de un microorganismo para

decarboxilar un aminoácido y formar una amina con la consiguiente alcalinización
del medio.
La decarboxilación es el proceso por el cual, las bacterias que poseen enzimas

decarboxilasas (específicas para cada sustrato) son capaces de atacar a los
aminoácidos en su grupo carboxilo (COOH), generando una amina (diamina) y CO 2
como producto secundario.
Las enzimas decarboxilasas son numerosas y cada una es específica para un

sustrato determinado. En un laboratorio de bacteriología, las decarboxilasas más
importantes utilizadas para la identificación bacteriana son: Lisina Decarboxilasa y
Ornitina Decarboxilasa. La reacción de la arginina es mediada más bien por una
Arginina Dehidrolasa. Las decarboxilasas son enzimas adaptativas o inducibles,
formadas por el organismo en un medio ácido en presencia de sustrato específico, y
los productos de la decarboxilación provocan una desviación del pH hacia la
alcalinidad. La decarboxilación ocurre anaeróbicamente, es un proceso irreversible,
no oxidativo, que requiere fosfato de piridoxal como coenzima.
La lisina sufre la decarboxilación para producir cadaverina (una diamina) y

anhídrido carbónico por acción de la enzima específica lisina-decarboxilasa.
La ornitina es decarboxilada por la enzima ornitina-decarboxilasa produciendo

putrescina (diamina) y anhídrido carbónico.
La arginina es catabolizada en un proceso a través de dos pasos: la arginina,

primero es dehidrolizada a citrulina, que luego se convierte en ornitina. La ornitina
luego se decarboxila a putrescina, que produce los mismos cambios en el indicador de
pH, como se mencionó para los otros aminoácidos.
114
Medios y Reactivos:
Medio: Caldo Base de Möeller

Peptona .....................................................................................................5.00 g.
Extracto de carne ......................................................................................5.00 g.
Púrpura de bromocresol ...........................................................................0.01 g.
Rojo de cresol........................................................................................ 0.005 g.
Glucosa .......................................................................................................0.5 g.
Fosfato de piridoxal..................................................................................0.05 g.
Agua destilada ................................................................................... 1.000.0 ml
L-Aminoácidos*.......................................................................................... 1 %
*(Lisina, Ornitina u Arginina)
pH final: 6.0 + 0.2
El caldo de Möeller es la base que se emplea con mayor frecuencia. Esta

contiene una pequeña cantidad de glucosa, de tal manera, que el microorganismo al
crecer, fermenta la glucosa y produce ácido (el medio que originalmente es de color
púrpura, cambia a amarillo). Si el aminoácido es decarboxilado, se forman
compuestos alcalinos (aminas) y el medio revierte a su color púrpura original.
Procedimiento:
Inocular el caldo aminoácido a partir de un cultivo puro (usar un inóculo

liviano). Con cada batería de investigación, inocular un tubo control de caldo base
que contiene glucosa sin aminoácido (Control de Decarboxilación, DC). Cubrir todos
los tubos, incluyendo el control, con 1 ml. de petrolato o parafina estéril. En estas
condiciones, el oxígeno del medio es consumido por el microorganismo y esto
controla el pH (la reacción sólo ocurre en medio ácido y en anaerobiosis). Incubar los
tubos a 35ºC por 24–48 horas. A veces se necesita una incubación más prolongada
(de 6 a 10 días) para demostrar reacciones débiles debidas a la escasa capacidad de
decarboxilación de un organismo.
115
 Prueba positiva: la reaparición de un color púrpura en el tubo que contiene el

aminoácido, indica una prueba positiva debido a la liberación de aminas por la
reacción de decarboxilación.
 Prueba negativa: color amarillo.
 Control DC: color amarillo (siempre). La aparición de color amarillo en el

control DC indica que el microorganismo es viable y que el pH del medio ha
disminuido en forma suficiente como para activar la decarboxilación.
Fenilalanina Deaminasa
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar si un organismo posee la enzima

fenilalanina deaminasa, la cual es capaz de deaminar la fenilalanina con producción
de ácido fenil-pirúvico y la liberación de amoníaco (NH3). La reacción se evidencia
mediante la detección de ácido fenil-pirúvico en el medio de prueba a través del
agregado de una solución de cloruro férrico al 10%. Este compuesto actúa como
agente quelante con el ácido fenil-pirúvico para dar un color verde debido a la
formación de una hidrazona.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Fenilalanina

DL-fenilalanina ..........................................................................................2.0 g.
Extracto de levadura ...................................................................................3.0 g.
Fosfato disódico .........................................................................................1.0 g.
Agar ..........................................................................................................12.0 g.
116
pH final: 7.3 + 0.2
Reactivo: Cloruro Férrico (FeCl3) al 10%

Cloruro férrico.........................................................................................10.00g.
Agua destilada .................................................................................... 100.00ml.
Procedimiento:
Inocular el bisel del agar fenilalanina. Incubar a 35ºC por 24–48 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación, agregar 4 a 5 gotas del reactivo directamente a
la superficie del agar sembrado. Hacer rotar suavemente el tubo para que el reactivo
impregne todo el crecimiento bacteriano sobre el bisel. En el término de 1 a 5
minutos se produce la aparición del color verde en el bisel.
 Prueba positiva: color verde en el bisel. Indica la presencia de ácido fenil-

pirúvico. Se debe interpretar la reacción inmediatamente, dado que el color
producido es inestable y se desvanece rápidamente.
 Prueba negativa: no se produce cambio de color, el medio se mantiene amarillo.
Rojo de Metilo
Fundamento:
Comprobar la capacidad de un microorganismo de elaborar y mantener

productos finales ácidos estables a partir de la fermentación de la glucosa, superando
la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa que detecta la
acidez final como producto de la fermentación de la glucosa.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un espectro entre 6.0 (amarillo) y

4.4 (rojo), detectando ácido a pH considerablemente más bajos que otros indicadores
117
comúnmente utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por ende, para producir
un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades
de ácido a partir de hidratos de carbono.
Esta prueba detecta la producción de ácidos fuertes, tales como: láctico,

acético y fórmico, a partir de la glucosa, mediante la vía de fermentación de ácidos
mixtos. Sólo los microorganismos capaces de mantener este pH bajo después de una
incubación prolongada (48–72 horas) superando el sistema amortiguador del pH del
medio, pueden denominarse rojo de metilo positivos.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo MR/VP (Rojo de Metilo/Voges-Proskaüer). Este medio también

sirve para efectuar la prueba de Voges-Proskaüer que se estudiará posteriormente.
Caldo MR/VP
Polipeptona...............................................................................................7.00 g.
Glucosa .....................................................................................................5.00 g.
Fosfato dipotásico (buffer) ...................................................................... 5.00 g.
Agua destilada .................................................................................. 1.000.0 ml.
pH final: 6.9 + 0.2
Reactivo: Rojo de Metilo

Rojo de metilo ............................................................................................ 0.1 g.
Alcohol etílico (95%) .............................................................................. 300ml.
Agua destilada ......................................................................................... 200ml.
Procedimiento:
Sembrar el caldo MR/VP con un inóculo ligero a partir de un cultivo puro.

Incubar a 35ºC por un tiempo mínimo de 48 horas. En ocasiones, es necesario
prolongar la incubación hasta por 5 días. Transcurrido este tiempo, divida el caldo
con crecimiento en dos partes (utilice para este fin, tubos estériles), agregar a un tubo,
118
el indicador de pH rojo de metilo (aproximadamente, 5 gotas) directamente al caldo.
La otra parte del cultivo en caldo será utilizada para la prueba de Voges–Proskaüer.
 Prueba positiva: color rojo estable. La aparición de un color rojo que se

mantiene en la superficie del medio indica suficiente producción de ácido para
reducir el pH a 4.4 y constituye una prueba positiva.
 Prueba negativa: color amarillo. Indica que la acidez del medio no se mantiene,
sino que los productos ácidos del metabolismo han sido transformados en otros
compuestos.
Voges - Proskaüer
Fundamento:
Determinar la capacidad de algunos microorganismos de elaborar un producto

final neutro, el acetil-metil-carbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la
glucosa; el cual es un precursor de la producción del 2,3-butanediol.
La formación de acetoína y 2,3-butanediol es un proceso reversible de

reducción-oxidación, en el que la acetoína se convierte por reducción en 2,3-
butanediol ó éste es oxidado a acetoína.
En presencia de oxígeno atmosférico y medio alcalino, los productos finales

neutros son oxidados a diacetilo, que es el reactante para el color producido en la
reacción; y el -naftol, sirve como catalizador para producir un complejo de color
rojo.
119
Medios y reactivos:
Medio: Caldo RM/VP (ya descrito en la prueba de rojo de metilo).

Reactivos: -naftol (5%)
-naftol................................................................................................... l5.00 g.
Alcohol etílico absoluto .................................................................... 100.00 ml.
KOH (40%):
Hidróxido de potasio ..............................................................................40.00 g.
Procedimiento:
Inocular el caldo RM/VP con el microorganismo de prueba. Incubar a 35ºC

por un tiempo mínimo de 48 horas. Luego de este lapso, pasar una alícuota de 1ml.
del caldo a un tubo de prueba estéril. Añadir los reactivos en el siguiente orden: 0.6
ml. de -naftol y luego, 0.2ml. de KOH. Agitar el tubo suavemente para exponer el
medio al oxígeno atmosférico, a fin de oxidar la acetoína y obtener una reacción de
color. Dejar descansar el tubo, por lo menos, durante 10 a 15 minutos antes de
intentar la interpretación de la prueba. En ocasiones se requiere una incubación más
prolongada, hasta de 10 días.
 Prueba positiva: está representada por la aparición de un color rojo 15 minutos o

más después de agregar los reactivos, lo que indica la presencia de diacetilo, el
producto de oxidación de acetoína.
 Prueba negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del
reactivo).
120
TSI (Triple Azúcar Hierro)
Fundamento:
Es un medio diferencial en tubo que tiene como propósito: 1) demostrar la

fermentación de carbohidratos con o sin la producción de gas y 2) demostrar la
producción de H2S.
Un microorganismo puede exhibir las siguientes reacciones: 1) fermentar

solamente la glucosa, 2) fermentar glucosa y lactosa y/o sucrosa y, 3) no fermentar
ningún carbohidrato.
El medio contiene rojo de fenol como indicador de pH, el cual en medio

alcalino es de color rojo, en medio ácido, es amarillo y, en medio neutro, toma una
coloración rojo-naranja.
En el bisel, la fermentación se produce aeróbicamente y en el taco,

anaeróbicamente. De forma que, en el bisel, la glucosa (monosacárido) es
catabolizada a través de la Vía de Embden-Meyerhof hasta piruvato que a través del
Ciclo de Krebs, es degradada a CO2, H2O y energía; mientras que en el taco, el
piruvato sigue otra vía fermentativa y pasa a lactato y/o alcoholes, además de CO 2,
H2O y energía.
Si el microorganismo fermenta sólo la glucosa, la cantidad de ácido producida

es poca y se observa un TSI con bisel alcalino y taco ácido (Alc/Ac). Si fermenta otro
carbohidrato, además de la glucosa, se produce más ácido y se observa Ac/Ac.
El bisel alcalino (rojo) indica que se ha producido la degradación aeróbica de

la glucosa. Después de 18–24 horas de incubación, la baja concentración de glucosa
ha sido consumida y el microorganismo comienza a utilizar las peptonas para su
crecimiento. El catabolismo de las peptonas produce liberación de amoníaco (NH3)
dando un pH alcalino con el rojo de fenol (indicador de pH). Sin embargo, el taco
121
amarillo indica degradación anaeróbica de la glucosa. Aquí se forman productos
terminales ácidos, dando un pH ácido (color amarillo).
Ciertos microorganismos fermentan, tanto la glucosa, como lactosa y/o

sucrosa. Estos carbohidratos se encuentran en una concentración diez veces mayor
que la de glucosa. En un período de 18–24 horas, aún no se ha consumido
completamente y permanece una condición ácida (Ac/Ac).
Algunos microorganismos, sobre todo los Bacilos Gram Negativos no

Fermentadores de la Glucosa (BGNNF) son incapaces de fermentar los carbohidratos
presentes en el medio, por lo que, recurren a las peptonas para obtener sus nutrientes.
Estas peptonas pueden ser degradadas por vía anaeróbica y aeróbica, dando una
reacción Alc/Alc ó, por vía aeróbica solamente, produciendo una reacción Alc/ N.
Cuando las peptonas son degradadas se produce un pH alcalino por la liberación de
amoníaco que imparte al medio un color rojo intenso.
Se puede determinar si se produce gas como producto terminal del

metabolismo de los carbohidratos. La bacteria que produce gas (CO 2+H2) se
denomina aerogénica, lo que se manifiesta por el desdoblamiento del medio, burbujas
de gas, desplazamiento total del medio del fondo del tubo dejando una línea clara o
una ligera muesca del medio en el costado del tubo. Si la bacteria no produce gas, se
denomina anaerogénica.
Otro sistema de diferenciación presente en el TSI, está constituido por

indicadores de la producción de H2S (sulfuro de hidrógeno). Este es un gas que
producen los microorganismos a través de la desasimilación, bajo condiciones
anaeróbicas, de aminoácidos que contienen azufre (metionina, cistina y cisteina) o a
través de la reducción de compuestos sulfurados inorgánicos (tiosulfato, sulfito y
sulfato). Tales microorganismos poseen enzimas que reducen el átomo de azufre de
compuestos inorgánicos sulfurados o remueven el grupo sulfuro de aminoácidos
azufrados. Las sales de hierro (citrato férrico) y el tiosulfato de hierro reaccionan con
el sulfuro de hidrógeno para formar un precipitado negro de sulfuro de hierro.
122
La producción de H2S puede detectarse en otros medios, además del TSI;
como por ejemplo, el Peptona Hierro Agar (PIA), Kliger Hierro Agar (KIA), Lisina
Hierro Agar (LIA) y las tiras impregnadas con sales de plomo. Estas últimas, no son
muy utilizadas, debido a su toxicidad.
Medios y reactivos:
Medio: Triple Azúcar Hierro (TSI).

Extracto de levadura .................................................................................3.00 g.
Peptona ...................................................................................................20.00 g.
Lactosa ...................................................................................................10.00 g.
Sucrosa ...................................................................................................10.00 g.
Glucosa .....................................................................................................1.00 g.
Citrato férrico amónico ............................................................................0.20 g.
Tiosulfato de sodio ...................................................................................0.30 g.
Agar ........................................................................................................12.00 g.
Rojo de fenol ..........................................................................................0.024 g.
Agua destilada ................................................................................. 1000.00 ml.
pH: 7.4 + 0.2
Procedimiento:
A partir de un cultivo puro, inocular el TSI con el asa en punta, punzando

primero el taco y luego, estriando sobre el bisel o viceversa (la punción debe llegar
hasta el fondo). Incubar a 35ºC por 24-48 horas.

123
LIA (Lisina Hierro Agar)
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un bacilo Gram negativo decarboxila o

deamina la lisina. Además, permite detectar la producción de gas a partir de la
fermentación de la glucosa y la formación de ácido sulfhídrico (H2S). Cuando la
glucosa es fermentada, el taco y el bisel se vuelven ácidos (amarillos). Si el
organismo produce lisina decarboxilasa, se forma una amina (cadaverina) que
neutraliza los ácidos orgánicos formados por la fermentación de la glucosa y, el taco
revierte al estado alcalino (púrpura). Si no ocurre decarboxilación, el taco permanece
ácido. Cuando ocurre deaminación oxidativa de la lisina, se forma ácido -
cetocarboxílico, el cual reacciona con las sales de hierro (citrato férrico amónico)
cerca de la superficie del medio (en presencia de oxígeno) y en presencia de flavina
mononucleótido, lo que se evidencia por la aparición de un color rojo (borgoña) en el
bisel del medio.
El medio posee también un sistema para detectar la producción de H2S; citrato

férrico amónico y tiosulfato de sodio. Los microorganismos que producen sulfuro de
hidrógeno causan el ennegrecimiento del medio debido a la producción de sulfuro de
hierro (ferroso).
Medios y reactivos:
Medio: Lisina Hierro Agar (LIA)

Peptona .....................................................................................................5.00 g.
Dextrosa ...................................................................................................1.00 g.
Hidrocloruro de L-lisina .........................................................................10.00 g.
Citrato férrico amónico ............................................................................0.50 g.
Púrpura de bromocresol ...........................................................................0.02 g.
Agar ........................................................................................................15.00 g.
124
pH: 6.7 + 0.2
Procedimiento:
Con un asa en punta, inocular por punción el taco y estriar el bisel del LIA (o
viceversa), teniendo la precaución de pinchar varias veces el taco. Incubar a 35ºC por
18-24 horas. Transcurrido este tiempo, proceder a su lectura e interpretación.
 Alc/Ac: indica que el microorganismo no es capaz de decarboxilar, ni deaminar la

lisina. Se observa el taco ácido (de color amarillo) y el bisel alcalino (de color
púrpura). Puede o no haber producción de H2S y gas.
 Alc/Alc o Alc/N: indica que el microorganismo es capaz de decarboxilar la lisina.

Se observan alcalinos (púrpura) tanto el taco, como el bisel. Puede o no haber
producción de H2S y gas.
 Rojo/Ac: indica que el microorganismo deamina la lisina. Esta reacción se
observa en organismos de los géneros: Proteus, Providencia y Morganella.
Gas de Glucosa
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato

específico (glucosa), incorporado a un medio básico, produciendo ácido con gas
visible.
Las bacterias que fermentan la glucosa con producción de gas, se denominan

aerogénicas y las que no lo producen, anaerogénicas.
125
Cuando se utiliza un medio de cultivo en caldo con hidrato de carbono, se
coloca un tubo de fermentación o tubo de Durham en posición invertida, para
evidenciar la producción de gas. Una sola burbuja en el tubo de Durham basta para
registrar la producción de gas.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo básico rojo de fenol con glucosa (1%)

Peptona ...................................................................................................10.00 g.
Extracto de carne (opcional) ....................................................................1.00 g.
Rojo de fenol ..........................................................................................0.018 g.
Glucosa (1%) ..........................................................................................10.00 g.
pH: 7.4 + 0.2
Procedimiento:
Inocular el caldo glucosa con un cultivo puro del microorganismo en prueba

(inóculo denso). Incubar a 35ºC durante 24–48 horas.
Lectura e interpretación: (Figuras 161)
 Prueba positiva: se observan burbujas de gas en el tubo de Durham o el medio se

halla completamente desplazado por el gas, dejando una parte vacía en el tubo
invertido. El medio debe observarse ácido (amarillo) por la fermentación de la
glucosa.
 Prueba negativa: no se observan burbujas de gas; aunque debe haber acidez,

pues el microorganismo puede fermentar la glucosa sin liberar gas.
126
Fermentación de Carbohidratos
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato

(hidrato de carbono, polihidroxialcohol, glucósido o sal de ácido orgánico específico),
produciendo ácido.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo base rojo de fenol

Peptona ...................................................................................................10.00 g.
Extracto de carne (opcional) ....................................................................1.00 g.
Rojo de fenol ..........................................................................................0.018 g.
Carbohidrato............................................................................................ 0.5-1%
pH: 7.4 + 0.2
Carbohidratos que pueden probarse: manitol, sorbitol, inositol, adonitol,

dulcitol, sucrosa, lactosa, fructosa , xilosa, salicin, ramnosa, galactosa, glucosa,
trehalosa, arabinosa, rafinosa, celobiosa, inulina y melobiosa.
Procedimiento:
Inocular asépticamente los caldos con carbohidratos a partir de un cultivo
puro. Incubar a 35ºC por 24–48 horas. En ocasiones, puede requerirse una incubación
más prolongada para considerar negativo un resultado.
 Prueba positiva: se observa acidez en el medio (hay cambio de color, el medio se

torna amarillo).
127
 Prueba negativa: el medio se observa alcalino (rojo), se produce crecimiento
(turbidez); pero no hay cambio de color del indicador.
Licuefacción de la Gelatina
Fundamento:
Muchos microorganismos producen enzimas extracelulares capaces de

hidrolizar proteínas complejas en productos finales solubles de menor tamaño,
denominados peptonas, proteosas o péptidos y aminoácidos constituyentes. Los
pequeños fragmentos pueden ser transportados al interior celular a través de la
membrana plasmática, para ser utilizados luego, en la biosíntesis de nuevo material
celular o en la producción de energía. Estas enzimas se denominan colectivamente
proteasas, las cuales son altamente específicas para cada sustrato. El proceso de
degradación se denomina proteólisis. Las dos proteasas más utilizadas en el
laboratorio son: la gelatinasa y la caseinasa.
La gelatina es una proteína derivada del colágeno encontrado en la piel y

tejido conectivo animal. A una concentración del 12%, la gelatina es sólida a
temperatura ambiente (20ºC) pero se derrite a 28-30ºC. La degradación de la gelatina
conduce a la pérdida de la capacidad de solidificación de esta proteína. Así, el
fundamento de esta prueba es determinar la capacidad de un organismo de producir
enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que hidrolizan la gelatina.
Medios y reactivos:
Medio: Gelatina Nutritiva

Peptona .....................................................................................................5.00 g.
Gelatina ................................................................................................120.00 g.
pH: 6.8 + 0.2
128
Procedimiento:
Inocular el medio por punción con asa en punta a partir de un cultivo puro
(inóculo denso). La punción debe tener una profundidad de 1,5 – 2,5 cm. Rotular un
tubo como control (sin inocular). Incubar ambos tubos a 35ºC por 24 horas. En
ocasiones, se requiere incubación prolongada de hasta 14 días. Observar si hay
crecimiento y licuefacción.
Al término de cada período de incubación (24 horas), colocar ambos tubos en

un refrigerador o un baño de hielo durante un período suficiente (aproximadamente 2
horas) para determinar si se ha producido o no la digestión de la gelatina
(licuefacción). Hacer el traspaso de la incubadora al refrigerador sin agitar los tubos.
 Prueba positiva: medio licuado, indica que el microorganismo posee enzimas

proteolíticas (gelatinasas).
 Prueba negativa: el medio se mantiene sólido. Indica que el microorganismo no

tiene actividad proteolítica (gelatinasa).
 Tubo de control: El medio se mantiene sólido.
Reducción de Nitratos
Fundamento:
Los microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de extraer

oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La
presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta mediante el agregado de -
naftil-amina y ácido sulfanílico, con la formación de un colorante de diazonio rojo, -
sulfobenceno-azo--naftil-amina.
129
Medios y reactivos:
Medio: Caldo Nitrato

Peptona .....................................................................................................5.00 g.
Nitrato de potasio (KNO3) ...................................................................... 1.00 g.
pH: 7.00 + 0.2
Reactivo A: -naftil-amina
-naftil-amina ......................................................................................... 5.00 g.
Acido acético (5N), 30% ........................................................................ 1.00 Lt.
Reactivo B: Acido sulfanílico

Acido sulfanílico ......................................................................................8.00 g.
Acido acético (5N), 30% ........................................................................ 1.00 Lt.
Procedimiento:
Inocular el caldo nitrato con el microorganismo en estudio. Incubar a 35ºC

durante 18 a 24 horas. Al terminar la incubación, agregar 1 ml. de cada uno de los
reactivos A y B, en ese orden.
 Prueba positiva: la aparición de un color rojo en los 30 segundos posteriores al

agregado de los reactivos, indica la presencia de nitritos y representa una reacción
positiva.
 Prueba negativa: si no aparece color rojo luego del agregado de los reactivos,
esto puede indicar que los nitratos no han sido reducidos (una verdadera reacción
negativa) o que han sido reducidos a otros productos, como amoníaco, nitrógeno
130
molecular (denitrificación), óxido nítrico (NO) u óxido nitroso (N2O) e
Hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan sólo nitritos, este último proceso
llevaría a una lectura falsa negativa. Por ende, es necesario agregar una pequeña
cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones aparentemente, negativas. Los iones
de zinc reducen los nitratos a nitritos y la aparición de color rojo después del
agregado del zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma una reacción
verdaderamente negativa.
Citocromo-oxidasa
Fundamento:
Los citocromos son proteínas que forman parte de las cadenas transportadoras
de electrones, propias del metabolismo respiratorio. Actúan como el último eslabón
en la cadena respiratoria aerobia transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con
la formación de agua.
El sistema de citocromos se halla en microorganismos aeróbicos,

microaerofílicos y anaeróbicos facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es
importante para identificar microorganismos que carecen de la enzima o son
anaeróbicos obligados.
Determinar la presencia o ausencia de estas proteínas proporciona información

útil para la clasificación de grupos bacterianos.
La prueba de citocromo-oxidasa detecta la presencia de citocromo c en la

bacteria. Se basa en la capacidad de algunos colorantes como el tetrametil--
fenilendiamina o dimetil--fenilendiamina de oxidarse al ceder electrones al
citocromo c. Estos colorantes son incoloros en estado reducido y pueden oxidarse
131
rápidamente en presencia del citocromo c, produciendo formas coloreadas (azul o
rosado, respectivamente) (Figura 165).
La prueba citada anteriormente, no debe realizarse en medios que contengan

sangre; ya que los eritrocitos contienen la enzima citocromo-oxidasa y pueden dar
falsos positivos. No deben usarse asas o alambres de inoculación de acero inoxidable
o nichrome para esta prueba porque productos de oxidación superficial formados al
esterilizar el asa o alambre con la llama del mechero Bunsen pueden dar como
resultado reacciones falso-positivas (emplear asas de platino, o en su defecto,
aplicadores de madera o hisopos de algodón estériles). De igual manera, esta prueba
debe efectuarse en medios libres de inhibidores, por lo tanto, no debe realizarse a
partir de cultivos en medios selectivos o diferenciales que contengan una elevada
concentración de glucosa, ya que esta puede inhibir la actividad de oxidasa.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Nutritivo

Digesto pancreático de tejido animal .......................................................1.00 g.
Agar ........................................................................................................15.00 g.
Agua destilada ......................................................................................... 1.00Lt.
pH final: 7.3 + 0.2
Reactivos:
Kovacs: Clorhidrato de tetrametil--fenilendiamina (1%)

Tetrametil--fenilendiamina dihidrocloruro ..............................................1.0 g.
Agua destilada................. .................................................................... .....1.0 Lt.
Gordon y McLeod: Clorhidrato de dimetil--fenilendiamina (1%)

Dimetil--fenilendiamina monohidrocloruro.............................................1.0 g.
132
Agua destilada...................... .................................................................... 1.0 Lt.
Procedimiento:
Usualmente, la prueba se lleva a cabo por medio de dos métodos:

1. El método directo en placa (Método de Steel), en la que 2 ó 3 gotas del
reactivo se agregan directamente a colonias bacterianas aisladas en un medio
de agar nutritivo en placa.
2. El método indirecto (Método de Kovacs) con tira de papel de filtro, en la
cual se agregan unas pocas gotas del reactivo.
 Prueba positiva: cuando se utiliza el reactivo tetrametil, las colonias bacterianas

que tienen actividad de citocromo-oxidasa desarrollan un color azul intenso en el
sitio de inoculación en 10-15 segundos. El color se va haciendo más intenso hasta
que se torna negro, en este punto, la bacteria es no viable. Cuando se utiliza el
derivado dimetil, la reacción oxidasa positiva está indicada por la aparición de un
color rosado que se hace más intenso hasta llegar a negro
Prueba negativa: no se produce cambio de color en las colonias.
Oxidación Fermentación de la Glucosa (OF-Glucosa)
Fundamento:
Algunas bacterias catabolizan la glucosa por vía oxidativa, produciendo

dióxido de carbono y agua. El catabolismo oxidativo requiere la presencia de oxígeno
molecular (O2). La mayoría de las bacterias; sin embargo, pueden fermentar la
glucosa sin utilizar el oxígeno. El catabolismo fermentativo no requiere oxígeno;
aunque puede ocurrir en su presencia. Los productos finales de la fermentación son
generalmente, pequeñas moléculas de ácidos orgánicos.
133
Para determinar si un microorganismo utiliza la glucosa por vía oxidativa,
fermentativa o no la utiliza, se emplea el medio basal de Rudolph Hugh y Einar
Leifson al cual se le añade glucosa (OF-glucosa). El medio OF es un medio
semisólido en taco (0.25-1.5% de agar) que contiene una elevada concentración de
glucosa (0.5-1%) y una baja concentración de peptonas (0.2-1%). Las peptonas
sustentarán el crecimiento de las bacterias no oxidativas, no fermentadoras. El medio
contiene azul de bromotimol como indicador de pH, el cual se torna amarillo en
medio ácido, evidenciando el catabolismo del carbohidrato. Las condiciones alcalinas
debidas al uso de las peptonas y no de los carbohidratos, se detectan por la aparición
de un color azul intenso.
La baja relación peptona-hidratos de carbono, reduce la formación de aminas

alcalinas capaces de neutralizar la escasa cantidad de ácidos débiles que pueden
formarse por el metabolismo oxidativo. El contenido relativamente mayor del
carbohidrato permite incrementar la cantidad de ácidos que pueden formarse
potencialmente. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos que se
forman en la superficie del agar infiltren todo el medio, lo que facilita la visualización
del cambio de pH del indicador.
Medios y Reactivos:
Medio: Medio basal de Hugh y Leifson.

Peptona .....................................................................................................2.00 g.
D-glucosa ...............................................................................................10.00 g.
Agar ..........................................................................................................2.50 g.
Fosfato dipotásico ....................................................................................0.30 g.
Agua destilada ........................................................................................ 1.00 Lt.
pH: 7.1 + 0.2
134
Procedimiento:
Para la prueba de OF-glucosa se requieren dos tubos, cada uno inoculado con
el microorganismo en estudio, usando un asa en punta, punzando el taco varias veces
(3 a 4) hasta la mitad (sin llegar al fondo). Un tubo de cada par se cubre con una capa
de 1 cm. de aceite mineral o parafina líquida estéril. Ambos tubos se incuban a 35ºC y
se examinan a diario por varios días.
La producción de ácidos se detecta por la aparición de un color amarillo. Los

siguientes son los patrones de reacciones:
Tubo Tubo
Metabolismo
Abierto cerrado
Ácido Neutro Oxidativo
Ácido Ácido Fermentativo
Alcalino Neutro Inactivo
Catalasa
Fundamento:
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2)

en oxígeno y agua. Salvo los estreptococos, la mayor parte de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayoría de las bacterias
anaerobias que descomponen el H2O2 lo hacen mediante enzimas peroxidasas, que
actúan en forma semejante a la catalasa.
El peróxido de hidrógeno es uno de los productos oxidativos finales en el

metabolismo aerobio de los carbohidratos. Si se acumula, el peróxido de hidrógeno es
letal para las células bacterianas. La catalasa convierte el H2O2 en agua y oxígeno,
reacción que se evidencia por el desprendimiento de burbujas de gas.
135
Medios y reactivos:
Medio de Cultivo: Se prefiere utilizar Agar nutritivo (AN)(ya descrito en la prueba

de oxidasa). No deben utilizarse medios que contengan sangre; ya que los eritrocitos
poseen la enzima catalasa, pudiendo producir resultados falsos positivos.
Reactivo: Peróxido de Hidrógeno (3%)

Peróxido de hidrógeno, 30% (Superoxol) ................................................. 10ml.
Agua destilada ........................................................................................... 90ml.
Procedimiento:
Existen dos métodos para efectuar esta prueba:
1. Prueba en portaobjetos: transferir con el asa o un aplicador de madera, una

pequeña porción de una colonia bien aislada, a la superficie de una lámina
portaobjetos. Agregar una o dos gotas del H2O2 (3%). Se recomienda que el
microorganismo no sea agregado al reactivo (revirtiendo el orden), en especial,
si se utilizan asas con contenido de hierro; porque pueden haber resultados
falsos-positivos.
2. Prueba en tubo o placa de agar: Agregar unas gotas del reactivo (alrededor de
1ml.) directamente sobre la superficie del agar en placa o en bisel.
Lectura e interpretación: (Figura 168a-b)
 Prueba positiva: La producción rápida y sostenida de burbujas de gas o

efervescencia constituye un resultado positivo.
 Prueba negativa: no hay formación de burbujas (no se forma O2).

136
Coagulasa
Fundamento:
La coagulasa es una proteína de composición química desconocida, con

actividad semejante a la protrombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina,
produciendo un coágulo visible en un sistema de prueba apropiado.
La coagulasa está presente en dos formas, libre y ligada (unida), cada una con
diferentes propiedades que requieren el uso de pruebas separadas:
 Coagulasa ligada (Prueba en portaobjetos): la coagulasa ligada, también

denominada Factor de Agregación, está unida a la pared de la célula bacteriana y
no se encuentra presente en los filtrados de cultivos. Las hebras de fibrina se
forman entre las células bacterianas suspendidas en el plasma (fibrinógeno),
haciendo que se agrupen en agregados visibles cuando se observan en la prueba
del portaobjetos. La actividad de la coagulasa ligada no es inhibida por los
anticuerpos formados contra la coagulasa libre. Tiene la capacidad de convertir al
fibrinógeno en fibrina directamente, sin intervención de los factores plasmáticos.
 Coagulasa Libre (Prueba en tubo): la coagulasa libre es una sustancia semejante

a la trombina presente en el filtrado de cultivos. Cuando una suspensión de
bacterias productoras de coagulasa se mezcla con igual cantidad de plasma en un
tubo de prueba, se forma un coágulo visible como resultado del empleo de los
factores plasmáticos de la coagulación, de manera semejante a cuando se agrega
trombina.
Medios y reactivos:
Medio: Plasma humano que puede obtenerse de una muestra de sangre fresca
o plasma de conejo, liofilizado, preparado comercialmente, porque es más fácil
mantener el control de calidad. No deben usarse productos de sangre que contengan
137
citrato como anticoagulante, porque aquellos microorganismos que utilizan el citrato,
pueden liberar calcio y causar resultados falsos-positivos.
Procedimiento:
 Prueba en Portaobjetos (Coagulasa Ligada): se coloca una gota de una

suspensión bacteriana en solución salina fisiológica estéril sobre una lámina
portaobjetos. Se coloca una gota del plasma reconstituido al lado de la gota de la
suspensión bacteriana. Se mezcla. Imprimir al portaobjetos un suave movimiento
de rotación hacia delante y hacia atrás, observando la inmediata formación de un
precipitado granular.
 Prueba en tubo (Coagulasa libre): en forma aséptica, se colocan 0.5ml. de

plasma humano o de conejo reconstituido en el fondo de un tubo de prueba estéril.
Se agregan 0.5ml. de un cultivo puro en caldo soya tripticasa o caldo infusión
cerebro-corazón, de 18 a 24 horas del microorganismo en estudio.
Alternativamente, pueden resuspenderse varias colonias del microorganismo de
prueba. Se mezcla con suavidad rotando el tubo, con la precaución de no revolver
o sacudir la mezcla. Se incuba el tubo a 37ºC por 18-24 horas.Se recomienda
revisar periódicamente la prueba, por ejemplo, cada cuatro horas para evidenciar la
producción de un coágulo visible.
Lectura e interpretación: (Figuras 169 a-b)
Prueba en Portaobjetos:
 Prueba Positiva: se detecta, por lo general, en 15 a 20 segundos, con la aparición

de un precipitado granular.
 Prueba negativa: no se observa agregación en 2-3 minutos. Esta prueba se

considera sólo presuntiva y todos los resultados negativos o positivos tardíos,
deben ser verificados con la prueba en tubo, porque algunas cepas de
138
Staphylococcus aureus producen sólo coagulasa libre que no reacciona en la
prueba en lámina.
Prueba en Tubo:
 Prueba positiva: la reacción se considera positiva si se observa cualquier grado de

coagulación visible del plasma. Esta prueba se observa mejor inclinando
suavemente el tubo. El coágulo o gel permanecerá en el fondo de éste si la prueba
es positiva.
Algunos microorganismos pueden formar fibrinolisinas potentes que son

capaces de disolver el coágulo después que éste se ha formado. En consecuencia,
pruebas positivas pueden ser pasadas por alto si no se observa el tubo a intervalos
frecuentes.
Otras cepas pueden producir coagulasa suficiente como para dar sólo
resultados positivos tardíos después de 18-24 horas de incubación; por lo tanto,
todas las pruebas negativas a las 4 horas deben observarse de nuevo después de 18
a 24 horas de incubación.
 Prueba negativa: no se evidencia formación de coágulo; es decir, el plasma

permanece líquido.
Hidrólisis del Hipurato
Fundamento:
Determinar si el microorganismo posee la enzima hipuricasa (hipurato

hidrolasa), que puede hidrolizar el ácido hipúrico, con la formación de benzoato de
sodio y glicina. La hidrólisis del ácido hipúrico puede detectarse por dos métodos:
139
1. Prueba lenta para detectar Benzoato (ácido benzoico) usando cloruro férrico
al 12%: el cloruro férrico precipita las proteínas, el hipurato y el benzoato; sin
embargo, las proteínas y el hipurato son más solubles que el benzoato en un
exceso de cloruro férrico. Así, la presencia de un precipitado en un caldo de
cultivo con hipurato después de agregar cloruro férrico en exceso, indica la
presencia de benzoato y una reacción positiva para la hidrólisis del hipurato. La
cantidad de precipitado depende del grado en que el hipurato sea hidrolizado.
2. Prueba rápida para detectar glicina usando Ninhidrina como reactivo: la

ninhidrina es un fuerte agente oxidante que deamina los grupos -amino con
liberación de NH3 y CO2. El amoníaco liberado reacciona con la ninhidrina
residual y produce un color púrpura. La ninhidrina puede usarse para detectar
glicina, el único compuesto -amino formado en la prueba del hipurato,
indicando hidrólisis. La prueba es sensible, rápida y a menudo, puede
interpretarse después de 2 horas de incubación.
Medios y reactivos:
 Detección de Benzoato :
Medio: Caldo Hipurato de Sodio:

Caldo infusión corazón ..........................................................................10.00 g.
Hipurato de sodio ...................................................................................10.00 g.
Agua destilada ................................................................................. 1.000.00 ml
pH final: 7.4 + 0.2
Reactivo: Cloruro Férrico (12%):

FeCl36H2O ............................................................................................12.00 g.
Acido clorhídrico concentrado ................................................................. 40 ml.
140
 Detección de Glicina :
Medio: Solución acuosa de Hipurato de sodio (1%)

Hipurato de sodio .....................................................................................1.00 g.
Reactivo: Ninhidrina:
Ninhidrina ................................................................................................3.50 g.
Acetona/Butanol (1:1) ...................................................................... 100.00 ml.
Procedimiento:
 Detección de Benzoato: Inocular un caldo hipurato de sodio con el

microorganismo en estudio, incubar a 37ºC durante 18-24 horas. Centrifugar el
medio (10 minutos a 2500 rpm) para compactar las células y pipetear 0.8ml. del
sobrenadante en un tubo de ensayo estéril. Agregar 0.2ml. del reactivo (cloruro
férrico ) al tubo de prueba y mezclar bien.
 Detección de Glicina: Hacer una suspensión densa del microorganismo en estudio

en 0.4ml. de una solución de hipurato de sodio al 1%. Incubar a 37ºC por 2 horas.
Agregar 0.2 ml (5 gotas). del reactivo (ninhidrina) y mezclar bien. Reincubar a
37ºC por 10 minutos.
Lectura e interpretación:
1.-Detección de Benzoato: después del agregado del cloruro férrico se formará un

precipitado denso. El resultado de la prueba depende del tiempo que se mantenga ese
precipitado (Figura 170 a).
 Prueba positiva: si el precipitado persiste después de 10 minutos; indica que se ha

formado benzoato a partir de la hidrólisis del hipurato.
141
 Prueba negativa: si la solución se aclara dentro de los diez minutos siguientes a la
adición del reactivo, la reacción no es específica y se debe a la interacción con el
hipurato no hidrolizado o con las proteínas del medio; por lo tanto, la prueba es
negativa.
2.-Detección de Glicina: (Figura: 170 b)
 Prueba positiva: la aparición de un color púrpura profundo después del

agregado de la ninhidrina indica la presencia de glicina y un resultado positivo
para la hidrólisis del hipurato. El color púrpura debe aparecer dentro de los diez
minutos posteriores a la adición de la ninhidrina.
 Prueba negativa: no aparece el color púrpura, el medio permanece del color

original.
Bilis Esculina
Fundamento:
Esta prueba se basa en la capacidad de ciertas bacterias, de hidrolizar el

glucósido esculina a esculetina y glucosa en presencia de 1-4% de sales biliares
(equivalentes a 10-40% de bilis), por acción de la enzima esculinasa. La esculetina
reacciona con las sales de hierro presentes en el agar (citrato férrico) y forma un
complejo marrón oscuro o negro que difunde en el medio.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Bilis-Esculina

Peptona .....................................................................................................5.00 g.
Extracto de carne .......................................................................................3.00g.
Esculina .....................................................................................................1.00g.
Sales biliares............................................................................................40.00g.
Citrato férrico ............................................................................................0.50g.
142
Agar .........................................................................................................15.00g.
pH final: 6.6 + 0.2
El medio de Bilis-Esculina habitualmente se prepara en agar inclinado en

tubos; aunque también se ha utilizado con éxito en placas de agar y en caldo.
Procedimiento:
Inocular la superficie del bisel del agar bilis-esculina con un cultivo puro del
microorganismo en prueba; o en su defecto, sembrar la superficie de una placa de
agar. Incubar a 35ºC por 24- 48 horas. Si la prueba es para un presunto enterococo, la
debe incubarse a 42ºC; pues en este caso, la prueba determina además, la capacidad
del microorganismo de crecer a temperaturas elevadas.
 Prueba positiva: se observa el ennegrecimiento difuso en el medio; o un halo

negro o marrón alrededor de las colonias en la placa de agar.
 Prueba negativa: no se ha producido el ennegrecimiento del medio. Puede

producirse crecimiento; pero esto no indica la descomposición de la esculina;
solamente indica que la concentración de bilis no inhibió el crecimiento de los
organismos.
Hidrólisis del Almidón
Fundamento:
El almidón es un polímero complejo de la glucosa, utilizado por algunos

microorganismos como fuente de carbono y energía. Las bacterias secretan una
exoenzima, denominada amilasa, que hidroliza el almidón en glucosa, a fin de que
ésta pueda atravesar la membrana citoplasmática y penetrar al interior de la célula.
143
Esta prueba se basa en la capacidad de la bacteria de hidrolizar el almidón contenido
en el medio. Una prueba cualitativa para detectar la hidrólisis del almidón consiste en
la aparición de un color azul al añadir una solución de iodo (lugol). Cuando el
almidón es hidrolizado, sus productos de degradación (dextrina, maltosa o glucosa)
no dan este color azul a la reacción.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Almidón
Peptona ........................................................................................................5.0g.
Extracto de levadura ..................................................................................1.50g.
Extracto de carne .......................................................................................1.50g.
Cloruro de sodio ........................................................................................5.00g.
Agar ...........................................................................................................15.0g.
Almidón soluble ..........................................................................................2.0g.
Agua destilada ................................................................................. 1.000.00ml.
pH final: 7.4 + 0.2
Las concentraciones de almidón sugeridas varían entre 0.2, 1 y 5%; se

recomienda primera para el estudio de bacterias anaerobias.
Reactivo: Solución de Lugol (Iodo).
Cristales de yodo .........................................................................................1.0g.

Ioduro de Potasio.........................................................................................2.0g.
Agua destilada ...................................................................................... 300.0ml.
Procedimiento:
Inocular un agar almidón con el microorganismo de prueba (se recomienda

inocular por estría única ya que se pueden estudiar varios cultivos en una misma
placa, si se siembran desde el borde hacia el centro). Incubar a 35ºC por 18-24 horas.
144
Para evidenciar la hidrólisis del almidón, agregar a la placa solución de iodo; el
almidón intacto presente en el medio forma un complejo coloreado de azul.
 Prueba positiva: la ausencia de color azul alrededor del crecimiento indica que
el almidón ha sido hidrolizado; mientras que el resto del medio se vuelve azul.
 Prueba negativa: el medio se vuelve azul hasta en la zona inoculada,

indicando que el almidón no ha sido hidrolizado.
Hidrólisis de la Caseína
Fundamento:
La caseína es la principal proteína de la leche, existe como una suspensión

coloidal que le da una apariencia opaca. Muchas bacterias poseen enzimas que
hidrolizan esta proteína, reacción que se evidencia por el aclaramiento de un medio
que contiene leche descremada. Es conveniente refrigerar las placas durante 2 días
antes de ser utilizadas para aumentar la opacidad del medio.
Medios y reactivos:
Medios: Agar leche descremada

Leche descremada en polvo ......................................................................28.0g.
Caseína ......................................................................................................5.00g.
Extracto de levadura ..................................................................................2.50g.
Dextrosa (glucosa) ....................................................................................1.00g.
Agar .........................................................................................................15.00g.
Agua destilada ................................................................................. 1.000.00ml.
pH final: 7.0 + 0.2
145
Procedimiento:
Sembrar un agar leche descremada con el microorganismo de prueba (se

sugiere inocular por estría única). Incubar a 35ºC por 18-24 horas en aerobiosis.
Lectura e Interpretación: (Figura 173)
 Reacción positiva: las colonias de microorganismos que digieren la caseína

(bacterias proteolíticas) estarán rodeadas de un halo claro.
 Reacción negativa: si el microorganismo no hidroliza la caseína, el medio

permanece opaco.
Producción de Hemolisinas
Fundamento:
Muchas bacterias producen enzimas (toxinas) con capacidad de degradar los

eritrocitos y la hemoglobina en su interior. Estas enzimas se denominan hemolisinas.
El tipo de hemólisis producido en agar sangre es útil para la identificación de

patógenos bacterianos, especialmente, los estreptococos. Los estreptococos producen
dos hemolisinas: Estreptolisina O, antigénica y oxígeno lábil, puede ser inhibida por
la producción de H2O2 por estreptococos creciendo en condiciones aeróbicas o en
presencia de niveles elevados de CO2 y, Estreptolisina S, no antigénica pero estable al
oxígeno. Estas producen una destrucción total de los eritrocitos (-hemólisis). Si las
colonias estreptocócicas no producen hemólisis, se dice que presentan una hemólisis
gamma (-hemólisis), nombre inapropiado ya que no ocurre destrucción de
eritrocitos.
146
Otro tipo de reacción característica de estos microorganismos es la hemólisis
alfa (-hemólisis), evidenciada por la destrucción parcial de la pared de los eritrocitos
y pérdida de algo de hemoglobina en el agar, lo que resulta en una coloración verdosa
del medio.
Medios y reactivos:
Medio: La base de agar utilizada en la preparación del medio debe estar libre
de azúcares reductores, ya que éstos suprimen la acción lítica de los estreptococos
sobre los eritrocitos presentes en el medio, tal vez mediante la disminución del pH.
La estreptolisina O es inactivada a pH bajos; por lo tanto, la presencia de cualquier
azúcar reductor en el medio puede suprimir la expresión de -hemólisis por las
colonias estreptocócicas en la superficie de las placas de agar incubadas de forma
aerobia.
En la actualidad, el medio más usado es agar sangre de carnero (5%); ya que

la sangre humana o de otros animales puede contener anticuerpos que neutralizan el
efecto de las hemolisinas, produciendo en consecuencia, falsos negativos.
Medio: Agar Sangre de Carnero (5%).
Extracto de carne .....................................................................................500.0g.

Triptosa .....................................................................................................10.0g.
Cloruro de sodio ..........................................................................................5.0g.
Agar ...........................................................................................................15.0g.
Sangre de carnero desfibrinada estéril .......................................................... 5%
pH final: 7.3 + 0.2
147
Procedimiento:
Inocular por rayado la superficie de las placas de ASC con el microorganismo

de prueba. Incubar a 35ºC por 18-24 horas en atmósfera anaeróbica. Alrededor del 2-
5% de los estreptococos del grupo A sólo producen estreptolisina O y pueden
perderse en cultivos incubados en una atmósfera aeróbica, salvo que se tomen
medidas para reducir la tensión de oxígeno en, al menos, una parte del medio de
cultivo. Se recomienda punzar el agar en varios puntos con el asa, o colocar una
lámina cubreobjetos sobre el área inoculada. Esta manipulación permite observar
mejor la hemólisis debajo de la superficie, donde prevalecen condiciones
relativamente anaerobias (Figura 174).
Se ha comprobado que la incubación anaerobia aumenta significativamente la

tasa de recuperación de estreptococos -hemolíticos de cultivos mixtos. La extensión
del período de incubación a 48 horas también mejora el índice de recuperación de
estos microorganismos.
 -Hemólisis: destrucción (lisis) total de los eritrocitos, las colonias se observan

rodeadas de un halo claro, incoloro y libre de eritrocitos intactos (Figura 175 a).
 -Hemólisis: destrucción parcial de los eritrocitos, las colonias aparecen

rodeadas de un halo color verdoso (Figura 175b).
 -Hemólisis (Gamma): no se observa destrucción de los eritrocitos; no hay

hemólisis, el medio se conserva intacto (Figura 175c).
148
Susceptibilidad a la Bacitracina (Taxo A)
Fundamento:
La susceptibilidad a bajas concentraciones de bacitracina (antibiótico

polipeptídico) provee un método fácil y económico para la identificación presuntiva
de los estreptococos -hemolíticos del Grupo A y B; aunque este método es todavía
usado en muchos laboratorios, esta prueba ha sido suplantada por procedimientos
sexológicos.
Los estreptococos del Grupo A son susceptibles a concentraciones

relativamente bajas de bacitracina (0.04 U); mientras que otros estreptococos -
hemolíticos, muestran susceptibilidad variable a este antibiótico.
Medios y Reactivos:
Medio: esta prueba debe realizarse en agar sangre de carnero (ASC) 5 %; ya

descrito en la prueba de hemólisis.
Taxo A: Taxo diferencial de bacitracina (0.04 Unidades/Disco); no debe

emplearse disco de sensibilidad (10 Unidades/Disco)
Procedimiento:
Tomar 3 ó 4 colonias del estreptococo -hemolítico e inocular a manera de

césped, una placa de ASC. Asépticamente, con ayuda de una pinza estéril, colocar el
disco de antibiótico (taxo A) en el área inoculada. Incubar la placa a 35ºC en
microaerofilia (5-10% CO2) por 18-24 horas.

149
 Susceptible (S): presencia de cualquier halo de inhibición del crecimiento
alrededor del disco.
 Resistente (R): presencia de crecimiento alrededor del disco (no hay halo de
inhibición).
Limitaciones:
 Sólo es aplicable a estreptococos -hemolíticos.
 No existe información en relación a que los diámetros del halo de inhibición

deban ser medidos.
 El inóculo debe ser confluente. Si éste es muy ligero, provocará que

estreptococos -hemolíticos no Grupo A, aparezcan como susceptibles a la
bacitracina.
Desoxirribonucleasa (DNasa)
Fundamento:
La producción de DNasa detecta la capacidad del microorganismo de producir

la enzima desoxirribonucleasa que hidroliza el ADN. El medio es de color verde claro
debido a la formación de un complejo ADN-verde de metilo. Si el microorganismo
que crece en el medio, hidroliza el ADN, el verde de metilo es liberado, tornando el
medio incoloro alrededor del crecimiento del organismo de prueba.
Alternativamente, la prueba puede realizarse en el medio DNasa que lleva

incorporado azul de toluidina como indicador. La positividad viene dada por una zona
rosada alrededor de la zona inoculada donde se ha producido la hidrólisis del ADN;
mientras que el resto de la placa permanece azul.
150
Medios y Reactivos:
Medio:
Agar DNasa con verde de metilo

Triptosa ....................................................................................................20.00g
ADN ...........................................................................................................2.00g
Cloruro de sodio ........................................................................................5.00g.
Agar .........................................................................................................15.00g.
Verde de metilo .........................................................................................0.05g.
Agua destilada ....................................................... …………..……1000.00 ml.
pH final: 7.3 + 0.2
Agar DNasa con azul de toluidina

Cloruro de calcio ...................................................................................0.0011g.
ADN ..........................................................................................................0.30g.
Cloruro de sodio ......................................................................................10.00g.
Agar .........................................................................................................10.00g.
Azul de toluidina .....................................................................................0.083g.
Tris (hidroximetil) aminometano ..............................................................6.10g.
Agua destilada ....................................................... …………..……1000.00 ml.
pH final: 9.0 + 0.2
Procedimiento:
Inocular el agar DNasa con el microorganismo de prueba (se recomienda

inocular por estría única). Incubar aeróbicamente a 35ºC por 18-24 horas.
151
Agar DNasa verde de metilo:
 Prueba positiva: el medio se observa incoloro alrededor del crecimiento del

microorganismo de prueba.
 Prueba negativa: si no hay degradación del ADN, el medio permanece del

color original (verde claro).
Agar DNasa azul de toluidina: (Figura 178)
 Prueba positiva: se observa un halo rosado alrededor del crecimiento

bacteriano, indicando hidrólisis del ADN.
 Prueba negativa: si no hay degradación del ADN, el medio permanece del

color original (azul)
Prueba de Camp
Fundamento:
El fenómeno CAMP fue informado por primera vez en 1,944 por Christie,
Atkins y Munch-Peterson, cuya contribución se reconoce en el acrónimo que
identifica la prueba.
Ciertos microorganismos (incluyendo a los estreptococos grupo B) producen
una proteína extracelular difusible (factor CAMP) que actúa en forma sinérgica con la
-lisina de S. aureus para incrementar la acción hemolítica sobre los eritrocitos
Medios y Reactivos:
Medio: esta prueba debe realizarse en agar sangre de carnero (ASC) 5%; ya
descrito anteriormente.
152
Cepa: S. aureus -lisina positiva
Procedimiento:
Esta prueba se realiza inoculando una estría única de los estreptococos a ser
identificados, perpendicular a una estría de S. aureus productora de -lisina. Las dos
estrías no deben tocarse (1 cm. de separación aproximadamente) (Figura 179).
Las placas inoculadas deben incubarse en atmósfera aeróbica a 37ºC por 18-
24 horas. Aunque la incubación en una atmósfera microaerofílica puede acelerar la
reacción, también se observará un mayor número de falsos positivos.
La prueba también puede realizarse empleando discos impregnados de -lisina

que se colocarán sobre la placa de ASC para inocular en forma perpendicular, el
microorganismo de prueba.
 Prueba positiva: en la unión de las dos estrías inoculadas. la zona de -hemólisis

aumentada, adquiere la forma de una punta de flecha
 Prueba negativa: no se observa zona de hemólisis aumentada.
Susceptibilidad a la Optoquina (Taxo P)
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar el efecto de la optoquina sobre un

organismo. El clorhidrato de etil-hidroxicupreína (optoquina), un derivado de la
quinina, inhibe selectivamente el crecimiento de Streptococcus pneumoniae en
concentraciones muy bajas (5 g/ml ó menos). La optoquina puede inhibir otros
estreptococos -hemolíticos; pero sólo con concentraciones mayores.
153
Medios y Reactivos:
Medio: Agar sangre de carnero (5%) (Ya descrito anteriormente)
Disco de Optoquina (5 g) (Taxo P)
Procedimiento:
Seleccionar 3 ó 4 colonias bien aisladas del microorganismo de prueba e

inocular, a manera de césped, un ASC. Usando una pinza previamente esterilizada a
la llama del mechero, colocar el disco de optoquina en el tercio superior del área
sembrada. Con las pinzas, presionar suavemente el disco, para que se adhiera a la
superficie del agar. Invertir la placa e incubar a 35ºC durante 18 a 24 horas en
atmósfera microaerofílica. Transcurrido el tiempo de incubación, proceda a medir el
halo de inhibición (incluyendo el diámetro del disco).
 Prueba positiva: se observa una zona de inhibición de 14 mm. ó más alrededor

del disco de optoquina de 6 mm ó una de 16 mm. ó más si se utiliza un disco de
10 mm.
 Prueba negativa: no se observa halo de inhibición del crecimiento, o se observa

una zona de inhibición de diámetro inferior al mencionado anteriormente para la
prueba positiva.
Solubilidad en bilis
Fundamento:
Las sales biliares, en especial el desoxicolato y el taurocolato de sodio, tienen

la capacidad de lisar de forma selectiva las células de Streptococcus pneumoniae
cuando se agrega a células bacterianas en crecimiento activo en un medio de cultivo
154
artificial. Este microorganismo produce enzimas autolíticas, que son responsables de
la depresión central o umbilicamiento característico de las colonias viejas en medio
de agar. Se cree que el agregado de sales biliares acelera este proceso, aumentando la
reacción lítica asociada con la disminución de la tensión superficial entre el medio y
la membrana celular bacteriana.
Medios y Reactivos:
Medio: Agar sangre de carnero 5% (Prueba en agar).
Reactivos: Desoxicolato de sodio (10%)

Desoxicolato de Sodio..............................................................................10.0 g.
H2O destilada ..................................................................................... ....100 ml.
También puede utilizarse Taurocolato de sodio al 10% en solución acuosa.
Procedimiento:
1.-Prueba en Placa (Prueba Rápida):
a) En un cultivo puro del microorganismo de prueba en ASC, marcar un círculo

alrededor de una colonia bien aislada, con tinta china o marcador indeleble,
sobre el fondo de la placa de Petri, para ayudar a localizarla después de la
prueba.
Agregar una gota de desoxicolato de sodio al 2% (diluir el reactivo al 10% en
proporción 1:5 con agua destilada) sobre la colonia.
b) Sin invertir la placa, incubar a 35ºC por 30 minutos en atmósfera aeróbica.
2.-Prueba en tubo:
a) Preparar una suspensión densa del microorganismo de prueba en solución

salina fisiológica estéril, a partir de un cultivo de 18 a 24 horas en agar sangre.
b) Marcar dos tubos estériles, uno como muestra y uno, como control.
c) Agregar 0,5 ml de la suspensión bacteriana a cada tubo.
155
d) Agregar 0.5 ml. de desoxicolato de sodio al 10 % al tubo marcado como
muestra.
e) Agregar 0.5 ml. de solución salina fisiológica estéril al tubo marcado como
control.
f) Agitar con suavidad ambos tubos y colocarlos en la incubadora a 35-37ºC o
en Baño de María, durante 3 horas, controlando cada hora.
1.-Prueba en agar: (Figura 182)
 Prueba positiva: la colonia se desintegra. Deja un área parcialmente hemolisada

en la superficie del medio de cultivo donde se encontraba la colonia.
 Prueba negativa: la colonia se mantiene intacta.
2.-Prueba en Caldo: (Figura 183)
 Prueba Positiva: los microorganismos solubles en bilis aclaran visiblemente la

turbidez del cultivo dentro de las 3 horas. El tubo de control con solución salina
debe permanecer turbio.
 Prueba Negativa: la solución se mantiene turbia, igual que el control.
Malonato
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de utilizar el malonato de sodio

como única fuente de carbono. Si el organismo es capaz de utilizar el malonato como
única fuente de carbono, al mismo tiempo que utiliza el sulfato de amonio como
fuente de nitrógeno, se produce un aumento de la alcalinidad, que se debe a la
formación de hidróxido de sodio. El malonato es un inhibidor de la enzima succinato-
156
deshidrogenasa, enzima que cataliza la conversión del ácido succínico en ácido
fumárico (ciclo de Krebs).
Medios y Reactivos:
Medio: Caldo malonato:

Sulfato de amonio……(NH4)2SO4 .........................................................2.00 g.
Fosfato de potasio (K2HPO4) ..................................................................0.60 g.
Fosfato monopotásico (KH2PO4). ...........................................................0.40 g.
Malonato de sodio ....................................................................................3.00 g.
Dextrosa (glucosa) ...................................................................................0.25 g.
Agua destilada ................................................................................... 1000.00ml
pH: 6.7 + 0.2
Procedimiento:
Inocular el caldo malonato con el microorganismo de prueba. Incubar en

aerobiosis, a 35ºC por 24–48 horas.
 Prueba positiva: color azul claro a azul intenso en todo el medio, producido por
el crecimiento del microorganismo a expensas del malonato como fuente de
carbono y la alcalinización del medio por la formación de NaOH.
 Prueba negativa: no se observa cambio de color (el medio se mantiene verde).

157
Identificación utilizando sistemas multipruebas
Se ha desarrollado una variedad de equipos comerciales que abarcan una serie

de pruebas bioquímicas, las cuales son realizadas simultáneamente. Estas incluyen el
sistema API y Enterotube II, entre otros. Aunque, originalmente, fueron desarrollados
para la identificación de enterobacterias (por ser los microorganismos más
frecuentemente aislados en la microbiología clínica), en la actualidad están
disponibles para otros grupos bacterianos. Los patrones de resultados obtenidos con
cepas conocidas se comparan entre varios laboratorios para crear un banco de
información computarizada que es suministrado por la industria que fabrica el equipo.
A través de la comparación obtenida con los resultados de las cepas bacterianas
probadas con la data suministrada por el fabricante, se puede hacer una identificación
tentativa en un tiempo mucho menor al que se requeriría si se utilizaran métodos
convencionales.
A pesar de esta innegable ventaja, deben tomarse ciertas precauciones para su

empleo:
1. Deben seguirse exactamente las instrucciones dadas por el fabricante y es

imprescindible el empleo de un cultivo puro del microorganismo de prueba.
2. El equipo debe utilizarse única y exclusivamente para identificar los
microorganismos para los cuales fueron concebidos.
3. Previo a la ejecución de la identificación, los resultados obtenidos, generalmente,
requieren correlación con otras características de identificación, tales como: tipo
de muestra de donde proviene el microorganismo, morfología colonial en medios
diferenciales y selectivos y reacción de oxidasa, por ejemplo.
4. Con frecuencia, los resultados deben ser confirmados utilizando otras técnicas
como la serología.
Los sistemas multipruebas más conocidos incluyen los siguientes:

158
Sistema API (Biomérieux Vitek, INc., Hazelwood, MO 63042) consiste en
un panel plástico que contiene una serie de microtubos individuales. Cada una
contiene un sustrato deshidratado que se rehidrata con una suspensión del
microorganismo de prueba. Después de la inoculación, las tiras son incubadas en
bandejas plásticas a 35ºC por 18-24 horas. Se examina luego la galería, buscando
cambios de color y las pruebas son registradas como positivas y negativas, según
convenga. Los resultados de las pruebas son utilizados para determinar un número de
identificación (código optal) que corresponde a una especie bacteriana.
Las galerías API disponibles en la actualidad incluyen, entre otros:
1. API 20 E: Identificación de bacilos Gram negativos en 18-24 horas.
2. RapiD 20 E: Identificación rápida de enterobacterias en 4 horas.
3. API 20 NE: Identificación de bacilos Gram negativos no entéricos en 24-48 horas.
4. Api Staph: Identificación de estafilococos y micrococos en 18-24 horas.
5. Api Candida: Identificación de levaduras en infecciones clínicas en 18-24 horas.
6. Api 20 Strep: Identificación de estreptocococs y bacterias relacionadas en 4 a 24

horas.
7. Api 20 C AUX: Identificación de levaduras en 24-48 horas.
8. Api 20 A: Identificación de anaeróbicos en 24-48 horas.
9. Api Coryne: Identificación de corinebacterias y corineformes en 24 horas.
10. Api NH: Identificación de Neisseria, Haemophilus y B. catarrhalis en 2 horas.
11. Api Campy: Identificación de Campylobacter en 24 horas.
12. Api 50 CH: Metabolismo de Carbohidratos.
13. Api 50 CHB Medium: Identificación de 22 especies o taxa.
14. Api 50 CHL Medium: Identificación de 52 especies o taxa.
15. Api Listeria: Identificación de todas las especies de Listeria en 24 horas.

159
El sistema API 20E se ha convertido en el método de referencia con el cual se
compara la exactitud de otros sistemas. Las 20 características que pueden
determinarse con el sistema están entre los grupos de pruebas más amplios de los
sistemas instrumentales. Identifica un gran porcentaje de bacterias en 24 horas, sin la
necesidad de determinar características fisiológicas adicionales (Figura 185).
El sistema es un poco incómodo para su inoculación, un problema que se

supera rápidamente con la práctica. Después de la inoculación, las galerías deben
manipularse con cuidado de modo que las suspensiones bacterianas no se
derramen y contaminen los medios circundantes. Se requiere práctica para
interpretar algunas reacciones límite, lo que puede afectar el número de biotipo y
la identificación final. En ocasiones, números de biotipos no aparecen en el
registro de perfiles; sin embargo, el fabricante proporciona un número telefónico y
correo electrónico para consultas.
Enterotube II ( BD, Bioscience, Cockeysville,MD 21030) este sistema es útil

para la identificación de enterobacterias. Consta de un tubo que con 12
compartimientos, cada uno contiene 15 pruebas bioquímicas. Los compartimientos se
inoculan punzando con el alambre de inoculación provisto por el equipo, una colonia
aislada del cultivo de prueba y luego, empujando el alambre a través de cada
compartimiento. Después de la inoculación, el tubo se incuba a 35ºC por 24 horas. Se
examinan los compartimientos y las pruebas se registran como positivas o negativas,
basándose en cambios de color. Los resultados de las pruebas se usan para determinar
un número de identificación que corresponde a una especie bacteriana (Figura 186).
De todos los sistemas, el Enterotube II es el más fácil de inocular. Ocupa poco

espacio y el riesgo de contaminación es mínimo. Las reacciones de color en general,
son fáciles de interpretar. Sin embargo; los reactivos para las pruebas de indol y VP
deben agregarse con una jeringa y aguja a través del delgado refuerzo de plástico. Si
esto no se hace de forma cuidadosa, el reactivo agregado puede filtrar hacia otros
compartimientos, alterando las reacciones. Por ende, se aconseja interpretar las
reacciones en otros compartimientos antes de agregar estos reactivos. Una desventaja
160
del sistema Enterotube, en comparación con sistemas que utilizan sustratos secos, es
que la incorporación de medios de agar convencionales acorta la vida útil.
El fabricante proporciona sistemas de identificación y codificación

computarizados (CCIS) que listan las posibles identificaciones bacterianas para los
números de biotipos de cinco dígitos que derivan de la interpretación de los cambios
de color.
Micro-ID (Remel): es el sistema ideal para laboratorios donde se desee la

identificación de bacterias en 4 a 6 horas. La inoculación del sistema es relativamente
fácil y las unidades ocupan poco espacio durante la incubación o almacenamiento.
Sólo es necesario agregar un reactivo (KOH al 20%) a una de las cámaras antes de
interpretar los resultados. Las reacciones son claras y pueden compararse con una
guía de colores. El fabricante suministra un registro de perfiles que lista la probable
identificación de microorganismos para los números de biotipos de cinco dígitos y es
posible efectuar comparaciones computarizadas. La exactitud es comparable con la de
otros sistemas instrumentales.
Minitek (Becton Dickinson Microbiology Systems): es muy recomendable

para los microbiólogos que desean libertad de elección en lo relativo a la selección de
las características para la identificación. El fabricante proporciona alrededor de 40
discos diferentes impregnados en reactivos que pueden seleccionarse en cualquier
combinación deseada. Esta elección de sustratos proporciona una amplia flexibilidad
para identificar grupos de microorganismos que no sean enterobacterias; se ha
logrado un éxito considerable en la identificación de bacilos no fermentadores,
anaerobios y levaduras de importancia clínica. En general, las reacciones son
visiblemente claras y el uso de un gran número de tarjetas de comparación de colores
hace que la interpretación resulte relativamente fácil. El fabricante también
proporciona un mini-codificador que permite una rápida clasificación de candidatos
bacterianos con cada perfil bioquímico elegido.
Una desventaja de permitir al usuario una total libertad de elección de las

características de identificación es la dificultad para estandarizar números de biotipos.
161
A la inversa, si el usuario elige un conjunto óptimo de pruebas, desde un punto de
vista teórico, puede obtener el mejor número de biotipo posible. La necesidad de
comprar varias piezas de equipo y suministros hace que la inversión inicial sea algo
costosa. Además, el sistema requiere diversas manipulaciones en los pasos de
inoculación, incubación e interpretación. La necesidad de cubrir los discos y el medio
de cultivo dentro de los pozos de reacción con aceite mineral, agrega un paso más al
procedimiento y es considerado engorroso por muchos usuarios.
MicroScan (American MicroScan, Inc., Sacramento, CA): consiste en

paneles plásticos con microtubos, en los cuales se incluyen hasta 32 sustratos
reactivos para la identificación d enterobacterias y otras especies bacterianas. Los
paneles se suministran en un estado congelado o contienen sustratos deshidratados
que hacen que el envío resulte más conveniente y permiten el almacenamiento a
temperatura ambiente y una vida útil más prolongada.
Los microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana y se incuban a

35ºC durante 15-18 horas. Luego, pueden interpretarse visualmente y los resultados
bioquímicos se convierten en un número de biotipo de siete u ocho dígitos que puede
“traducirse” en una identificación con un libro de códigos suministrado por el
fabricante. Alternativamente, puede utilizarse un lector automático de bandejas para
detectar el crecimiento bacteriano o cambios de color por diferencias de transmisión
de luz (Figura 187).
Sceptor (BBL Microbiology Systems): permite la hidratación e inoculación

simultáneas de paneles con sustratos desecados en bandejas de microtitulación para
enterobacterias. Se hace una suspensión del microorganismo a estudiar y luego se
traspasa al envase descartable. Este envase se coloca en un dispositivo de inoculación
automático y las placas son hidratadas e inoculadas de manera simultánea. Los
pocillos para arginina, H2S, lisina, ornitina y ureasa se cubren con aceite mineral
estéril. Los paneles se incuban a 35ºC durante 18-24 horas. Inmediatamente después
de la incubación, se agrega reactivo de Kovac’s y cloruro férrico a los pocillos para
indol y fenilalanina, respectivamente. Las reacciones se interpretan visualmente y se
ingresan de forma manual en un módulo de computadora. El empleo de los
162
programas computarizados permite la obtención de un número de biotipo de siete
dígitos y la identificación.
Todos estos sistemas proveen una mayor estandarización en la identificación

debido a que evita las limitaciones de las variaciones en la preparación de los medios
de cultivo en los diferentes laboratorios. También ahorran tiempo, trabajo y dinero.
A cada grupo de trabajo le será entregado el material y las cepas bacterianas

necesarias para proceder a la ejecución de las pruebas bioquímicas estudiadas en la
presente unidad práctica. Proceda según lo aprendido y registre los resultados
obtenidos.
Resultados
Complete las siguientes tablas con los resultados de las pruebas bioquímicas
realizadas.
Indol
Organismo
Positivo Negativo
Urea
Organismo
Positivo Negativo
Citrato
Organismo
Positivo Negativo
163
Motilidad
Organismo
Positiva Negativa
Lisina DC
Organismo
Positivo Negativo
Ornitina DC
Organismo
Positivo Negativo
Arginina DC
Organismo
Positiva Negativa
Fenilalanina Deaminasa
Organismo
Positiva Negativa
Gas de Glucosa
Organismo
Positivo Negativo
Manitol
Organismo
Positivo Negativo
164
Bilis Esculina
Organismo
Positiva Negativa
Hidrólisis de Almidón
Organismo
Positiva Negativa
Hidrólisis de Caseina
Organismo
Positiva Negativa
Hidrólisis de Gelatina
Organismo
Positiva Negativa
Hidrólisis del Hipurato

Organismo
Positiva Negativa
Taxo P
Organismo
Positiva Negativa
Taxo A
Organismo
Positiva Negativa
165
Test de Camp
Organismo
Positiva Negativa
DNasa
Organismo
Positiva Negativa
Solubilidad en bilis
Organismo
Positiva Negativa
TSI
Organismo
Taco Bisel Gas H2S
LIA
Organismo
Taco Bisel Gas H2S
Coagulasa
Organismo
Positiva Negativa
166
Rojo de Metilo
Organismo
Positivo Negativo
Voges Proskauer
Organismo
Positivo Negativo
Catalasa
Organismo
Positiva Negativa
Oxidasa
Organismo
Positiva Negativa
Organismo Tubo Abierto Tubo Cerrado OF
Tipo de Hemólisis
Organismo
Alfa Beta Gamma
Nitratos
Organismo
Color Positivo Negativo Zn
167
Malonato
Organismo
Positiva Negativa
1. ¿Si una bacteria no fermenta la glucosa, por qué no se prueba su capacidad para
fermentar otros carbohidratos?
2. ¿Por qué se utiliza agar y no gelatina como agente solidificante de los medios de
cultivo?
3. ¿Puede un microorganismo ser RM y VP positivo?. Explique.
4. ¿Si un caldo con carbohidrato no cambia de color después de ser inoculado, cómo
puede usted decir si ha ocurrido una falla del microorganismo al crecer o al
fermentar el carbohidrato?
5. Enumere 4 medios utilizados para la detección del H2S.

168
6. En ausencia de azúcares, ¿la descomposición de proteínas conduce a una
alcalinización o acidifación del medio?. Explique.
7. Enumere dos productos finales del metabolismo de la glucosa en microorganismos

VP positivos.
8. ¿Qué diferencia existe entre el reactivo de Erlich y el de Kovacs para la prueba de

indol?.
9. Explique brevemente por qué un carbohidrato como la glucosa, no debe añadirse a un

medio donde se quiera determinar denitrificación.
10. ¿Por qué el medio para la prueba de indol no debe contener glucosa?.
11. Indique cuáles son los productos finales de la decarboxilación de ornitina, lisina y
arginina, esquematizando las reacciones.
12. ¿Por qué las pruebas de oxidasa y catalasa no deben realizarse en medios que
contengan sangre?.
169
13. La reducción de los nitratos ocurre con mas frecuencia en presencia o ausencia de
oxígeno. Explique.
14. ¿Qué es un agente quelante?.
15. Indique si los siguientes enunciados son verdaderos o falsos:
a. Las amilasas son enzimas que degradan almidón______

b. La naturaleza coloidal de la leche sirve de base para interpretar la hidrólisis de la
caseina________
c. La caseina es una proteína encontrada en la leche_______
d. El agar nutritivo es el medio utilizado para detectar la producción de
hemolisinas_______
e. Los tubos de Durham se utilizan para determinar la producción de ácido a partir
de la fermentación de carbohidratos________
f. La producción de H2S es una reacción anaeróbica________
g. El indol es producto de la desaminación de la fenilalanina______
h. Un anaerobio estricto, dará la prueba de oxidasa positiva_______
i. La coagulasa contribuye a la patogenicidad bacteriana________
j. El empleo del citrato requiere condiciones de aerobiosis________
k. El medio para las decarboxilasas contiene dos indicadores de pH______
l. El medio de agar úrea contiene púrpura de bromocresol como indicador de pH
m. La ninhidrina es el reactivo utilizado en la prueba de hidrólisis del hipurato
mediante la detección de benzoato________
n. El medio para la prueba de motilidad es sólido_________
o. La catalasa se lee mediante la formación de un coágulo visible______
p. Las decarboxilasas son enzimas constitutivas__________
170
Unidad V
Genética Bacteriana
Objetivo Terminal:
 Verificar el proceso de transferencia de material genético por conjugación

entre las bacterias.
171
Transferencia de Material Genético por Conjugación Bacteriana
1. Demostrar la capacidad de los plásmidos de transferir resistencia de una bacteria a

otra y expresar dicha resistencia en su nuevo hospedero.
Generalidades
Los plásmidos son elementos genéticos extracromosómicos capaces de

codificar diversas funciones en la célula bacteriana, entre ellas, resistencia a los
antibióticos; estos elementos se transfieren fácilmente de una especie bacteriana a
otra lo que permite que rápidamente se diseminen genes que confieren resistencia a
las drogas.
A este fin se utilizará, como receptora, una cepa de Escherichia. coli resistente
a ácido nalidíxico ( E. coli K12NAR) pero sensible al resto de los antimicrobianos
conocidos; también se utilizará, como donante, una cepa de Klebsiella pneumoniae
resistente a ceftazidima (CAZ) (K. pneumoniae CAZR).
Mediante conjugación se transferirá a la cepa receptora (E. coli K12 NAR) el

plásmido de la cepa donante (K. pneumoniae CAZR), por lo que la cepa receptora
después del proceso de conjugación expresará resistencia a CAZ.
1. Antes de iniciar el protocolo para conjugación, se inocula un Caldo Soya

Tripticasa (CST) con cada una de las cepas (E. coli K12NAR y K. pneumoniae
CAZR). Se incuban en agitación a 37°C hasta alcanzar la fase exponencial del
crecimiento, lo cual se logra, generalmente, después de 2 a 2.5 horas de
incubación, para ese momento el caldo contiene una población bacteriana de
172
aproximadamente 2x108 bacterias/ml.
2. A partir de estos caldos se realiza un antibiograma para determinar los patrones de
susceptibilidad y resistencia utilizando el método de Kirby y Baüer, siguiendo los
criterios del CLSI (Instituto para la Estandarización de Laboratorios Clínicos,
según sus siglas en inglés). El antibiograma se realizará en agar Müeller Hinton
(MH), preparando una suspensión estandarizada del microorganismo, equivalente
al tubo 0.5 de la escala de Mc Farland. Se probarán los discos de CAZ y NA a
ambas cepas, posteriormente se incubarán las placas a 37°C por 18-24 horas.
3. Una vez finalizado el período de incubación, se procede a leer el antibiograma, la
cepa donante debe ser resistente a CAZ y sensible a NA; por otra parte, la cepa
receptora debe ser resistente a NA y sensible a CAZ.
4. Para realizar el cruce, primero se incuban ambas cepas (donante y receptora) en
agitación a 37°C, una vez alcanzado el crecimiento se mezclan volúmenes iguales
(1 ml), de la cepa donante y la receptora en un tubo estéril y se incuban durante la
noche a 37°C. Al día siguiente, se inocularán placas de Mac Conkey (MC), Mac
Conkey con ácido nalidíxico (MC/NA) y Mac Conkey/ácido
nalidíxico/ceftazidima (MC/NA/CAZ).
5. Se preparan diluciones 1/10 de cada uno de los cruces, desde 10 0 hasta 106, en
solución salina fisiológica estéril, posteriormente se dispensa 0.01 ml de cada
dilución a la placa correspondiente y se raya para obtener crecimiento confluente.
Las placas se incuban a 37°C por 18 a 24 horas, para luego seleccionar aquellas
más apropiadas para efectuar el contaje de colonias y poder establecer la
frecuencia con la cual se transfiere la resistencia.
6. Después de la incubación en las placas de MC se puede observar el crecimiento
tanto de la cepa donante como de la receptora, ya que el medio no contiene ningún
agente antimicrobiano, esta placa sirve para controlar que ambos microorganismos
están creciendo. En la placa de MC/NA se observa el crecimiento sólo de la cepa
receptora ( E. coli K12NAR), ya que posee resistencia a NA (antibiótico agregado
al medio), esta placa se utiliza para calcular el número total de receptoras. Por
último, en la placa de MC/NA/CAZ se observa el crecimiento sólo de las cepas
receptoras (NAR) que han adquirido resistencia a CAZ, mediante el proceso de
conjugación, esta placa indica el número total de receptoras resistentes a CAZ y
NA (cepas transconjugantes).
173
7. La frecuencia de transferencia de los plásmidos de resistencia se expresa como la
relación entre el número de células receptoras resistentes y el número de células
receptoras totales.
Frecuencia de No. colonias transconjugantes resistentesa

Transferencia =
No. total de colonias receptorasb
a: MC/NA/CAZ; b: MC/NA
8. Para corroborar la transferencia de resistencia a CAZ producida durante la

conjugación, se seleccionan 5 colonias aisladas de la placa de MC/NA/CAZ y se
siembran cada una en CST. Incubar durante 2-2.5 horas a 37°C hasta alcanzar una
turbidez adecuada, posteriormente se realiza un antibiograma y se prueba el disco
de CAZ, las placas son incubadas a 37°C por 18-24 horas y examinadas por
inhibición del crecimiento alrededor de los discos (Figura 188).
1. Defina el proceso de conjugación.
2. ¿Por qué es importante probar el disco de ácido nalidíxico en la cepa donante

antes de realizar un protocolo de conjugación?
3. Explique que sucedería en los tres grupos de placas si la cepa donante no tuviese
un plásmido conjugativo.
174
4. Observe el siguiente experimento de conjugación donde no hubo transferencia de
resistencia y explique las posibles razones del fracaso (Figura 189).
5. Observe el siguiente experimento de conjugación donde no hubo transferencia de

resistencia y explique las posibles razones del fracaso a (Figura 190).
6.-Observe los resultados del siguiente proceso de conjugación y realice el calculo de

la tasa de transferencia (Figura 191).
7.-Observe los resultados del siguiente proceso de conjugación y realice el cálculo de

la tasa de transferencia (Figura 192).
175
Unidad VI
Control del Crecimiento Bacteriano
Objetivo Terminal
Al finalizar la unidad, el estudiante estará en capacidad de:
 Aplicar las pruebas de laboratorio que se utilizan para la evaluación de la

efectividad de los agentes antimicrobianos in vitro.
176
Evaluación de Métodos Físicos para el
Control del Crecimiento Bacteriano
1. Evaluar el efecto del calor y las radiaciones ultravioletas sobre el crecimiento

bacteriano.
Calor
El uso de temperatura para el control del crecimiento bacteriano es

ampliamente utilizado. Generalmente, cuando se aplica calor sobre las bacterias, éstas
mueren; mientras que cuando se usan bajas temperaturas el crecimiento se inhibe.
Al aumentar la temperatura y rebasar la temperatura máxima de crecimiento,

aparecen los efectos letales. La muerte por calentamiento es una función exponencial
y ocurre rápidamente a medida que la temperatura se eleva. Estos hechos tienen
importantes consecuencias prácticas. Si se desea matar a cada una de las células de un
cultivo, esto es esterilizar una población, tomaría más tiempo a temperaturas bajas
que a temperaturas elevadas.
Los objetos pueden ser esterilizados ya sea por calor seco aplicado en un
horno o por calor húmedo en forma de vapor. De ambos métodos, se prefiere el calor
húmedo por su acción destructiva más rápida. Una temperatura de 80°C durante 5 a
10 minutos destruye la forma vegetativa de todas las bacterias.
La aplicación de calor húmedo para la destrucción de bacterias puede hacerse

de diversas formas: ebullición, tindalización, pasteurización y vapor a presión
(autoclave). De éstas, el vapor a presión es el más eficaz porque posibilita
temperaturas por encima del punto de ebullición del agua, tales temperaturas son
177
necesarias debido a alta resistencia al calor de las esporas de algunas especies
bacterianas.
El procedimiento usual es calentar con vapor de agua a presión de 15 libras, a

una temperatura de 121°C, por 15-20 minutos. Si se esterilizan objetos voluminosos,
la transferencia del calor a su interior será lenta y el tiempo de calentamiento debe ser
suficientemente largo para que el material esté a 121°C durante 15 a 20 minutos. En
este procedimiento los microorganismos son destruidos por la alta temperatura que se
alcanza cuando el vapor es sometido a la presión indicada.
La esterilización con calor seco requiere temperaturas más elevadas y un

período de calentamiento más prolongado El tipo más ampliamente utilizado de calor
seco es el horno de aire caliente. Se requiere un tiempo de esterilización de 2 horas a
180°C para destruir todos los microorganismos, incluyendo los formadores de
esporas.
Materiales
 Placas de Petri conteniendo Agar Nutritivo (2 por grupo).

 Termómetro
 Tubos de ensayo
 Beaker
 Baño de María
Cultivos
 Cultivo joven (24 horas) de Bacillus subtilis

 Cultivo viejo (48 – 72 horas) de Bacillus subtilis
 Staphylococcus epidermidis
 Escherichia coli
178
Procedimiento
A cada grupo de estudiantes se le asigna un cultivo en caldo de alguno de los

microorganismos arriba mencionados y dos temperaturas (63°C y 72°C)
1. Dividir cada una de las dos placas de Agar Nutritivo en cinco (5) secciones: “0”
tiempo, “15” seg., “2” min., “5” min. y “15” min. Identificar cada una de las
placas con las temperaturas de prueba (una con 63°C y la otra 72°C).
2. Ajustar la temperatura de dos Baños de María, uno a 63°C y el otro a 72°C,
mantener estas temperaturas.
3. Inocular el microorganismo asignado sobre la sección marcada como “0” tiempo,
en la placa de Agar Nutritivo correspondiente.
4. Colocar el tubo con caldo de cultivo del microorganismo asignado dentro del
Baño, una vez que la temperatura este en el punto deseado. Después de 15
segundos retirar el tubo, resuspender el cultivo e inocular sobre la sección
correspondiente en la placa de Agar Nutritivo identificada con la temperatura que
corresponda.
5. Colocar nuevamente el tubo en el Baño de agua y repetir el procedimiento a los 2,
5 y a los 15 minutos.
6. El procedimiento se realiza de la misma manera para el microorganismo asignado
a 63°C y a 72°C.
7. Incubar las placas a 35°C durante 24 horas. Registrar los resultados obtenidos en
la tabla de datos, de acuerdo a los siguientes criterios:
Negativo: sin crecimiento

Positivo +: crecimiento escaso
Positivo ++: crecimiento moderado
Positivo +++: crecimiento abundante.
179
Resultados
Temperatura/Tiempo
Organismo
63°C 72°C
0 15s 2m 5m 15m 0 15s 2m 5m 15m
B. subtilis (24h)
B. subtilis (48-72h)
S. epidermidis
E. coli
Interpretación:
Radiaciones
Nuestro ambiente está bombardeado con radiación electromagnética de varios

tipos. Esta radiación actúa como si estuviese compuesta de ondas que se desplazan en
el espacio como las olas lo hacen sobre la superficie del agua. La distancia entre dos
picos o valles de una onda se denomina longitud de onda. A medida que disminuye la
longitud de onda de la radiación electromagnética, aumenta la energía de la radiación.
Los rayos gamma y rayos X son mucho más energéticos que la luz visible o las ondas
de infrarrojo.
La luz solar es la principal fuente de radiación de la tierra. Comprende: luz

visible, radiación ultravioleta (UV), rayos infrarrojos y ondas de radio (Figura 193).
Muchas formas de radiación electromagnética son perjudiciales para los

microorganismos. Esto es especialmente cierto en el caso de la radiación ionizante, de
180
longitud de onda muy corta o de energía alta, que puede provocar que los átomos
pierdan electrones, es decir, que se ionicen. Dos formas principales de radiación
ionizante son: los rayos X, que se producen artificialmente, y los rayos gamma, que
se emiten durante la desintegración de radioisótopos. Aunque los microorganismos
son más resistentes a la radiación ionizante que los organismos superiores, pueden ser
destruidos con una dosis suficientemente grande.
La radiación ultravioleta es un tipo de radiación no ionizante que puede

producir la muerte de todas las clases de microorganismos, debido a su longitud de
onda corta (aproximadamente de 10 a 400 nm.) y alta energía). Sin embargo, la
radiación UV no atraviesa eficazmente el cristal, las películas de suciedad, el agua y
otras sustancias. Debido a este inconveniente la radiación UV se emplea como agente
esterilizante en muy pocas situaciones. Las lámparas UV se utilizan para
descontaminar ambientes como quirófanos, áreas de procesamiento de alimentos y en
cabinas de seguridad biológica para esterilizar el aire y cualquier superficie expuesta.
También se dispone de unidades de UV comerciales para el tratamiento del agua. La
longitud de onda más letal corresponde a 260 mn, debido a que es mas eficazmente
absorbida por el ADN. El principal mecanismo de destrucción por radiación UV es la
formación de dímeros de timina que inhiben la replicación y función del DNA
(Figura 194).
El ADN dañado se puede reparar mediante diferentes mecanismos. En la

fotorreactivación, una enzima fotorreactivadora emplea la luz azul para separar los
dímeros de timina. Este proceso se produce en ausencia de luz y se denomina
reactivación oscura. Cuando la exposición a UV es demasiado fuerte, el daño es tan
extenso que no es posible repararlo.
Muchos microorganismos usan pigmentos carotenoides para protegerse frente a

la fotooxidación. Los carotenoides inactivan eficazmente el oxigeno en estado de
singlete (molécula con gran poder oxidante, que destruye rápidamente una célula), es
decir absorben energía de éste y lo convierten de nuevo en estado elemental no
excitado.
181
Materiales
 Placas de Petri conteniendo Agar Nutritivo (2 por grupo).

 Hisopos de algodón estériles
 Materiales de cobertura: gasa, papel, tela, papel aluminio, vidrio transparente,
plástico.
 Lámpara UV (265 nm).
Cultivos
 Serratia marcescens
 Bacillus subtilis
 Staphylococcus aureus
 Escherichia coli
Procedimiento
Asignar a cada grupo de estudiantes uno de los cultivos arriba mencionados.
1. Inocular con un hisopo la superficie de cada placa con el cultivo en caldo del
microorganismo asignado, para garantizar una completa cobertura rayar la
superficie del medio en dos direcciones. Rotular las placas como: “A” y “B”.
2. Retirar la tapa de las placas inoculadas y cubrir la mitad con uno de los materiales
de cobertura.
3. Colocar cada placa directamente debajo de la luz UV, dejando aproximadamente
24 cm. entre la lámpara y la cobertura.
Placa A: Exponer por 30 seg.
Placa B: Exponer por 15 seg.
4. Incubar las dos placas, a 22°C o a temperatura ambiente durante 24 horas (la placa
B en oscuridad).
5. Transcurrido el tiempo de incubación examinar todas las placas y anotar los
resultados.
182
Resultados
¿Qué microorganismo utilizó?
¿Qué material de cobertura empleó?
Dibuje los resultados. Observe la producción de pigmento.
Placa A Placa B
Interpretación:
1. Compare la sensibilidad al calor del cultivo joven de Bacillus subtilis y el cultivo

viejo de éste mismo microorganismo, explique y razone su respuesta.
2. ¿Qué ventajas presenta un microorganismo pigmentado frente a uno no

pigmentado en relación a la exposición a luz UV?
183
3. Explique el mecanismo de acción bactericida de la luz UV.
4. Explique ¿por qué la placa B fue incubada en oscuridad, razone su respuesta?

184
Evaluación de Desinfectantes y Antisépticos
1. Evaluar la efectividad del lavado y cepillado de las manos.

2. Explicar la importancia de las medidas de asepsia en el laboratorio de
Bacteriología.
Generalidades
Los microorganismos que colonizan permanentemente la piel y las mucosas

son denominados flora residente; mientras que aquéllos que están presentes durante
días o semanas son referidos como flora transitoria.
La importancia del lavado de las manos en la prevención de enfermedades, fue

reportada por Ignaz Semmelweis, en 1846, en el Hospital General de Viena, quien
observó, que la ausencia de métodos asépticos tenia influencia sobre la incidencia de
la fiebre puerperal y otras enfermedades infecciosas. Semmelweis, estableció criterios
o normas de lavado de las manos con una solución de clorada de lima, observando un
descenso en la rata de muerte por fiebre puerperal de 12% a 1,2% en un año.
Los lineamientos establecidos por el Centro de Control y Prevención de

Enfermedades, indican que el lavado de las manos es el procedimiento más
importante en la prevención de infecciones intrahospitalarias.
La estructura de la piel y la capa grasa que recubre las manos, dificultan la

remoción de los microorganismos presentes en ella; por lo que el uso de jabón y
cepillo ayudan a eliminar la capa oleaginosa y por ende las bacterias existentes.
El personal que labora en instituciones dispensadoras de salud, debe lavarse

las manos antes y después de atender a un paciente. Estas recomendaciones deben ser
185
seguidas por las personas que trabajan en laboratorios donde se manipulan muestras
biológicas. El lavado y cepillado de las manos con agua y jabón durante 10 a 15
minutos, remueve la microflora transitoria.
En este ejercicio, se evaluará la efectividad del lavado de la piel de las manos

con agua y jabón; solo microorganismos aeróbica y no exigente en su nutrición, serán
observados en esta práctica.
Materiales
 Agar Nutritivo en placa (AN).(2/grupo)

 Cepillo de lavado.
 Diferentes tipos de jabones antisépticos y de tocador.
Procedimiento:
1. Tomar dos placas de AN y rotularlas, una como agua y la otra como jabón
colocando el nombre del jabón a evaluar; dividir cada una de las placas en cuatro
cuadrantes y marcarlas del 1 al 4.
2. Comenzar con la placa rotulada como agua tocando la primera sección con los
dedos sin lavar; lavar las manos solo con agua, escurrir el exceso y tocar la
sección 2.
3. Sin secar sus dedos, repetir el lavado efectuado en la sección 2 y tocar la sección
3; lavar por tercera las manos sólo con agua y tocar la sección 4.
4. Para trabajar con la placa marcada como jabón, se emplea la otra mano. Lavar
con agua y jabón, enjuagar y escurrir el exceso y tocar la sección 1.
5. Repetir el procedimiento efectuado en el paso anterior y tocar la sección 2.
6. Usando un cepillo, cepillarse las manos con agua y jabón, por 2 minutos enjuagar
bien, eliminar el exceso, y tocar la sección 3.
7. Efectuar el mismo procedimiento del paso 6 pero durante 4 minutos, y colocar
los dedos en la sección 4.
186
8. Incubar las placas a una temperatura de 35-370C, durante 24 horas, observar el
crecimiento y reportarlo de la siguiente forma:
Negativo: sin crecimiento
Positivo +: crecimiento escaso
Positivo ++: crecimiento moderado
Positivo +++: crecimiento abundante.
Resultados
Sección Sólo Agua Jabón:
1(sin lavar)
2
3
4
Interpretación
1. ¿En qué difiere la microflora normal de la transitoria?
2. Compare los resultados obtenidos en el laboratorio entre un jabón en barra y uno

líquido.
3. Si la mayoría de la microbiota normal y la transitoria no son dañinas, explique por

qué las manos deben ser lavadas y cepilladas antes de cualquier cirugía.
187
Pruebas de Susceptibilidad y Resistencia Bacteriana a los
Antibióticos
1. Realizar apropiadamente los diferentes métodos para determinar la susceptibilidad

y resistencia de las bacterias a los antibióticos.
2. Interpretar los resultados obtenidos por los métodos utilizados.
3. Reportar adecuadamente los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los
antibióticos.
Generalidades
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es

una de las funciones más importantes de los laboratorios de Microbiología Clínica. Se
realiza mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo
es evaluar la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos.
El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un

microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una
bacteria o población bacteriana. El resultado de la prueba de susceptibilidad, la
farmacología del antimicrobiano, el sitio del la infección y los aspectos clínicos del
paciente, sustentan la elección de las drogas adecuadas para el tratamiento de las
enfermedades infecciosas.
El panorama actual de la resistencia de los microorganismos a los

antimicrobianos hace ineludible su determinación, incluso en aquellos casos en los
que la sensibilidad se considera universal y no se han descrito, por el momento,
mecanismos de resistencia. Cada laboratorio de microbiología establecerá según su
estructura, demanda asistencial y política de antibióticos, un esquema de organización
y técnicas de trabajo que aseguren la realización e información posterior de los
antibiogramas.
188
Los ensayos de sensibilidad deben estar estandarizados y sujetos a procesos
de control que aseguren su reproducibilidad. En la presente guía se resumen los
métodos básicos utilizados para el estudio de la sensibilidad, así como los criterios
para su interpretación y control de acuerdo al CLSI (Instituto para la Estandarización
de Laboratorios Clínicos, según sus siglas en inglés).
Indicaciones para la realización de las Pruebas de Susceptibilidad
Es preciso realizar en el laboratorio las pruebas de sensibilidad antimicrobiana

porque son una ayuda invaluable para la selección del agente apropiado para el
tratamiento de la infección. Como en los últimos años se ha venido observando una
mayor frecuencia de la resistencia bacteriana, es menester, hacer un estudio de cuál es
el agente causal de la infección y cuál es la droga indicada para éste. Sin embargo,
algunos tratamientos se hacen sin conocer estos dos factores y las consecuencias
pueden ser: 1) crear resistencia a las drogas, y 2) destruir la flora normal bacteriana.
Existen microorganismos que mantienen su sensibilidad original a algunas

drogas, por lo que en esos casos, la terapia empírica es totalmente reconocida y no es
necesario realizar pruebas de sensibilidad. Por ejemplo, los estreptococos Grupo A
han permanecido sensibles a penicilina G, al igual que los meningococos;
desafortunadamente, esto es cada vez menos común.
Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando aún, conociéndose

la sensibilidad del microorganismo a drogas altamente efectivas, el paciente no puede
recibir dicho tratamiento. Por ejemplo, en casos de infecciones por estreptococo
grupo A, en pacientes alérgicos a penicilina, se debe probar la sensibilidad a otros
antibióticos alternativos como eritromicina y otros macrólidos.
Sin embargo, los patrones de resistencia cambian en forma constante. No

importa cuan rápidamente se introduzcan los nuevos agentes terapéuticos, las
bacterias parecen estar dispuestas a sobrepasarlos.
189
Métodos para determinar la Susceptibilidad Bacteriana a los Antibióticos
a. Dilución en caldo
b. Dilución en agar
c. Difusión del disco en agar.
d. E-test
e. Otras pruebas
A. Método de dilución en caldo
Este método fue descrito en los años 1940 y a pesar de ser una de las primeras
técnicas en ser descritas, es aún considerada como método de referencia. En este
método se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano,
generalmente diluciones a la mitad (1:2), en tubos que contienen un medio de cultivo
líquido (caldo) que sostendrá el desarrollo del microorganismo de prueba.
El caldo más comúnmente utilizado para estas pruebas es el Müeller-Hinton

suplementado con cationes magnesio y calcio.
Los agentes antimicrobianos se preparan en soluciones concentradas en un

solvente adecuado, y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones
apropiadas. Los solventes más utilizados para preparar las soluciones madre de los
antibióticos a probar son: buffer fosfato pH 6.0 ó 8.0/0.1 M., etanol, HCl 0.04-0.05 N,
metanol, NaOH 1 M ó 2.5 M. Los diluyentes más empleados son: agua destilada y
buffer fosfato.
Un inóculo estándar del microorganismo (1x105 células/ml) se agrega a un

volumen igual (por lo general, 1 ml) de cada concentración de antibiótico y a un tubo
con caldo sin antimicrobiano que servirá de control de crecimiento. Luego de la
incubación adecuada, se observa la turbidez de los caldos, que indicará desarrollo del
microorganismo. La bacteria crecerá en el tubo control y en todos los caldos que no
contengan suficiente antibiótico como para inhibir su desarrollo.
190
El método de dilución es un método cuantitativo para determinar la
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y la Concentración Bactericida Mínima
(CBM) del antibiótico probado. La CIM se define como la menor concentración del
antibiótico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. Se expresa en microgramos por
mililitro del antibiótico (g/ml). Por CBM, se entiende la mínima concentración del
antibiótico que destruye el 99.99% de las bacterias probadas.
Si la concentración del antimicrobiano representada por la CIM puede ser

alcanzada fácilmente en el suero del paciente por las vías normales de administración,
se dice que el microorganismo es sensible a ese agente. Por el contrario, si la CIM es
mayor que el nivel alcanzable o se encuentra dentro de los límites de toxicidad para el
hospedador, se dice que el microorganismo es resistente a este agente antimicrobiano.
Existen dos modalidades de las pruebas de dilución en caldo: la macrodilución

y la microdilución.
Técnica de Dilución en Caldo (Macrodilución). Determinación de la

Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).
Procedimiento
1. Rotular con números del 1 al 10, diez tubos estériles.

2. Agregar a los tubos 2 al 10, 0.5 ml. de Caldo Soya Tripticasa (CST).
3. Agregar a los tubos 1 y 2, 0.5 ml. de una dilución previamente preparada del
antibiótico con una concentración de 100 g/ml ó de 200 g/ml (tubo 1: control
del antibiótico; siempre deberá estar claro).
4. Mezclar bien el contenido del tubo 2 y traspasar 0.5 ml. al tubo 3. Mezclar bien y
traspasar 0.5 ml. para el tubo 4 y, así sucesivamente, hasta llegar al tubo 9. De
este último tubo, tomar 0.5 ml. y descartarlos. De esta manera se obtienen
diluciones seriadas a la mitad, desde 100g/ml hasta 0.4g/ml; ó de 200 g/ml
hasta 0.8 g/ml. El tubo 10 no contiene antibiótico y servirá como control de
crecimiento microbiano.
191
5. Agregar a todos los tubos 0.5 ml. de una suspensión bacteriana
estandarizada*(105 bacterias/ml).
6. Incubar los tubos de prueba a 35°C por 18-24 horas.
7. Una vez transcurrido el período de incubación, se examinan los tubos en busca
de crecimiento, el cual se evidencia por presencia de turbidez. La CIM se
interpreta como la concentración del antibiótico, contenida en el primer tubo de
la serie, que inhibe el crecimiento (Figura 195).
*Estandarización del inóculo
Inocular un CST a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba (4

ó 5 colonias) e incubar a 35°C por 18-24 horas. Transcurrido este tiempo, comparar la
turbidez con el estándar 0.5 de Mc Farland que contiene aproximadamente 10 8 células
bacterianas/ml. (ajustar la turbidez si es necesario, utilizando para ello, CST o SSF
estéril). De esta dilución, preparar una dilución 1:100, tomando 0.1 ml. de la
suspensión estandarizada y traspasarla a un tubo que contenga 9.9 ml. de SSF (la
concentración bacteriana será ahora de 106 células/ml., aproximadamente). De aquí,
preparar una dilución 1:10, tomando 1 ml. de la suspensión anterior y traspasarlo a un
tubo conteniendo 9 ml. de CST. Mezclar bien. Esta dilución contiene un estimado de
105 células bacterianas/ml. y será utilizada para la inoculación de las pruebas de
susceptibilidad a los antibióticos por el método de dilución en caldo.
Preparación de los Estándares Nefelométricos de Mc Farland
1. Preparar 10 tubos de ensayo de igual tamaño y buena calidad que hayan sido
cuidadosamente lavados y enjuagados.
2. Preparar ácido sulfúrico puro al 1%.
3. Preparar una solución acuosa de cloruro de bario puro al 1%. Mantenga la
suspensión en agitación continua mientras agrega el BaCl 2.
4. Colocar en los tubos, las cantidades de cada solución indicadas en el cuadro
siguiente, completando un volumen final de 10 ml. por tubo:
192
Tubo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Cloruro de Bario (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Ácido Sulfúrico (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Densidad celular
aproximada 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
(108células/ml)
Para preparar el inóculo estandarizado, diluir a la mitad (1:2) el tubo Nº 1 de

Mc Farland. Verificar la densidad óptica del estándar, usando un espectrofotómetro
con un paso de luz de 1cm. El estándar 0.5 de Mc Farland debe tener una absorbancia
de 0.08-0.10 a 625 nm. Mantenga los estándares herméticamente cerrados a
temperatura ambiente y al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estándar en
agitador mecánico (vortex) antes de su uso para logar una turbidez homogénea. Este
estándar contiene aproximadamente 1.5 x 108 células bacterianas/ml.
Determinación de la Concentración Bactericida Mínima (CBM)
Para medir la capacidad de un antimicrobiano de destruir a un

microorganismo, se debe determinar la prueba de actividad bactericida.
Procedimiento
1. Cuando se inocula la suspensión inicial del microorganismo en los tubos de caldo,

se toma una alícuota del tubo de control del crecimiento y se inocula en una placa
de agar para determinar el número real de unidades formadoras de colonias (UFC)
del inóculo. Este número se obtiene multiplicando por el factor de dilución el
número de colonias presentes, luego de la incubación de las placas de agar.
2. Luego que se ha determinado la CIM, se siembra placas de agar con una cantidad
conocida del inóculo (0.1 ml) tomado de cada uno de los tubos de caldo que no
presentan turbidez luego de la incubación.
3. El número de colonias que se desarrollan en estos subcultivos, se compara con el
número de UFC/ml del cultivo original. En aquellos tubos que no presentan
turbidez, los microorganismos permanecían viables o bien, habrían sido destruidos
193
por el antibiótico. Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan
totalmente una población bacteriana, la mínima concentración del agente
antimicrobiano que permite sobrevivir a menos del 0.1% del inóculo original se
denomina CBM ó Concentración letal mínima (CLM) (Figura 196)
4. Cuando un agente con propiedad bactericida conocida presenta una CBM in vitro
que es mucho mayor que su CIM, se dice que la bacteria es tolerante al
antimicrobiano en cuestión.
Técnica de Microdilución
Los métodos descritos anteriormente, pueden ser utilizados para estudiar

muchos tipos de bacterias tanto aerobias como anaerobias; pero son lentos y
laboriosos. Para cada sistema bacteria-antibiótico debe prepararse una serie completa
de tubos, lo cual hace prohibitivo probar más de unos pocos antimicrobianos frente a
cada cepa aislada de un paciente. Sin embargo, la adaptación del método de dilución
en caldo a una técnica de microdilución ahorra reactivos y tiempo del operador.
Este procedimiento es semejante, en principio, al método de macrodilución en

caldo, excepto en que la susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos es
determinada en una serie de orificios que están moldeados en una placa plástica. Cada
placa puede contener 80, 96 o más orificios (Figura 197).
Las ventajas de este método son el uso de pequeños volúmenes de reactivos y

el gran número de bacterias que pueden ser probadas de forma simple y poco costosa.
El examen de las microplacas se efectúa directamente sobre una fuente de luz

o se leen observando el fondo sobre un lector con espejo. Aunque las microplacas se
preparan empleando el mismo medio de crecimiento y las mismas concentraciones de
antimicrobianos, existe una diferencia importante. El inóculo bacteriano, 5 x 10 5
bacterias/ml, disminuye considerablemente en cada microcubeta dado el pequeño
volumen sembrado. Estas microcubetas, por lo general, tienen una capacidad de 0.1
ml, por lo tanto el inóculo final será 5 x 104 UFC/ml.
194
El inóculo pequeño también hace difícil determinar la CBM, ya que el número
de UFC puede no ser suficiente para permitir la determinación del 99.9% de
destrucción bacteriana; por lo que se recomienda que los micrométodos se empleen
sólo para la determinación de la CIM y que los resultados de la CBM, se obtengan
por la técnica de macrodilución.
Ventajas y Limitaciones de los Métodos de Dilución en Caldo
Se consideran de referencia para la determinación cuantitativa de la actividad

de los antimicrobianos. Son los métodos adecuados, cuando además de la actividad
inhibitoria, se quiere determinar también, la actividad bactericida. En comparación
con los métodos de difusión, son técnicamente más complejos y casi siempre más
costosos, en particular cuando se utilizan paneles comerciales de microdilución.
Proceda a realizar la determinación de la CIM por el método de dilución en

caldo a los microorganismos de prueba.
Resultados
Registre los valores de CIM obtenidos para cada microorganismo y

antibiótico.
Género:__________________________
Especie:__________________________
Antibiótico:________________________
CIM:_____________________________
Género:___________________________
Especie:___________________________
Antibiótico:_________________________
CIM:_______________________________
195
B. Método de Dilución en Agar
Este método ha sido exitosamente adaptado para su uso de rutina en los

laboratorios. Consiste en probar concentraciones seleccionadas de antibióticos. Se
diferencia del anterior, únicamente en el medio de cultivo; aquí, se utiliza agar (medio
sólido). Se inocula una suspensión estandarizada de bacterias en una serie de placas,
cada una con una concentración determinada de antibiótico. Aquellos
microorganismos susceptibles a la concentración dada de antibiótico, no crecen;
mientras que los organismos resistentes, crecerán produciendo colonias.
Procedimiento
1. Rotular las placas de Petri con las concentraciones de antibióticos que se desean
probar, incluyendo una marcada como 0 µg/ml (libre de antibiótico, control de
crecimiento bacteriano). Para cada serie de concentraciones se debe incluir al
comienzo y al final de la misma, placas de medio sin antibiótico que servirán
para controlar el crecimiento y la posibilidad de contaminación.
2. Preparar el medio de cultivo a utilizar. (generalmente agar Müeller-Hinton); pero
en función de los microorganismos y de sus necesidades nutritivas puede ser
necesario, añadir algún suplemento a este medio o utilizar un medio diferente.
3. Previo a la esterilización, el agar fundido es distribuido en tubos estériles con
tapa de rosca, en alícuotas que permitan obtener las diluciones deseadas del
antibiótico (generalmente, 19 ml de medio por 1 ml de la correspondiente
concentración del antibiótico); de manera que, para placas de 100 mm de
diámetro son necesarios, 20 ml de medio con antibiótico).
4. Esterilizar los tubos conteniendo el medio a 121ºC a 15 libras de presión por 15
minutos y estabilizar luego en Baño de María a 45-50ºC. Añadir los suplementos
(si es necesario).
5. Agregar el antibiótico a cada tubo. Mezclar por inversión.
6. El medio conteniendo antibióticos, se vierte cuanto antes en las placas de Petri
estériles, evitando la formación de burbujas que dificultaría la posterior
inoculación de las placas.
196
7. Dejar solidificar el medio en las placas, las cuales se utilizarán inmediatamente o
se almacenarán en refrigeración a 4-8ºC, en bolsas plásticas.
8. Antes de la inoculación, las placas se deben dejar a temperatura ambiente unos
30 minutos, comprobando que no existe agua de condensación en la superficie de
las mismas.
9. Preparación del Inóculo: el inóculo recomendado se prepara con una suspensión
bacteriana estandarizada con el tubo 0.5 de Mc Farland que contiene
aproximadamente 108 UFC/ml, que posteriormente se diluye 1:10 para ajustar la
concentración a 107 UFC/ml.
10. Una vez que se ha preparado el inóculo, las placas debe sembrarse antes de los
15-30 minutos, para evitar que la demora pueda provocar cambios significativos
en el tamaño del inóculo. La inoculación puede hacerse de dos maneras:
utilizando un asa calibrada estéril o un dispositivo de inoculación (replicador), el
cual dispensa 0.001 ó 0.002 ml de la suspensión bacteriana en la superficie de las
placas de agar. De esta forma, se depositan cerca de 1 x 104 UFC por gota sobre
la superficie del agar que contiene las diferentes concentraciones de los agentes
antimicrobianos. Para la inoculación, se deben preparar las series de placas de
modo que se comience inoculando un control sin antibióticos, se continúa
inoculando a partir de la placa con mayor concentración de antibiótico y se
finaliza sembrando una nueva placa de control sin antibiótico.
11. Cada una de las cepas a probar, se debe sembrar por rayado en una placa sin
antibiótico para comprobar la pureza de las mismas.
12. Las placas inoculadas se dejarán a temperatura ambiente hasta que las gotas de
inóculo estén secas.
13. Incubar las placas a 35ºC durante 16-24 horas.
14. Luego de la incubación en condiciones apropiadas, los microorganismos se
desarrollarán en aquellas placas que no contengan suficiente concentración de
antibiótico para inhibir su crecimiento. La CIM es la mayor dilución del
antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano.
197
Ventajas y Limitaciones del Método de Dilución en Agar
Es un método bien estandarizado con resultados confiables y reproducibles

que puede utilizarse como referencia para evaluar la exactitud de otros sistemas de
prueba. Adicionalmente, permite probar simultáneamente varios aislamientos y
detectar más fácilmente, contaminación de los cultivos que los métodos de dilución
en caldo. La mayor desventaja es que consume mucho tiempo y es muy laborioso.
Además, no permite determinar la CBM.
C. Método de Difusión del Disco en Agar (Método del Disco único de Alta
Potencia o Método de Baüer y Kirby)
Descrito por primera vez por Anderson en 1.961 y luego estandarizado por
Baüer y Kirby en 1.966, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció que
los laboratorios de bacteriología usarán este método de rutina para las pruebas de
sensibilidad antimicrobianas (antibiogramas) en microorganismos de crecimiento
rápido.
Es el método estandarizado debido a que se economiza tiempo y dinero, hay

facilidad y reproducibilidad en los resultados, además, da un margen de seguridad del
96%.
Fundamento
Este método utiliza discos de papel de filtro impregnados con antibiótico.

Inmediatamente que los discos son colocados sobre la superficie de medios de
cultivo, previamente inoculados con el microorganismo de prueba, el antibiótico
difunde de manera radial, creando una reducción logarítmica en la concentración del
antibiótico. Si la bacteria es sensible al efecto del antibiótico, se producirá un halo de
inhibición del crecimiento alrededor del disco; en caso contrario, la bacteria crecerá
normalmente (Figura 198).
Los diámetros de los halos de inhibición han sido correlacionados con las
198
CIM de los antibióticos obtenidas por pruebas de dilución seriada con inóculos
bacterianos estandarizados.
El método de difusión del disco en agar es utilizado de rutina para la

determinación de la susceptibilidad antimicrobiana; pero la CIM y la CBM
determinadas mediante pruebas de dilución se están convirtiendo en rutinarias,
especialmente cuando existen infecciones severas en pacientes hospitalizados y se
requiere una información más exacta; siendo particularmente útiles en pacientes
sépticos, inmuno-comprometidos, con meningitis o endocarditis bacteriana, en
pacientes que no responden al tratamiento de elección y en aquellos que requieren
altas dosis de antibióticos potencialmente tóxicos para el tratamiento de la infección.
Procedimiento
1. Se toman 4 ó 5 colonias de la bacteria aislada en cultivo puro y se inocula un CST

(3-4 ml.) (Figura 199)
2. Incubar el CST a 35°C por 18-24 horas (mínimo 2-8 horas), con el objeto de
obtener una suspensión bacteriana de 108 células/ml, aproximadamente. Dicha
concentración es similar al tubo N° 0.5 de Mc Farland.
3. Si es necesario, ajustar la turbidez del CST, empleando para ello SSF estéril o CST
(Figura 200).
4. Cuando se obtiene esta concentración aproximada de bacterias, se procede a
inocular el medio de cultivo. Se recomienda el Agar Müeller-Hinton (MH)*, el
cual se ambienta 30 minutos antes de su inoculación. Para este fin, la suspensión
bacteriana se toma con un hisopo de algodón estéril, el cual se rota contra las
paredes del tubo, antes del sembrarlo en forma masiva, para eliminar el exceso de
líquido.
Nota: se recomienda el agar MH* para las bacterias no exigentes; en caso de

estreptococos pueden emplearse modificaciones como el MH enriquecido con 5% de
Sangre (MHS) y para microorganismos más exigentes como Haemophilus, se
recomienda el Haemophilus Test Medium (HTM). Lo ideal es tener un medio de
cultivo de bajo contenido de cationes (magnesio y calcio); ya que éstos afectan la
199
actividad de los aminoglicósidos y tetraciclinas; y además, el medio no debe presentar
variación entre lotes.
5. Inocular a manera de césped toda la superficie del agar, rotando la placa en

ángulos de 60°, al igual que el hisopo (Figura 201).
6. Después de 3-5 minutos el inóculo está seco y con ayuda de una pinza esterilizada
por flameado a la llama del mechero, colocar cada uno de los discos de antibióticos
sobre la superficie del agar. Hacer ligera presión con la pinza para asegurar la
adherencia del disco a la superficie del agar. Puede utilizarse un dispensador de
discos, que es un instrumento que permite colocar varios discos simultáneamente
(Figura 202).
7. Una vez colocados todos los discos, incubar las placas en la estufa a 35°C por 18-
24 horas.
8. La lectura e interpretación de las zonas de inhibición se hace de acuerdo al
diámetro de la zona donde no ha crecido la bacteria, la cual se determina al medir
con una regla o vernier por la parte dorsal de la placa de Petri (Figura 203).
9. Los resultados se expresan de manera cualitativa en tres categorías, como:
Resistente (R), Sensible (S) o Intermedio (I), según los resultados obtenidos en las
tablas correspondientes del CLSI (ver anexo 1).
La categoría sensible implica que una infección dada por las cepas en estudio
puede ser tratada apropiadamente con la dosis de antibiótico recomendada para el tipo
de infección y el agente causal, a menos que existan contraindicaciones.
La categoría intermedio, incluye cepas que pueden ser inhibidas por

concentraciones más elevadas de antibiótico, siempre que la dosis usada pueda ser
incrementada (por ejemplo, beta-lactámicos) o que sean concentrados
fisiológicamente en el tejido infectado, por ejemplo, beta-lactámicos y quinolonas en
orina;. También indica una zona “buffer” que debería evitar que pequeños factores
técnicos difíciles de controlar causen mayores discrepancias de interpretación,
especialmente, para drogas con limitado margen fármaco-tóxico.
La categoría resistente indica que las cepas no son inhibidas por las
200
concentraciones séricas normalmente alcanzadas a las dosis habituales y/o caen en el
rango donde son comunes mecanismos específicos de resistencia bacteriana, (por
ejemplo: beta-lactámicos) y la eficacia clínica no ha sido comprobable.
Interpretación de los resultados:
El tamaño de la zona de inhibición que se observa en una prueba de difusión

en agar no tiene significado por sí mismo. Las normas interpretativas provistas por el
CLSI (ver anexos) derivan de una correlación entre las medidas de las zonas y las
CIM de aquellas especies que pueden ser estudiadas mediante un método de difusión
en agar.
Ventajas del Método de Difusión en Agar
1. Su técnica es de fácil ejecución y sus resultados son reproducibles.

2. Los reactivos utilizados son relativamente económicos.
3. No requiere equipos especiales.
4. Sus resultados son de fácil interpretación.
5. Presenta flexibilidad en la selección de los antibióticos a probar.
Limitaciones del Método de Difusión en Agar
1. Ha sido estandarizado para un reducido espectro de microorganismos.

2. Sus resultados son de carácter cualitativo y no cuantitativo.
3. Sólo permite probar una concentración de cada antibiótico.
Proceda a realizar un antibiograma por la técnica de Kirby & Baüer a una cepa
de Escherichia coli y de Staphylococcus aureus, según le indique su profesor.
201
Resultados
Registre los diámetros de los halos de inhibición obtenidos para cada

microorganismo y antibiótico (mm). Interprételos y reporte correctamente los
Género: _____________________
Especie: ______________________
Antimicrobiano Código Diámetro (mm) Interpretación
Género: _____________________
Especie: ______________________
Antimicrobiano Código Diámetro (mm) Interpretación

202
C. Método de E-TEST (PDM-Epsilometer Test, Ab Biodisk; Suecia)
Este es un método relativamente nuevo que combina los principios de la

técnica de difusión del disco y la dilución en agar. Utiliza tiras plásticas de plástico
no poroso, de 6 cm. de largo x 5 mm de ancho, impregnadas de antibiótico, presentes
en un gradiente de concentración predefinido, las cuales son colocadas en la
superficie del medio de cultivo previamente inoculado y que, una vez incubadas en
condiciones apropiadas por el tiempo conveniente, van a producir zonas de inhibición
del crecimiento con forma elipsoidal y simétrica. El punto donde la elipse toca la
escala graduada de la tira de E-test, indica directamente, la CIM del antibiótico en
cuestión (Figura 204).
Procedimiento
1. Preparar un inóculo estandarizado de manera similar al utilizado en el método de

Kirby & Baüer (108 células/ml).
2. Durante los 15 minutos posteriores al ajuste del inóculo, introducir un hisopo
estéril dentro de la suspensión y al retirarlo, rotar varias veces contra la pared del
tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de eliminar el exceso de
inóculo. Inocular las placas de agar MH uniformemente, sin dejar ninguna zona
libre.
3. Dejar absorber el inóculo de 10-15 minutos para asegurarse que la superficie del
agar esté completamente seca antes de aplicar las tiras. Este punto es crítico para
optimizar la realización del E-test.
4. Tanto si se utiliza el aplicador de las tiras como las pinzas, se debe asegurar que
la escala de CIM esté orientada hacia arriba y que la máxima concentración esté
cercana al extremo de la placa. Asegúrese que la tira contacte completamente con
la superficie del agar. Elimine las gotas de aire que puedan encontrarse por
debajo de la tira presionándola ligeramente con las pinzas. Es importante no
mover la tira una vez que han sido colocadas en la superficie del agar; ya que el
antibiótico empieza a difundir rápidamente (Figura 205).
5. Cuando se utiliza una placa de Petri de 100 mm. de diámetro, deposite sólo dos
tiras por placa; mientras que cuando se utilizan placas de 150 mm. No se deben
203
colocar más de 6 tiras y siempre deben disponerse de manera radial, como se
muestra a continuación (Figura 206).
6. Por lo general, las placas son incubadas inmediatamente. La temperatura, tiempo
y atmósfera de incubación utilizadas deben ser óptimas para el crecimiento de la
especie bacteriana en estudio.
7. Lectura de los resultados: después del período de incubación, leer la CIM en el
punto de intersección entre el extremo de inhibición de la elipse y la tira de E-test
(Figura 207).
8. Cuando el crecimiento tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa
formación de la elipse de inhibición, la CIM se informará como superior al valor
máximo de la escala de lectura y, por el contrario, cuando la elipse de inhibición
se encuentre por debajo de la tira, debe ser informado como inferior al valor
mínimo de la escala de lectura (Figuras 208-211).
Ventajas y Limitaciones del E-test
En contra de lo que ocurre en el método de difusión de Kirby & Baüer, donde

la orientación del disco no tiene importancia; si se coloca la tira de E-test al revés, no
se observa elipse de inhibición ya que el gradiente de concentraciones se sitúa sólo
sobre una de las caras de la tira.
El E-test, se considera como un método alternativo para el estudio cuantitativo

de la sensibilidad antimicrobiana. Del mismo cabe destacar su sencillez y buena
correlación con la técnica estándar de dilución en caldo o agar para el estudio de la
CIM. Esta es una técnica, sumamente fácil de ejecutar y de interpretar; pero tiene la
desventaja que las tiras son sumamente costosas.
Proceda a realizar la determinación de la CIM por el método de E-test a los

microorganismos que le indique su profesor.
204
Resultados
Registre los valores de CIM obtenidos para cada microorganismo y

antibiótico. Repórtelos correctamente.
Género:_______________ Género:_______________
Especie:_______________ Especie:_______________
Antibiótico:_____________ Antibiótico:_____________
CIM:__________________ CIM:__________________
D. Otras pruebas
Pruebas para detectar beta-lactamasas
Las beta-lactamasas (-lactamasas) son enzimas bacterianas heterogéneas que

rompen el anillo -lactámico de las penicilinas, cefalosporinas y otros antibióticos del
grupo, dando lugar a compuestos sin actividad antibacteriana. Se encuentran en una
amplia variedad de especies bacterianas Gram positivas y Gram negativas. Pueden
estar localizadas en los cromosomas bacterianos o en los plásmidos que pueden
transferirse de una bacteria a otra. Se dice que son constitutivas, cuando están
presentes en ausencia del antibiótico, a menudo en grandes cantidades; o inducibles,
cuando son producidas sólo después que la bacteria ha tenido contacto con el
antibiótico. Algunas afectan de forma predominante a las penicilinas; otras, a las
cefalosporinas; mientras que algunas poseen una actividad más amplia (Figura 212).
La presencia de estas enzimas puede detectarse rápidamente, indicando en

forma temprana que el aislamiento no responderá a los antibióticos -lactámicos.
La mayoría de los métodos para detectar la presencia de -lactamasas, se

basan en los cambios químicos producidos en la molécula de penicilina y
cefalosporinas al ser hidrolizado el anillo -lactámico:
a) Por formación de un grupo carboxílico extra que da un compuesto diácido

205
(ácido penicilinoico) que puede ser detectado usando un indicador de pH o
por su habilidad para reducir el yodo.
b) Por detección microbiológica de la baja actividad antibacteriana del producto
formado.
c) Por cambio en la disposición de electrones en la molécula de una
cefalosporina cromogénica al ser hidrolizada, observándose un cambio de
color atribuido al producto formado.
1. Método ácido-métrico
Detecta la producción de ácido penicilinóico después de la hidrólisis de la

penicilina y su presencia se pone de manifiesto mediante un indicador de pH, el rojo
de fenol.
Puede realizarse en medio líquido o empleando discos o tiras de papel,

generalmente comerciales. En el primer caso, se emplean tubos estériles o placas de
micro-titulación con 0.1 ml de una solución de penicilina G (1 millón de U/ml) pH
8,5 y rojo de fenol (0.5%). Esta solución puede prepararse añadiendo 2 ml de rojo
fenol 5%, 16.6 ml de agua destilada y 1.2 g de penicilina G (1 vial de 20 millones de
U). El pH se ajustará con NaOH 1 N. Los tubos una vez preparados pueden
conservarse a -20ºC durante 6 meses.
El cambio de color violeta de esta solución al amarillo antes de 15 minutos,

después de hacer una suspensión con 4-5 colonias de un cultivo puro de una bacteria,
indicará la producción de β-lactamasa. La ausencia de cambio de color durante estos
15 minutos pueden ser inespecíficos o producidos por el propio deterioro del reactivo.
No deben añadirse cultivos líquidos sobre la solución de penicilina, puesto que puede
modificarse el pH y variar el resultado de la prueba.
Los sistemas acidométricos comerciales suelen utilizar discos o tiras de papel

de impregnados con una solución alcalinas (1.25 mmol/litro NaOH) de penicilina G
(125 µg/ml) y 0.1% de azul de bromocresol. Una vez desecadas pueden conservarse a
4ºC hasta 6 meses. Antes de utilizarse, deben rehidratarse con 1-2 gotas de agua
206
destilada, pudiendo para ello, colocarse sobre un portaobjetos de vidrio o placa de
Petri. La aparición de un color amarillo antes de 5 minutos después de colocar 2-3
colonias de un cultivo puro sobre la superficie de los discos o tiras rehidratados
indicará la presencia de β-lactamasa. Al igual que en el caso anterior, no deben
utilizarse cultivos líquidos.
3. Método Yodo métrico:
Utiliza bencil-penicilina como substrato; aunque también se ha descrito con

alguna cefalosporina. En presencia de β-lactamasa, se produce ácido penicilinóico o
cefalosporánico, el cual el pH del medio y se reduce el yodo de la mezcla yodo-
almidón, desapareciendo el intenso color azulado de este complejo. En ausencia de
β-lactamasa no se decolora la mezcla yodo-almidón.
Este método es menos sensible y específico que los otros dos métodos y por
ello, es el menos empleado. Puede realizarse en tubos o con tiras de papel. En tubo,
se reparten alícuotas de 0.1 ml de una solución de penicilina G (6 mg/ml) disuelta en
tampón fosfato 0.1 M, pH 6.0. Los tubos se inoculan con las colonias del cultivo a
estudiar hasta obtener una turbidez aproximada de 10 9 UFC/ml. Posteriormente, se
añaden 20-25 µl de una solución de almidón al 1%, se mantiene 30-60 minutos a
temperatura ambiente y se añade 20-25 µl de una solución de yodo (2%)-yoduro
potásico (53%). La mezcla se agita durante 1 minuto y debe decolorarse en menos de
10 minutos si el microorganismo produce β-lactamasa.
También se utilizan discos o tiras de papel desecados. Están impregnados con

una solución de almidón (0.2%) y penicilina G (1%) que se rehidratan con una
solución de yodo (2%)-yoduro potásico (53%). Tras depositar sobre su superficie
unas colonias, se observará el cambio de color.
El método yodo-métrico tampoco debe realizarse a partir de medios líquidos.

Pueden existir falsos positivos por reducción del yodo.
207
3. Método de la Cefalosporina Cromogénica (Nitrocefina):
La nitrocefina es una cefalosporina cromogénica, cuyo color amarillo es

atribuido al sustituyente dinitrotirilo en la posición 3 de su molécula. Al ser
hidrolizada por las -lactamasas cambia su color al rojo intenso debido a la formación
de una base de Shift cromogénica dada por la fuerte conjugación del anillo -
lactámico y la doble ligadura en el anillo dihidrotiazina con el grupo dinitrotiril
(Figura 213).
A diferencia de los métodos anteriores, el método cromogénico es altamente

específico; aunque está limitado por la capacidad de hidrólisis que ejerzan las β-
lactamasas sobre la nitrocefina; la cual generalmente, se comercializa en forma de
discos. Estos deben colocarse sobre un portaobjetos de vidrio o placa de Petri y
rehidratarse con 1 ó 2 gotas de agua destilada. La aparición de un color rojo intenso
en 1-2 minutos después de colocar 2-3 colonias de un cultivo puro del
microorganismo de prueba sobre la superficie de los discos, indicará la presencia de
β-lactamasa (Figura 214.
En ocasiones, se emplea una solución de nitrocefina 0.5 mM que se prepara

disolviendo 2.56 mg de nitrocefina en 9.5 ml de tampón fosfato 0.1 M, pH 7.0 y 0.5
ml de dimetilsulfóxido. La prueba suele realizarse emulsionando las colonias del
microorganismo a estudiar en 20 µl de la solución de nitrocefina. La aparición de un
color rojo intenso en 1-2 minutos, indicará la presencia de β-lactamasa.
El compuesto PADAC (piridina 2 –azo-ρ-dimetil-alinina cromóforo) es otra

cefalosporina cromogénica que también se utiliza para la detección rápida de la
producción de β-lactamasa. Es peor substrato que la nitrocefina, y por ello, menos
sensible. Se emplea en solución (250 µg/ml en tampón fosfato 50 mM pH 7.0) o en
discos o tiras de la misma manera que la nitrocefina.
208
Proceda a investigar la producción de β-lactamasa, por el método de la

cefalosporina cromogénica, en las cepas bacterianas que le indique su profesor.
Resultados
Microorganismo:____________________
β-lactamasa:_______________________
Microorganismo:____________________
β-lactamasa:_______________________
1. Defina:
a) Antibiograma
b) CIM
c) CBM
2. ¿El método de difusión en agar determina actividad bacteriostática o bactericida?.

Explique brevemente.
209
3. Indique en qué fase del crecimiento un microorganismo es más sensible a los
antibióticos.
4. ¿Por qué el método de difusión en agar no es un indicador perfecto de cómo

actuará la droga in vivo?¿Qué otros factores deben ser considerados antes de usar
un agente quimioterápico in vivo?
5. Explique ¿Qué efecto tendría la administración de tetraciclina durante el curso de

una terapia con penicilina?
6. Señale las ventajas y desventajas de los diferentes métodos utilizados para

determinar la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos.
210
7. Se hicieron diluciones seriadas de un antibiótico en caldo por el método de
microdilución, a las cuales se agregaron cantidades iguales de un cultivo de
Staphylococcus aureus a cada pozo. Después de la incubación, se examinaron los
pozos para determinar si hubo crecimiento bacteriano. Los pozos que no mostraron
crecimiento fueron subcultivados en caldo nutritivo sin antibiótico. Los resultados
fueron registrados como (+) si hubo crecimiento y (-) sin crecimiento.
Antimicrobiano Dilución Crecimiento Subcultivo
A 1:10-1:70 - -
1:80 - -
1:90 - +
1:100 - +
1:200-1:500 + +
B 1:10-1:150 - -
1:160 - +
1:170 + +
1:180 + +
1:190-1:500 + +
Indique:
¿Cuál es la CIM?
¿Cuál es la CBM?
¿Qué antibiótico es más efectivo contra el microorganismo probado?

211
8. Indique ¿Por qué debe utilizarse un inóculo estandarizado en las pruebas de
susceptibilidad?
9. ¿Cuáles son los controles que se utilizan en la determinación de la CIM?. ¿Para

qué sirven?
10. ¿En qué casos está indicado realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana?
212
Unidad VII
Interacción Bacteria-Hospedero
Objetivo Terminal:
 Verificar la presencia de flora normal en diferentes sitios anatómicos.

213
Flora Normal
1. Observar las formas bacterianas de la flora normal presentes en diversas muestras

de origen humano.
Generalidades
Normalmente, los microorganismos crecen abundantemente dentro y en la

superficie del cuerpo humano. Esta población microbiana se conoce como “flora
normal, autóctona, indígena o habitual”.
Según las condiciones de permanencia y colonización en el organismo, dentro

de la flora habitual del organismo humano, se pueden considerar dos grupos: la “flora
residente”, constituida por microorganismos relativamente constantes en un área
determinada y condiciones igualmente dadas y la “flora transitoria”, que incluye
microorganismos, generalmente provenientes del ambiente, no específicos, que
pueden permanecer en piel o mucosas, durante un período de tiempo relativamente
corto (horas, días o semanas) y de poca significación desde el punto de vista
ecológico.
En el útero, el feto es estéril; la colonización microbiana del recién nacido

comienza inmediatamente después del nacimiento, en el paso a través del canal del
parto, por el contacto con la madre, medio ambiente y otros seres humanos.
Inicialmente, es colonizado por una gran variedad de microorganismos, dependiendo
de diversos factores ambientales; sólo semanas después, la flora microbiana del
infante es similar a la del adulto.
La relación entre la microflora normal y una persona saludable puede ser

clasificada como una de dos tipos de simbiosis (asociación estrecha entre dos
214
organismos): comensalismo o mutualismo. En una relación de comensalismo, un
organismo es beneficiado y el otro resulta ileso. Por ejemplo, muchas de las bacterias
que viven en el intestino grueso, donde utilizan como nutrientes algunos productos de
la digestión de los alimentos, mientras el hospedero no es beneficiado ni dañado. En
una relación de mutualismo, ambos organismos son beneficiados. Por ejemplo, los
miembros de la flora residente intestinal reciben un suministro constante de
nutrientes, a la vez que sintetizan vitamina K, intervienen en la producción de
pigmentos y de ácidos biliares, absorción de nutrientes y desdoblamiento de
productos, así como en el antagonismo a patógenos microbianos.
Un tercer tipo de asociación biológica es el parasitismo. En esta relación uno

de los organismos se beneficia y el otro se perjudica. En la enfermedad infecciosa, el
microorganismo es un parásito que produce daño al hospedador. Este
microorganismo recibe el nombre de patógeno.
Algunos miembros de la microflora normal se convierten en parásitos bajo

ciertas condiciones. Estos organismos se conocen como oportunistas.
Flora Normal del Cuerpo Humano
Las regiones anatómicas del cuerpo humano colonizadas por microorganismos

comprenden: piel y mucosas, oído externo, tracto respiratorio superior, tracto
gastrointestinal y parte externa del aparato genito-urinario.
Los órganos y regiones del cuerpo generalmente libres de microorganismos

(áreas anatómicas normalmente estériles) son: el tracto respiratorio inferior, uretra
posterior, cérvix, sangre y otros líquidos orgánicos, sistema nervioso y huesos, entre
otros. No existe un patrón sobre la distribución de los microorganismos en el cuerpo
humano, ya que esto depende de una serie de variables difícilmente controlables. En
el cuadro 1, aparecen los microorganismos más frecuentemente encontrados
formando parte de la flora normal de las diferentes zonas anatómicas.
215
Piel
Debido a su continua exposición y contacto con el ambiente, la piel es

particularmente apta para alojar microorganismos transitorios. No obstante, hay una
flora residente, constante y bien definida, modificada en las diferentes partes
anatómicas por secreciones, cambio habitual de ropa o proximidad a mucosas (boca,
nariz y región perineal).
Oído
Anatómicamente, el oído está formado por tres regiones denominadas: oído

externo, oído medio y oído interno. De ellas, el oído externo es un área donde se
encuentran microorganismos de los que habitualmente contiene la piel. Su densidad
está relacionada con los hábitos del individuo y pueden ocasionalmente, pasar al oído
medio, produciéndose una enfermedad conocida como otitis.
Ojo
Aunque la conjuntiva del ojo está constantemente expuesta al ambiente, su
colonización es poco frecuente, posiblemente, debido al alto contenido de lisozima.
Boca y Tracto Respiratorio Superior
Incluye regiones anatómicas ricas en variedad y cantidad de microorganismos.

La cavidad oral humana y la nasofaringe albergan gran cantidad de ellos, los cuales
penetran a través del aire o alimentos. Por lo general, los bronquios de pequeño
calibre y los alvéolos son estériles. Los microorganismos predominantes en las vías
respiratorias superiores, sobre todo en la faringe, son estreptococos no hemolíticos, α-
hemolíticos y neiserias.
Tracto Gastrointestinal
En los individuos normales en ayunas, el estómago y la porción superior del

intestino delgado, son estériles o contienen menos de 10 3 microorganismos/ml. Los
216
organismos deglutidos son destruidos por el ácido clorhídrico y por las enzimas de las
secreciones gástricas, o pasan con rapidez al intestino delgado, donde el peristaltismo,
la bilis y las enzimas pancreáticas son responsables de mantener la esterilidad o un
número de microorganismos menor de 103/ml.
En oposición al escaso número de microorganismos presentes en el intestino

delgado, la microflora del colon representa un rico ecosistema, compuesto por
microorganismos metabólicamente activos, muy próximos a una superficie mucosa
de absorción. La mayoría de estos organismos intestinales se comportan como
simples comensales y algunos establecen relaciones de mutualismo con sus
hospederos. Algunas bacterias intestinales sintetizan vitaminas útiles, como el ácido
fólico y la vitamina K. La microflora intestinal previene la colonización por especies
patógena; ya sea por competición o mediante la producción de sustancias
antimicrobianas (bacteriocinas y antibióticos).
Tracto Genito-Urinario
Uretra
En ambos sexos, la porción anterior de la uretra, contiene un pequeño número

de microorganismos provenientes de la flora normal de piel y perineo. Estos
microorganismos suelen encontrarse en la orina normal excretada en cantidades de
102 a 104 /ml.
Vagina
Poco después del nacimiento, aparecen en la vagina, lactobacilos aerobios que

persisten mientras el pH sea ácido (varias semanas); cuando el pH se vuelve neutro
(permaneciendo así hasta la pubertad), se presenta una flora mixta de cocos y bacilos.
En la pubertad, la flora vaginal está constituida por gran cantidad de lactobacilos
aerobios y anaerobios que mantienen la acidez del pH vaginal, mediante el
catabolismo de carbohidratos, particularmente, del glucógeno. Éste parece ser un
217
mecanismo importante para prevenir el establecimiento de otros organismos
potencialmente patógenos en la vagina.
Cuadro 1
Flora Normal predominante en diferentes Áreas Anatómicas
Sitios del Microflora

cuerpo
S. aureus (escasos)
S. epidermidis
Streptococcus grupo viridans
Bacillus sp.
Piel y mucosas Corynebacterium sp
Micrococcus sp
Neisseria sp.
Propionibacterium sp.
Peptostreptococcus sp.
Corynebacterium sp.
Oído Externo S. aureus
S. epidermidis
Corynebacterium sp.
Moraxella sp.
Ojo Neisseria sp.
S. epidermidis
Neisseria sp.
Lactobacillus sp.
Tracto S. epidermidis
Respiratorio Corynebacterium sp.
Superior Bacteroides sp.
Fusobacterium sp.
Prevotella sp.
Cantidades menores de los siguientes cuando se acompañan
218
de los microorganismos antes mencionados:
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
S. aureus
Bacilos Gram negativos
N. meningitidis.
Enterobacterias, excepto Salmonella, Shigella y Yersinia,
Streptococcus α hemolíticos y no hemolíticos.
Bacteroides sp.
Bacillus sp.
Tracto Gastro- Clostridium sp.
intestinal Fusobacterium sp.
Lactobacillus sp.
Peptostreptococcus sp.
Bacilos Gram negativos no fermentadores de la glucosa.
Enterococcus sp.
Corynebacterium sp.
Lactobacillus sp.
Streptococcus α hemolíticos y no hemolíticos.
Tracto Genito- Enterococcus sp.
urinario Enterobacterias
S. epidermidis
Anaerobios (Prevotella, Clostridium, Bacteroides,
Peptostreptococcus)
Fuente: Barrios A, 1996:203-204.
Materiales
 Placas conteniendo agar sangre humana ( una por grupo)

 Hisopos con torunda de algodón estériles
 Tubos conteniendo solución salina fisiológica
219
 Depresores linguales
 Colorantes de Gram
 Láminas portaobjeto
Procedimiento
A cada grupo le corresponderá la toma y procesamiento de muestras

provenientes de diferentes áreas anatómicas. Para la obtención de dichas muestras
proceda según se describe a continuación:
Exudado Faríngeo
1. Seleccionar para la toma de muestra a un estudiante que no presente signos de

faringitis; es decir, aparentemente sano.
2. Bajo visión directa, con la ayuda de un depresor lingual, presionar la lengua hacia
abajo para observar los pilares de la faringe y el área tonsilar.
3. Utilizando un hisopo, frotar las criptas tonsilares y la pared posterior de la faringe,
evitando tocar la mucosa oral, lengua o úvula.
4. Inocular directamente una placa de agar sangre, e incube en aerobiosis a 35–37°C
durante 24 horas.
5. Pasado el período de incubación, realizar la lectura del cultivo, observando los
diferentes tipos de colonias presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un
frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anote los resultados.
Boca
1. Con la ayuda de un hisopo estéril, frotar varias zonas de la boca.

2. Inocular directamente una placa de agar sangre. Incubar a 35 – 37°C, durante 24
horas en aerobiosis.
3. Pasado el período de incubación, observar la morfología colonial y seleccionar
varios tipos de colonias a partir de las cuales debe realizar frotis coloreados con
Gram. Observar y anotar los resultados.
220
Piel
1. Utilizando un hisopo, previamente humedecido en solución salina fisiológica,

frotar un área determinada de la piel (cuello, axilas).
2. Inocular directamente sobre una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35
– 37°C durante 24 horas.
frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anotar los resultados.
Exudado Nasal
1. Inserte un hisopo, previamente humedecido en solución salina fisiológica, dentro

de la fosa nasal. Rotar el hisopo contra la mucosa nasal.
2. Inocular directamente sobre una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35
– 37°C durante 24 horas.
frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anote los resultados.
Resultados
Tipo de muestra
Características Exudado Boca Piel Oído Exudado
faríngeo nasal
Morfología
colonial
Cantidad
Morfología
microscópica
221
1. Mencione los tipos de microflora normal y diga en qué se diferencian.
2. Mencione tres microorganismos que forman parte de la flora normal de piel,

tracto respiratorio superior y tracto gastrointestinal.
3. Mencione tres áreas anatómicas normalmente estériles.
4. Defina microorganismos oportunistas.
5. De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica, indique en cuales observó

mayor cantidad de flora normal. Razone y justifique su respuesta.
222
Unidad VIII
Control de Calidad en el Laboratorio de Bacteriología
Objetivo Terminal:
 Ejecutar adecuadamente las técnicas de preparación de medios de cultivo de

uso rutinario en el Laboratorio de Bacteriología.
223
Preparación y Control de Calidad de Medios de Cultivo
1. Seleccionar los materiales y equipos adecuados para la preparación

de medios de cultivo.
2. Preparar adecuadamente medios de cultivo líquidos, sólidos y semi-sólidos.
3. Seleccionar la técnica de esterilización adecuada según el medio de cultivo a

preparar.
4. Identificar las posibles causas de error en la preparación de medios de cultivo.
5. Practicar correctamente las pruebas de control de calidad en el laboratorio de

Bacteriología.
6. Efectuar correctamente la lectura e interpretación de las pruebas de control de

calidad realizadas en el laboratorio.
Generalidades
Para estudiar debidamente los microorganismos se requiere cultivarlos en

condiciones de laboratorio. Para lograr esto, es preciso conocer cuales son los
nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Mediante investigaciones extensas
se han determinado las necesidades nutricionales de las bacterias, y esta información
ha permitido el desarrollo de numerosos medios de cultivo. Ya que las necesidades
nutricionales de las bacterias varían de manera muy amplia, existen diferencias
importantes en cuanto a la composición de los medios empleados. Las bacterias
también presentan notables diferencias en lo que respecta a las condiciones del
ambiente que favorecen su proliferación.
224
Medios de Cultivo
Son sustancias de origen natural o sintético, sólidos o líquidos, que le

proporcionan a los microorganismos las sustancias nutritivas necesarias para su
crecimiento.
Algunas bacterias pueden crecer bien en cualquier medio de cultivo; otros,

son más exigentes y requieren medios especiales que contengan factores de
crecimiento y, otras, no son capaces de desarrollarse en ninguno de los medios
artificiales disponibles hasta ahora.
Los microorganismos que se multiplican en o sobre la superficie de un medio

de cultivo, constituyen un cultivo.
Características de los Medios de Cultivo
Suponga que se quiere cultivar un microorganismo particular a partir de una

muestra clínica, por ejemplo. ¿Qué requerimientos debe cumplir ese medio de
cultivo?
Un buen medio de cultivo se caracteriza por:

a) Contener los nutrientes esenciales en la proporción adecuada para soportar el
crecimiento de los microorganismos: fuente de energía, de carbono y de
nitrógeno, oligoelementos, factores de crecimiento y agua.
b) Poseer una cantidad adecuada de sal (generalmente, en forma de cloruro de sodio)
para estabilizar el medio.
c) Tener humedad suficiente para permitir la proliferación de las formas vegetativas
de los microorganismos.
d) Estar libre de sustancias inhibidoras para el microorganismo a cultivar.
e) Poseer un pH adecuado para el metabolismo del microorganismo. La mayoría de
las bacterias crecen mejor a pH neutro o cercano a la neutralidad (6.8–7.1); pero
los hongos crecen a pH más ácidos.
225
f) El medio, originalmente, debe ser estéril (libre de toda forma de vida) a fin de
garantizar que sólo los microorganismos inoculados estén presentes en el medio.
g) Poseer una consistencia adecuada (sólido, semisólido o líquido).
h) Finalmente, debe ser incubado en condiciones apropiadas: temperatura, atmósfera
y tiempo.
Conservación de los medios de cultivo deshidratados
Una amplia variedad de medios de cultivo está actualmente disponible para el

crecimiento de los microorganismos en el laboratorio. La mayor parte de estos
medios, comercialmente disponibles, poseen componentes pre-mezclados que sólo
requieren la adición de agua y esterilización. Constantemente, estos medios son
evaluados para optimizar su uso en el aislamiento e identificación de
microorganismos de interés en los diferentes campos microbiológicos de aplicación.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua

del exterior, así como la formación de agua dentro de la botella, como consecuencia
de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorecen el crecimiento
bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de pH y
cambios en el color del medio. Además, la exposición a la luz puede llevar a
importantes alteraciones en los constituyentes del medio.
En consecuencia, los medios de cultivo deshidratados deben conservarse

siempre en sitio fresco y seco, protegidos de la luz. Los frascos con tapa de rosca,
deben cerrarse bien después de cada toma.
Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios

deshidratados tienen una vida útil de al menos 1 año. Si se observan alteraciones
sustanciales, tales como: hidratación, endurecimiento, presencia de grumos y cambio
de color, deben descartarse.
226
Precauciones Especiales en la Preparación de los Medios de Cultivo
La preparación de medios de cultivo para uso en el laboratorio, a partir de

medios deshidratados, es esencialmente una simple manipulación dirigida por unos
cuantos principios de sentido común. El procedimiento requiere precisión, exactitud
y atención hacia la pureza y la esterilidad, las cuales son consideraciones rutinarias
para el personal de Bacteriología. Debe tenerse especial cuidado en relación con:
 Medios deshidratados: Registrar en el recipiente la fecha de recepción y de

apertura. Almacénelos como se indica en la etiqueta, con escasa luz, baja
humedad ambiental y con el recipiente correctamente tapado. Asegúrese de
que las características físicas del polvo son las típicas y adecuadas antes de su
empleo.
 Equipo: Utilizar material de vidrio, en perfectas condiciones, totalmente

limpio, y que haya sido aclarado con agua destilada o desionizada. Los
equipos utilizados como dispositivos de medida, escalas, medidores de pH y
autoclaves, deben ser frecuentemente calibrados con precisión.
 Agua: usar agua destilada o desionizada libre de plomo, cloro, cobre y

detergentes.
Técnica de Preparación de Medios de Cultivo
En la preparación de medios de cultivo, se deben seguir los siguientes pasos:
 Pesar con exactitud la cantidad de medio deshidratado requerido, según las

indicaciones del fabricante.
 El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del
mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en
la rehidratación. Se recomienda disolver completamente en el volumen
adecuado de agua, utilizando recipientes con capacidad que duplique el
volumen final del medio a preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos,
227
debe agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenización al
momento de repartirlo.
 Calentar a temperatura de ebullición los medios que contienen agar o gelatina
para disolverlos completamente. Los medios con agar, particularmente
aquellos que lo contienen en poca cantidad, pueden hervir de forma
inesperada y repentina y derramarse fuera de la fiola. Durante el
calentamiento, se debe agitar frecuente pero suavemente, para evitar el
sobrecalentamiento del medio y la pérdida de su valor nutritivo. Los medios
líquidos (no contienen agar) no requieren calentamiento.
 Verificar el pH del medio y, si es necesario, ajustarlo
 Cuando se va a esterilizar deben seguirse las instrucciones de tiempo, presión
y temperatura para la obtención de medios de cultivo óptimos: 121°C, 15
libras de presión, por 15 minutos, son suficientes para la mayoría de los
medios. Cuando se preparan medios termolábiles deben utilizarse otros
métodos de esterilización, por ejemplo: filtración o tindalización.
 Estabilizar el medio en Baño de María a una temperatura entre 45°-55°C para
disminuir gradualmente la temperatura y evitar la solidificación del agar y la
formación de agua de condensación. Los medios líquidos, luego de repartidos,
se esterilizan en el autoclave y no requieren estabilización.
 Añadir asépticamente las sustancias enriquecedoras o aditivos. Estos
suplementos, por ejemplo: sangre, hemoglobina, entre otros, sensibles al
calor, se añaden al medio después de la esterilización y la estabilización para
evitar el deterioro del enriquecimiento debido al calor. Mezclar
cuidadosamente, evitando la formación de burbujas o espuma.
 Repartir asépticamente el medio en las placas de petri o en tubos de ensayo.
 Dejar solidificar a temperatura ambiente (si el medio contiene agar).
 Rotular todos los medios preparados, tanto en placas como en tubos,
indicando la fecha de preparación
 Almacenar el medio preparado a la temperatura indicada por el fabricante. El
almacenamiento a 4°C es adecuado para la mayoría de los medios. Sin
embargo, medios de cultivo como el caldo tioglicolato y agar sangre
anaerobiosis deben guardarse a temperatura ambiente. Deben ajustarse bien
las tapas una vez cerrados los tubos y colocar las placas preparadas, de forma
228
invertida, en bolsas plásticas para evitar la evaporación excesiva de la
humedad del medio.
 Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz
puede afectar algunos de sus componentes.
Fuentes de Error en la Preparación de Medios de Cultivo
 Medio inadecuado: dado que los medios suelen estar dispuestos por orden
alfabético en un estante, es posible seleccionar inadvertidamente un frasco
equivocado o un suplemento inadecuado, con lo cual el medio resulta no apto
para su uso. Es siempre importante leer el rótulo, particularmente cuando se
recibe en el laboratorio una nueva partida de medios.
 Agua: se debe medir cuidadosamente la cantidad de agua que se añade al
reconstituir el medio. Dado que las impurezas hacen inapropiada el agua
corriente para la mayoría de los medios biológicos, los laboratorios deben usar
agua destilada, desionizada o que haya recibido ambos tratamientos.
 Pesaje: emplear balanzas adecuadas para pesar los medios deshidratadados
(en polvo). Los errores de pesaje alteran significativamente la composición
del pH final del medio.
 Distribución de los medios: los medios deben repartirse exacta y
asépticamente en placas y tubos. La medición errónea de la cantidad a
dispensar, puede ocasionar, por ejemplo, un medio de agar con espesor
demasiado fino o grueso, siendo ambos inadecuados para su empleo.
 Esterilización: un error común en la preparación de los medios de cultivo es la
esterilización a una temperatura demasiado elevada y/o durante un período
demasiado largo. Esto puede producir el deterioro o descomposición de
algunos componentes de los medios haciéndolos inadecuados.
 Material de vidrio: se debe tener la precaución de utilizar material de vidrio
limpio; ya que los residuos adheridos al vidrio pueden inhibir,
particularmente, algunos microorganismos exigentes.
229
Control de Calidad de Medios de Cultivo
Todo programa de control de calidad para medios de cultivo persigue

asegurar que un medio respalde el desarrollo de los microorganismos de interés,
exhibir una respuesta bioquímica típica, ser estable y tener un tiempo de preservación
razonable.
La calidad de cada lote de medio de cultivo preparado, se prueba antes de su

uso, mediante la inoculación de microorganismos cuyas reacciones se conocen. Las
cepas de control deben verificarse para corroborar su pureza, sembrándolas en placas
de agar.
Los procedimientos en Bacteriología dependen de que los microorganismos

viables en el cultivo sean capaces de mantener sus características morfológicas,
fisiológicas y que sean típicas, estables y reproducibles.
Existen varias fuentes de cultivos de referencia que pueden utilizarse para el

Control de Calidad:
 American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA.

 National Collection of Type Culture (NCTC), Inglaterra
 Nacional Collection of Industrial bacteria (NCIC) Survey, Inglaterra
 Japanese Federation of Culture Collection of Microorganisms (JFCC), Japón.
Existen otras fuentes comerciales que también pueden proveer cepas

bacterianas para el control de calidad de los medios de cultivo.
También pueden utilizarse cepas salvajes aisladas en el laboratorio, si son

conservadas, se les caracteriza adecuadamente y sus reacciones son bien verificadas
y reproducibles.
El Control de Calidad de un medio de cultivo incluye:

230
 Prueba de esterilidad
 Prueba de desarrollo
 Prueba de inhibición
 Prueba de respuesta bioquímica
Prueba de Esterilidad:
Pocos son los medios utilizados sin esterilización final; pero son excepciones.
Todos los medios deben ser estériles cuando se inoculan. Cada lote de medio
preparado en el laboratorio, debe ser controlado para asegurar su esterilidad. Esta
prueba se realiza incubando una muestra (1-5%) del lote en la estufa durante 24-48
horas a 35ºC. Si al efectuar la prueba no se produce crecimiento, la prueba de
esterilidad es positiva.
Si aparece contaminación en el medio, la prueba de esterilidad es negativa,

pues hubo crecimiento en el medio (sin inocular) como resultado de esterilización
inadecuada. En estos casos, debe repetirse el procedimiento con otro porcentaje igual
del lote y si el resultado persiste, el medio se descarta, no puede ser utilizado. En
caso contrario, si puede utilizarse el medio; ya que la contaminación pudo ser
accidental.
Los medios utilizados para realizar las pruebas de esterilidad deben

descartarse al ser completada la prueba; ya que son inadecuados para la inoculación a
causa de la deshidratación producida luego de 24-48 horas de incubación.
Prueba de Desarrollo
Tiene por finalidad determinar la capacidad del medio de cultivo, de respaldar

el crecimiento de presuntos microorganismos, inoculándolos con un típico
aislamiento de reserva. Cuando se prueba la capacidad del medio de respaldar
desarrollo, debe utilizarse una suspensión diluida. Esta suspensión va a dar mayor
231
seguridad de que el medio es adecuado para el desarrollo de un pequeño número de
microorganismos presentes en una muestra.
Este inóculo se prepara suspendiendo varias colonias en solución salina

fisiológica (SSF) hasta obtener una turbidez igual a la del estándar 0.5 de
MacFarland, posteriormente, se realiza una dilución 1/100 (0,1ml de la suspensión
estandarizada + 9,9ml de SSF). Inocular el medio con 10 l de la suspensión.
Al seleccionar un microorganismo para la prueba, se debe elegir entre las

especies más exigentes que pueden esperarse en las muestras biológicas.
Prueba de Inhibición
Se aplica a los medios selectivos y diferenciales. Para demostrar el efecto

inhibidor del medio, se utiliza un inóculo abundante; ya que si el medio va a impedir
el desarrollo de un gran inóculo, va a inhibir el pequeño número de microorganismos
que pueden estar presentes en la muestra primaria.
Este inóculo se prepara suspendiendo varias colonias en solución salina

fisiológica (SSF) hasta obtener una turbidez igual a la del estándar 0.5 de
MacFarland, posteriormente, se realiza una dilución 1/10 (1ml de la suspensión
estandarizada ( 9,9ml de SSF). Inocular el medio con 10 l de la suspensión.
Prueba de Respuesta Bioquímica
Al inocular medios empleados para verificar una reacción específica, tal

como fermentación de carbohidratos o producción de H2S, es necesario usar cepas
puras de características bioquímicas conocidas, a fin de verificar que esas
características puedan ser expresadas por el microorganismo al desarrollarse en un
medio de cultivo determinado.
232
Generalmente, se utilizan cepas que permitan verificar las diferentes
reacciones potencialmente observables en un determinado medio de prueba y no
debe realizarse dilución de las mismas; ya que lo importante, es detectar la reacción
metabólica expresada por el microorganismo, más no, su crecimiento o desarrollo.
La Tabla 1 puede considerarse como guía a la hora de efectuar el Control de

Calidad a un medio de cultivo en particular:
Tabla 1
Pruebas de control de calidad de Medios de Cultivo
Prueba de Control de Calidad

Medio Esterilidad Desarrollo Inhibición Respuesta
Bioquímica
Basal x x
Selectivo x x x
Diferencial x x
Enriquecido x x
Indicador x x
Enriquecimiento x x x
Transporte x x
Control de Calidad de los Suplementos
Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo

pueden confrontar problemas de eficiencia o inhibición, debido a almacenamiento
y/o transporte inadecuados.
Muchos suplementos son sensibles al calor, por ello se añaden al medio

después de la esterilización para evitar su deterioro.
233
Los medios preparados con la mezcla inhibidora vancomicina, colistina,
nistatina (VCN), deben ser utilizados dentro de los 8 días siguientes a su preparación
ya que la eficacia de la mezcla disminuye muy rápido.
Para evitar deterioro de los frascos de VCN rehidratados, deben guardarse

congelados si no se van a usar de inmediato. No sobrepasar los 15 días.
Cada vez que se reciba un lote de sangre de carnero para la preparación de

agar sangre, debe registrarse su apariencia, presencia o no de coágulos, hemólisis,
número de lote, fecha de recibo y expiración y determinar la concentración de
hemoglobina, la cual debe medir entre 13-15 g/dl.
Además, se debe determinar la esterilidad de la sangre, para lo cual se debe

tomar, una pequeña muestra de la bolsa con una jeringa y se inocula en agar sangre y
caldo tioglicolato. Incubar por 24-48 horas a 35°C y observar si hay o no crecimiento
bacteriano.
A cada grupo le corresponerá la preparación de uno o varios medios de

cultivo. Prepárelos según las indicaciones del fabricante y efectúe las pruebas de
control de calidad correspondientes según el tipo de medio. Reporte e interprete los
Resultados
Registre e interprete los resultados de las pruebas de control de calidad de los
medios preparados.
234
Resultados
Medio Esterilidad Desarrollo Inhibición Respuesta
Bioquímica
1. Explique los pasos para la preparación de un medio de cultivo, resaltando las

diferencias entre los medios de cultivo líquidos y sólidos.
2. -¿Por qué los medios de cultivo líquidos no requieren estabilización?
3. Indique por qué los suplementos deben ser añadidos al medio después de la
estabilización.
4. Mencione algunos medios de cultivo que no pueden esterilizarse en autoclave.y

explique ¿por qué?
5. ¿Qué importancia tiene el control de calidad en el Laboratorio de Microbiología?
6. Explique por qué a los medios selectivos y diferenciales se les aplica pruebas de
inhibición y respuesta bioquímica.
235
7. ¿Qué finalidad tiene la aplicación de la prueba de desarrollo en medios
enriquecidos?
8. ¿Por qué algunos medios de cultivo no requieren esterilización?.

236
Ilustraciones
282
Anexos
283
Anexo 1: Tabla de interpretación del diámetro de la zona de inhibición para
discos de antibióticos
Interpretación del diámetro de la zona de
Agente Potencia
Código inhibición (mm)
antimicrobiano del disco
Resistente Intermedio Susceptible
Amikacina AN-30 30g
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa
Acinetobacter y staphylococcus ≤ 14 15 - 16  17
Amoxicilina/ Acido
Clavulánico AmC-30 20/10g
Enterobacteriaceae ≤ 13 14 – 17  18
Staphylococcus spp. ≤ 19   20
Ampicilina AM-10 10g
Enterobacteriaceae y V. cholerae ≤ 13 14 - 16  17
Staphylococcus spp. ≤ 28   29
Enterococcus spp ≤ 16   17
Listeria monocytogenes ≤ 19   20
Haemophilus spp. ≤ 18 19 - 21  22
Ampicilina/Sulbacta SAM-20 10/10g
m
Acinetobacter y staphylococci ≤ 11 12 - 14  15
Azitromicina AZM-15 15g
Staphylococcus spp. ≤ 13 14 - 17  18
Haemophilus spp    12
Aztreonam ATM-30 30g ≤ 16   17
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa ≤ 16   17
Acinetobacter
Carbenicilina CB-100 100g
Enterobacteriaceae y Acinetobacter ≤ 19 20 - 22 23
P. aeruginosa ≤ 13 14 - 16  17
Cefaclor CEC-30 30µg ≤ 13 14 - 16  17
284
Enterobacteriaceae y stapylococci ≤ 14 15 - 17  18
Haemophilus spp 30µg ≤ 16 17 - 19  20
Cefamandol MA-30 30µg
Cefazolina CZ-30 30µg
Cefdinir CDR-5 5g
Haemophilus spp.    20
Enterobacteriaceae y staphylococci ≤ 16 17 - 19  20
Cefepime FEP-30 30g
Acinetobacter y staphylococci ≤ 14 15- 17  18
N. gonorrhoeae    31
Streptococci (no-S. pneumoniae) ≤ 23 24 - 25  26
Cefixima CFM-5 5g
Enterobacteriaceae ≤ 15 16 - 18  19
Haemophilus spp.  -  21
N. gonorrhoeae  -  31
Cefmetazol CMZ-30 30g
N. gonorrhoeae ≤ 27 28 - 32  33
Cefonicid CID-30 30g
Enterobacteriaceae y staphylococci ≤ 14 15- 17  18
Haemophilus spp ≤ 16 17-19  20
Cefoperazona CFP-75 75g
Cefotaxima CTX-30 30g
285
Streptococci (no-S pneumoniae) ≤ 25 26- 27  28
Cefotetan CTT-30 30µg
N. gonorrhoeae ≤ 19 20 - 25  26
Cefoxitina FOX-30 30µg
N. gonorrhoeae ≤ 23 24 - 27  28
Cefpodoxima CPD-10 10µg
Cefprozil CPR-30 10µg
Haemophilus spp ≤ 14 15 - 17  18
Ceftazidima CAZ-30 30µg
Ceftibuten CTB-30 30g
Enterobacteriaceae ≤ 17 18- 20  21
Ceftizoxime ZOX-30 30g
Enterobacteriaceae,P. aeruginosa
Ceftriaxona CRO-30 30g
286
Streptococci (no-S. pneumoniae) ≤ 24 25- 26  27
Cefuroxima(sodium) CXM-30 30g
N. gonorrhoeae ≤ 27 28 - 32  33
Cefalotina CF-30 30g
Enterobacteriaceae y staphylococci ≤ 14 15- 17  18
Cloramfenicol C-30 30g
Acinetobacter y staphylococci
Enterococci y V. cholerae ≤ 12 13- 17  18
Haemophilus spp. ≤ 25 26- 28  29
S. pneumoniae ≤ 20   21
Streptococci (no-S. pneumoniae) ≤ 17 18- 20  21
Cinoxacina CIN-100 100g
Ciprofloxacina CIP-5 5µg
Acinetobacter, staphylococci y enterococci ≤ 15 16 - 20  21
N. gonorrhoeae ≤ 27 28- 40  41
Claritromicina CLR-15 15µg
Stapylococcus spp ≤ 13 14 - 17  18
Streptococci ≤ 16 17 - 20  21
Clindamicina CC-2 2µg
Stapylococcus spp ≤ 14 15 - 20  21
S pneumoniae y otros streptococci ≤ 15 16 - 18  19
Colistina CL-10 10µg ≤8 9 - 10  11
287
Doxiciclina
Acinetobacter, staphylococci y enterococci ≤ 12 13 - 15  16
Enoxacina ENX-10 10µg
N. gonorrhoeae ≤ 31 32 - 35  36
Eritromicina E-15 15g
Staphylococcus spp y enterococci ≤ 13 14- 22  23
S pneumoniae y otros streptococci ≤ 15 16- 20  21
Fosfomicina FOS-200 200g
E. coli y E. faecalis solamente ≤ 12 13- 15  16
Gentamicina
Enterococcus GM-120 120g ≤6 7- 9  10
spp.
Para alto nivel de resistencia
P. aeruginosa, Acinetobacter y ≤ 12 13- 14  15
staphylococci
N. gonorrhoeae ≤ 27 28- 36  37
S pneumoniae y otros streptococci ≤ 15 16- 18  19
Imipenem IPM-10 10g
Kanamicina K-30 30g
Enterobacteriaceae y staphylococci. ≤ 13 14 - 17  16
Levofloxacina LVX-5 5g
Acinetobacter, staphylococci y enterococci. ≤ 13 14 - 16  17
288
Haemophilus spp.
Lomefloxacina LOM-10 10µg
Enterobacteriaceae
Acinetobacter y stapylococci ≤ 18 19- 21  22
N. gonorrhoeae ≤ 26 27 - 37  38
Loracarbef LOR-30 30µg
Haemophilus spp ≤ 15 16 - 18  19
Meropenem MEM-10 10µg
Acinetobacter y stapylococi ≤ 13 14 - 15  16
Mezlocilina MZ-75 75µg
Enterobacteriaceae y Acinetobacter ≤ 17 18 - 20  21
P. aeruginosa ≤ 15   16
Minociclina MI-30 30µg
Acinetobacter, staphylococci y enterococci ≤ 14 15- 18  19
Moxalactam
Acinetobacter y stapylococci ≤ 14 15- 22  23
Nafcilina NF-1 1µg
Staphylococcus aureus ≤ 10 11- 12  13
Acido Nalidíxico NA-30 30g
Enterobacteriaceae ≤ 13 14- 18  19
Neomicina N-30 30g ≤ 12 13- 15  16
Netilmicina NET-30 30g
289
Nitrofurantoina F/M-300 300g
Enterobacteriaceae, staphylococci y ≤ 14 15 - 16  17
enterococci
Norfloxacina NOR-10 10g
Acinetobacter,staphylococci y enterococci ≤ 12 13 16  17
Novobiocina NB-30 30g
Enterobacteriaceae y staphylococci. ≤ 14 15- 16  17
Ofloxacina OFX-5 5g
N. gonorrhoeae ≤ 24 25 - 30  31
S pneumoniae y otros streptococci no β-
hemolíticos ≤ 12 13- 15  16
Penicilina P-10 10U
Stapylococcus spp ≤ 28   29
Enterococcus ≤ 14   15
L. monocytogenes ≤ 19 20- 27  28
N. gonorrhoeae ≤ 26 27 - 46  47
Streptococci (no-S pneumoniae) ≤ 19 20 - 27  28
Piperacilina PIP-100 100µg
Piperacilina/ TZP-110 100/10µg
Tazobactam
Staphylococcus spp y P. aeruginosa ≤ 17   18
Polimixina B PB-300 300U ≤8 9 - 11  12
Rifampina RA-5 5µg
Staphylococcus spp y Enterococcus ≤ 16 17 - 19  20
290
S pneumoniae ≤ 16 17 - 18  19
Sparfloxacina SPX-5 5µg
Staphylococcus ≤ 15 16 - 18  19
S pneumoniae ≤ 15 16 - 18  19
Espectinomicina SPT-100 1µg
N. gonorrhoeae ≤ 14 15- 17  18
Estreptomicina
Enterococci S-300 300µg ≤6 7- 9  18
Para altos niveles de resistencia
Enterobacteriace S-100 10µg ≤ 11 12- 14  15
ae
Sulfisozaxol G-25 25g
Acinetobacter, staphylococci y V. cholerae ≤ 12 13 - 16  17
Tetraciclina Te-30 30g
Enterobacteriaceae P. aeruginosa
Acinetobacter, staphylococci
Enterococci y V. cholerae ≤ 14 15 - 18  19
N. gonorrhoeae ≤ 30 31 - 37  38
Ticarcilina TIC-75 75g
Ticarcilina/ Acido TIM-85 75/10g
Clavulánico
Staphylococcus spp ≤ 22   23
Tobramicina NN-10 10g
291
Trimetoprim TMP-5 5g
Trimetoprim/ SXT-100 1,25µg
Sulfametoxazol 23,75µg
Acinetobacter, staphylococci y V. cholerae ≤ 10 11 - 15  16
S pneumoniae ≤ 15 16 - 18  19
Trovafloxacina TVA-10 10µg ≤ 13 14 - 16  17
Vancomicina Va-30 30µg
Staphylococcus spp    15
Enterococcus spp ≤ 14 15 - 16  17
S. pneumoniae y otros streptococci    17
292
Anexo 2: Fórmula, Preparación y Control de Calidad de Medios de Cultivo de
uso frecuente en Microbiología
Agar Sangre Humana (ASH):

(Usando como base agar soya tripticasa).
Fórmula en gramos/litro):
Digesto pancréatico de caseína ..............................................................15.00 g.
Digesto pancréatico de harina de soya .....................................................5.00 g.
Agar ........................................................................................................15.00 g.
pH final: 7.3 + 0.2
Preparación:
1. Suspenda 40.0 gramos en un litro de agua destilada o desionizada y caliente hasta

la ebullición, mezclando suavemente para que se disuelva por completo.
2. Esterilice en autoclave a 121ºC durante 15 minutos a 15 libras de presión.
3. Enfríe hasta 45–50ºC y añada asépticamente 5% de sangre humana defribrinada
estéril.
4. Mezcle a fondo, evitando la formación de burbujas de aire y dispense en placas de
petri estériles.
Uso:
El ASH. es usado para el aislamiento, cultivo y detección de la actividad

hemolítica de los estreptococos y otros microorganismos de crecimiento fastidioso.
Este medio deriva sus nutrientes de la infusión de peptonas que suministra
compuestos nitrogenados y de carbono, azufre, vitaminas e ingredientes traza. El
cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.
Control de Calidad:
Streptococcus pyogenes : crecimiento, -hemólisis.
Streptococcus pneumoniae : crecimiento, -hemólisis.
293
Staphylococcus aureus: crecimiento
Escherichia coli: crecimiento.
Agar Gelosa Chocolate (GC)

Fórmula en gramos/litro:
Digesto pancreático de caseína ..................................................................7.5 g.
Digesto péptico de tejido animal ................................................................7.5 g.
Almidón de maíz. .......................................................................................1.0 g.
Fosfato dipotásico ......................................................................................4.0 g.
Fosfato monopotásico. ...............................................................................1.0 g.
Cloruro de sodio. ........................................................................................5.0 g.
Agar. .........................................................................................................10.0 g.
pH: 7.2 + 0.2
Preparación:
1. Suspenda 72 gramos del polvo deshidratado en 1.000 ml de agua destilada para

preparar una base de doble concentración. Mezcle vigorosamente.
2. Caliente con agitación frecuente y deje hervir un minuto para que se disuelva
completamente el agar.
3. Esterilice por autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión.
4. Esterilice por autoclave 100 ml. de una solución de Hemoglobina (2%).
5. Enfríe la solución a 50ºC en Baño de María.
6. Añada 2 ml de Isovitalex a la base y luego añada la solución de Hemoglobina.
7. Mezcle cuidadosamente y reparta en placas de petri (aproximadamente 20 ml. por
placa) evitando la formación de burbujas.
Uso:
Es un medio enriquecido usado para el aislamiento y cultivo de

microorganismos fastidiosos, especialmente Neisseria y Haemophilus. Contiene
peptona de caseína y de carne como fuente de nutrientes, buffer fosfato para
controlar el pH y almidón de maíz para neutralizar los ácidos grasos tóxicos que
294
pudieran estar presentes en el agar. Se añade como suplemento:hemoglobina e
isovitalex. El primero, provee el factor X (hemina) para especies de Haemophilus y
el segundo, provee el factor V (nicotamida-adenina- dinucleótido) para especies de
Haemophilus y además, vitaminas, aminoácidos, coenzimas, dextrosa, iones férricos
y otros factores que mejoran el crecimiento de neiserias patógenas.
Control de Calidad:
Neisseria gonorrhoeae: crecimiento

Neisseria meningitidis: crecimiento
Haemophilus influenzae: crecimiento
Streptococcus pneumoniae: crecimiento
Agar Mac Conkey (MC)

Digesto pancreático de gelatina ...............................................................17.0 g.

Digesto péptico de tejido animal ................................................................1.5 g.
Lactosa .....................................................................................................10.0 g.
Mezcla de sales biliares. .............................................................................1.5 g.
Agar. ...........................................................................................................3.5 g.
Rojo neutro ...............................................................................................0.03 g.
Cristal violeta. ........................................................................................0.001 g.
pH final: 7.1+ 0.2
Preparación:
1. Suspender 50.0 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada.

Mezcle hasta que se obtenga una suspensión uniforme.
295
2. Calentar suavemente, agitando frecuentemente y hervir durante un minuto.
Esterilizar en autoclave a 121ºC y 15 libras de presión por 15 minutos.
3. El medio estéril fundido se estabiliza a 45–50°C, en Baño de María y se dispensa

en placas de Petri estériles.
Uso:
Es un medio inhibidor, diferencial y selectivo para la detección de

organismos coliformes y patógenos entéricos. Permite sólo el crecimiento de bacilos
Gram negativo. La concentración de sales biliares en el medio es relativamente baja
en comparación con otros medios para bacterias entéricas (SSA, entre otros), el
colorante cristal violeta inhibe los organismos Gram positivo, especialmente,
enterococos y estafilococos.
La diferenciación entre los organismos entéricos se logra por la combinación

de lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Las colonias incoloras (no fermentadoras
de la lactosa, NFL) o rosadas (colonias fermentadoras de la lactosa, CFL) se
producen dependiendo de la habilidad del microorganismo para fermentar o no la
lactosa.
Control de Calidad:
Escherichia coli: crecimiento, CFL.

Proteus mirabilis: crecimiento, CNFL.
Salmonella typhimurium: crecimiento, CNFL.
Enterococcus faecalis: inhibición (parcial o total).
Staphylococcus aureus: inhibición (parcial o total).
296
Tiosulfato Citrato Bilis Sucrosa (TCBS)
Peptona de caseína .....................................................................................5.0 g.
Peptona de carne. .......................................................................................5.0 g.
Extracto de levadura...................................................................................5.0 g.
Citrato de sodio. .......................................................................................10.0 g.
Oxgall (bilis de buey) .................................................................................5.0 g.
Colato de sodio...........................................................................................3.0 g.
Sucrosa. ....................................................................................................20.0 g.
Citrato férrico .............................................................................................1.0 g.
Azul de timol ............................................................................................0.04 g.
Agar ..........................................................................................................14.0 g.
pH: 8.4 + 0.6
Preparación:
1. Suspender 88 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar

vigorosamente. Calentar con agitación frecuente. Hervir por un minuto para que
se disuelva completamente el polvo.
2. Enfriar a 45–50ºC en Baño de María y repartir en placas de Petri estériles.
3. NO AUTOCLAVAR.
4. Dejar solidificar a temperatura ambiente.
Uso:
Es un medio altamente selectivo (de único propósito) para el aislamiento de

V. cholerae y otras especies del género, a partir de una variedad de especimenes. La
inhibición de las bacterias Gram positiva se logra mediante la adición de bilis de
buey y colato de sodio. El tiosulfato de sodio sirve como fuente de carbono y, en
combinación con el citrato férrico detecta la producción de sulfuro de hidrógeno
297
(H2S). La sucrosa se incluye como carbohidrato fermentable para el metabolismo de
los vibrios. El pH alcalino del medio aumenta la recuperación de V. cholerae. El
doble indicador de pH (azul de timol y de bromotimol) facilita la detección de la
producción de ácido a partir de la sucrosa; aún a pesar del pH alcalino del medio
Control de Calidad:
V.cholerae: colonias amarillas (CFS, colonias fermentadoras de la

sucrosa).
V. parahaemolyticus: colonias azul-.verdosas o verde-azuladas
(CNFS)
E. coli: inhibición parcial o completa.
Ps. aeruginosa: inhibición parcial o completa.
E. faecalis: inhibición parcial o completa.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)

Xilosa. ......................................................................................................3.50 g.
Lactosa .....................................................................................................7.50 g.
Sucrosa .....................................................................................................7.50 g.
L-Lisina ....................................................................................................5.00 g.
Cloruro de sodio. ......................................................................................5.00 g.
Rojo de fenol. ...........................................................................................0.08 g.
Agar ........................................................................................................13.50 g.
Desoxicolato de sodio ..............................................................................2.50 g.
Citrato de Hierro y Amonio .....................................................................0.80 g.
pH final:7.5 + 0.2
298
Preparación:
1. Realizar una suspensión con 55 gramos del material deshidratado en un litro de

agua destilada. Calentar para disolver el agar agitando frecuentemente, dejar
hervir un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. NO AUTOCLAVAR.
2. Estabilizar en Baño de María a una temperatura de 50-55ºC. El medio debe tener
un color rojizo claro, sin precipitado. El calentamiento excesivo o prolongada
estancia en el Baño de María puede producir precipitación.
3. Repartir asépticamente en placas de petri y dejar solidificar a temperatura
ambiente.
Uso:
Recomendado para el aislamiento y diferenciación de enteropatógenos,

especialmente especies de Shigella y Salmonella. Es un medio selectivo diferencial
que utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por lo tanto, inhibe el
crecimiento de las bacterias Gram positivas. La xilosa se incorpora al medio puesto
que este carbohidrato es fermentado por prácticamente todas las enterobacterias,
excepto por especies de Shigella y esta propiedad incrementa la diferenciación de
especies de este género. La lisina se incluye para diferenciar Salmonella del grupo de
los no patógenos; ya que sin lisina, las salmonelas rápidamente fermentan la xilosa y
serían indistinguibles de las especies no patógenas. Después que las salmonelas
agotan el suministro de xilosa, la lisina es atacada vía enzimática, a través de la lisina
decarboxilasa, con reversión al pH alcalino que mimetiza la reacción de las shigelas.
Para prevenir tal reversión por coliformes lisina-positivos, se añade al medio, sucrosa
y lactosa para lograr la producción de ácido en exceso.
La adición de un sistema indicador de pH, aumenta la capacidad diferencial

del medio. Este consiste en tiosulfato de sodio y citrato férrico-amónico, los cuales se
incluyen para la visualización del H2S producido, resultando en la formación de
colonias con centros negros. Los no enteropatógenos productores de sulfuro de
hidrógeno, no decarboxilan la lisina.
299
Control de Calidad:
S. thyphimurium: colonias rojas con H2S.

S. flexneri: colonias rojas sin H2S.
E. faecalis: inhibición parcial
E. coli: inhibición parcial; colonias amarillas sin H2S.
Salmonella Grupo III: colonias amarillas con H2S.
Salmonella- Shigella Agar (SSA)

Extracto de carne de res. ............................................................................5.0 g.
Peptona polipeptona. ..................................................................................5.0 g.
Lactosa .....................................................................................................10.0 g.
Sales biliares...............................................................................................8.5 g.
Citrato de sodio ..........................................................................................8.5 g.
Tiosulfato de sodio. ....................................................................................8.5 g.
Citrato de hierro. ........................................................................................1.0 g.
Agar ..........................................................................................................13.5 g.
Verde brillante.........................................................................................0003 g.
Rojo neutro (indicador)............... ............................................................0025 g.
pH final: 7.0 + 0.2
Preparación:
1. Suspender 60 gramos del medio en un litro de agua destilada. Calentar

frecuentemente y dejar hervir por un minuto para que se disuelva
completamente.
2. Enfriar el medio, aproximadamente hasta 45-50ºC, en Baño de María y

dispensar en las placas de Petri.
3. Permita que las placas se sequen por aproximadamente dos horas con la tapa
entreabierta. NO AUTOCLAVAR.
300
Uso:
Es un medio diferencialmente selectivo para aislamiento de bacilos

enteropatógenos, especialmente, los pertenecientes al Género Salmonella. Este medio
no es recomendado para el aislamiento primario de Shigella.
Es considerado un medio moderadamente selectivo, basado en el grado de

inhibición del crecimiento de los Gram positivos, que son inhibidos por el contenido
de sales biliares, verde brillante y citrato. La diferenciación de los bacilos entéricos
se logra mediante la incorporación de lactosa en el medio. Los organismos que
fermentan este carbohidrato, producen ácidos que en presencia del indicador de pH,
rojo neutro, provocan la aparición de colonias rosadas. Los no fermentadores,
producen colonias incoloras. Este último grupo, abarca la mayoría de los patógenos
intestinales, incluyendo Salmonella y Shigella.
El tiosulfato de sodio y el citrato férrico permiten la detección de H2S que se

evidencia por la aparición de centros negros en las colonias.
Control de Calidad:
S. thyphimurium: colonias no fermentadoras con H2S.

S. flexneri: colonias no fermentadoras sin H2S.
E. coli: inhibición parcial.
E. faecalis: inhibición completa.
Sabouroud Dextrosa Agar (SB)

Digesto péptido de tejido animal...............................................................5.0 g.
Dextrosa ...................................................................................................40.0 g.
Agar........................................................................ ..................................15.0 g.
pH final: 5.6 + 0.2
301
Preparación:
1. Suspender 65 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Calentar con

agitación frecuente y dejar hervir por un minuto para que se disuelva
completamente el polvo.
2. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión.
3. Si se desea agregar cloramfenicol, añadir 0.05 g. del antibiótico a los ingredientes

anteriores.
Uso:
Se utiliza en procedimientos cualitativos para el cultivo de hongos (patógenos

y no patógenos), particularmente dermatofitos. Es un medio de propósito general
desarrollado para el cultivo de dermatofitos. El bajo pH de aproximadamente 5.6 es
favorable para el crecimiento de los hongos, especialmente los dermatofitos, y
ligeramente inhibitorio para las bacterias contaminantes en las muestras clínicas.
Este medio se recomienda para el recuento total de hongos. La adición de
cloramfenicol es una modificación diseñada para incrementar la inhibición
bacteriana.
Es un medio a base de peptona suplementado con dextrosa para soportar el

crecimiento de los hongos. Las peptonas proporcionan los factores nitrogenados de
crecimiento; la dextrosa provee la energía para el crecimiento fúngico. El
cloramfenicol es un antibiótico de amplio espectro, inhibidor para una amplia
variedad de bacterias Gram positivas y negativas, cuando se añade a su formulación.
Control de Calidad:
C. albicans: crecimiento.
T. mentagrophytes: crecimiento
E. coli: inhibición parcial o completa (sólo si contiene Cloramfenicol)
302
Base de Peptonas para preparar Indol
Peptona. ....................................................................................................10.0 g.
pH: 7.0 + 0.2
Preparación:
1. Rehidratar 10 gramos de peptona en un litro de agua destilada. Añadir cloruro de
sodio a una concentración de 10 %. Dispensar un volumen de 3 ml. en cada tubo
(13 x 100).
2. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión a una

temperatura de 121ºC.
3. Dejar enfriar y conservar en refrigeración hasta su empleo.
Uso:
Peptona, es un término químicamente indefinido que se utiliza para describir

los productos hidrosolubles obtenidos después de la hidrólisis de las proteínas.
Contienen una mezcla de áminoácidos libres y polímeros de aminoácidos (péptidos)
que van hasta péptidos de mayor tamaño, capaces de permanecer en solución después
de calentarlos a 100ºC.
Las peptonas se fabrican utilizando enzimas o ácidos minerales fuertes para

hidrolizar las proteínas que pueden ser de origen animal (peptona de carne: incluye la
caseína y gelatina) o de origen vegetal (peptona de soya). Las peptonas producidas a
partir de estas diversas fuentes se pueden subdividir ulteriormente en las producidas
por ácidos o por enzimas, tales como: tripsina, pepsina o papaína.
Las distintas enzimas rompen los enlaces peptídicos de las moléculas de

proteínas en lugares diferentes, liberando así una variedad de péptidos y de
aminoácidos libres. Por su parte, la hidrólisis ácida, rompe todos los enlaces
peptídicos de forma que produce aminoácidos libres solamente. Desafortunadamente,
303
destruye también algunos aminoácidos valiosos, como el triptófano. Así, las peptonas
ricas en triptófano se seleccionan para las pruebas de producción de indol.
El caldo triptofano se ha desarrollado especialmente, como sustrato para la

producción de indol. Debido a su alto contenido de triptofano, es más fiable que el
caldo peptonado para este propósito.
Para realizar la prueba se utiliza el reactivo de Kovac’s que, al ser añadido a

un medio que contiene triptofano después de permitir el crecimiento bacteriano,
permite la formación de un anillo rojo que es indicativo de la producción del indol.
Control de Calidad:
E. coli: indol positivo.

K. pneumoniae: indol negativo.
Motilidad
Extracto de carne ........................................................................................3.0 g.
Digesto pancreático de gelatina ...............................................................10.0 g.
Agar ............................................................................................................4.0 g.
pH final: 7.3 + 0.2
Preparación:
1. Disolver 22 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Calentar en agitación

suave y frecuente. Dejar hervir. Dispensar en tubos y esterilizar en autoclave a
121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión.
2. Si se desea, se puede añadir al medio 0.05 gramos de trifenil-tetrazolium (TTC,
colorante vital) antes de la esterilización (o alternativamente, añada 5 ml de una
solución al 1 % de TTC asépticamente después de la esterilización).
304
Uso:
Se emplea en la detección de la motilidad de los bacilos Gram negativos

entéricos. Esta puede ser observada directamente por examen de los tubos posterior a
la incubación. El crecimiento se disemina desde la línea de inoculación, si el
microorganismo es mótil. Organismos con gran motilidad producen turbidez en todo
el tubo. El crecimiento de los microorganismos no mótiles, sólo ocurre a lo largo de
la línea de inoculación.
El uso opcional de TTC en el medio, permite la visualización del crecimiento

bacteriano. Este se incorpora al interior celular durante el metabolismo. El color rojo
impartido a las células ayuda en la determinación de la motilidad.
Control de Calidad:
E. coli: mótil
K. pneumoniae: no mótil.
Agar Citrato de Simmons

Sulfato de magnesio ...................................................................................0.2 g.
Fosfato dihidrógeno de amonio......................................1.0 g.
Fosfato dipotásico ......................................................................................1.0 g.
Citrato de sodio ..........................................................................................2.0 g.
Agar ..........................................................................................................15.0 g.
pH final: 6.8 + 0.2
Preparación:
1. Para rehidratar el medio, suspender 24,2 gramos en un litro de agua destilada o
desionizada y calentar hasta la ebullición mezclando suavemente para que se
disuelva por completo. Distribuir en tubos de ensayo.
305
2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos a 15 libras de presión. Dejar
solidificar en forma inclinada para que se forme taco y bisel.
Uso:
Se emplea en la investigación de bacilos Gram negativos usando como base

el empleo del citrato. Los organismos capaces de utilizar el citrato de sodio y el
fosfato de amonio como fuente de carbono y nitrógeno, respectivamente, crecerán en
el medio y producirán una reacción alcalina evidenciada por el cambio de color del
indicador azul de bromotimol, de verde (neutro) a azul (alcalino).
Control de Calidad:
E. aerogenes: positivo (crecimiento, el medio se torna azul)

E. coli: negativo (sin crecimiento)
Caldo Rojo Fenol con Manitol

Digesto pancreático de caseína ................................................................10.0 g.
D-manitol ...................................................................................................5.0 g.
Rojo fenol. ..............................................................................................0.018 g.
pH final: 7.3 + 0.2
Preparación:
1. Resuspender 20 gramos del polvo en un litro de agua.

2. Dispensar en tubos (13 x 100), a razón de 3 ml. por tubo, aproximadamente.
306
Uso:
Se emplea para determinar la habilidad de un microorganismo para fermentar

o no, el manitol, este es el único carbohidrato fermentable en el medio, puesto que la
peptona de caseína no contiene carbohidratos. Los fermentadores del manitol
producen una reacción ácida en el medio que causa el cambio de color del indicador
rojo de fenol (del rojo al amarillo). Si se quiere evidenciar la producción de gas, se
añade un tubo de Durham al medio.
Control de Calidad:
E. coli: positivo (crecimiento con producción de gas)

S. aureus: positivo (crecimiento con producción de ácido)
P. vulgaris: negativo.
S. epidermidis: negativo.
Agar Nutritivo (AN)

Digesto pancreático de gelatina .................................................................5.0 g.

Extracto de carne. .......................................................................................3.0 g.
Agar. .........................................................................................................15.0 g.
pH final: 6.8 + 0.2
Preparación:

vigorosamente. Calentar con agitación frecuente y hervir por un minuto para que
se disuelva por completo el agar.
3. Repartir asépticamente en las placas.

307
Uso:
Es usado para el cultivo de bacterias y para el recuento de organismos en

agua, heces y otros materiales. Su composición, relativamente simple, provee los
nutrientes necesarios para la replicación de gran cantidad de microorganismos que no
son exigentes para crecer. El extracto de carne contiene sustancias solubles en agua,
incluyendo carbohidratos, vitaminas, compuestos de nitrógeno orgánico y sales. Las
peptonas constituyen la principal fuente de nitrógeno orgánico, particularmente,
aminoácidos y péptidos de cadena larga.
Control de Calidad:
S. aureus: crecimiento moderado a fuerte.

E. coli: crecimiento moderado a fuerte.
Agar Thayer Martin (VCN)

Peptona de carne.. ......................................................................................7.5 g.
Almidón de maíz ........................................................................................1.0 g.
Fosfato dipotásico.. ....................................................................................4.0 g.
Fosfato monopotásico. ...............................................................................1.0 g.
Cloruro de sodio.. .......................................................................................5.0 g.
Agar ..........................................................................................................12.0 g.
Hemoglobina. ...........................................................................................10.0 g.
Isovitalex ............................................................................................... 10.0 ml.
VCN suplemento ................................................................................... 10.0 ml.
pH final: 7.2 + 0.2
Preparación:
1. Disolver la base GC en la cantidad conveniente de agua destilada (ver

preparación de GC). Mezclar vigorosamente.
2. Calentar hasta que hierva.
308
3. Esterilizar en autoclave a 121ºC a 15 libras de presión por 15 minutos.
4. Estabilizar en Baño de María a 50ºC por 30 minutos.
5. Agregar una solución de Hemoglobina al 2%, Isovitalex al 1% y el suplemento
VCN (1%).
6. Mezclar cuidadosamente y repartir en placas estériles.
Uso:
Es usado en el aislamiento de especies de Neisseria patógenas en

especimenes que conllevan flora asociada. Tiene como base el GC. Adicionalmente
contiene los agentes antimicrobianos: vancomicina, colistina y nistatina, que
constituyen el suplemento inhibidor del medio. La vancomicina es activa
primariamente contra bacilos Gram positivos. La colistina inhibe los bacilos Gram
negativos, incluyendo especies de Pseudomonas; pero no, especies de Proteus. La
nistatina inhibe los hongos que pudieran estar presentes en la muestra.
Control de Calidad:
N. gonorrhoeae: crecimiento.
N. meningitidis: crecimiento.
N. sicca: inhibición completa.
C. albicans: inhibición completa.
S. aureus: inbibición completa
E. coli: inhibición completa
Agar Müeller-Hinton (MH)

Extracto de carne. .......................................................................................2.0 g.
Hidrolizado ácido de caseína ...................................................................17.5 g.
Almidón......................................................................................................1.5 g.
Agar ..........................................................................................................17.0 g.
pH final: 7.3 + 0.1
309
Preparación:
1. Disolver 38 gramos del medio en un litro de agua destilada.

2. Calentar con agitación constante. Dejar hervir por un minuto para que se
disuelva completamente.
3. Esterilizar por autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión. No
sobrecalentar.
4. Estabilizar en Baño de María a 45-55ºC.
5. Añadir los suplementos, tales como:5 % de sangre defibrinada estéril (MHS).
Mezclar bien.
6. Repartir en placas de petri estériles.
Uso:
Recomendado para las pruebas de susceptibilidad por el método de difusión

del disco de Baüer y Kirby, procedimiento estandarizado por el CLSI, Instituto para
la estandarización de laboratorios clínicos (según sus siglas en inglés). El suplemento
con sangre o chocolate se ha sugerido para su uso en pruebas para Haemophilus y
Streptococcus.
Control de Calidad:
MH: S. aureus ATCC 25923

MHS: S. pneumoniae ATCC 6305
MH: E. coli ATCC 25922
MHCH: H. influenzae ATCC10211
MH: Ps. aeruginosa ATCC 27853
Caldo Soya Tripticasa (CST)

Digesto pancreático de caseína ................................................................17.0 g.

Digesto papaico de soya. ............................................................................3.0 g.
310
Fosfato dipotásico. .................................................................................... 2.5 g.
Dextrosa. ....................................................................................................2.5 g.
pH final: 7.3 + 0.2
Preparación:
1. Suspender 30 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar

vigorosamente.
2. Calentar gentilmente hasta disolución completa.
3. Dispensar en tubos de 13 x 100, a razón de 3 ml. por tubo
Uso:
Es un medio de propósito general, usado en procedimientos cualitativos para

el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos a partir de una variedad de
muestras de diferente origen. Los componentes peptídicos proveen los aminoácidos y
otros compuestos nitrogenados. La dextrosa actúa como fuente de energía. El NaCl
mantiene el equilibrio osmótico del medio. El fosfato dibásico actúa como buffer
para controlar el pH.
Control de Calidad:
B. subtilis: crecimiento
C. albicans: crecimiento
S. aureus: crecimiento
E. coli: crecimiento
Caldo Thioglicolato (CT)

Digesto pancreático de caseína. ...............................................................17.0 g.
Digesto papaico de soya .............................................................................3.0 g.
311
Dextrosa .....................................................................................................6.0 g.
Thioglicolato de sodio ................................................................................0.5 g.
Agar ............................................................................................................0.7 g.
L- cisterna...................................................................................................0.1 g.
Sulfito de sodio ..........................................................................................0.1 g.
Hemina ...................................................................................................0.005 g.
Vitamina K .............................................................................................0.001 g.
pH final: 7.0 + 0.2
Preparación:

vigorosamente.
2. Calentar con agitación frecuente y dejar hervir un minuto para que se disuelva
completamente el polvo.
3. Dispensar en tubos con tapa de rosca (hasta más de la mitad).
5. Almacenar el medio preparado a 15–30º C. Después de almacenamiento
prolongado, se debe recalentar el medio una vez y hervirlo (100ºC por 10
minutos) para eliminar el oxígeno absorbido antes de su uso.
6. Los suplementos deben añadirse asépticamente, después de la esterilización.
Uso:
Es un medio enriquecido que se usa para el cultivo de microorganismos

fastidiosos y no fastidiosos a partir de diferentes tipos de muestras. El tioglicolato de
sodio, como agente reductor, mantiene una baja tensión de oxígeno en el medio. La
vitamina K sirve como factor de crecimiento para algunos microorganismos,
incrementando el crecimiento de ciertas especies de anaeróbicos y esporulados. La
hemina es una fuente de factor X que estimula el crecimiento de organismos
exigentes.
312
Control de Calidad:
B. fragilis: crecimiento
C. perfringens: crecimiento
E. coli: crecimiento
Ps. aeruginosa: crecimiento.
Caldo Selenito F
Selenito ácido de sodio...............................................................................4.0 g.

Digesto pancreático de caseína. .................................................................5.0 g.
Lactosa .......................................................................................................4.0 g.
Fosfato monopotásico ................................................................................7.0 g.
pH final: 7.0 + 0.2
Preparación:

vigorosamente.
2. No requiere esterilización, si el medio es usado inmediatamente. Si va a ser
almacenado, calentar a 100ºC por 30 minutos. El exceso de calor es dañino. NO
AUTOCLAVAR.
3. Almacenar el medio a una temperatura de 2- 8ºC. La pequeña cantidad de
precipitado coloreado no es perjudicial.
Uso:
Es usado en el enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella y algunas

especies de Shigella, a partir de muestras de heces, alimentos y otros materiales de
importancia sanitaria. Las peptonas de caseína y carne proveen los compuestos
313
esenciales de nitrógeno y carbón. La lactosa en el medio sirve para mantener un pH
uniforme.
Cuando el selenito es reducido por el crecimiento de la bacteria se produce

alcalinidad; un incremento en el pH podría disminuir la toxicidad del selenito y
resultaría en el sobrecrecimiento de bacterias extrañas. En realidad, el ácido
producido por la fermentación de la lactosa sirve para mantener un pH neutral o
ligeramente disminuido.
La función del fosfato es doble: sirve para mantener estable el pH y también,

disminuye la toxicidad del selenito, aumentando la capacidad de enriquecimiento del
medio. El selenito ácido de sodio inhibe muchas especies de bacterias Gram positivas
y Gram negativas, incluyendo enterococos y coliformes.
Los subcultivos deben hacerse entre las 6-18 horas de incubación; de lo

contrario, el efecto inhibidor de las sales de selenito disminuye.
Control de Calidad:
Crecimiento en MC después de subcultivar el Selenito F

Microorganismo
O horas 24 horas
S. typhimurium Crecimiento escaso a moderado de Crecimiento moderado a fuerte

colonias incoloras de colonias incoloras
S. sonnei Crecimiento escaso a moderado de Crecimiento moderado a fuerte
colonias incoloras de colonias incoloras
E. coli Crecimiento moderado a fuerte de Crecimiento moderado a escaso
colonias rosadas de colonias rosadas
Medio de Transporte Cary & Blair

Thioglicolato de sodio ................................................................................1.5 g.
314
Agar ............................................................................................................5.0 g.
pH final: 8.0 + 0.5
Preparación:
1. Suspender 12.6 gramos del medio en 991 ml. de agua destilada. Mezclar
vigorosamente.
2. Calentar en agitación constante y dejar hervir por un minuto para que se disuelva
completamente.
3. Enfriar a 50ºC y añadir 9 ml de una solución al 1% de cloruro de calcio (BaCl 2).
Ajustar el pH si es necesario (8.4).
4. Dispensar en tubos con tapa de rosca (aproximadamente, 7 ml. en cada tubo).
Vaporizar por quince minutos. Enfriar y ajustar la tapa.
Uso:
Se emplea para la colección y conservación de especimenes clínicos. Contiene

un mínimo de nutrientes para incrementar la supervivencia del microorganismo; sin
replicación. El tioglicolato de sodio se añade para proporcionar un bajo potencial
redox. El pH relativamente alto, minimiza la destrucción de las bacterias debido a la
producción de ácido.
Control de Calidad:
S. flexneri: crece cuando se subcultiva a un agar nutriente después de 18

horas.
N. gonorrhoeae: crece cuando se subcultiva a un agar nutriente después de 18
horas.
315
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21. Johnson, T.; Case, C. Laboratory Experiments in Microbiology. Sixth
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23. Joklik, Wolfang. Microbiología. Zinsser. Vigésima Edición. Editorial
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24. Kelley, Susan; Post, Frederick. Basic Microbiology Techniques. Fourth
Edition. Star Publishing Company. Korea, 2002.
25. Koneman, Elmer; Allen, Stephen; Janda, William; Schreckenberger, Paul;
Winn, Washington Jr. Color Atlas and Textbook of Diagnostic
Microbiology. Fifth Edition. Lippincott,1997.
26. López, M.; Vargas, J. Manual de Aislamiento e Identificación de
Bacilos Gram Negativos no Fermentadores de la Glucosa. Centro de
Referencia Bacteriológica. SAHUM. Maracaibo-Venezuela, Septiembre
2003.
27. Luengo de Borges, Edicta. Manual de Microbiología Básica.
Volúmenes I, II y III. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de
Ciencias. Departamento de Biología. Maracaibo-Venezuela, 1.989.
28. Mac Faddin, J. Biochemical Tests for Identification of Medical
Bacteria. Third Edition. Williams & Wilkins. Baltimore, USA. 2.000.
29. Murray, Patrick; Baron, Ellen; Pfaller, Michael; Tenover, Fred; Yolken,
Robert. Manual of Clinical Microbiology. Seventh Edition. American
Society for Microbiology. ASM, Press.USA, 1999.
30. Normativa para la Puesta en Práctica de Estudios de la Sensibilidad

Antimicrobiana Mediante Discos. Sexta Edición, Approved Standard
NCCLS- The National Committee for Clinical Laboratory Standard. M2–
A6. Vol. 13, N°24. Pennsilvania, USA.
31. Normativa para la Puesta en Práctica del Estudio de Susceptibilidad

Antimicrobiana. Octavo Suplemento Informativo. NCCLS , M100 –S8 ,
Vol. 17, N° 2. Pennsilvania, USA.
32. Oxoid. Manual de Medios de Cultivo, Ingredientes para su

preparación y otros elementos de Laboratorio. Cuarta Edición. Oxoid
Limited. Inglaterra, 1.988.
33. Pelczar, M.; Reid, R.; Chan, E. Microbiología. Cuarta Edición. Editorial
Mc Graw–Hill. México, 1.988.
34. Power, David and McCuen, Peggy. Manual of BBL Products and
Laboratory Procedures. Sixth Edition. Cat. No. 52000. Becton
Cepa
Donante
317
Dickinson Microbiology Systems. USA, 1.988.
35. Pratts Guillem. Microbiología Clínica. Editorial Médica Panamericana,

S. A. Madrid-España, 2006.
36. Prescott, Lansing; Harley, John; Klein, Donald. Microbiología. Cuarta
Edición. McGraw-Hill Interamericana. España, 1999.
37. Sánchez de Forero, María Piedad. Manual de Procedimientos en
Bacteriología Clínica. Primera Edición. Editorial Presencia Ltda.
Bogotá-Colombia, 1986.
38. Tortora, Gerard. Microbiology: An Introduction. Fifth Edition. The

Benjammin/Cummings Publishing Company, Inc. USA. 1995.
39. Tortora, Gerard. Microbiology. Principles & Applications. Fifth Edition.

The Benjammin/Cummings Publishing Company, Inc. USA. 1995.
40. Walter, McBee, Temple. Introducción a la Microbiología. Compañía
Editorial Continental, S.A. México, 1.980.
41. World Health Organization, Switzaerland, and Center for Disease Control
and Prevention, Atlanta- Georgia, 2003.2006.

Manual Practico de Bacteriologia LUZ

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1

Unidad I. Introducción al Trabajo Práctico de Bacteriología .................................. 9

Unidad II: Morfología y Ulltra-Estructura de la Célula Bacteriana ..................... 36

Unidad III: Nutrición y Crecimiento Bacteriano ...................................................... 71

Unidad V. Genética Bacteriana ................................................................................ 170

Unidad VI: Control del Crecimiento Bacteriano .................................................... 175

Unidad VII: Interacción Bacteria-Hospedero ......................................................... 212

Unidad VIII: Control de Calidad en el Laboratorio de Bacteriología .................. 222

Ilustraciones ................................................................................................................. 236

El presente Manual Práctico está dirigido fundamentalmente a los

Los contenidos han sido organizados en ocho unidades, divididas en un

La Unidad I consiste en tres sesiones prácticas: la primera, orientada

La Unidad II consta de dos sesiones prácticas: la primera, relacionada con

En la Unidad III, los contenidos han sido organizados en tres sesiones

Los contenidos de la Unidad V, han sido organizados en una única sesión

Los contenidos de la Unidad VI han sido organizados en tres sesiones

En la Unidad VII, los contenidos han sido organizados en una sesión

La Unidad VIII ha sido organizada en una sesión práctica con la finalidad

Esperando que esta obra constituya un valioso aporte a la enseñanza de la

Al finalizar la Unidad, el participante estará en capacidad de:

 Aplicar las normas de seguridad que rigen el trabajo en el Laboratorio de

1. Aplicar las normas de seguridad en el Laboratorio de Bacteriología.

Normas de Seguridad en el Laboratorio de Bacteriología

Los laboratorios de Bacteriología son ambientes especiales con respecto a

Además del riesgo por infección, los laboratorios de Bacteriología

Los riesgos biológicos existentes en el laboratorio microbiológico son los

3. Es indispensable usar guantes de goma o látex cuando se manipulan materiales

5. Se recomienda no llevarse los objetos o las manos, a la cara o la boca, durante su

7. Está terminantemente prohibido utilizar teléfonos celulares dentro del laboratorio

8. Mantenga su mesón de trabajo despejado. Disponga únicamente, los materiales

9. En caso de cualquier accidente, por pequeño que éste sea, notifíquelo de

10. Muchos de los microorganismos estudiados en el laboratorio son patógenos para

12. No realice experimentos o trabajos sin autorización de su superior.

16. Los microorganismos desecados o fijados sobre láminas portaobjetos no

18. No interrumpa a quienes están trabajando; pues se pueden ocasionar graves

24. Las superficies de trabajo se descontaminarán al terminar cada actividad

25. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite, en lo

26. Durante el trabajo se mantendrán cerradas las puertas del laboratorio.

“Cumpliendo a cabalidad las normas anteriormente descritas, el laboratorio de

Material y Equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriología

Con fines didácticos, el material de uso en el Laboratorio de Bacteriología

Debe cumplir con ciertos requisitos especiales; como:

El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriología está

Cilindros graduados: También denominados Probetas graduadas, son recipientes de

Frascos para hemocultivo: Son frascos redondeados o rectangulares, de vidrio

Láminas cubreobjeto (laminillas): Son laminillas delgadas de vidrio con forma

Láminas portaobjeto: Son rectángulos de vidrio utilizados para realizar extendidos a

Mechero de alcohol: Consta de un envase de vidrio o metal, provisto de una mecha, la

Pipetas Pasteur: Se obtienen comercialmente, o pueden prepararse en el laboratorio.

Tubos de fermentación (Durham): En bacteriología se usan para el estudio de los

Varillas de vidrio: Son cilindros de vidrio con extremos redondeados, de longitud y

B) Instrumentos, Equipos y otros Materiales usados en Bacteriología

Asas bacteriológicas: Están formadas por un mango de Kolle unido a un alambre de

Campana o jarra de microaerofilia: Son recipientes formados por un cuerpo y una

Campana de extracción: Sistema de seguridad, compuesto por un extractor centrífugo

Centrífugas: Son instrumentos metálicos de distintas capacidades, con envoltura de

Cestas: Son recipientes de tejido metálico o plástico resistente al calor, de diferentes

Dispensador: Es un dispositivo que se utiliza para repartir volúmenes pequeños de

Espátulas: Instrumentos planos, obtusos, semejantes a un cuchillo que se emplean

Guantes de látex para laboratorio: Son prendas de tamaño variable y ambidextros.

Guantes de seguridad: Son prendas utilizadas para manipular objetos calientes

Gradillas: Soportes especiales de madera, metal o plástico, empleados para colocar

Microincinerador: Es un aparato eléctrico que cumple las funciones de un mechero de

Microscopio: El microscopio compuesto de luz, ampliamente utilizado en la

pHmetro: Instrumento que tiene como finalidad medir el pH de soluciones químicas

Plancha de calentamiento: Es un instrumento que tiene como finalidad el