3. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS MARCADAS.

Las técnicas inmunológicas marcadas pueden ser:

 Técnicas directas: miden directamente el analito, generalmente el antígeno, del complejo antígeno -
anticuerpo. Para realizar esta técnica, se incuba la muestra con el anticuerpo primario marcado
durante un determinado tiempo, a la temperatura indicada, luego se retira el exceso de anticuerpo
mediante lavados y se procede a la detección del complejo antígeno - anticuerpo.

 Técnicas indirectas: miden indirectamente el analito, generalmente el anticuerpo, del complejo

antígeno - anticuerpo, empelando un anticuerpo puente. Esta técnica se realiza en varias etapas,
primero se incuba la muestra con el anticuerpo puente, y se lava para retirar el exceso de anticuerpo
puente, luego se incuba son el anticuerpo marcado y se retira el exceso de anticuerpo mediante
lavados y por último se procede a la detección del complejo antígeno - anticuerpo.

 Técnicas tipo sándwich: el antígeno queda atrapado entre dos capas de anticuerpos. Esta técnica se
denomina DAS, cuando el segundo anticuerpo está marcado o HADAS, cuando el segundo anticuerpo
no está marcado y se emplea anticuerpos anti-especie o puente marcado para detectarlo.

Según la competitividad entre el antígeno y el anticuerpo, las técnicas inmunológicas marcadas son:

 No competitivas: se emplea un reactivo, ya sea el antígeno o el anticuerpo, en exceso. La medición

del analito marcado, generalmente un anticuerpo, es directamente proporcional a la concentración de
antígeno presente en la muestra. Esto puede representarse por medio de una curva de respuesta a la
concentración.

 Competitivas: se emplea un reactivo limitante, ya sea el antígeno o el anticuerpo. El analito sin

marcar, generalmente antígeno, en la muestra se mide por su capacidad para competir con un
antígeno marcado. El antígeno sin marcar bloquea la capacidad del antígeno marcado de unirse
puesto que ese punto de unión en el anticuerpo ya se encuentra ocupado.
3.3. ENZIMAINMUNOANÁLISIS.

La técnica de ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay) utiliza antígenos o anticuerpos marcados
con enzimas, como fosfatasa alcalina, peroxidasa y galactosidasa, para poder visualizar la reacción Ag-Ac. La
técnica se realiza en placas de poliestireno con múltiples pocillos que se tapizan con el antígeno o con el
anticuerpo. La reacción se revela añadiendo un sustrato que al actuar sobre la enzima del conjugado da lugar a
un color visible que es cuantificable mediante un lector de ELISA.

Existen múltiples variantes de ELISA que permiten la detección cualitativa o la medición cuantitativa de
antígeno o anticuerpo, realizando una curva estándar con base en concentraciones conocidas de anticuerpo o
antígeno, a partir de la cual es posible determinar la concentración desconocida de una muestra.

ELISA indirecto.

El método ELISA indirecto permite detectar y cuantificar anticuerpos, empleando anticuerpos secundarios
conjugados con la enzima. La muestra que contenga el anticuerpo primario se añade a una placa de
microtitulación recubierto con antígeno y se permite que reaccione con el antígeno unido a la placa. Después de
eliminar por lavado el anticuerpo primario libre, la presencia de anticuerpo unido a antígeno se detecta
mediante la adición de un anticuerpo secundario conjugado con enzima, que se une al anticuerpo primario. A
continuación se elimina por lavado el anticuerpo secundario que haya quedado libre y se añade un sustrato
para la enzima. La cantidad de producto de la reacción de color que se forma se mide con lectores
espectrofotométricos.

El método ELISA indirecto es el método para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En
esta prueba, proteínas recombinantes de la envoltura y del núcleo del VIH se adsorben como antígenos en fase
sólida a placas de microtitulación. Las personas infectadas con VIH producen anticuerpos séricos contra
epítopes en estas proteínas víricas. Por lo general, el ELISA indirecto permite detectar anticuerpos séricos
contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.

ELISA en sándwich

El método ELISA en sándwich permite detectar o cuantificar antígenos. En esta técnica, el anticuerpo se
inmoviliza en una placa de microtitulación, sobre el que se añade una muestra que contiene antígeno y se deja
reaccionar con el anticuerpo inmovilizado y en el caso de que en dicha muestra se encuentre el antígeno,
quedará capturado en la placa. Después de realizar un lavado, se agrega un segundo anticuerpo ligado a
enzima específico para un epítopo distinto del antígeno y se permite que reaccione con el antígeno unido. Tras
eliminar cualquier segundo anticuerpo libre mediante lavado, se añade sustrato que, por acción de la enzima,
dará un producto coloreado observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotómetro.

ELISA competitivo
 El método ELISA competitivo permite medir cantidades de antígeno. En esta técnica se incuba primero
anticuerpo en solución con una muestra que contiene antígeno. Después la mezcla de antígeno y anticuerpo se
añade a una placa de microtitulación recubierta con antígeno. Cuanto más antígeno se encuentra en la
muestra, tanto menos anticuerpo libre está disponible para unirse a la placa recubierta con antígeno. La adición
de un anticuerpo secundario conjugado con la enzima, específico para el isotipo de un anticuerpo primario
puede utilizarse para determinar la cantidad de anticuerpo primario unido al foso como en un ELISA indirecto.