Hromatografija

Povijest kromatografije
• Profesor iz Bazela Friedrich Goppelsröder je 1861. objavio osvrt na rad M. Schönbein-a.
• Schönbein je utvrdio da filter papir upija otopine raznih supstanci različitom brzinom i
raličitim intenzitetom.
• Goppelsröder je ovaj fenomen razradio i doveo do nastanka preparativne papirne
kromatografije. Izolirao je, između ostalog, azulen.
Mihail Semenovič Cvet
• Botaničar, rođen 1872. u Italiji, umro 1919 u Rusiji.
• Iako nije otkrio kromatografiju, Cvet je najznačajniji pionir kromatografije koji je objavio
prvi rad o razdvajanju klorofila 1906.
• Različitim praškovima je punio staklene cijevi i na njima odvajao komponente ekstrakta
lišća.
Princip kromatografije
• Kromatografija je metoda razdvajanja komponenti iz smjese, pri čemu dolazi do
preraspodjele između dvije faze koje se ne miješaju i od kojih je jedna pokretna, a druga
nepokretna.
• Faze su odabrane tako da komponente smjese imaju različit afinitet prema njima.
• Različito kretanje komponenti smjese omogućava njihovo razdvajanje.
Osnovne faze procesa
• Uspravna staklena cijev (kolona) se ispuni fino sprašenom čvrstom supstancom (stacionarna
faza).(a)
• Na vrh kolone se nanese mala zapremina otopine smjese koja se razdvaja.(b)
• Na kolonu se dodaje mobilna faza koja pod utjecajem gravitacije putuje niz kolonu. Različite
supstance različitom brzinom putuju u mobilnoj fazi.(c)
• Komponente smjese se identificiraju u različitim frakcijama eluata.(d)
Identifikacija u kromatografiji se provodi uspoređivanjem
• Otopina uzorka u kojem su supstance A i B se propusti kroz kolonu.
• Zabilježe se zapremine mobilne faze potrebne da se sa kolone eluiraju komponente A i B.
• Zapremine potrebne za eluiranje pojedine supstance se uspoređuju sa zapreminama
potrebnim za eluiranje čistih, referentih supstanci A i B koje su prethodno propuštene kroz
kolonu, pod istim uslovima brzine protoka.
• Ako je brzina protoka mobilne faze kroz kolonu ista i ako su isti ostali eksperimentalni
uvjeti, identifikacija se može provesti na osnovu vremena potrebnog da se komponenta A ili
B eluira sa kolone.
Faktori koji otežavaju identifikaciju
• Proces je spor.
• Identifikacija nije jednoznačna jer se prate samo volumeni, odnosno vremena eluiranja koja
se uspoređuju sa vremenima eluiranja standardnih supstanci.
• Matriks uzorka može izmijeniti stacionarnu fazu i njena svojstva, pa time i volumene,
odnosno vremena eluiranja.
Današnja kromatografija
• Koriste se minijaturizirani sistemi za razdvajanje kontrolirani mikroprocesorima kojima se
mogu odvajati i detektirati nanogramske količine supstance.
• Osim vremena eluiranja (češće se koristi naziv vrijeme zadržavanja) detekcija i identifikacija
se vrši na osnovu specifičnih spektroskopskih podataka.
• Osnovni podatak svake kromatografske analize je kromatogram.
• Kromatogram je dvodimenzionalni zapis na papiru ili ekranu koji pokazuje variranje sastava
mobilne faze na izlasku iz kolone u funkiciji vremena.
• Odziv detektora (signal) je predstavljen na ordinati, a vrijeme na apscisi.
• Kriva ima baznu liniju koja odgovara signalu detektora kad u mobilnoj fazi nema nikakve
druge supstance.
• Razdvajanje je potpuno kada se u kromatogramu vidi onoliko signala (pikova) koliko smjesa
ima komponenti.

Koncept vremena zadržavanja

• Vrijeme koje u koloni provede supstanca koja ne
stupa u nikakvu interakciju sa stacionarnom fazom se
zove vrijeme zadržavanja nezadržane supstance (tM).
• Vrijeme zadržavanja (tR) se mjeri od momenta
unošenja uzorka do maksimuma signala.
 • Reducirano vrijeme zadržavanja (t’R) je razlika vremena zadržavanja i vremena zadržavanja
nezadržane supstance.
• Pik idealnog oblika ima izgled grafičkog prikaza zakona normalne raspodjele (Gaussova
kriva).

 µ = vrijeme zadržavanja
• σ = standardna devijacija
• σ2 = varijansa
• y = odrziv detektora u funkciji vremena x
• Idealno pikovi su opisani funkcijom vjerovatnoće:

Karakteristike krive normalne distribucije (Gaussova kriva)

Realni kromatogrami uglavnom odstupaju od Gaussove krive

Razlozi za odstupanje od
idealnog slučaja
• Nepravilnosti u
koncentraciji uzorka na
početku kolone nastale pri
nanošenju uzorka.
• Različita brzina mobilne
faze u sredini kolone i uz
zidove kolone.
• Difuzija analita u mobilnoj
fazi
• Otpor pri prelasku analita
iz stacionarne u mobilnu iz
mobilne u stacionarnu fazu.
Dva načina izračunavanja asimetrije pika
• Skewing faktor, “a” (prema USP), mjeri se na 10% visine od
bazne linije.
• Tailing faktor ili faktor simetrije, TF (prema Ph. Eur.)
mjeri se na 5% visine od bazne linije

Teoretski tavani
• Model teoretskih tavana služi za objašnjavanje kretanja supstanci kroz kolonu. Sam naziv je
preuzet iz teorije frakcione destilacije.
• Prema modelu teoretskih tavana, čitava dužina kolone L podijeljena je na male, uske
dijelove jednake širine H.
• U svakom od ovih dijelova koncentracija analita u mobilnoj fazi je u ravnoteži s
koncentracijom analita u stacionarnoj fazi.
• U svakom slijedećem uspostavljanju ravnoteže, supstanca putuje za dužinu kolone H što
odgovara visini teoretskog tavana.
Simulacija razdvajanja na osnovu teoretskih tavana

Kolona ima 30 teoretskih tavana, KA = 0,6; KB = 1,6; masa svake komponente 300 mg
Efikasnost kolone kao broj teoretskih tavana
• Kako supstanca putuje kroz kolonu, prostor u kojem se nalazi se stalno širi.
• Linearna disperzija koja se izražava kao varijansa σ2 na kraju kolone iznosi: σ2 = H.L.
• Broj teoretskih tavana u koloni dužine L iznosi: N=L/H.
 • Iz prethodno iznesenog se vidi da je odnosno
• Broj teoretskih tavana N je relativan parametar jer ovisi o vrsti analita i analitičkim uvjetima.
• Radi lakšeg izračunavanja broja teoretskih tavana koriste se slijedeći obrasci:

• Da bi se usporedila efikasnost dvije kolone, bolji rezultati se dobiju ako se koristi reducirano
vrijeme zadržavanja, pri čemu se izračuna efektivni broj teoretskih tavana:

• Za izračunavanje efikasnosti u gasnoj kromatografiji se često koristi i efektivna visina

teoretskog tavana:

• U kromatografiji gdje je mobilna faza tekućina, a čestice stacionarne faze imaju pravilan
sferni oblik sa dijametrom d, koristi se reducirana visina teoretskog tavana:

• Kolone koje imaju sličan odnos visine teoretskog tavana H i dijametra čestice d imaju slične
performanse.
Volumeni zadržavanja
• Volumen zadržavanja analita VR je volumen mobilne faze potreban da omogući kretanje
analita kroz kolonu, od momenta injiciranja, do momenta izlaska iz
kolone. F-brzina protoka mobilne faze
• Volumen pika Vpeak odgovara volumenu mobilne faze u kojem je
analit otopljen u momentu kad izlazi iz kolone.
• Mrtvi volumen VM je volumen mobilne faze u koloni

Faktor kapacitivnosti ili faktor zadržavanja, k’

• Kada se analit ukupne mase mT unese u kolonu, on se preraspodjeljuje između stacionarne i
mobilne faze. Masa analita u stacionarnoj fazi je mS, a u mobilnoj mM.
 • Odnos ovih masa je faktor kapacitivnosti k’ i ne mijenja se tokom eluiranja supstance s
kolone.

• Iako ostaje konstantan do kraja analize, k’ je ovisan o eksperimentalnim uvjetima.

• Pokazuje afinitet stacionarne faze prema analitu.
• Idealno bi trebao biti veći od 1 i manji od 5.
• Pošto je broj molekula analita n u stacionarnoj i mobilnoj fazi proporcionalan vremenu koje
analit provede u stacionarnoj i mobilnoj fazi, može se pisati:
• Odnosno
Faktor separacije, alfa
• Omogućava
uspoređivanje dva susjedna pika.
• Prema konvenciji α je uvijek veće od 1 jer
komponenta 1 eluira prije komponente 2.
Faktor rezolucije R
• Za kvantifikaciju razdvajanja dvije supstance bolje je koristiti faktor rezolucije R, jer za
razliku od a uzima u obzir širinu signala:

• Kombinacijom prethodnih obrazaca, rezolucija R se može izračunati i ovako:

Utjecaj širine signala na R

Za kvantitativnu analizu R mora biti najmanje 1,5 dok za kvalitativnu analizu mora biti 1 ili veći.
Utjecaj dužine kolone na R

Dvostruko povećanje dužine kolone povećava R za 1,41

Efikasnost separacije u ovisnosti o brzini mobilne faze (Van Deemterova jednačina)
• A = turbulentna difuzija (izražena u cm)
• B = longitudinalna difuzija (izražena u cm2/sekundi)
• C = otpor prelasku analita iz stacionarne u mobilnu i iz mobilne u
stacionarnu fazu (izražena u sekundama)
• ū - brzina protoka mobilne faze
Van Deemterova kriva

Optimalna brzina mobilne faze:

• Turbulentna difuzija A ovisi o veličini čestica dp i njihovoj uniformnosti λ. A=2λdp.

• Turbulentna difuzija je veoma mala u LC i ne postoji kod WCOT kapilarnih kolona.
• Longitudinalna molekulska difuzija ovisi o koeficijentu difuzije D i uniformnosti čestica
stacionarne faze λ. B = 2λD
 • Otpor prelasku analita iz stacionarne u mobilnu fazu i obratno, C, postaje dominantan kad je
brzina prevelika da se uspostavi ravnoteža. Ovisi o difuziji analita u stacionarnoj fazi (DS i u
mobilnoj fazi (DM). C=DS+DM
• Van Deemterova jednačina se u izvornom obliku uglavnom koristi za gasnu kromatografiju
na punjenim kolonama
Golay jednačina za kapilarne kolone u GC

CL je difuzija u tekućoj stacionarnoj fazi, CG je difuzija analita u mobilnoj gasovitoj fazi.

Knox-ova jednačina za tekućinsku kromatografiju