Pendahuluan
Generasi in vitro dari
pluripotent stem sel
organoid paru-paru
manusia
Abstrak
Terobosan baru dalam budaya organoid 3
dimensi (3D) untuk banyak sistem organ
telah menyebabkan model-model in vitro
fisiologis baru yang kompleks untuk
mempelajari perkembangan manusia dan
penyakit. Di sini, kami melaporkan
diferensiasi langkah-bijaksana sel punca
pluripoten manusia (hPSCs) (embrio dan
diinduksi) ke organoids paru-paru. Dengan
memanipulasi jalur sinyal perkembangan
hpscs menghasilkan sparoid depan
ventral-anterior, yang kemudian
berkembang menjadi organ paru manusia
(HLOs). HLO terdiri dari kompartemen
epitel dan mesenkimal paru-paru,
terorganisir dengan struktural fitur yang
mirip dengan paru-paru asli. HLO memiliki
epitel saluran napas atas dengan sel basal
dan sel-sel bersilia yang belum matang
dikelilingi oleh otot polos dan
miofibroblast serta alveolar-like domain
dengan jenis sel yang sesuai.
Menggunakan RNA-sequencing, kami
menunjukkan bahwa HLO sangat luar
biasa mirip dengan paru-paru janin
manusia berdasarkan profil
transkripsional global, yang menunjukkan
bahwa HLO adalah model yang sangat
baik untuk mempelajari perkembangan
paru-paru manusia, pematangan dan
penyakit.
Beberapa laporan telah menunjukkan
bahwa diferensiasi terarah dari sel induk
berpotensi majemuk (hPSCs), yang
mencakup sel induk embrio (hESCs) dan
induced (iPSCs), adalah salah satu yang
paling efisien pendekatan untuk mencapai
diferensiasi sel atau jaringan yang menarik
(D’Amour et al., 2005; Kroon et al., 2008;
Si-Tayeb et al., 2009; Spence et al., 2011;
Wong et al., 2012). Menggunakan
pendekatan ini, diferensiasi hPSCs ke garis
silsilah paru telah dicapai menggunakan
beragam metodologi dengan beragam
tingkat keberhasilan (Kadzik dan Morrisey,
2012; Longmire dkk., 2012; Mou et al.,
2012; Wong et al., 2012; Ghaedi dkk.,
2013; Huang et al., 2013; Firth et al.,
2014). Sejauh ini, sebagian besar upaya
untuk membedakan garis keturunan paru
dari hPSCs telah difokuskan pada
penggunaan Budaya monolayer 2 dimensi
(2D). Beberapa kemajuan terbaru dalam
menghasilkan 3 dimensi (3D) jaringan
seperti organ, yang disebut 'organoid',
telah dilaporkan (Meyer et al., 2011;
Spence et al., 2011; Nakano et al., 2012;
Takebe et al., 2013; Lancaster et al., 2013;
McCracken et al., 2014). Seperti 3D eLife
digest your behavior secara tradisional
telah dipelajari di lab dalam situasi dua
dimensi, di mana sel-sel tumbuh dalam
lapisan tipis di piring sel-budaya. Namun,
sebagian besar sel di tubuh ada di
dalamnya lingkungan tiga dimensi sebagai
bagian dari jaringan dan organ kompleks,
dan begitu peneliti telah mencoba untuk
menciptakan kembali lingkungan ini di lab.
Sampai saat ini, beberapa 'organoids'
semacam itu telah berhasil dihasilkan,
termasuk model usus manusia, perut, otak
dan hati. Organoids ini dapat meniru
respon dari jaringan nyata dan dapat
digunakan untuk menyelidiki bagaimana
organ bentuk, berubah dengan penyakit,
dan bagaimana mereka dapat menanggapi
terapi potensial. Di sini, Dye et al.
mengembangkan model tiga dimensi baru
dari paru-paru manusia dengan
membujuk manusia sel punca untuk
menjadi jenis sel tertentu yang kemudian
membentuk jaringan kompleks dalam
cawan petri. Untuk membuat organ-organ
paru-paru ini, Dye et al. memanipulasi
beberapa jalur pensinyalan yang
mengontrol pembentukan organ selama
perkembangan embrio hewan. Pertama,
sel-sel induk diinstruksikan untuk
membentuk sejenis jaringan yang disebut
endoderm, yang ditemukan pada embrio
awal dan menimbulkan paru-paru, hati
dan beberapa organ internal lainnya.
Kemudian, Dye et al. mengaktifkan dua
jalur perkembangan penting yang
diketahui untuk dibuat endoderm
membentuk jaringan usus tiga dimensi.
Namun, dengan menghambat dua kunci
lainnya jalur perkembangan pada saat
yang sama, endoderm menjadi jaringan
yang menyerupai awal paru-paru
ditemukan pada embrio saja. Jaringan
mirip paru-paru ini membentuk struktur
bola tiga dimensi saat berkembang.
Selanjutnya Tantangannya adalah
membuat struktur ini berkembang
menjadi jaringan paru-paru. Dye et al.
bekerja metode untuk lakukan ini, yang
melibatkan mengekspos sel-sel ke protein
tambahan yang terlibat dalam paru-paru
pengembangan. Organ paru-paru yang
dihasilkan bertahan dalam kultur
laboratorium selama lebih dari 100 hari
dan berkembang menjadi struktur yang
terorganisasi dengan baik yang
mengandung banyak jenis sel yang
ditemukan di paru-paru. Analisis lebih
lanjut mengungkapkan aktivitas gen di
organoids paru-paru menyerupai paru-
paru janin manusia yang sedang
berkembang, menunjukkan bahwa organ
paru-paru yang tumbuh di piringan tidak
sepenuhnya matang. Temuan Dye et al
memberikan pendekatan baru untuk
menciptakan organ paru-paru manusia
dalam budaya yang mungkin membuka
jalan baru untuk menyelidiki
perkembangan paru-paru dan penyakit.
model menawarkan beberapa
keunggulan; mereka sering memiliki
organisasi struktural yang mirip dengan
penduduk asli organ, jenis sel dari
berbagai lapisan kuman (misalnya,
mesoderm dan endoderm (Spence et al.,
2011; McCracken dkk., 2014; Wells and
Spence, 2014), dan beberapa garis
keturunan seluler, membuatnya model
fisiologis kompleks untuk mempelajari
proses perkembangan, homeostasis
jaringan dan kondisi patologis secara in
vitro. Pekerjaan sebelumnya telah
menunjukkan bahwa aktivasi FGF dan
sinyal WNT secara sinergis mendorong
CDX2 + komitmen garis usus dalam
endoderm yang diturunkan hpsc dan juga
mendorong 'morfogenesis dalam
hidangan ', di mana jaringan 2D mengatur
dirinya sendiri menjadi spheroids 3D yang
terdiri dari mesenchymal dan lapisan
epitel terpolarisasi yang terlepas dari
lapisan sel yang patuh (Spence et al.,
2011). Itu juga Telah ditunjukkan bahwa
penghambatan pensinyalan BMP dan
TGFβ mampu mendorong jaringan
menjadi SOX2 + garis keturunan foregut
(Green et al., 2011; McCracken et al.,
2014). Membangun studi-studi
sebelumnya, kami menunjukkan bahwa
stimulasi simultan WNT dan FGF signaling
sambil menghambat BMP / TGFβ jalur
pensinyalan dalam kultur endoderm hPSC
mencegah komitmen garis usus, dan
sebaliknya, nikmatkan nasib depan SOX2 +
anterior sementara juga dengan kuat
menghasilkan SOX2 + foregut anterior
Struktur spheroid 3D. Untuk lebih
membatasi spreoid foregut ke garis silsilah
paru, studi saat ini berfokus pada
memanipulasi FGF dan HH signaling. Di
mouse, level tinggi dari sinyal Fgf telah
terbukti menginduksi ekspresi Shh di
endoderm paru (Hebrok et al., 1998;
Morrisey dan Hogan, 2010; Rankin dan
Zorn, 2014) yang disertai dengan induksi
Nkx2.1 + progenitor paru-paru (Hebrok et
al., 1998; Serls, 2004). Kemudian sinyal
dari endoderm ke mesoderm, dan mutasi
pada Shh, Gli2 atau Gli3 menyebabkan
perkembangan paru yang terganggu,
dengan Gli2 / Gli3 double knockout tikus
menunjukkan agenesis paru (Bellusci et
al., 1997a; Motoyama et al., 1998; Li et al.,
2004). Kami hasil menunjukkan bahwa
FGF2 menginduksi NKX2.1, PAX8, dan SHH
dalam budaya endoderm foregut
manusia. Dengan menggunakan inhibitor
farmakologis FGF dan HH signaling kami
menunjukkan bahwa SHH diperlukan
untuk Ekspresi ekspresi NKX2.1 dari FGF2,
dan FGF2 juga menginduksi PAX8 secara
independen dari pensinyalan HH.
Observasi ini menunjukkan suatu
paradigma di mana kondisi FGFLo / HHHi
secara istimewa menginduksi Progenitor
paru PAX8Lo / NKX2.1Hi dan kondisi FGFHi
/ HHLo mendukung nasib PAX8Hi /
NKX2.1Lo. Diberikan bahwa Pax8
diperlukan untuk pengembangan tiroid,
kami fokus pada mendefinisikan kondisi
yang paling kuat menginduksi NKX2.1
sambil meminimalkan ekspresi PAX8
(Kimura et al., 1996; Mansouri et al.,
1998; Yuanet al., 2000; Vilain et al., 2001;
Li et al., 2004; Kusakabe et al., 2006; Carre
et al., 2009 ´; Narumi et al., 2012). Dengan
menerapkan kondisi HHHi selama
generasi spheroids foregut kami mampu
meningkatkan ekspresi NKX2.1 di
spheroids foregut dan kemudian
memperluas spheroids di media
mengandung FGF10, memungkinkan
mereka untuk tumbuh menjadi organoid.
Organoid bertahan dalam budaya selama
lebih dari 100 hari dan mengembangkan
struktur epitel saluran napas proksimal
seperti terorganisir dengan baik yang
mencakup banyak sel jenis yang
ditemukan di epitel paru proksimal,
termasuk sel basal dan bersilia bersama
dengan klub langka sel. Selain itu, struktur
saluran napas proksimal sering dikelilingi
oleh aktin otot polos (SMA) jaringan
mesenchymal positif. Organoid juga
memiliki sel epitel distal seperti yang
diekspresikan penanda progenitor, SFTPC
/ SOX9 dan HOPX / SOX9, konsisten
dengan alveolar bipoten awal sel
progenitor terlihat pada tikus (Desai et al.,
2014; Treutlein et al., 2014). Untuk
mendukung gagasan itu organoids
mungkin lebih mirip dengan paru-paru
berkembang dengan sel-sel progenitor
yang melimpah, kami menggunakan
RNAsequencing untuk membandingkan
profil transkripsi global organoids dengan
janin manusia dan dewasa paru-paru,
hESCs tidak terdiferensiasi dan endoderm
definitif. Analisis komponen utama,
hirarkis Pengelompokan dan korelasi
Spearman semuanya menunjukkan bahwa
organoids memiliki kesamaan yang
mencolok dengan manusia paru-paru
janin. Secara bersama-sama, data kami
menunjukkan sistem in vitro yang efisien
dan kuat untuk menghasilkan kompleks,
Organ paru manusia 3D yang belum
matang / janin di alam. Kami
mengantisipasi bahwa model ini akan
berfungsi sebagai model yang tak
tertandingi untuk studi pengembangan
paru-paru manusia, pematangan dan
penyakit.
Hasil
Diferensiasi hPSC menjadi spreoid depan
anterior Kami dan orang lain telah
melaporkan induksi endoderm manusia
yang efisien menggunakan ActivinA
(D’Amour et al., 2005; Zhang et al., 2010;
Spence et al., 2011), dan pembatasan
garis keturunan lebih lanjut ke SOX2 +
anterior foregut endoderm menggunakan
penghambatan pensinyalan BMP dan
TGFβ (Green et al., 2011; Loh et al., 2014).
Kami baru-baru ini menunjukkan bahwa
penghambatan BMP signaling selama
induksi garis keturunan usus dengan ligan
WNT dan FGF cukup untuk menghambat
CDX2 usus dan menginduksi SOX2 +
foregut posterior spheroids mampu
menimbulkan organoroid lambung
manusia (antral) (McCracken et al., 2014).
Diberikan bahwa paru-paru berasal dari
foregut anterior, kami berusaha untuk
menentukan kondisi untuk menghasilkan
ventral spheroids depan anterior. Untuk
melakukan ini, kami menguji apakah
penghambatan ganda BMP dan TGFβ
mampu anteriorisasi budaya, seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Green et al.,
2011). Kami memperlakukan hESC dengan
ActivinA (100 ng / ml) selama 4 hari untuk
menginduksi endoderm, diikuti oleh 4 hari
Noggin (NOG, 200 ng / ml) dan molekul
kecil TGFβ inhibitor, SB431542 (SB, 10
μM). Kami menegaskan bahwa kondisi ini
bisa untuk menginduksi mRNA dan
ekspresi protein yang kuat dari SOX2, yang
mengekspresikan penanda endodermal
FOXA2, sambil menekan penanda garis
usus usus CDX2 (Gambar 1A – C, Gambar
1 — gambar suplemen 1A). Analisis QRT-
PCR juga menunjukkan bahwa
dibandingkan dengan kontrol (di mana
endoderm adalah diinduksi tetapi tidak
terkena NOG / SB), paparan NOG / SB
anterior ventral kuat diinduksi foregut gen
NKX2.1 dan PAX8, sedangkan transkrip
foregut posterior, PDX1 dikurangi. HHEX,
yang diekspresikan dalam hati
berkembang, sistem empedu dan tiroid,
tetapi tidak ada pada paru primordium,
tetap tidak berubah (Gambar 1B).
Mengingat bahwa NKX2.1 diekspresikan di
paru-paru dan tiroid primordium, dan
PAX8 dinyatakan dalam primordium tiroid,
hasil ini menunjukkan bahwa 4 hari
Perawatan ActivinA diikuti oleh
pengobatan NOG / SB 4 hari bias budaya
menuju ventralanterior garis keturunan
foregut. Penambahan FGF4 plus WNT3A
(atau Chir99021, penghambat GSK3β yang
meningkatkan β-catenin bergantung pada
pensinyalan WNT) mempromosikan
komitmen garis usus CDX2 dan spheroid
3D pembentukan dalam kultur endoderm
(Spence et al., 2011; Xue et al., 2013;
Chen et al., 2014b). Berbasis pada hasil jaringan saraf dengan menambahkan NOG
kami pada Gambar 1B-C, kami / SB ke kultur hESC yang tidak diterapi
berhipotesis bahwa menggabungkan FGF, dengan ActivinA (Chambers et al., 2009).
Chir99021, NOG dan SB akan Dengan memeriksa induksi penanda
menghasilkan generasi SOX2 + ventral- neural NESTIN, SOX1, dan PAX6, kami
anterior foregut spheroids. Untuk menguji menegaskan bahwa transkrip ini sangat
ini, kami menghasilkan endoderm (4 hari diinduksi dalam budaya saraf NOG / SB
ACTA) dan tidak menambahkan faktor ganda, tetapi rendah dalam kultur
pertumbuhan (kontrol Endoderm) atau spheroid ventral foregut. Sebaliknya,
NOG, SB, FGF4, dan Chir99021 (NOG / SB / FOXA2, yang diekspresikan dalam foregut
F / Ch) (Gambar 1D). Penambahan (Monaghan et al., 1993; Ang dan Rossant,
keempat faktor menghasilkan generasi 3- 1994; D'Amour dkk., 2005, 2006; Kroon
dimensi SOX2 +, spheroids CDX2− dkk., 2008; Si-Tayeb et al., 2009;
(Gambar 1E, F). SOX2 + spheroids juga DeLaForest et al., 2011) dan dalam
menyatakan protein endodermal FOXA2, beberapa jaringan saraf (Stott et al.,
dan epitel, co-expressing E-Cadherin 2013), memiliki ekspresi yang tinggi di
(ECAD) (Gambar 1F, Gambar 1 — gambar ventral foregut spheroids, tetapi secara
tambahan 2). Selain SOX2, spheroids signifikan berkurang pada saraf NOG / SB
menunjukkan ekspresi mRNA yang lebih ganda kondisi (Gambar 1 — gambar
tinggi penanda garis depan foregut tambahan 4). Secara keseluruhan, hasil ini
anterior NKX2.1 dan PAX8 dibandingkan sangat menyarankan spheroids memang
dengan kontrol endoderm, menunjukkan foregut, dan bukan berasal dari saraf.
bahwa mereka adalah ventral-anterior
foregut spheroids (Gambar 1E),
bagaimanapun, imunofluoresensi
terungkap bahwa kadar protein NKX2.1
hanya di atas ambang deteksi (Gambar 1
— gambar 2). Spheroids juga memiliki
populasi kecil sel yang mesodermal di asal
pewarnaan positif Vimentin protein (VIM)
(Gambar 1 — gambar tambahan 3).
Diberikan bahwa jaringan saraf juga
mengekspresikan NKX2.1, PAX8, SOX2,
dan FOXA2, dan bahwa protokol induksi
saraf menggunakan dual BMP dan TGFβ
penghambatan, kami ingin mengecualikan
kemungkinan bahwa spheroids adalah
saraf di alam. Untuk melakukan ini, kami
menghasilkan kultur kontrol endoderm,
spheroids foregut (ActivinA diikuti oleh Gambar 1. Generasi spheroid anterior tiga
NOG / SB / F / Ch), dan menginduksi dimensi ventral depan dari endoderm
monolayers. (A) hESC dibedakan menjadi
foregut endoderm dengan
memperlakukan sel dengan 4 hari Activin
A (ACTA) diikuti oleh 4 hari NOG + SB. (B)
Foregut endoderm (NOG + SB) memiliki
ekspresi yang tinggi dari penanda foregut
SOX2 sementara marker hindgut CDX2
berkurang secara signifikan dibandingkan
dengan kontrol endoderm yang tidak
diobati (End). NOG + SB monolayers
memiliki ekspresi yang tinggi dari gen
foregut anterior ventral NKX2.1 dan PAX8
sementara posterior foregut marker PDX1
berkurang. Penanda foregut HHEX
diekspresikan dalam hati yang sedang
berkembang, sistem biliaris, dan tiroid dan
tetap tidak berubah. (C) Mayoritas sel di
NOG + SB diperlakukan budaya yang SOX2
positif (hijau) dibandingkan dengan
kontrol, di mana hanya sel yang tersebar
gugus SOX2 positif. Batang skala mewakili
200 μm. (D) hESC dibedakan menjadi
spreoid foregut dengan memperlakukan
sel dengan 4 hari ACTA dan kemudian
tambahan 4-6 hari NOG + SB + FGF4 + Ch.
Gambar perwakilan dari spheroid dalam
tetesan matrigel ditampilkan sebagai
gambar gunung utuh. Batang skala
mewakili 100 μm. (E) Foregut spheroids
(NOG + SB + FGF4 + Ch) memiliki ekspresi
yang tinggi dari penanda foregut SOX2
sementara marker hindgut CDX2
berkurang secara signifikan dibandingkan
dengan kontrol endoderm yang tidak
diobati (End) (panel atas). Spheroids
punya ekspresi yang tinggi dari gen
foregut anterior NKX2.1 dan PAX8
sementara marker foregut posterior PDX1
adalah Gambar 1. berlanjut pada halaman
berikutnya.
Banyak jalur pensinyalan penting untuk
induksi dan perkembangan paru (ditinjau
dalam Min et al., 1998; Weaver et al.,
2000; Morrisey dan Hogan, 2010; Rankin
dan Zorn, 2014). Tingkat FGF yang tinggi
signaling telah ditunjukkan untuk
menginduksi ekspresi Shh dan Nkx2.1 di
endoderm foregut pada tikus (Hebrok et
al., 1998; Serls, 2004); lebih lanjut, Gli2 / 3
nol embrio tikus gagal membentuk paru-
paru (Motoyama et al., 1998) dan
pensinyalan Hh penting untuk proliferasi
mesenkim paru secara in vivo (Bellusci et
al., 1997a). Data ini mengkonfirmasi
bahwa pensinyalan Fgf dan Hh sangat
penting untuk spesifikasi paru dan ligan
dari kedua jalur pensinyalan telah
diterapkan pada garis turunan paru-paru
hPSC dalam 2D budaya (Wong et al., 2012;
Huang et al., 2013). Dalam budaya kami,
kami telah melaporkan bahwa kira-kira
85–95% sel adalah endoderm, tetapi
sebagian sel yang tersisa mesodermal dan
berukuran kecil populasi mesodermal
dipertahankan di spheroids dan organoids
(Spence et al., 2011; McCracken dkk.,
2014) (Gambar 1 — gambar tambahan 3).
Oleh karena itu, berdasarkan mouse dan
hPSC studi, kami berhipotesis bahwa FGF
dan / atau HH signaling akan menginduksi
garis keturunan paru-paru NKX2.1 + di
endoderm depan anterior. Untuk menguji
hipotesis kami, kami awalnya berfokus
pada endoderm patuh budaya monolayer
untuk mengoptimalkan kondisi induksi.
Kultur diperlakukan selama 4 hari dengan
ActivinA diikuti oleh tambahan 4 hari
dengan NOG / SB (disebut sebagai
Foregut). Kontrol terdiri dari ActivinA
perawatan hanya diikuti oleh tidak ada
faktor pertumbuhan tambahan (kontrol
Endoderm), atau ActivinA diikuti oleh
NOG / SB, diikuti oleh tidak ada faktor
tambahan (kontrol Foregut). Semua
kelompok eksperimen adalah
dibandingkan dengan kontrol endoderm
dan foregut (Gambar 2). Kami pertama
menguji kemampuan FGF2 ke
menginduksi SHH, NKX2.1 dan PAX8
dengan mengekspos budaya foregut ke
konsentrasi FGF2 rendah dan tinggi (50,
500 ng / ml) (Gambar 2A). Kami
mengamati peningkatan yang bergantung
pada konsentrasi kuat pada SHH dan PAX8
mRNA ekspresi dibandingkan dengan
kontrol foregut atau endoderm, dan
peningkatan sederhana dari Ekspresi
NKX2.1 pada dosis tertinggi FGF2 (500 ng /
ml) (Gambar 2A). Kami juga mengamati
bahwa dual Penghambatan NOG / SB
dalam kultur endoderm menginduksi
ekspresi NKX2.1 dan PAX8 yang kuat
tanpa menambahkan FGF2 (Angka 1B,
2A). Dengan demikian, kami ingin
menentukan apakah ekspresi NKX2.1
dalam budaya foregut adalah karena FGF
endogen dan / atau pensinyalan HH.
Untuk menguji ini, kami menghambat
jalur FGF atau HH dengan molekul kecil
SU5402 (SU, 10 μm) dan Sant-2 (10 μm)
masing-masing (Gambar 2B – C).
Mengobati budaya foregut dengan
inhibitor FGF SU menyebabkan penurunan
PAX8 dan reduksi sederhana dalam SHH,
sementara ekspresi NKX2.1 tidak berubah
dibandingkan dengan kontrol foregut
(Gambar 2B). Sebaliknya, penghambatan
sinyal HH menyebabkan penurunan yang
signifikan dalam NKX2.1 ekspresi, tetapi
tidak PAX8 dibandingkan dengan foregut
yang tidak diobati. Ketika FGF2
ditambahkan ke budaya, kita mengamati
peningkatan sederhana dalam ekspresi
NKX2.1, dan ketika FGF ditambahkan
bersama dengan Sant-2, Ekspresi NKX2.1
berkurang secara signifikan (Gambar 2C).
Bersama-sama, hasil kami menunjukkan
hierarki di mana FGF berada di hulu SHH
dan PAX8, dan di mana SHH berada di
hulu NKX2.1. Untuk menguji apakah HH
signaling mampu menginduksi NKX2.1
dalam budaya foregut, kami
menambahkan agonis Smoothed, SAG (1
μM) untuk budaya foregut. Penambahan
SAG menginduksi peningkatan ekspresi
NKX2.1 sebesar 6,5 kali lipat di atas
kontrol foregut (Gambar 2D). Namun, SAG
sendiri tidak mengurangi ekspresi PAX8.
Berdasarkan hasil ini, kami selanjutnya
berhipotesis bahwa peningkatan HH
signaling akan menghasilkan
meningkatkan ekspresi NKX2.1 hilir FGF,
dan bahwa penghambatan FGF secara
bersamaan signaling akan mengurangi
ekspresi PAX8; oleh karena itu, kami
menghambat pensinyalan FGF endogen
dengan SU saat mengaktifkan HH dengan
SAG (Gambar 2D). Kombinasi ini
menyebabkan tambahan peningkatan
ekspresi NKX2.1 (21 kali lipat vs 6,5 kali
lipat dengan SAG saja, jika dibandingkan
dengan foregut) dan penurunan seiring
PAX8 mRNA (Gambar 2D). Yang penting,
imunofluoresensi adalah berkorelasi
dengan data QRT-PCR yang menunjukkan
peningkatan jumlah sel NKX2.1 + dengan
penambahan dari SAG saja. Budaya yang
diperlakukan SAG + SU menunjukkan
peningkatan lebih lanjut dalam jumlah
NKX2.1 mengekspresikan sel, dengan
∼77% dari semua sel mengekspresikan
NKX2.1 dibandingkan dengan ∼20% dalam
foregut kontrol, dan hampir tidak ada sel
mengekspresikan PAX8 (Gambar 2 -
gambar suplemen 1). SAG dan SAG+ Sel
yang diperlakukan dengan SU juga
mengekspresikan FOXA2 dan SOX2 yang
mengonfirmasi asal endodermalnya
(Gambar 1 — gambar suplemen 1).
Gambar 2. Induksi NKX2.1 di endoderm
foregut anterior dengan memodulasi FGF
dan HH signaling. (A) hESCs adalah
dibedakan menjadi endoderm (Akhir) atau
foregut anterior dengan NOG + SB
(Untuk). Foregut anterior diobati dengan
rendah (50 ng / ml) dan tinggi (500 ng /
ml) konsentrasi FGF2. FGF2 menyebabkan
peningkatan tergantung dosis pada SHH
dan PAX8 Ekspresi dengan sedikit
peningkatan ekspresi NKX2.1
dibandingkan dengan kontrol endoderm
yang tidak diobati. Perhatikan itu Ekspresi
NKX2.1 ditingkatkan oleh eksposur NOG +
SB saja (tidak ada FGF2). (B) Penambahan
inhibitor FGF SU5402 (SU) ke NOG + SB
foregut culture (Untuk) menyebabkan
pengurangan ekspresi SHH dan PAX8 yang
signifikan, tetapi NKX2.1, GLI1, dan PTCH1
tidak berbeda secara signifikan
dibandingkan dengan kontrol foregut, di
mana tidak ada faktor pertumbuhan
ditambahkan setelah SB + NOG. (C)
Penambahan inhibitor HH Sant-2
menyebabkan penurunan yang signifikan
dalam NKX2.1 dibandingkan kontrol
foregut. Demikian pula ketika FGF2 (500
ng / ml) dan Sant-2 ditambahkan secara
bersamaan, NKX2.1 sederhana induksi
yang disebabkan oleh FGF2 berkurang
secara signifikan sedangkan ekspresi PAX8
tetap tidak berubah. (D) Foregut
endoderm diobati dengan SAG atau SAG +
SU selama 8 hari memiliki peningkatan
ekspresi NKX2.1 sebesar 6,5 kali lipat dan
21 kali lipat, Gambar 2. melanjutkan pada
halaman berikutnya
HH-menginduksi spheroid foregut
menimbulkan organoids paru manusia
(HLOs)
Berdasarkan pengamatan yang
menstimulasi HH dan menghambat sinyal
FGF sangat meningkatkan NKX2.1 ekspresi
sambil mengurangi ekspresi PAX8
(Gambar 2), kami menguji beberapa
kondisi aktivasi HH dan penghambatan
FGF untuk menginduksi spheroid foregut
NKX2.1HI / PAX8LO (NOG / SB / F / Ch)
(diringkas dalam Gambar 3 — gambar
tambahan 1). Konsisten dengan peran
penting dari sinyal FGF dalam
pertumbuhan paru-paru dan
morfogenesis bercabang (Hebrok et al.,
1998; Min et al., 1998; Weaver et al.,
2000; Abler et al., 2009; Morrisey dan
Hogan, 2010; Rankin dan Zorn, 2014),
kami menemukan bahwa kondisi di mana
Penghambatan FGF digunakan
menyebabkan penurunan jaringan epitel
relatif terhadap jaringan mesenkim, yang
bisa karena hilangnya epitelium atau
pertumbuhan mesenkim yang berlebih; ini
menunjukkan bahwa endogen
Pensinyalan FGF diperlukan untuk
mempertahankan jaringan epitel dalam
budaya 3D (Gambar 3 — gambar
suplemen 2). Oleh karena itu, kami juga
menguji beberapa kondisi yang
menstimulasi pensinyalan HH
menggunakan SAG saja, tanpa
penghambatan FGF. Kami menemukan
bahwa metode yang paling efisien untuk
meningkatkan ekspresi NKX2.1 adalah
dengan menambahkan SAG selama fase
spheroid foregut (Gambar 3A).
Membandingkan spheroids foregut (NOG
/ SB / F / Ch) dengan yang diperlakukan
dengan SAG (NOG / SB / F / Ch / SAG),
kami mengamati substansial penurunan
ekspresi SOX2 dibandingkan dengan
spheroids NOG / SB / F / Ch dan
peningkatan yang signifikan dalam NKX2.1
mRNA. Selain itu, ekspresi protein NKX2.1
nuklir ditemukan di epitel ECAD + yang
menyatakan penanda epitel endodermal
FOXA2 dan SOX2 (Gambar 3B, C, Gambar
3 — gambar suplemen 3). Menariknya,
selama spesifikasi paru pada tikus, tabung
usus awalnya mengekspresikan Sox2
sepanjang endoderm, tetapi Sox2
diregulasi ke bawah di bidang paru-paru
selama spesifikasi paru-paru dan Induksi
Nkx2.1 (Hebrok et al., 1998; Serls, 2004;
Domyan et al., 2011). Dengan demikian,
downregulation secara bersamaan SOX2
dan peningkatan NKX2.1 yang diamati
pada SAG yang dirawat spheroids foregut
konsisten dengan perubahan transkripsi
awal yang terjadi selama spesifikasi paru
pada tikus. Kami juga mengamati sedikit
peningkatan, tetapi tidak signifikan dalam
tingkat transkrip PAX8 di NOG / SB / F / Ch
/ SAG diperlakukan foregut spheroids
(Gambar 3B). Yang penting, ekspresi
protein PAX8 adalah tidak terdeteksi
dalam NOG / SB / F / Ch / SAG
diperlakukan spheroids foregut dan
ekspresi tetap rendah / tidak terdeteksi
sepanjang waktu dalam budaya. (Gambar
3 — gambar tambahan 4). Mirip dengan
NOG / SB / F / Ch diperlakukan spheroids,
spheroids NOG / SB / F / Ch / SAG
diperlakukan memiliki umur populasi sel
dalam spheroids mesodermal di asal,
mengekspresikan Vimentin (VIM) (Gambar
3 — gambar tambahan 5). NOG / SB / F /
Ch / SAG diperlakukan spheroids foregut
tertanam di Matrigel untuk memberikan
pertumbuhan 3D lingkungan Hidup.
Spheroids dipertahankan di media basal
(lihat ‘Bahan dan metode’) ditambah
dengan 1% FBS kehilangan struktur epitel
ECAD + dan terutama terdiri dari
mesenkim dalam 20 hari setelah 3D
budaya (Gambar 3 — gambar tambahan
2D, E). FGF10 sangat penting untuk
morfogenesis bercabang dan
pemeliharaan sel progenitor paru selama
pengembangan serta homeostasis
jaringan di paru-paru dewasa (Bellusci et
al., 1997a; Min et al., 1998; Weaver et al.,
2000; Volckaert et al., 2013). Kita
mengamati bahwa penambahan FGF10
(500 ng / ml) memungkinkan spheroids
berkembang dan dilewatkan selama lebih
dari 100 hari. FGF10 mempromosikan
pemeliharaan ECAD + struktur epitel
dengan lebih sedikit kontribusi
mesenchymal dibandingkan dengan
kondisi inhibitor basal dan FGF (Gambar
3D). NOG / SB / F / Ch / SAG dikultur
selama 15 hari di FGF10 memiliki epitel
ECAD + melimpah yang menunjukkan
penanda paru-paru proksimal SOX2 dan
penanda paru-paru distal SOX9. SOX2 +
domain dan SOX9 + domain
didistribusikan ke seluruh HLO yang
ditentukan oleh seluruh gunung
immunofluorescence dan confocal Z-
sections. (Gambar 3 — gambar tambahan
6). FGF10 diobati spheroids foregut
mempertahankan ekspresi NKX2.1 seiring
waktu; Namun, konsisten dengan mouse
pengembangan, penanda progenitor
distal, NMYC dan ekspresi ID2 mRNA
menurun dari waktu ke waktu sementara
penanda sel Alveolar Tipe I dan II distal,
HOPX dan SFTPC meningkat dari waktu ke
waktu (Okubo, 2005; Rawlins et al., 2009)
(Gambar 3E). Data ini menunjukkan
bahwa HLO melewati suatu tahap
menyerupai perkembangan paru-paru
janin awal pada tikus.
Gambar 3. HH-induced ventral foregut
spheroids menimbulkan organoids paru-
paru. (A) hESCs dibedakan menjadi
spheroids foregut dengan memperlakukan
sel dengan 4 hari ACTA dan kemudian
tambahan 4-6 hari NOG + SB + FGF4 + Ch
dengan penambahan agonis HH SAG.
Perwakilan seluruh me-mount gambar
spheroids dalam tetesan matrigel
ditunjukkan pada rendah (kiri, skala bar
200 μm) dan pembesaran tinggi (kanan,
skala bar 100 μm). (B) Penambahan SAG
ke NOG + SB + FGF4 + Ch spheres
menyebabkan pengurangan transkrip
SOX2 dan CDX2 (panel atas) dan
peningkatan signifikan dari transkrip
NKX2.1 (panel bawah) dibandingkan
dengan NOG + SB + FGF4 + Ch spheres
(tanpa SAG). Garis keturunan foregut
lainnya (PAX8, PDX1, HHEX) tidak berbeda
secara signifikan ketika SAG berada
ditambahkan. (C) Mayoritas sel-sel di bola
NOG + SB + FGF4 + Ch + SAG
mengekspresikan protein FOXA2, SOX2
dan NKX2.1. Batang skala mewakili 50 μm.
Gambar 3. berlanjut pada halaman
berikutnya. (D) Garis waktu menunjukkan
NOG + SB + FGF4 + Ch + SAG menginduksi
spreoid foregut yang ditanam dan
dipertahankan dalam FGF10. Perhatikan
bahwa Hari 1 adalah hari spheroids
berlapis di Matrigel. Batang skala mewakili
100 μm. (E) Organoids mengekspresikan
penanda paru dengan cara yang konsisten
dengan perkembangan paru-paru tikus.
Semua ekspresi ditunjukkan relatif
terhadap sel induk berpotensi majemuk
yang tidak terdiferensiasi (hPSC), dan paru
manusia dewasa ditampilkan sebagai
referensi. Spoiler for progenitor paru-paru
NMYC dan ID2 sangat rendah pada paru
dewasa, dan diekspresikan pada tingkat
tinggi pada kultur organoid awal, tetapi
berkurang seiring waktu (D = Hari dalam
budaya), sedangkan ekspresi NKX2.1
relatif konstan. Sebaliknya, SFTPC
diketahui diekspresikan pada level rendah
pada progenitor paru distal, tetapi
meningkat dan sangat diekspresikan
dalam sel AECII. Secara konsisten, SFTPC
sangat diekspresikan pada paru-paru
manusia dewasa dan meningkat seiring
waktu dalam kultur organoid dan AECI
marker HOPX juga sangat diekspresikan
pada paru manusia dewasa dan
meningkat seiring waktu di organoid. * p
<0,05. Semua bar kesalahan mewakili SEM
HLO memiliki struktur seperti saluran
napas proksimal
HLO berbudaya lebih dari 2 bulan memiliki
struktur epitel yang mencolok menyerupai
saluran udara proksimal,
mengekspresikan penanda tipe-spesifik
sel proksimal, termasuk sel basal (P63), sel
bersilia (FOXJ1, ACTTUB) dan sel klub
(SCGB1A1) (Gambar 4). Jaringan saluran
napas proksimal sering dikelilingi oleh
otot polos aktin positif (SMA +)
kompartemen mesenkhi. Meskipun
ekspresi mRNA P63 dipertahankan di
seluruh budaya (Gambar 4A), hanya
dalam budaya yang berkepanjangan (> 2
bulan) di mana Sel P63 + secara spasial
diatur sepanjang sisi basal dari struktur
seperti tabung epitel, bersebelahan
dengan SMA + mesenkim, mirip dengan
bronkus dan bronkiolus manusia (Gambar
4B) (Boers et al., 1998; Nakajima dkk.,
1998; Evans et al., 2001; Rock et al.,
2009). Dengan 65 hari in vitro (D65)
seperti proksimal struktur epitel
membentuk struktur seperti kista yang
mengekspresikan P63, sebagaimana
ditentukan oleh seluruh gunung
pewarnaan immunofluorescence dan
confocal z-stack. Selain itu, ekspresi SMA
terkuat di pinggiran HLO (Gambar 4 -
gambar tambahan 1). P63 + sel proksimal
saluran nafas juga bekerja bersama SOX2
dan NKX2.1 sebagaimana ditentukan pada
bagian serial (Gambar 4 — gambar 2).
Terletak di permukaan luminal HLO
proksimal saluran napas-seperti struktur
adalah sel-sel mengekspresikan
multisiliatif faktor transkripsi sel FOXJ1
(Gambar 4B). Sangat sedikit sel yang
mengekspresikan penanda sel klub
SCGB1A1, dan protein ini diamati dalam
pola ekspresi ber-pixilated (Gambar 4D).
Multi-Ciliated dan mRNA khusus sel klub,
FOXJ1 dan SCGB1A1 berturut-turut
meningkat secara signifikan budaya HLO
berkepanjangan (Gambar 4A). Meskipun
penanda sel goblet ekspresi mRNA
MUC5AC adalah terdeteksi, ekspresi
protein tidak terdeteksi oleh
immunofluorescence (Gambar 4A dan
data tidak ditampilkan). Meskipun faktor
transkripsi sel bersilia ganda FOXJ1
melimpah di saluran napas proksimal
struktur, kami mengamati bahwa ACTTUB
dilokalisasi ke sisi apikal sel-sel ini, tetapi
tidak muncul dilokalisasi ke silia pada
permukaan sel apikal (Gambar 4C),
menunjukkan bahwa ini dapat mewakili
sel yang belum sepenuhnya
terdiferensiasi. Yang lain telah
menunjukkan bahwa diferensiasi yang
kuat dari multi-ciliated sel-sel dari hPSCs
membutuhkan modifikasi kondisi budaya
untuk mempromosikan diferensiasi tipe
sel fungsional (Firth et al., 2014). Dengan
demikian, ada kemungkinan bahwa
lingkungan HLO, seperti Matrigel atau
media kaya FGF10, tidak mempromosikan
diferensiasi terminal dari semua tipe sel.
Untuk mengubah HLO lingkungan, kami
menumbuhkan spheroids NOG / SB / F /
Ch / SAG foregut ke matriks paru-paru
manusia aseluler (Booth et al., 2012).
Spheroids unggulan pada irisan matriks
paru-paru acellular terutama
memunculkan struktur seperti saluran
napas proksimal di mana jumbai stereotip
dari struktur positif ACTTUB yang bersilia
pada permukaan apikal sel diamati
menghadap ke lumen. Di bagian serial,
saluran udara ini berlimpah Sel FOXJ1 +
(Gambar 4E). Dengan demikian, HLOs
memiliki kapasitas untuk menghasilkan
sel-sel bersilia lebih dewasa mengingat
stimulus atau lingkungan yang benar.
Seperti disebutkan, saluran proksimal
sering berhubungan erat dengan
mesenkim SMA + (Gambar 4B) sedangkan
pada paru-paru murine dewasa, saluran
udara proksimal juga terkait dengan
Pdgfrα + dan Vim + sel mesenchymal
(Boucherat et al., 2007; Hinz et al., 2007;
Chen et al., 2012). Dengan demikian, kami
menyelidiki populasi mesenkimal dalam
HLO secara lebih rinci.
Immunofluorescence mengungkapkan
bahwa D65 HLOs memiliki PDGFRα + /
VIM + double positif dan Populasi sel
PDGFRα− / VIM +, yang merupakan
indikasi myofibroblast dan fibroblast
masing-masing (Gambar 5A).
Miofibroblast dewasa murine juga
mengekspresikan Sma dan Pdgfrα
sedangkan otot polos yang terdiferensiasi
adalah Sma + / Pdgfra− (Leslie et al., 1990;
Low dan White, 1998; Boucherat et al.,
2007; Hinz et al., 2007; Chen et al., 2012),
dan kami mengamati PDGFRα + / SMA +
dan PDGFRα− / SMA + populasi sel yang
menunjukkan bahwa HLO memiliki
myofibroblasts dan sel otot polos
(Gambar 5B). The HLOs tidak menodai
positif untuk Safranin O yang
menunjukkan di sana tidak ada jaringan
kartilago, sedangkan teratoma iPSC
berasal memiliki tulang rawan yang
melimpah (Gambar 5C). Secara bersama-
sama, populasi mesenkimal HLO beragam
dengan miofibroblas, fibroblast, dan sel
otot polos.
HLO memiliki struktur seperti saluran
napas alveolar yang belum matang
Epitel paru-paru distal pada tikus dan
manusia membentuk alveoli gas-tukar,
yang terdiri dari sel epitel tipe alveolar
tipe I dan tipe II (AECI, AECII). Selama
perkembangan, paru-paru bagian distal
epitel mengungkapkan penanda
progenitor termasuk SOX9, ID2, dan
NMYC (Okubo, 2005; Rawlins et al., 2009;
Chang et al., 2013; Rockich et al., 2013).
Semua penanda distal hadir di HLO;
Namun, ID2 dan NMYC diekspresikan
pada tingkat tinggi dalam budaya awal,
tetapi diatur di bawah berkepanjangan
budaya (Gambar 3F) sementara ekspresi
SOX9 tetap konsisten sepanjang waktu
dalam budaya (Gambar 6A). Baru-baru ini,
ada kemajuan besar pada tikus ke arah
mendefinisikan nenek moyang alveolar
bipoten populasi selama periode akhir
janin / awal neonatal (Desai et al., 2014;
Treutlein et al., 2014), dan pekerjaan ini
telah menyoroti fakta bahwa banyak
penanda yang sebelumnya dianggap
diferensiasi terminal penanda-penanda
diekspresikan bersama dalam progenitor
bipoten. Secara khusus, penanda AECII
SftpC dan AECI marker Hopx dapat
diekspresikan dalam nenek moyang
bipotent sebelum berkomitmen pada satu
garis keturunan atau yang lainnya. Selain
itu, kami telah menunjukkan bahwa Sox9
menandai populasi nenek moyang awal di
mengembangkan paru-paru tikus dan
Sox9 juga menandai nenek moyang
bipoten pada kehidupan janin akhir
(Rockich et al., 2013; Treutlein et al.,
2014). Dalam HLO yang tumbuh dalam
budaya yang berkepanjangan (> 2 bulan),
kami mengamati hal itu Penanda jenis sel
AECII (SFTPC, SFTPB) dan AECI (PDPN,
HOPX) hadir (Gambar 6A-B). Namun, kami
juga mengamati bahwa tingkat SFTPC
sangat rendah (Gambar 3F), dan bahwa
sel SFTPB + adalah
langka (Gambar 6B). Hal ini menunjukkan
bahwa sel-sel saluran napas bagian distal
yang ada di HLO mungkin seperti
progenitor populasi. Untuk menguji
kemungkinan ini, kami menggabungkan
SFTPC (AECII) atau HOPX (AECI) dengan
SOX9 dan menemukan berlimpah SFTPC /
SOX9 dan HOPX / SOX9 sel-sel positif
ganda (Gambar 6B). Mewarnai bersama
secara serial bagian menunjukkan bahwa
SFTPC / SOX9 sel-sel positif ganda juga
NKX2.1 + (Gambar 6-angka suplemen 1).
Sebaliknya sel co-expressing ini tidak
ditemukan pada paru manusia dewasa
(Gambar 6C). Meskipun jarang, beberapa
SFTPB + yang diamati pada HLO
menyerupai sel AECII yang terlihat pada
orang dewasa sel paru-paru manusia, dan
PDPN + menyerupai sel AECI memanjang
di paru-paru manusia (Gambar 6B-C).
Untuk meningkatkan kepercayaan bahwa
sel-sel yang mengekspresikan penanda
AECII adalah sel AECII, kami menggunakan
transmisi electron microscopy (TEM)
untuk menentukan apakah HLO memiliki
sel yang mengandung pipih tubuh, yang
diperlukan untuk perdagangan protein
dan sekresi surfaktan (Schmitz dan Muller,
¨ 1991; Stahlman et al., 2000; Weaver et
al., 2002). Menggunakan TEM, kami
mengamati tubuh lamelar baik di sel-sel
dalam HLO, dan di ruang terbuka antar
sel, menunjukkan bahwa tubuh lamelar
sedang disekresikan (Gambar 6D). Secara
bersama-sama, data kami menunjukkan
bahwa HLO sebagian besar memiliki sel-
sel progenitor alveolar yang tidak
berdiferensiasi dengan sel AECI dan AECII
yang terdiferensiasi yang berbeda diselingi
di seluruh jaringan seperti distal.
Gambar 4. Organisme paru membentuk
struktur mirip saluran napas proksimal. (A)
Gen yang diekspresikan di saluran
proksimal adalah diperiksa di organoids
sepanjang waktu. Proximal airway spidol
SOX2 menurun seiring waktu dalam
budaya HLOs dibandingkan dengan HLO
D10. Dibandingkan dengan hPSC yang
tidak terdiferensiasi, organoids
mengekspresikan level tinggi dari sel basal
marker P63 di semua titik waktu,
sementara ekspresi penanda sel klub
SCGB1A1 dan spidol sel bersilia FOXJ1.
Lanjutan meningkat secara signifikan
dalam budaya yang berkepanjangan
(dibandingkan dengan D10 HLOs). Ada
peningkatan tetapi tidak signifikan tren
dalam ekspresi MUC5AC sel goblet dari
waktu ke waktu dalam budaya. (B) D65
HLO memiliki struktur yang menyerupai
proksimal saluran napas, di mana
epitelium (β-catenin, merah) memiliki sel
basal P63 + (hijau), dan dikelilingi oleh
SMA + (putih, atas dan bawah panel kiri)
jaringan mesenchymal. Berdampingan
dengan lapisan sel basal positif P63 (hijau,
rendah, panel kanan) adalah sel-sel positif
FOXJ1 (putih). Batang skala mewakili 50
μM (atas) dan 10 μM (bawah). (C)
Proksimal epitel yang menyerupai airway
(β-catenin, hijau) terkilir bersama untuk
ACTTUB pada sisi apikal sel (merah).
Batang skala mewakili 50 μM (atas) dan
10 μM (bawah). (D). Epitel seperti saluran
napas (E-cadherin, red) proksimal juga
diwarnai bersama Penanda sel klub CC10
(putih, panel kanan). Batang skala
mewakili 50 μM (atas) dan 10 μM
(bawah). (E) manusia Acellular Matriks
paru-paru diunggulkan dengan spheroids
dan dibiakkan selama 40 hari (D40).
Matriks memiliki aliran udara proksimal
yang berlimpah struktur yang memiliki sel
multi-sili pada permukaan apikal yang
diberi label oleh ACTTUB (merah, panel
atas) dalam keadaan rendah (batang skala
50 μM) dan pembesaran tinggi (skala bar
10 μM). Bagian serial menunjukkan bahwa
sel-sel juga FOXJ1 positif (putih, panel
bawah) dengan epitel yang digariskan
dalam ECAD (hijau) di rendah (skala bar 50
μM) dan pembesaran tinggi (skala bar 10
μM). (B – D) ‘L’ dalam gambar
pembesaran tinggi menunjukkan lumen. *
p <0,05. Semua bar kesalahan mewakili
SEM.
Penilaian kuantitatif komposisi HLO
Kami telah menunjukkan bahwa HLO
memiliki epitel seperti proximal dan distal
seperti di samping jaringan mesenkim
sekitarnya. Untuk lebih baik mengukur
komposisi HLO, kami melakukan analisis
kuantitatif kuantitatif jenis dan struktur
sel. Kami membagi 48 individu HLO, dan
memeriksa mereka untuk P63 + struktur
seperti saluran napas proksimal (seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 4B-D), dan
saluran napas distal seperti struktur
(seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6
— gambar tambahan 1). Kami
menemukan bahwa 39/48 (81%) dari
HLOs memiliki struktur epitel saluran
napas proksimal, sementara 48/48 (100%)
dari HLO memiliki saluran napas distal
seperti struktur (Gambar 7A). Kami
kemudian menghitung luas penampang
rata-rata terdiri dari P63+ jaringan yang
menyerupai saluran napas proksimal dan
P63− / SFTPC + distal dan menemukan
bahwa struktur proksimal terdiri 14,5% (±
0,6%) dari seluruh area HLO, sedangkan
85,5% (± 0,6%) bersifat distal di alam
(termasuk epitel dan mesenkim) (Gambar
7B). Untuk menentukan persentase sel
tertentu jenis dalam HLO, kami membagi
dan menodai 15 HLO individual (n = 15)
dan menghitung sel positif untuk penanda
khusus, dan jumlah total nuklei Dapi +
dalam suatu bagian (Gambar 7C – G).
Rata-rata, 57% dari semua sel di HLOs
adalah NKX2.1 + (Gambar 7C), 39% dari
semua sel adalah P63 +, 3% adalah FOXJ1
+, 5% adalah SFTPC +, dan 4% dari semua
sel adalah HOPX + (Gambar 7D-G).
Gambar 5. Organ-organ paru memiliki
banyak jenis sel mesenkimal. (A) D65 HLO
memiliki PDGFRα + (hijau) VIM + (putih)
myofibroblas ganda positif dan fibroblas
PDGFRα− / VIM +. Skala bar mewakili 50
μm. (B) D65 HLOs juga memiliki PDGFRα +
(hijau) SMA + (putih) double-positif
myofibroblasts dan PDGFRα− / SMA +
halus otot dan myofibrblast. Skala bar
mewakili 50 μm. (C) D65 HLOs tidak
mengandung kartilago mana pun positif
kontrol teratoma yang berasal dari iPSC
memiliki pewarnaan Safranin O yang jelas
khusus untuk kartilago. Hijau cepat
menandai sitoplasma dan hematoxylin inti
dari kedua jaringan. Batang skala mewakili
100 μm.
HLO secara global mirip dengan paru-
paru janin manusia
Mengumpulkan bukti menunjukkan
bahwa HLO tidak dewasa. Misalnya,
penanda progenitor distal awalnya
dinyatakan kuat sedangkan ekspresi SFTPC
sangat rendah sepanjang waktu dalam
HLOs (Gambar 3E), Sel FOXJ1 + tampaknya
tidak membentuk struktur multi-sila
matang sampai ditempatkan ke
dekelluarized matriks paru-paru (Gambar
4B, E) dan sel SCGB1A1 + langka tidak
menyerupai sel-sel klub dewasa (Gambar
4D). Selain itu, sebagian besar epitel
seperti distal mengekspresikan penanda
bipolar progenitor (Gambar 5). Untuk
langsung mengatasi kematangan HLO,
kami melakukan RNA-sequencing
(RNAseq) pada HLOs (n = 6; 3 D65 HLOs, 3
D110 HLOs), pada hESC yang tidak
terdiferensiasi dan pada endoderm
definitif. Kami juga memanfaatkan dataset
RNAseq yang tersedia untuk paru-paru
janin manusia yang mewakili berbagai
tahap gestasional, dan untuk paru-paru
manusia dewasa (file Tambahan 1). Untuk
menentukan global kesamaan antara
jaringan-jaringan ini relatif terhadap HLOs,
kami melakukan analisis komponen utama
(PC) (Gambar 8A, B) (Ringner, 2008 ´),
pengelompokan hierarkis (Gambar 8C)
(Eisen et al., 1998) dan Spearman korelasi
rank-order (Jiang et al., 2004) analisis
matriks (Gambar 8D) dari tabulasi lengkap
Matriks FPKM dihasilkan dari dataset
rangkaian RNA dan mewakili ekspresi gen
total melengkapi dalam setiap sampel.
Konsisten di semua tiga jenis analisis
informatika, transkripsi aktivitas di HLOs
memiliki tingkat kemiripan terbesar
dengan paru-paru janin manusia. Data ini
sangat kuat menunjukkan bahwa
transkripsi global HLO sangat mirip
dengan paru-paru janin manusia, dan
mendukung ide tersebut bahwa HLO
berada dalam keadaan janin yang kurang
terdiferensiasi ketika tumbuh dalam
kondisi yang dijelaskan di sini.

Gambar 6. Organ-organ paru memiliki sel-
sel progenitor bipotent distal yang
melimpah. (A) Ekspresi distal penanda
progenitor SOX9 tetap tidak berubah dari
waktu ke waktu dan ekspresi penanda
AECI PDPN rendah di HLO budaya. (B)
Mayoritas sel SFTPC + (hijau, panel kiri)
diekspresikan bersama SOX9 (merah).
Sama halnya dengan banyak sel
mengekspresikan penanda awal AECI
HOPX + (hijau, panel kanan) bersama-
diekspresikan SOX9 (merah). Sedikit, sel-
sel yang tersebar mengungkapkan AECII
marker SFTPB (putih, panel kedua) atau
penanda AECI, PDPN (panel ketiga, putih).
Beberapa Sel PDPN + juga menunjukkan
morfologi skuamosa memanjang yang
terlihat pada paru-paru dewasa. (C) Sel
AECII paru manusia berlabel SFTPC (hijau,
panel kiri) tidak co-express SOX9. SFTPB +
sel (putih, panel kedua) pada dewasa paru
manusia memiliki morfologi yang mirip
dengan sel SFTPB + di HLOs. Sel AECI paru
manusia mengekspresikan PDPN (putih,
ketiga panel), dan menunjukkan bentuk
sel AECI yang khas. Sel AECI manusia
mengekspresikan HOPX (hijau, panel
kanan), tetapi tidak co-express SOX9. (B –
C) Skala bar dalam gambar pembesaran
rendah di B (panel atas) mewakili 50 μM
dan skala bar pada gambar pembesaran
yang lebih tinggi dalam B, C (panel bawah)
mewakili 10 μM. (D) D50 HLO
mengandung badan pipih yang
merupakan organel khusus untuk sel
AECII. Batang skala mewakili 500 nm.
Pembahasan
Sampai saat ini, sejumlah kelompok telah
menetapkan metode untuk menghasilkan
jenis sel paru-paru spesifik menggunakan
2D sistem budaya (Green et al., 2011;
Longmire dkk., 2012; Mou dkk., 2012;
Wong et al., 2012; Ghaedi et al., 2013;
Huang et al., 2013). Meskipun sel-sel garis
keturunan paru-paru telah dihasilkan
dengan berbagai efisiensi (∼30–80%
NKX2.1 + sel [Wong et al., 2012; Huang et
al., 2013; Firth et al., 2014]) dan dapat
menghasilkan keduanya proksimal (∼5–
36% sel [Wong et al., 2012; Huang dkk.
2013; Firth et al., 2014]) dan jenis sel
distal (hingga 50% sel [Huang et al.,
2013]), organisasi spasial yang tepat dari
jenis sel dan Morfologi jaringan spesifik
belum dilaporkan dalam sistem 2D. Di sini,
kami menunjukkan bahwa HLO memiliki
keduanya mesenchymal dan paru-paru
epitel (∼60% NKX2.1 +) sel dengan
struktur seperti saluran napas proksimal
yang memiliki Sel P63 + (∼40%) dan FOXJ1
+ (∼3%) bersama dengan struktur seperti
saluran napas bagian distal yang memiliki
SFTPC + (∼5%) dan HOPX + (∼4%) sel. Saat
ini tidak jelas apakah sistem budaya 2D
yang dijelaskan memiliki kemampuan
untuk menimbulkan mesodermal garis
keturunan. Dengan demikian, HLO
memungkinkan seseorang untuk
menjawab pertanyaan mengenai
organisasi jaringan spasial dan interaksi
epitel-mesenkimal. Karena HLO
membentuk struktur terorganisir yang
menyerupai bronchi dan bronkiolus
dengan mesenkim yang berdekatan,
jaringan rumit yang terorganisir ini
memungkinkan eksplorasi, untuk contoh,
renovasi saluran napas setelah cedera.
Apalagi penataan ruang dari tipe sel
tertentu akan sangat penting untuk
mempelajari dinamika jalan napas
proksimal selama homeostasis dan
cedera. Misalnya, lokasi sel P63 + yang
berdekatan dengan sel FOXJ1 + di HLOs
akan diperlukan untuk mempelajari sel
basal diferensiasi ke dalam jenis sel napas
proksimal yang berbeda selama
homeostasis atau setelah cedera. Sebagai
tambahan Untuk morfologi jaringan dan
struktur selama kultur yang
berkepanjangan, HLO terdiri dari kedua
epitelium dan mesenkim dalam budaya
awal yang dipertahankan dari waktu ke
waktu. Karena pengembangan paru
membutuhkan pembicaraan silang yang
luas antara epitel dan mesenkim untuk
mengatur perkembangan proses,
proliferasi dan diferensiasi, HLOs mungkin
merupakan sistem in vitro yang ideal
untuk mempelajarinya interaksi jaringan-
jaringan yang kompleks. Baru-baru ini, ada
dorongan untuk menentukan populasi
progenitor selama perkembangan paru-
paru dan homeostasis dewasa untuk lebih
memahami diferensiasi dan transisi antara
percabangan dan alveolarisasi. Dua
kelompok telah mendefinisikan populasi
leluhur bipoten di embrionik / paru-paru
neonatal yang menimbulkan baik sel AECI
dan AECII (Desai et al., 2014; Treutlein et
al., 2014). Sel-sel bipoten ini
mengekspresikan penanda progenitor
distal Sox9 bersama dengan penanda
diferensiasi Sel AECI dan AECII, termasuk
SftpC, HopX, dan Pdpn. Kami
menunjukkan bahwa HLOs menyatakan
keduanya Penanda AECI dan II; Namun,
sebagian besar sel-sel ini juga menyatakan
SOX9 menunjukkan bahwa Sebagian besar
epitelium distal terdiri dari progenitor
bipoten. Dengan demikian, HLO akan
memungkinkan kita untuk
memperolehnya wawasan tentang
populasi bipoten ini, telusuri bagaimana
progenitor bipoten diatur, dan tentukan
mekanisme bagaimana keputusan nasib
dibuat ketika diferensiasi terminal terjadi.
Bukti-bukti yang mendukung bahwa HLOs
bersifat janin dapat mencerminkan fakta
bahwa satu blok penuh pematangan ada
in vitro, seperti halnya dengan organageis
garis endoderm lainnya (usus dan
lambung), yang tampaknya belum
matang. Artinya, sementara mereka
memiliki sel khusus garis keturunan
tertentu jenis, sel mungkin tidak
menunjukkan fungsi dewasa seperti
dewasa (McCracken et al., 2014; Watson
et al., 2014). Ini juga merupakan kasus
untuk sel mirip β pankreas dan sel mirip
hepatosit yang dihasilkan in vitro (Si-
Tayeb et al., 2009; Hrvatin et al., 2014).
Atau, negara bagian nenek moyang
mungkin mencerminkan tingginya tingkat
FGF10 dalam media kultur, karena FGF10
dikenal untuk mempertahankan sel
progenitor di paru-paru (Ramasamy et al.,
2007; Nyeng et al., 2008). Mengingat
bahwa HLO mirip dengan paru-paru janin
manusia, ini jaringan adalah model yang
ideal untuk mempelajari pematangan
paru dari kedua epitel proksimal dan distal
bersama interaksi epitel-mesenkimal
dalam konteks perkembangan. Sementara
komposisi multi-garis, multi-seluler HLOs
adalah keuntungan utama, salah satunya
peringatan untuk sistem ini adalah bahwa
HLOs tidak muncul untuk menjalani
morfogenesis bercabang bona fide atau
memiliki zona transisional yang ditemukan
di paru-paru dewasa, seperti sambungan
duktal bronchioalveolar (BADJ). The HLOs
memiliki proximal SOX2 + domain dan
SOX9 distal + domain yang diamati selama
percabangan Morfogenesis, tetapi
regionalisasi ini terjadi tanpa menyiapkan
pola bercabang yang stereotip. Ini
mungkin karena fakta bahwa organoids
dikelilingi oleh media yang dilengkapi
dengan FGF10 dibandingkan dengan
situasi in vivo di mana FGF10
diekspresikan secara dinamis, spasial
terbatas di mesenkim distal (Bellusci et al.,
1997b; Nyeng et al., 2008; Abler et al.,
2009). Namun, itu baru-baru ini
menunjukkan bahwa ekspresi lokal FGF10
tidak diperlukan untuk percabangan
(Volckaert et al., 2013), jadi ini mungkin
tidak menjelaskan kurangnya
percabangan. Atau, mirip dengan yang
lain model organoid endoderm, HLO tidak
memiliki beberapa komponen dari organ
asli, termasuk sel imun, pembuluh darah,
dan persarafan. Dengan demikian, ada
kemungkinan bahwa input seluler penting
untuk morfogenesis bercabang hilang dari
HLOs. Memang, laporan terbaru
menunjukkan bahwa persarafan
diperlukan untuk percabangan yang tepat
(Bower et al., 2014), dan sementara
vaskulatur mungkin tidak penting untuk
paru-paru bercabang (Havrilak dan
Shannon, 2015), yang lain telah
menunjukkan endotelium vaskular
diperlukan untuk menginduksi program
bercabang dari epitel saluran napas
terisolasi dalam budaya 3D (Franzdottir ´
et al., 2010). Terakhir, lingkungan mikro
sangat penting untuk morfogenesis
bercabang terjadi termasuk perubahan
dinamis dalam matriks ekstraseluler di
sekitar ujung tunas pucuk paru-paru di
mana ECM terus berubah dan berinteraksi
dengan sitoskeleton epitelium bercabang
untuk memfasilitasi pergerakan sel dan
percabangan percabangan (Moore et al.,
2005; Kim dan Nelson, 2012; Wan et al.,
2013). Ada kemungkinan bahwa di masa
depan, ko-budaya dengan input seluler
tambahan mungkin terbukti
meningkatkan percabangan HLO. Secara
bersama-sama, kami uraikan di sini
sebuah sistem baru untuk menghasilkan
organ paru-paru manusia dari manusia sel
induk berpotensi majemuk. HLO memiliki
garis keturunan mesenkim dan epitel,
serta terorganisir struktur saluran napas
proksimal dengan banyak tipe sel dan
dikelilingi oleh mesenkim. HLO juga
memiliki sel-sel epitel distal yang
mengingatkan pada sel progenitor
alveolar bipoten baru-baru ini dijelaskan
pada tikus yang kemungkinan merupakan
cerminan dari kesamaan HLO pada paru
janin manusia. Kita percaya bahwa HLO
akan menjadi sistem manusia baru yang
sangat baik untuk model diferensiasi paru-
paru, homeostasis dan penyakit in vitro.
Bahan dan metode
Pemeliharaan hESC Advanced DMEM / F12 ditambah
suplemen N-2 dan B27, 10 mM Hepes, 1 ×
Garis sel ES manusia H1 (NIH registry #
L-Glutamine (200 mM), 1 × Penicillin-
0043) dan H9 (NIH registry # 0062)
streptomisin (5000 U / ml, semua dari Life
diperoleh dari WiCell Institusi penelitian.
Technologies) dengan 200 ng / ml Noggin
Garis ES manusia UM77-2 (NIH registry #
(NOG, R & D Systems) dan 10 μM
0278) diperoleh dari Universitas Indonesia
SB431542 (SB, Stemgent, Cambridge, MA)
Michigan. Jalur iPSC 3-5 dan 20-1
selama 4 hari. Untuk perawatan jangka
dihasilkan di Rumah Sakit Anak-anak
panjang, budaya simpan dalam media
Cincinnati dan telah dijelaskan
‘basal’ sebelum tanpa NOG dan SB, atau di
sebelumnya (Spence et al., 2011). Stem
hadapan faktor-faktor pertumbuhan
cell dipertahankan pada Matrigel (BD
termasuk 50, 500 ng / ml FGF2 (sistem R &
Biosciences, San Jose, CA) dalam medium
D), 10 μM Sant-2 (Stemgent), 10 μM
mTeSR1 (STEMCELL Technologies,
SU5402 (SU, Stemgent), 100 ng / ml SHH
Vancouver, Canada). HESCs adalah
(sistem R & D), dan SAG (Enzo Life
dilewatkan seperti yang dijelaskan
Sciences, Farmingdale, NY) selama 8 hari.
sebelumnya (Spence et al., 2011).
Diferensiasi diarahkan ke spheroid depan
Diferensiasi PSC menjadi endoderm
anterior dan paru-paru organoids
definitif
Setelah diferensiasi menjadi endoderm
Diferensiasi menjadi endoderm definitif
definitif, sel diinkubasi dalam media
dilakukan seperti yang dijelaskan
foregut dengan NOG, SB, 500 ng / ml FGF4
sebelumnya (D’Amour et al.,2005; Spence
(Sistem R & D), dan 2 μM CHIR99021
et al., 2011). Secara singkat, 4-hari Activin
(Chiron, Stemgent) selama 4-6 hari.
A (R & D sistem, Minneapolis, MN)
Setelah 4 hari dengan pengobatan faktor
diferensiasi protokol digunakan. Sel
pertumbuhan, spheroids mengambang
diobati dengan Activin A (100 ng ml − 1)
tiga dimensi hadir dalam budaya.
selama 3 hari berturut-turut dalam RPMI
Spheroids tiga dimensi dipindahkan ke
1640 media (Life Technologies, Grand
Matrigel untuk mendukung pertumbuhan
Island, NY) dengan peningkatan
3D seperti sebelumnya dijelaskan
konsentrasi 0%, 0,2%, dan 2% HyClone
(McCracken et al., 2011). Secara singkat,
mendefinisikan serum janin bovine (dFBS,
spheroids tertanam dalam tetesan
Thermo Scientific, West Palm Beach, FL).
Matrigel (BD Bioscience # 356237) dalam
Diferensiasi endoderm definitif menjadi satu sumur dari 24 piring, dan diinkubasi
foregut anterior pada suhu kamar selama 10 menit.
Setelah Matrigel dipadatkan, foregut
Setelah diferensiasi menjadi endoderm media dengan 1% serum fetal bovine (FBS,
definitif, foregut endoderm dibedakan, CAT #: 16000–044, Life) Teknologi) atau
pada dasarnya sebagai dijelaskan (Green faktor pertumbuhan lain dan molekul kecil
et al., 2011). Secara singkat, sel-sel dilapis dan diganti setiap 4 hari. Organoid
diinkubasi dalam media foregut:
dipindahkan ke tetesan Matrigel baru
setiap 10–15 hari.
Imunohistokimia
Immunostaining dilakukan seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Spence et al.,
2009; Rockich et al., 2013). Informasi
antibodi dan pengenceran dapat
ditemukan di file Tambahan 2. Semua
gambar diambil mikroskop confocal Nikon
A1 atau mikroskop Olympus IX71
epiflorescent.
Ekstraksi RNA dan qRT-PCR
RNA diekstrak dari monolayers, spheroids,
dan organoids menggunakan Isolasi Total
RNA MagMAX-96 Kit (Life Technologies)
dan MAG Max Express (Terapan
Biosystems, Grand Island, NY). Kuantitas
RNA dan kualitas ditentukan secara
spektrofotometri, menggunakan Nano
Drop 2000 (Thermoscientific).
Membalikkan transkripsi dilakukan
menggunakan kit SuperScript VILO
(Invitrogen, Grand Island, NY), menurut
protokol produsen. Akhirnya, qRT-PCR
dilakukan menggunakan Quantitect Sybr
Green MasterMix (Qiagen) pada sistem
PCR Time One Plus Real-Time (Teknologi
Life). Untuk daftar urutan primer lihat File
pelengkap 3.
Menyebar spheroid paru-paru pada
matriks paru-paru manusia dekellularized
Paru-paru manusia yang dianggap tidak
sesuai untuk transplantasi paru-paru
diperoleh dari detak jantung (atau autopsi
hangat) donor melalui Gift of Life
Michigan dan paru-paru diuraikan seperti
yang dijelaskan sebelumnya (Booth et al.,
2012). Irisan disiapkan menggunakan tisu
steril (Fisher) dan disterilisasi dengan
0,18% asam perasetat dan 4,8% EtOH.
Irisan matriks ditempatkan di piring 96
sumur dan sekitar 50 NOG + SB Sphere + F
+ Ch + SAG dipipet langsung ke matrik.
Sampel disentrifugasi selama 2 menit
pada 2000 rpm dan kemudian diinkubasi
pada 37˚C selama 30 menit tanpa media.
Media foregut dilengkapi dengan 1% FBS
dan 500 ng / ml FGF10 kemudian
ditambahkan ke matriks. Media berubah
setiap hari.
Mikroskop elektron transmisi
D50 HLO diproses seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Prasov et al., 2012; Rockich
et al., 2013). 70 nm bagian adalah bagian
yang dicitrakan menggunakan mikroskop
elektron Philips CM-100.
Luas dan kuantifikasi sel
HLO dengan sel P63 + dihitung sebagai
memiliki epitel seperti epitel proksimal
dan HLO dengan SFTPC + sel-sel dihitung
sebagai memiliki epitel seperti saluran
napas distal. Area epitel proksimal adalah
ditentukan oleh P63 + ECAD + pewarnaan.
Area diukur menggunakan perangkat
lunak ImageJ. Kuantifikasi sel NKX2.1, P63,
dan DAPI dihitung dengan software
penghitung sel Metamorph. FOXJ1, SFTPC,
dan HOPX dihitung dalam ImageJ
menggunakan plugin penghitung sel.
Analisis statistik dan ulangan
eksperimental
Semua percobaan immunofluorescence
dan qRT-PCR dilakukan setidaknya dua kali
dengan tiga (n = 3) sampel biologis
independen per percobaan. Satu-satunya
pengecualian untuk ini adalah eksperimen
itu termasuk sampel paru-paru manusia
dewasa dalam analisis. Untuk percobaan
ini, n = 1 paru-paru manusia biologis
sampel digunakan dalam ulangan statistik
(rangkap tiga) sedangkan semua sampel
lain menggunakan biologi bereplikasi (n =
3). Untuk kuantifikasi pada Gambar 7,
total 48 HLO berbeda (n = 48) dihitung
untuk Komposisi HLO. Untuk area epitel
proksimal, 29 HLO berbeda dihitung (n =
29). Untuk sel kuantifikasi, 15 HLO
berbeda dihitung (n = 15). Perbedaan
statistik antara kelompok-kelompok itu
dinilai dengan perangkat lunak Prism,
menggunakan beberapa uji t. Semua bar
kesalahan mewakili SEM. Hasilnya adalah
dianggap signifikan secara statistik pada p
<0,05.
Pengurutan dan analisis RNA
Urutan HLOs (n = 3 D65, n = 3 D110)
dilakukan oleh Universitas Michigan DNA
Sequencing Core, menggunakan platform
Illumina Hi-Seq. Urutan H9 Stem Cells (SC)
dan Definitif Endoderm (DE) dilakukan
oleh University of California, San Francisco
DNA Sequencing Core menggunakan
platform Illumina Hi-Seq. Semua urutan
disimpan dalam ArrayExpress EMBL-EBI
database menggunakan Annotare 2.0 dan
di katalog di bawah nomor aksesi E-MTAB-
3339 untuk HLO dan E-MTAB-3158 untuk
SC dan DE. Universitas Michigan
Bioinformatika Core memperoleh
membaca file dan menggabungkannya
menjadi satu file '.fastq' untuk setiap
sampel. Inti Bioinformatika juga
mengunduh file yang dibaca dari database
EBI-AE (Sampel paru dewasa) dan NCBI-
GEO (SRA) database (sampel paru-paru
janin) (file tambahan 1). Kualitas mentah
membaca data untuk masing-masing
sampel dievaluasi menggunakan FastQC
(versi 0.10.1) untuk mengidentifikasi fitur
dari data yang mungkin menunjukkan
masalah kualitas (misalnya, skor kualitas
rendah, urutan berlebihan, konten GC
yang tidak sesuai, dll). Laporan QC awal
menunjukkan over-representasi urutan
adaptor Illumina dalam sampel dari Set
data EBI-AE dan set data NCBI-GEO.
Urutan adaptor dipangkas dari bacaan
menggunakan Cutadapt (versi 0.9.5) (Chen
et al., 2014a). Secara singkat, bacaan
diselaraskan dengan transkriptome
referensi (UCSC hg19) menggunakan
TopHat (versi 2.0.9) dan Bowtie (versi
2.1.0.0) (Langmead et al., 2009). Manset /
CuffNorm (versi 2.2.1) digunakan untuk
ekspresi kuantisasi dan ekspresi
diferensial analisis (Trapnell et al., 2012),
menggunakan UCSC hg19.fa sebagai
urutan genom referensi dan UCSC
hg19.gtf sebagai anotasi transkriptom
referensi. Untuk analisis ini, kami
menggunakan pengaturan parameter: ‘–
Multi-baca-benar’ untuk menyesuaikan
perhitungan ekspresi untuk membaca
peta itu di lebih dari satu lokus, sebagai
baik sebagai ‘–kompatibel-hits-norma’
dan ‘-peras-kuartil -norm’ untuk
normalisasi nilai ekspresi. Tabel FPKM
yang dinormalkan dihasilkan
menggunakan fungsi Cuffnorm yang
ditemukan di Manset. Analisis kuantisasi
transkripsi dalam manset dilakukan
menggunakan Linux Debian 64-bit
platform stable versi 7.8 (‘Wheezy’).
Matriks FPKM lengkap, berisi jumlah
frekuensi untuk semua 24.010 gen yang
terkandung dalam genom referensi untuk dataset RNAseq. Selain itu, kami
semua 23 sampel RNAseq, dievaluasi menghitung peringkat Spearman koefisien
menggunakan analisis komponen prinsip korelasi (ρ) dengan cara berpasangan di
unscaled (PCA) untuk memvisualisasikan antara semua 23 sampel RNAseq
dan mengukur variasi multi-dimensi menggunakan yang lengkap menormalkan
antara sampel (Ringner, 2008 ´). Dari data FPKM. Koefisien Spearman diplot
24.010 gen yang dianotasikan dalam sebagai peta panas menggunakan fungsi
genom referensi, 2815 (11,7%) tidak tersebut ‘Heatmap.2’ dalam paket R
terdeteksi dalam analisis RNAseq dari ‘gplots’ (http://CRAN.R
salah satu dari 23 sampel. Komponen project.org/package=gplots). Data lengkap
prinsipnya adalah dihitung menggunakan skrip analisis tersedia di
fungsi ‘prcomp’ yang ditemukan dalam R https://github.com/hilldr/HLO_eLife2015.
(versi 3.1.2) bahasa pemrograman statistik
(http://www.R-project.org/) dan diplot
menggunakan paket R ‘ggplot2’
(Wickham, 2009). Hirarkis analisis klaster
berdasarkan pada jarak Canberra (Eisen et
al., 1998) antara vektor FPKM digunakan
untuk mengklasifikasikan sampel RNAseq
diskrit sesuai dengan tingkat
ketidaksamaan transkripsi total yang
ditunjukkan oleh nilai-nilai FPKM yang
dinormalkan. Analisis bootstrap digunakan
untuk menilai ketidakpastian dalam
ditugaskan hubungan pengelompokan
hierarkis. 10.000 iterasi bootstraping
dihasilkan oleh berulang kali secara acak
sampling dataset FPKM. Probabilitas
bootstrap (BP) dari suatu cluster
didefinisikan sebagai frekuensi hubungan
yang diberikan di antara bootstrap
ulangan. Resampling bootstrap multiskala
adalah digunakan untuk menghitung nilai
p sekitar-kurang (AU) untuk hubungan
yang diberikan, dengan AU> 95
menunjukkan tingkat signifikansi statistik
yang tinggi. Analisis dilakukan
menggunakan paket R ‘pvclust’ (Suzuki
dan Shimodaira, 2006). Korelasi Spearman
diterapkan sebagai penilaian tambahan
dari derajat kumulatif korelasi di antara