Metode dan bahan

Plant Decellularization: Bayam dan peterseli diperoleh dari pasar lokal. Artemisia annua
daun (kultivar SAM, spesimen voucher MASS 00317314) dipanen dari tanaman yang tumbuh di
tanah. Akar berbulu Kacang yang dihasilkan melalui Agrobacterium rhizogenes- transformasi genetik
termediasi [26,27]. Dekellularisasi untuk jenis tanaman yang berbeda diadaptasi dari seluruh organ
teknik perfusion decellularization [6e8]. Daun bayam itu cannulated melalui tangkai daun dan
peterseli yang dikanulasi melalui ujung basipetal dari segmen batang. Kutikula dihilangkan dari
tanaman melalui pengobatan serial dengan heksana (98%, Campur Isomer, Alfa Aesar, Haverhill,
MA) dan 1x PBS. Sebuah natrium 10% dodecyl sulfate (SDS) dalam larutan air deionisasi diperfusi
melalui cannulas selama 5 hari, setelah itu mereka diperfusi dengan 0,1% Triton-X-100 dalam
pemutih natrium klorit 10% (Aqua-Tab, Lingkungan Beckart, Kenosha, WI) dalam larutan air
deionisasi selama 48 jam. Air deionisasi steril kemudian disempurnakan untuk tambahan 48 jam.
Perfusi dicapai dari tekanan konstan kepala 152 mmHg dan aliran diprakarsai oleh gravitasi. A. annua
dan kacang tanah akar berbulu terdekellularisasi menggunakan teknik yang sama tetapi bukannya
kanulasi dan perfusi, mereka direndam dalam solusi. Setelah dekellularisasi selesai, jaringan
disimpan air deionisasi steril pada suhu 4 ° C hingga diperlukan hingga dua minggu.

Analisis histologi: Sampel daun dipotong menjadi kotak ~ 1 cm, istimewa dipotong dengan
saluran pembuluh darah utama dari daun ke bawah tengah alun-alun. Akar dan batang dipotong
menjadi kira-kira ~ Potongan panjang 1 cm. Sampel jaringan diperbaiki semalam di prosesor jaringan
ATP-1 otomatis (Ilmu Biomedis Segitiga, North Carolina) dan kemudian tertanam dalam parafin. Blok
parafin dipotong pada 14 mm. Sampel yang ada diwarnai menggunakan Sass Safranin dan protokol
Fast Green untuk tanaman pewarnaan dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [28].
Singkatnya, bagian diwarnai selama 1 jam dalam 1% (b / v) Safranin-O, dan kemudian dibilas dalam
air deionisasi selama sekitar 5 menit, atau sampai semua residu pewarna telah dihapus dari bagian.
Bagian mengalami dehidrasi 70%, kemudian 95% etanol dan dicelupkan selama 10 detik di Fast
Green FCF (0,1% b / v dalam 95% etanol). Bagian dicuci menjadi dua perubahan 100% etanol (2
menit / langkah) dan dibersihkan dalam dua perubahan xylene (2 menit / langkah). Sampel diwarnai
untuk lignin selama 10 menit dalam larutan jenuh phloroglucionol dalam 20% hidroklorida, sebagai
dilaporkan sebelumnya [29]. Sampel divisualisasikan melalui penggunaan a Mikroskop tegak DMLB2
(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL).

Scanning Electron Microscope Imaging: Persiapan sampel untuk analisis Scanning Electron
Microscopy (SEM) terdiri fiksasi dengan 1,5% glutaraldehid dalam 0,07 M yang baru disiapkan buffer
natrium cacodylate selama 2 jam. Sampel kemudian dibilas 0,07 M sodium cacodylate dengan
penambahan 2,5% sukrosa dan didehidrasi dengan perendaman dalam serangkaian etanol bertahap
dalam H2O, serial dalam konsentrasi berikut: 30, 50, 80, dan 95%. Kemudian sampel direndam
dalam hexamethyldisilazane (HDMS) di larutan etanol seri dalam konsentrasi berikut: 30, 50, 80, dan
95%. Sampel dibiarkan kering pada pemegang sampel dan kemudian sputter emas dilapisi sebelum
pencitraan dalam SEM.

DNA / Protein Kuantifikasi: Baik asli maupun dekellularized daun dimasukkan ke dalam
tabung centrifuge dalam bak mandi nitrogen cair dan tanah dengan alu. Fragmen diproses lebih
lanjut dengan menarik melalui jarum syringe 25-gauge dan dengan sonication dengan 5 pulsa
dilakukan 3 kali untuk mengurangi ukuran fragmen daun. DNA dulu diukur menggunakan Uji
Proliferasi Sel Langsung CyQUANT (Thermo Fisher, Waltham, MA) dan protein diukur menggunakan
Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (Thermo Fisher). Konsentrasi adalah ditentukan
menggunakan spektrofotometer Victor3 (Perkin Elmer, Waltham, MA).

Studi Perfusi: Daun bayam Decellularized telah dihapus dari penyimpanan didinginkan dan
dikeringkan dengan Kimwipes sebelum permulaan studi perfusi yang berbeda. A 0,1% Ponceau Red
(Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) dalam larutan asam asetat 1% diserap melalui kanula yang melekat
pada tangkai daun masing-masing daun bayam dekellularized. Ponceau merah diserap dari sebuah
konstanta tekanan 152 mmHg melalui aliran gravitasi didorong. Gambar itu diambil sebelum dan
sesudah kanulasi untuk menyelidiki yang tersisa patensi pembuluh darah daun dekellularized.

Microspheres (berukuran 1, 10, 50, dan 100 mm) (Phosphorex Inc., Hopkinton, MA)
digunakan untuk menentukan aliran diameter bagian dalam keterbatasan pembuluh darah daun.
Kesempurnaan telah tercapai melalui pompa syringe dengan laju aliran 200 ml / menit. Sebelum ke
perfusi microsphere, cairan kosong dipercayakan melalui daun di memesan untuk mengukur
autofluorescence dari perfusate. Serial perfusi ukuran mikrosfer neon tunggal yang berbeda adalah
dilakukan dimulai dengan diameter terkecil hingga terbesar. Setelah perfusi selesai, limpasan
masing-masing ukuran individual microspherewas dikumpulkan dan dianalisis menggunakan
microplate Victor3 pembaca (Perkin Elmer) terhadap kurva standar yang dikenal untuk masing-
masing mikrosfer berukuran individual. Ada beberapa kehilangan cairan yang dialami saat
mengumpulkan limpasan dari perfusi. Cairan ini kehilangan dapat dikaitkan dengan struktur berpori
dari daun menyebabkan volume kecil cairan untuk dikumpulkan di daun. Untuk kecepatan tinggi
video, kamera berkecepatan tinggi HiSpec4 (FastTec, San Diego, CA) adalah melekat pada mikroskop
terbalik DMIL (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) dan video berkecepatan tinggi diambil pada 60
bingkai per kedua. Campuran mikrosfer yang berbeda disempurnakan video. Mikrosfer yang
mengalir melalui pembuluh darah itu berwarna putih palsu untuk meningkatkan kontras antara bola
dan Latar Belakang. Gambar confocal dari daun diverifikasi microsphere jebakan. Gambar diperoleh
menggunakan SP5 Point Scanning Confocal (Leica Microsystems)

Uji Mekanis: Daun bayam yang asli dan dekellularized dipotong menjadi 1? Bentuk dogbone
2 cm. Daun dimasukkan ke dalam cengkeraman penguji mekanis dengan ujung daun apikal jujur.
Penguji ElectroPulse E1000 (Instron Corp, Norwood, MA) digunakan untuk meregangkan daun secara
uniaksial. Daun itu membentang pada strain konstan 10 mm / mm sampai kegagalan. Maksimum
tangen modulus, kekuatan tarik utama, dan regangan pada kegagalan dihitung. Modulus tangen
maksimum didirikan oleh pas garis ke wilayah linear kemiringan maksimal dari tegangan-regangan
grafik. Kekuatan tarik dan regangan utama pada kegagalan dihitung dari grafik tegangan-regangan
yang dihasilkan.

Budidaya dan Penyuapan Sel Mammalia: Hanya untuk HUVEC dan hPSCM percobaan
lampiran, batang daun perancah dilapisi dengan fibronektin. Fibronektin (dari plasma bovin, Sigma
Aldrich) adalah disuntikkan melalui kanula perancah daun pada konsentrasi 10 mg / mL dan diizinkan
untuk melapisi selama 24 jam dalam inkubator standar. Sebelum pembibitan HUVEC, daun disuntik
dengan PBS steril bersihkan semua fibronektin non-coated dari daun. Untuk hPS-CM penyemaian,
fibronektin diaplikasikan pada permukaan daun di konsentrasi dan waktu inkubasi yang sama.
Sebelum pembibitan hPS-CM, daun dicuci dalam PBS steril. HUVECs (CRL-1730, American Type
Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia) dipertahankan menggunakan Sel Endothelial Growth
Kit eVEGF (ATCC) sesuai dengan instruksi pabrikan. HUVECs diberi label fluorescently melalui
pengambilan acetylated low-density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) (Thermo Fisher). Pelabelan terjadi
dengan inkubasi HUVECs selama 4 jam pada 37? C dalam medium mengandung 10 ml / mL Dil-Ac-
LDL. Sebuah alikuot 500 ml mengandung 375.000 berlabel HUVECs disuntikkan ke dalam batang
kanula daun bayam dekellularized. HUVEC diizinkan 24 jam untuk kepatuhan dan kemudian dicuci
dengan PBS. Penganut HUVECs divisualisasikan menggunakan filter Rhodamine pada Titik SP5
Scanning Confocal (Leica Microsystems).

Viabilitas HUVECs setelah recellularization ditentukan dengan menggunakan uji serapan LDL.
HUVEC yang tidak berlabel disuntikkan ke dalam batang cannulated seperti yang dijelaskan
sebelumnya; 24 jam setelah pembenihan, Batang dan batang yang diunggulkan HUVEC dipindahkan
ke dalam medium mengandung 10 ml / mL Dil-Ac-LDL selama 4 jam pada 37? C. Gambar batang
diperoleh sebelum inkubasi LDL, 24 jam setelah akhir inkubasi, dan 48 jam setelah akhir inkubasi
menggunakan Rhodamin filter pada mikroskop terbalik DMIL (Leica Microsystems).

P4eP8 hMSCs (Lonza, Walkersville, Maryland) dipertahankan dalam medium pertumbuhan

MSCGM (Lonza) hingga mencapai 70e80% pertemuan. The hMSCs dirawat selama 24 jam dengan
medium MSCGM dilengkapi dengan 8.2 nM QDot 655 ITK carboxyl Quantum Dots (Thermo Fisher).
Setelah 24 jam perawatan, quantum dot-loaded hMSC dengan lembut dicuci dengan PBS dan
dipertahankan dalam pertumbuhan sedang sampai digunakan. Dimuat hMSCs yang diunggulkan
pada permukaan daun bayam decellularized selama 24 jam untuk memungkinkan lampiran. HSMC
yang patuh divisualisasikan menggunakan pengaturan filter QDot 655 Sp5 Point Scanning Confocal.
Kardiomiosit embri sel induk embrio (hPS-CM) (disediakan oleh Dr. Michael LaFlamme, Universitas
Toronto, Toronto, Ontario) [30] dipertahankan dalam medium RPMI mengandung 2% B27, 1% Pen /
Strep, dan 1% L-Glutamine (Thermo Fisher).

HPS-CM dicairkan dan segera diunggulkan ke permukaan bayam Daun-daun. Sel diberi 24
jam pembenihan sebelum media diganti, dan kemudian diganti setiap 48 jam untuk durasi 21 hari.
Kontraksi hPS-CM dan Analisis Fluoresen: HiSpec4 tinggi kamera kecepatan (FastTec, San Diego, CA)
melekat pada DMIL inverted microscope (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) dan video dari
kelompok hPS-CM yang dikontrak diambil pada 60 frame per kedua. Sebuah algoritma pelacakan
berbasis speckle, pemetaan kepadatan tinggi [31], diterapkan pada video kontraksi. Algoritma
mengukur perpindahan tingkat subpiksel dari objek intensitas cahaya acak. Dari perpindahan
subpiksel ini, strain kontraktil bisa dihitung atas suatu wilayah yang menarik. Video fluoresensi itu
direkam pada 71 frame per detik dan dianalisis melalui kode MATLAB khusus, yang mengukur
perubahan intensitas relatif lembur.

Analisis Statistik: Semua hasil disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi. Perbandingan
statistik dibuat baik melalui penggunaan t-test Student atau ANOVA satu arah dengan tes post-hoc
Tukey. Kedua uji statistik dilakukan dalam SigmaPlot (Systat Software Inc., San Jose, CA). Statistik
signifikansi ditentukan menjadi p <0,05.

Hasil

3.1. Persiapan dan karakterisasi tanaman dekellularized perancah

Struktur alami dari tumbuhan yang lebih tinggi memungkinkan untuk pengangkutan nutrisi melalui
xilem dan floem ke sel distal, mis. dari akar ke daun dan daun ke akar atau daun lainnya. Untuk
mengeksplorasi potensi untuk perancah rekayasa jaringan berbasis tanaman, perfusi dekellularisasi
[6] diadaptasi untuk digunakan dengan Spinacia oleracea (bayam) Daun-daun. Daun bayam
digunakan sebagai spesies model karena sifatnya ketersediaan siap, pola jaringan dan kepadatan
vaskular mereka, dan diameter tangkai daun lebar mereka. Petiol daun bayam diberi kanulasi
(Gambar. S1) dan kemudian diperfusi dengan larutan dekellularization (10% sodium dodecyl sulfate
(SDS) dalam air deionisasi) selama 5 hari, diikuti oleh 2 hari perfusi dengan solusi kliring (0,1%
TritonX- 100, 10% natrium klorit dalam air deionisasi). Suatu hari setelah inisiasi dari proses
dekellularization, daun mulai kehilangan mereka warna hijau karena hilangnya klorofil, yang
menunjukkan hilangnya kloroplas dari jaringan daun (Gambar 2A dan B). Daun menjadi tembus
pandang dengan rona hijau pada Hari ke 5 (Gbr. 2C). Penambahan sodium klorit mensterilkan
jaringan sementara juga menghilangkan sisa klorofil, menghasilkan daun yang tidak berwarna dan
tembus cahaya pada Hari ke 7 (Gambar 2D). Analisis histologis mengidentifikasi sel dengan nuklei
dan kloroplas dalam daun asli (Gambar 3, A dan C), keduanya tidak terlihat pada rekan-rekan
dekellularized mereka (Gbr. 3, B dan D). Selanjutnya, lignin, yang merupakan komponen
biopolimerik utama vaskularisasi daun, hadir sebelum dan sesudah dekellularization seperti yang
ditunjukkan oleh pewarnaan histologis tambahan (Gambar. S10). Dibulatkan daun bayam
mempertahankan pola dan kerapatan yang sama jaringan vaskular terlihat pada daun asli (Gambar
3E dan F) saat dicitrakan oleh scanning electron microscopy (SEM), menunjukkan bahwa proses
dekellularisasi tidak mempengaruhi sifat topografi dari permukaan daun. Baik dekellularization
maupun kliring Solusinya sendiri mampu sepenuhnya mendekellularisasi daun (Gbr. S2),
menunjukkan bahwa baik deterjen anionik maupun non-ionik dapat diperlukan untuk penghapusan
lengkap bahan sel tumbuhan.

Daun dekellularized mengandung DNA yang jauh lebih sedikit (9,4 ± 1,3

vs 1129 ± 217,3 ng DNA / jaringan mg, Gambar. 3G) dan secara signifikan lebih sedikit

protein bila dibandingkan dengan daun asli (2,4 ± 0,6 vs 19,1 ± 1,9 mg

protein / mg, Gambar. 3H). Data ini menunjukkan bahwa tanaman

proses dekellularisasi menghilangkan hampir semua DNA dan protein.

Tingkat DNA yang tersisa memenuhi persyaratan minimal

bertekad untuk mengklasifikasikan jaringan sebagai terdekellularisasi (<50 ng DNA per

jaringan mg) [32]. Kinetika penghapusan protein menunjukkan a

penurunan kadar protein yang cepat dan signifikan selama yang pertama

10 menit. Tingkat protein menurun lebih lanjut selama berikutnya

hari dan mencapai konsentrasi terendah setelah 3 hari dekellularisasi

(Gbr. S3). Setelah 5 hari perfusi, standar deviasi

antara tingkat protein dalam sampel yang berbeda ditemukan

diabaikan dan dengan demikian 5 hari perfusi dengan dekellularization

solusi dipilih sebagai waktu standar.

Untuk karakterisasi yang kuat dari perancah jaringan, sangat penting untuk

memeriksa sifat mekanik dari bahan perancah, seperti

sifat-sifat ini mengatur kemampuan jaringan untuk berfungsi. Kapan

dibandingkan dengan daun asli, daun dekellularized ditampilkan secara signifikan

kekuatan tarik ultimate yang lebih rendah (p ¼ 0,00925) dan strain di

kegagalan (p ¼ 0,000287) selama analisis mekanik tarik uniaksial

(Gambar. S4). Terlepas dari hilangnya integritas mekanis,

modulus tangen maksimum untuk daun bayam dekellularized

(0,3 MPa) berada dalam kisaran manusia dekellularized normal

jaringan jantung (0,2e0,5 MPa) [8].

Kami juga mengeksplorasi penerapan teknik ini ke yang lain

spesies dan jaringan tanaman. Petroselinum crispum (peterseli) batang,

Arachis hypogaea (kacang) akar berbulu, dan daun Artemisia annua

juga berhasil diuraikan (Gambar 3I) dengan demikian menyarankan

potensi luas untuk menggunakan berbagai jenis tumbuhan dan jaringan

untuk dekellularisasi. Pemeriksaan histologis berbeda-beda ini

sistem tanaman juga dilakukan dan menghasilkan hasil yang sama seperti

yang terlihat pada daun bayam (Gambar. S5), di mana ada kerugian yang tercatat

bahan nuklir sambil mempertahankan mikroarsitektur pabrik kotor.

Akar berbulu dan Aretemisia annua direndam dalam dekellularization

dan solusi kliring sebagai lawan perfusi karena mereka

pembuluh darah halus. Kadar DNA A. annua juga diukur

untuk memverifikasi bahwa perendaman dilakukan dengan tingkat dekellularisasi yang sama

sebagai perfusi (Gambar. S5).

3.2. Penilaian patensi vasculature daun pasca-dekellularisasi

Keuntungan utama menggunakan daun dekellularized sebagai scaffold

untuk rekayasa jaringan adalah pembuluh darah bawaan. Kami dengan demikian berusaha

menentukan apakah pembuluh darah daun tetap utuh dan paten

setelah proses dekellularization. Ponceau Red dipermainkan

melalui kanula daun bayam decellularized. The Ponceau

Red perfused di seluruh keseluruhan dari vasculature daun, dengan

beberapa kebocoran kecil yang diamati (Gambar 4A; Film S1). Perfusate

juga mengalir ke dan melalui cabang-cabang kecil dari vena daun

(Gambar 4B) menunjukkan bahwa mikrovaskulatur daun tetap ada

cukup utuh.

Video pelengkap yang terkait dengan artikel ini dapat ditemukan di

http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.02.011

Untuk perancah rekayasa jaringan vaskularisasi menjadi klinis

relevan, diameter bagian dalam pembuluh mimetik harus memungkinkan

aliran darah. Kapiler manusia memiliki diameter pembuluh darah antara 5 dan

10 mm [33] yang mendukung aliran darah merah berdiameter 6e8 mm

sel [34]. Untuk memprediksi apakah jaringan vaskular seorang yang terdekellularisasi

daun akan mendukung aliran sel-sel tersebut, pembuluh darah daun itu

disempurnakan dengan medium yang mengandung mikrosfer neon dari

berbagai ukuran diameter. Metode ini memungkinkan evaluasi keduanya

diameter dan patensi dari setiap pembuluh darah yang diberikan. Video (Film S2) diperoleh pada 60
frame per detik untuk memvisualisasikan microsphere

aliran (Gambar. 4C; Untuk meningkatkan kontras, manik itu berwarna putih palsu di

video-video ini). Medium yang diserap melalui daun (mengalir

melalui) dikumpulkan dan digunakan untuk menghitung persentase

mikrosfer pulih dengan mengukur intensitas fluoresensi.

Sementara semua manik 1 dan 10 mm ditemukan setelah perfusi,

transportasi manik-manik yang lebih besar menjadi semakin ketat;

hanya 46% dari 50 mm dan 10% dari 100 mm mikrosfer itu

dikumpulkan (Gambar 4D). Selain itu, analisis keberadaan cairan kosong

disempurnakan melalui sistem menunjukkan beberapa noise yang dihasilkan oleh

autofluorescence, di mana koleksi mikrosfer 100 mm adalah

ditemukan berada dalam wilayah kebisingan ini. Koleksi 1 dan 10 mm

mikrosfer ditemukan secara statistik lebih besar dari keduanya

Koleksi mikrosfer 100 mm (p ¼ 0,01 untuk mikrosfer 1 mm dan 10 mm)

dan suara fluida kosong (p ¼ 0,009 untuk 1 mm dan

p ¼ 0,01 untuk mikrosfer 10 mm). Visualisasi yang terperangkap

manik-manik dalam jaringan vaskular tanaman menghasilkan hasil yang saling melengkapi

(Gambar 4E dan F); yaitu hanya 50 dan 100 mmdiameter mikrosfer

ditemukan terperangkap di dalam jaringan tanaman. Diambil bersama-sama,

hasil ini menunjukkan bahwa vaskularisasi daun mendukung

aliran partikel dalam kisaran ukuran sel darah merah.

3.3. Recellularization perancah daun dekellularized dengan manusia sel

Keberhasilan penggunaan jaringan tumbuhan yang terdekellulisasi untuk kultur jaringan manusia
bergantung pada kemampuan sel manusia untuk menempel pada tanaman yang diproduksi

ECM. Jenis sel manusia yang berbeda diunggulkan

bagian atas perancah tanaman decellularized atau diperkenalkan ke tanaman

jaringan vaskular melalui kanulasi.

Untuk endotelialisasi vaskularisasi daun, vena umbilikalis manusia

sel-sel endotel (HUVEC) diunggulkan ke perancah daun

pembuluh darah. Pembuluh darah daun pertama kali dilapisi dengan fibronektin di

untuk mempromosikan keterikatan seluler ke dinding lignified

vaskulatur daun. HUVEC diberi label dengan low-density lipoprotein asetilated

(Dil-Ac-LDL) dikirim melalui kanula. Setelah

24 jam, lampiran HUVEC ke permukaan bagian dalam vasculaturewas daun

dikonfirmasi dengan confocal microscopy (Gambar. 5A). Kelangsungan hidup HUVEC setelah

recellularization dievaluasi menggunakan assay serapan LDL. Tidak berlabel

HUVEC disuntikkan melalui kanula dan dibiarkan 24 jam

untuk menempel ke permukaan bagian dalam batang daun. Dibagikan dan tidak diunggulkan

batang diinkubasi dalam medium Dil-Ac-LDL dan fluorescent

Sinyal dinilai 24 dan 48 jam setelah inkubasi. Di kedua waktu

poin, ada sinyal neon positif hadir untuk diunggulkan

batang dan tidak ada sinyal untuk batang yang tidak diolah, menunjukkan bahwa

HUVEC tetap layak setelah recellularization (Gambar. S6). Meskipun

HUVECs melekat dan tetap layak setelah recellularization, perbaikan

dalam memfungsikan vaskularisasi dan penggunaan daun

perfusi bioreaktor akan dibutuhkan sebelum endotelisasi lengkap

dari seluruh daun bisa terjadi.

Sel induk mesenchymal manusia (hMSC) digunakan untuk pembenihan

ke permukaan luar daun dekellularized (Gambar. 5B). Untuk mengatasi

autofluorescence dihasilkan dalam jaringan tanaman, sebagian besar

terlihat dalam gelombang yang lebih pendek dari spektrum yang terlihat [35], hMSCs

diberi label dengan titik-titik kuantum sebelum penyemaian, seperti sebelumnya

dijelaskan [36]. The hMSCs siap ditempelkan ke seluruh permukaan

daun 24 jam setelah pembenihan. Sel lampiran juga diamati

permukaan luar batang peterseli dekellularized (Gambar. S7), menunjukkan

bahwa permukaan tanaman tiga dimensi dapat digunakan sebagai

perancah, dari tanaman dengan beragam spesies atau struktur skala makro.

Ini akan memungkinkan jaringan yang lebih besar dan lebih rumit untuk dibentuk

di perancah ini.

3.4. Fungsi kardiomiosit sel induk berasal dari manusia pada perancah tanaman decellularized

Manusia berasal sel induk berasal dari kardiomiosit (hPS-CM)

yang diunggulkan ke permukaan perancah daun untuk menyelidiki

apakah sel dapat mematuhi dan mempertahankan fungsi. hPS-CM

melekat pada permukaan dan membentuk kelompok sel (Gambar 6A) di dalam

tiga hari pembenihan. Lima hari setelah penyemaian awal, hPS-CM

mulai secara spontan berkontraksi (Movie S3) saat diunggulkan di

perancah daun sementara kontrol hPS-CM diunggulkan pada kultur jaringan plastik

(TCPS) mulai kontraksi pada Hari ke-3.

Analisis kontraktil (Gambar 6B), berdasarkan perubahan tingkat sub-piksel dalam

intensitas cahaya acak dari cluster hPS-CM [31], ditunjukkan

sekitar 1% strain kontraktil pada tingkat kontraktil

0,8 Hz di myocytes diunggulkan pada scaffolds daun. Peta regangan spasial

terungkap kontraksi hadir di seluruh cluster hPS-CM

sedangkan permukaan perancah ditampilkan sedikit atau tidak ada ketegangan

sinyal (Gbr. 6C). Stres kontraktil meningkat dari Hari ke 5 hingga Hari ke 10. Pada

Hari ke 10, kontraksi memuncak dan stabil selama 7 hari, hingga Hari

17. Terjadi penurunan kontraksi dari Hari 17 ke Hari 21

(Gambar 6D). Pada Hari 21 (Gambar 6E), kontraksi hPS-CM menurun menjadi 0,6%

pada tingkat kontraktil 0,5 Hz. Kelompok kontrol hPS-CM diunggulkan

keTCPS memiliki tingkat kontraksi yang lebih besar pada semua hari

analisis dan langkah-langkah ini ditemukan lebih besar secara statistik

pada hari ke 7 (p ¼ 0,04) dan 17 (p ¼ 0,04). Tidak ada statistik

perbedaan antara gugus hPS-CM pada perancah daun dan

Kontrol TCPS untuk semua titik waktu lainnya. Analisis kontraktil pada hari ke-10

(Nilai puncak untuk hPS-CM yang diunggulkan ke perancah daun)

(Gbr. S8) menghasilkan nilai regangan yang sama untuk sel yang diunggulkan pada

TCPS dengan strain kontraktil mendekati 1,0% dengan frekuensi 0,37 Hz.

Karena penurunan kontraksi pada hari ke 21, kami menyelidiki apakah kapabilitas penanganan
kalsium dari sel-sel ini dipertahankan
menggunakan GCaMP3 melaporkan transfected sel hps-CM [30],

memberikan sinyal fluoresensi yang sesuai dengan intraseluler

sinyal kalsium. Video fluoresensi (Movie S4) mendeteksi GCaMP3

fluoresensi (Gambar 6F), sesuai dengan fluks kalsium selama

kontraksi. Pada Hari 21, perubahan intensitas sinyal fluoresen di

gugus hPS-CM diukur selama beberapa siklus kontraktil dan

dibandingkan dengan sinyal dari permukaan daun (Gambar. 6G dan H).

Sinyal kalsium yang berasal dari cluster hPS-CM lebih banyak

intens daripada sinyal dari permukaan daun, menunjukkan bahwa

hPS-CM mempertahankan kapabilitas penanganan kalsium ketika disemai

perancah daun dan bukan merupakan artefak autofluorescence.

Selanjutnya, sinyal kalsium juga mengikuti frekuensi yang sama,

0,5 Hz, seperti yang terlihat dengan kontraksi pada Hari 21 menyarankan bahwa

dua saling terkait dan dengan demikian cardiomyocytes berfungsi

biasanya di daun. Sinyal kalsium dari hPS-CM itu

yang diunggulkan pada scaffolds daun juga dibandingkan dengan hPS-CM

yang diunggulkan di TCPS pada hari ke 21 (Gbr. S9). Sinyal kalsium telah

intensitas fluoresen serupa dengan hPS-CM memiliki lebih tinggi

frekuensi penanganan kalsium. Perbedaan frekuensi ini mungkin

karena perbedaan ukuran cluster yang berbeda

dianalisis sebagai kelompok hPS-CM yang terbentuk di TCPS lebih besar

dari kelompok yang terbentuk pada perancah daun.

4. Diskusi

Menjelajahi “orthogonality” biologis antara kerajaan-kerajaan

kesempatan unik untuk berinteraksi dengan beberapa biologis

kerajaan, serta meniru fitur biologis dari yang lain

kerajaan. Pendekatan baru ini dapat dimanfaatkan untuk dimanfaatkan

paradigma yang telah berevolusi dalam satu kerajaan biologis untuk

memberikan solusi untuk masalah yang dihadapi kerajaan lain, melalui

antarmuka umum. Dengan mencari antarmuka antar pabrik

dan sistem hewan, solusi baru dapat direkayasa secara efektif

untuk berbagai disiplin ilmu, seperti pengobatan regeneratif.

Misalnya, faktor pembatas utama yang mempengaruhi klinis

terjemahan rekayasa jaringan adalah kurangnya jaringan vaskular yang layak

dalam jaringan rekayasa. Teknik fabrikasi saat ini, seperti

sebagai pencetakan 3-D, tidak dapat secara akurat dan efektif menciptakan mikrovaskulatur,

seperti yang terlihat di tempat tidur kapiler. Dengan semua itu di

pikiran, kami mencari inspirasi dari kerajaan tumbuhan untuk diatasi

tantangan ini. Vaskulatur tumbuhan, seperti pembuluh darah mamalia,

mendukung aliran cairan dan transportasi biomolekul penting.

Transportasi ini dicapai melalui mekanisme yang berbeda di

tanaman daripada di pembuluh mamalia, tetapi strukturnya mirip,

terutama arsitektur mikrovaskuler. Selanjutnya, selulosa

yang merupakan komponen utama dari dinding sel tumbuhan yang dipelajari dengan baik

polisakarida dan biomaterial. Selulosa telah digunakan secara luas

berbagai aplikasi obat regeneratif, seperti kartilago

teknik jaringan [37,38], rekayasa jaringan tulang [39,40], dan

penyembuhan luka [20,21]. Untuk penelitian itu, selulosa biasanya

berasal dari bakteri untuk mengontrol geometri serat dan

sifat kimia. Baru-baru ini, bagaimanapun, selulos diisolasi

dari jaringan hypesthium decellularized apel dan digunakan untuk

mendukung attachment dan proliferasi seluler dalam scaffold 3D [22].

Bahan tersebut ditemukan biokompatibel ketika ditanamkan mamalia dan vaskulatur tanaman
dengan biokompatibilitas nyata

dan sifat regeneratif dari jaringan tanaman, kami berusaha

lintas kerajaan dan mempelajari apakah tumbuhan dekellularized bisa berfungsi

sebagai perancah yang perfusable untuk rekayasa jaringan.

Teknik dekellularisasi perfusi berhasil

diadaptasi untuk digunakan dengan jaringan tanaman. Beberapa jenis tanaman, semua dengan

geometri hierarkis yang berbeda, dapat terdekellularisasi

termasuk, daun bayam dan A. annua, batang peterseli, dan kacang tanah

akar berbulu. Bayam dipilih sebagai model daun melalui sisanya

penelitian karena ketersediaannya yang siap dan vaskularnya yang tinggi

massa jenis. Spesies tanaman lainnya dipilih untuk menyoroti meluas

potensi teknik. Dekellularisasi diverifikasi

melalui pewarnaan histologis, serta kuantifikasi DNA dan

kandungan protein. Pewarnaan histologis menunjukkan hilangnya nukleat

bahan dari jaringan tanaman sambil mempertahankan kedua struktur

dan komposisi asli yang berbeda dari jaringan, seperti yang dicatat

ketika lignin ternoda sebelum dan sesudah dekellularisasi. Itu

vasculature tetap paten setelah dekellularization, seperti yang ditunjukkan

oleh perfusi microsphere. Menggunakan mikrosfer, the

diameter pembuluh pembuluh darah perfusable dalam daun bayam

dapat diperkirakan, yang ditemukan untuk mendukung aliran partikel

ukuran sel darah manusia. Perancah tanaman decellularized

juga didukung recellularization sel manusia. Ditaati

HUVECS menunjukkan beberapa keselarasan dengan dinding pembuluh darah bagian dalam, dan

tetap layak; MSC melekat pada permukaan daun; dan hPSCMs

secara spontan dikontrak selama 21 hari sementara

melekat pada permukaan perancah daun.

Dengan menggunakan arsitektur alami dari jaringan tanaman, kita bisa

efektif insinyur keragaman jaringan mamalia tergantung

pada template pabrik. Mencocokkan sifat mekanis asli

telah terbukti menjadi aspek penting ketika rekayasa jaringan. Sejak

berbagai macam struktur anatomi ada di dalam tanaman

kerajaan [17], menemukan struktur dengan sifat mekanik

meniru yang dibutuhkan untuk perancah rekayasa jaringan manusia,

bahkan setelah dekellularisasi, harus layak. Ini menguntungkan

karena keragaman dalam arsitektur tanaman yang berbeda dan

struktur mereka, dengan harapan mereka dapat merekapitulasi

beberapa kompleksitas terlihat dalam jaringan mamalia dan dengan demikian

mengarah ke aplikasi klinis masa depan. Optimasi lebih lanjut dan

investigasi akan diperlukan untuk memahami jaringan tanaman yang mana

akan sesuai untuk aplikasi rekayasa jaringan yang berbeda.

Sebuah jaringan tanaman yang sangat vaskularisasi, seperti daun bayam, mungkin

lebih cocok untuk jaringan yang sangat vaskularisasi, seperti jaringan jantung,

sedangkan struktur hollow silinder dari batang Impatiens

capensis mungkin lebih cocok dengan cangkok arteri. Sebaliknya, vaskular

tiang-tiang kayu mungkin berguna dalam rekayasa tulang karena mereka

kekuatan relatif dan geometri.

Solusi rekayasa jaringan berbasis tanaman harus lebih jauh

diuraikan dan dieksplorasi sebelum diterjemahkan ke dalam aplikasi medis.

Solusi dekellularization yang digunakan dalam penelitian ini mengandung

konsentrasi tinggi deterjen yang dipilih setelah awal

investigasi yang menyumbang waktu yang diperlukan untuk dekellularisasi.

Detergen residual hadir setelah dekellularisasi miliki

terbukti mempengaruhi viabilitas seluler [41] dan dengan demikian bisa menjadi

bermasalah dengan penggunaan konsentrasi deterjen tinggi. Ada

paling buruk hanya masalah viabilitas terbatas dalam penelitian ini, bagaimanapun, ini
dan kekhawatiran potensial lainnya harus ditangani lebih lanjut

penyempurnaan teknik dekellularization.

Saat ini, belum jelas bagaimana vaskulatur tanaman akan

diintegrasikan ke dalam pembuluh darah manusia asli dan apakah ada

akan menjadi respon imun. Selulosa dekellularized adalah respons terhadap seluruh jaringan
tanaman yang mengalami dekellularisasi. Investigasi masa depan

perlu dibuat menjadi respon imun asli untuk lebih

perancah tanaman komposisi yang kompleks. Selanjutnya, kami punya

menunjukkan kemampuan HUVECs untuk melekat pada pembuluh darah bagian dalam

setelah 24 jam. Untuk memiliki perancah non-trombogenik, endotelisasi penuh

kebutuhan harus ditunjukkan dan harus ada

fungsionalitas.

Kemampuan untuk sepenuhnya memurnikan jaringan yang telah mengalami dekellularisasi sudah
lama

menjadi masalah utama di lapangan dan studi masa depan diperlukan untuk

recellularize endothelium untuk jaringan tanaman. Investigasi terbaru

menjadi recellularization jaringan yang rumit, seperti vaskularisasi

seluruh paru-paru [42], telah membaik dan teknik-teknik baru ini akan

menjadi penting dalam meningkatkan potensi medis perancah pabrik kami

dan jaringan dekellularized lainnya. Satu aspek terakhir dari pabrik kami

perancah yang perlu dikembangkan lebih lanjut untuk meningkatkan

terjemahan medis, adalah pertanyaan tentang keluarnya aliran di pabrik

pembuluh darah. Vaskulatur tanaman tidak memiliki aliran keluar yang terpisah

sistem, seperti sistem vena. Jaringan potensial yang direkayasa

graft berdasarkan perancah tanaman bisa menggunakan beberapa daun

di mana beberapa bertindak sebagai pendukung arteri dan beberapa bertindak sebagai vena
kembali.

Penggunaan tumbuhan sebagai pondasi untuk rekayasa jaringan

perancah memiliki banyak manfaat di luar jaringan pembuluh darah bawaan mereka.
Ada dorongan saat ini dalam pengembangan teknologi untuk menjadi lebih banyak

"Hijau" dan ramah lingkungan karena kekhawatiran

perubahan iklim antropogenik dan persediaan alam berkurang

sumber daya. Perancah rekayasa jaringan biasanya diproduksi juga

dari biomaterial yang berasal dari hewan atau sintetis, yang keduanya memiliki

biaya besar dan dampak lingkungan yang besar. Biomaterial yang berasal dari hewan

digunakan secara luas sebagai bahan perancah untuk rekayasa jaringan

termasuk protein ECM asli seperti kolagen I atau

fibronektin dan seluruh jaringan dan organ hewan. Setiap tahun, 115

sejuta hewan [43] diperkirakan digunakan dalam penelitian. Disebabkan oleh

jumlah besar ini, banyak energi diperlukan untuk pemeliharaan dan

memberi makan hewan-hewan seperti itu juga untuk membuang sejumlah besar

sampah yang dihasilkan. Seiring dengan dampak lingkungan ini,

penelitian hewan juga memiliki sejumlah pertimbangan etis, yang

dapat dikurangi dengan model hewan yang tidak lagi mendukung lebih banyak

model jaringan manusia in vitro yang relevan secara biologis.

Biomaterial sintetis umumnya dihasilkan dari bahan kimia

pengolahan sumber daya tak terbarukan, seperti minyak bumi, dan

produksi mereka sering menghasilkan produk sampingan beracun. Contoh dari sebuah

biomaterial berpengaruh negatif terhadap lingkungan dapat ditemukan

dari polytetrafluoroethylene (Teflon), sintetis yang banyak digunakan

biomaterial dalam aplikasi kardiovaskular seperti jaringan direkayasa

cangkok vaskular [44]. Selama degradasi suhu tinggi

Teflon, sejumlah besar gas yang menipiskan ozon seperti trifluroacetic

asam dan klorodifluoroasetat [45] dihasilkan. Sementara

ini bukan masalah dalam tubuh ketika Teflon digunakan sebagai cangkok,

manufaktur produk sampingan adalah perhatian utama untuk produksi

dan penyimpanan material. Baru-baru ini, lebih banyak sumber ramah lingkungan untuk

produksi biomaterial telah dieksplorasi, seperti sintesis dari

minyak nabati [46] dan polimerisasi bio-polimer alami seperti

selulosa [47]. Dengan memanfaatkan kimia jinak dari jaringan tanaman

perancah, kita bisa mengatasi banyak keterbatasan dan biaya tinggi

sintetis, material komposit yang kompleks. Selanjutnya ada

banyak masalah dalam produksi massal material yang bisa jadi

mengatasi dari menggunakan jaringan tanaman. Tanaman dapat dengan mudah tumbuh
menggunakan

praktik pertanian yang baik (GAP) dan di bawah lingkungan yang terkendali.

Dengan menggabungkan jaringan tanaman ramah lingkungan dengan

dekellularisasi berdasarkan perfusi, kami telah menunjukkan bahwa mungkin ada

solusi berkelanjutan untuk rekayasa jaringan pra-vaskularisasi

perancah.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan kelayakan menggunakan dekellularized

tanaman untuk menyediakan scaffolding yang diproduksi secara berkelanjutan untuk jaringan

teknik. Dengan menerapkan paradigma dari satu kerajaan ke yang lain,

kami merancang metode untuk mengatasi keterbatasan perfusi itu

ada dalam pendekatan tradisional untuk rekayasa jaringan dan regeneratif

obat. Investigasi kami memberikan hasil yang menjanjikan, tetapi

banyak pertanyaan masih tetap ada sebelum tanaman yang terdekellularisasi menjadi

relevan secara klinis. Pengembangan tanaman decellularized untuk

scaffolding membuka potensi cabang sains baru itu

menyelidiki mimikri antara kerajaan, misalnya antara tanaman

dan binatang. Meskipun penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk dipahami

aplikasi masa depan teknologi baru ini, kami percaya itu memiliki

potensi untuk berkembang menjadi solusi "hijau" yang terkait dengan banyak hal

aplikasi obat regeneratif.