INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DEL LABORATORIO DE

BIOCONVERSIONES

ELABORADO POR:

Dr. Enrique Durán Páramo

M. en C. César A. Jiménez Sierra

M. en E. Hernán Cortés Arroyo

Modificado por Dr. Luis Fernández Linares para Curso 5BV1-2018

México D. F.

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PRÓLOGO

Una importante rama de la Biotecnología son las Bioconversiones, es decir, aquellos

procesos en los que se emplea un agente biológico (organismo, tejido, célula, organelo o

enzima) para transformar una materia prima en un producto o bien de interés. Las

Bioconversiones pueden aplicarse para: la obtención de diversos productos (Anticuerpos,

Edulcorantes, Enzimas, Hormonas, etc…); degradar contaminantes (acrilamida, fenoles,

etc…), transformar metabolitos para combinar la producción con síntesis química, facilitar el

diagnóstico, sensores, etc.

Si bien existen diversos agentes biológicos y de diversos orígenes que se emplean para

llevar a cabo una Bioconversión, las más utilizadas y sencillas de emplear son las células y

enzimas de origen microbiano (Bacterias y Levaduras). Es por esto, que este curso se enfoca

en el empleo de catalizadores microbianos.

El Laboratorio de Bioconversiones retoma e integra las Unidades de Aprendizaje: Fisiología

Celular, Laboratorio de Técnicas Microbiológicas, Laboratorio de Biorreactores e Ingeniería

Enzimática; con el fin de llevar a la práctica diversas Bioconversiones básicas. Las

Bioconversiones pueden llevarse a cabo fácilmente, poniendo en contacto un sustrato con

el catalizador biológico (enzima, bacteria u hongo); sin embargo, la eficiencia y especificidad

de la conversión se ven afectadas por el sistema en el que se trabaja y las condiciones en

las que opera. Es por ello, que el objetivo del laboratorio, además de la realización de las

bioconversiones, es el análisis y caracterización de las condiciones en las que se llevan a

cabo.

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ÍNDICE
PRÓLOGO .............................................................................................................................................. 2 
ÍNDICE ................................................................................................................................................... 3 
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA. ..................................................................... 4 
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES .................................................................. 6 
C.1. CAPACITACIÓN DEL USO Y MANEJO DE LOS EQUIPOS DE LABORATORIO. ................................... 6 
C.2. Adiestramiento en el uso, funcionamiento y bases del Espectrofotómetro y centrífugas ......... 10 
C.3. PREPARACIÓN DE REACTIVOS REQUERIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES. ...... 14 
C. 4. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES. ......................................................................... 14 
C.5. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA .................................................................................................. 16 
PRÁCTICA 1. Determinación de crecimiento celular por turbidimetría (D.O.), peso seco y  cuenta 
directa en cámara de Neubauer ......................................................................................................... 18 
PRÁCTICA 2.  Determinación de actividad enzimática y efecto de la concentración de enzima. ....... 22 
PRÁCTICA 3: Efecto de pH y temperatura en la actividad enzimática de la invertasa ....................... 26 
PRÁCTICA 4: Determinación de las constantes cinéticas de la enzima libre ...................................... 29 
PRÁCTICA 5: Inmovilización de Enzimas ............................................................................................. 33 
PRÁCTICA 6: Determinación de las constantes cinéticas y estabilidad de la enzima Inmovilizada .... 39 
PRÁCTICA 7: Conocimiento, preparación y esterilización de un Biorreactor con medio de cultivo. .. 43 
PRÁCTICA 8: Producción de enzimas con células libres ...................................................................... 46 
PRÁCTICA 9: Inmovilización celular y Producción de enzimas con células inmovilizadas .................. 52 
ANEXO I. Preparación de soluciones. .................................................................................................. 59 
ANEXO II. Técnicas y Determinaciones. .............................................................................................. 61 

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA.

1. Las personas que trabajen en el Laboratorio de Biotecnología deberán utilizar bata, así como los
accesorios necesarios para un trabajo seguro (guantes, googles, tapa boca, etc.).
2. Los alumnos deberán traer el siguiente material durante las sesiones de laboratorio: Papel
higiénico, franela, cerillos, masking tape; dentro del material que los alumnos deberán dejar en el
laboratorio están: jabón, ligas y frascos de vidrio y plástico.
3. Queda estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento, beber o fumar dentro del
Laboratorio de Biotecnología.
4. Las personas que se encuentran en el Laboratorio de Biotecnología deberán observar un
comportamiento adecuado.
5. Los reactivos y materiales se pedirán con vale, el cual contendrá: los materiales solicitados, el
nombre del solicitante, proyecto o materia en la que trabaja. Es responsabilidad del usuario
entregar el material limpio, seco y en buen estado).
6. Debido a la limitación de material, se pedirá solamente aquel material que se requiera en la sesión
de trabajo, el cual deberá entregar a la brevedad posible.
7. En caso de pérdida o deterioro del material, la persona responsable del mismo tendrá que
reponerlo antes de finalizar el semestre correspondiente, de lo contrario no se entregará
calificación de laboratorio o proyecto.
8. Los usuarios de los equipos deberán anotar su nombre, fecha, hora y material con el cuál se trabaje
en la bitácora correspondiente. Al concluir su trabajo se deberá apagar, limpiar y/o tapar el equipo.
9. Se deberán seguir las indicaciones señaladas para el uso del equipo y en caso de duda se
preguntará a los profesores o al responsable del Laboratorio de Biotecnología. En caso de
encontrar alguna falla se avisará inmediatamente al encargado de la práctica y/o al responsable
del Laboratorio de Biotecnología.
10. Cuando un equipo requiera ser usado durante un cierto período, se deberá avisar al responsable
del Laboratorio de Biotecnología, registrar el trabajo en la bitácora y colocar una etiqueta en un
lugar visible indicando: el periodo por el cual permanecerá prendido. las condiciones de uso, el
nombre del responsable, el nombre del usuario, el nombre de la materia o proyecto y la, fecha y
hora.
11. En caso de trabajos extra-clase del laboratorio, se consideran extensiones del laboratorio en
cuestión, por lo cual, alguno de los profesores encargados de la materia tendrá que hacerse cargo
del grupo
12. Al concluir la sesión de trabajo, se deberá entregar el material limpio y seco, limpiar el área de
trabajo, revisar y cerrar todas las conexiones de luz, agua y gas, así como verificar que los equipos
estén apagados.
13. Todo material que se deje almacenado en el refrigerador, congelador u otra parte en el Laboratorio
de Biotecnología, deberá ser debidamente etiquetado, indicando: fecha, nombre, material y
sustancia almacenada. Todo material que no cumpla con esta condición será desechado.
14. No se admitirán personas ajenas al Laboratorio de Biotecnología, toda persona no acreditada para
trabajar en dicho laboratorio será invitada a retirarse.
15. Todo equipo deberá de tener un responsable que vigié limpieza, su calibración, su instalación y su
buen funcionamiento. Ello con el objeto de darle un buen uso y mantenimiento para el
funcionamiento óptimo del trabajo en el laboratorio de docencia e investigación.
16. Ningún equipo puede ser extraído del Laboratorio de Biotecnología sin el consentimiento del
responsable de dicho laboratorio. Para efecto de préstamo de equipo o material, se deberá llenar
el formato de préstamo de equipo, en donde el solicitante se compromete a responsabilizarse del
equipo y a contribuir de forma económica para la reparación que se tenga que hacer al equipo.
17. Los profesores que utilicen el Laboratorio de Biotecnología deberán obedecer el presente
reglamento. Así también, deberán hacer respetar dicho reglamento por los estudiantes y mantener

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en buenas condiciones de funcionamiento y limpieza el equipo e instalaciones del laboratorio.

18. Todo profesor que efectúe alguna práctica de laboratorio o dirección de proyectos de
investigación deberá estar pendiente de sus estudiantes y de sus experimentos y
responsabilizarse de todo incidente que ocurra durante la utilización del Laboratorio de
Biotecnología.
19. Cualquier usuario de algún equipo del Laboratorio de Biotecnología, deberá solicitar su utilización
con el responsable del Laboratorio de Biotecnología. Una vez obtenido el visto bueno para su uso,
deberá anotar en el cuaderno propio a cada equipo: su nombre, el nombre de su responsable, las
condiciones de uso, la fecha y la hora.
20. Todo usuario del Laboratorio de Biotecnología deberá respetar·la clasificación y el orden de los
reactivos existentes en el laboratorio.
21. Todo profesor con acceso al almacén del Laboratorio de Biotecnología deberá respetar el orden
del equipo, material y sustancias ahí almacenadas. Así también, en caso de extraer algún equipo,
material o reactivo del almacén deberá avisar encargado del Laboratorio de Biotecnología a fin de
mantener los inventarios al día.
22. El responsable del Laboratorio de Biotecnología, junto con el presidente de la Academia de
Biotecnología realizarán las demandas necesarias al Jefe de Departamento de Bioprocesos, en
relación al abasto de agua destilada, material de seguridad (guantes, googles, tapa boca, etc.) de
tal forma que la seguridad en el Laboratorio de Biotecnología sea mantenida.
23. Toda persona que no cumpla con dicho reglamente será sancionada por la Academia de
Biotecnología en base a la infracción cometida.

Reglamento aprobado por la Academia de Biotecnología de UPIBI en su cuarta reunión ordinaria del
primer semestre 2001-2002 del 9 de noviembre de 2002.

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INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

OBJETIVOS DEL CURSO

Objetivo general

Capacitar al alumno en el uso y manejo de los equipos e instrumentos de laboratorio

Objetivos particulares
 Capacitar al alumno en el uso de micropipetas, espectrofotómetro, centrifuga e
instrumental de laboratorio.
 Preparación del reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y del reactivo de
Bradford
 Elaboración de las curvas estándar para la determinación de azúcares reductores y
proteína

C.1. CAPACITACIÓN DEL USO Y MANEJO DE LOS EQUIPOS DE

LABORATORIO.
MICROPIPETAS

En diversas áreas, es necesario el empleo de volúmenes pequeños, en el caso de este

laboratorio, en el orden de microlitros (μL). Para tomar estas cantidades con exactitud y
reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable. Los errores
de medida que se pueden cometer dependen principalmente del usuario y no de la
micropipeta en sí, a menos que esta no esté bien calibrada.

Procedimiento para transferir correctamente un volumen con una micropipeta:

1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que esté dentro del
intervalo establecido para la pipeta). Tomarla como se muestra en la figura 1,
identificando los topes del émbolo.

Posición Inicial1   2 3 4
Primer Tope 
Segundo Tope 

Figura 1. Manera de asir una pipeta automática y tomar una muestra (presión del émbolo).
2. El volumen requerido se fija girando el émbolo (Fig. 2). Se debe girar suavemente
(evitar estar cambiando constantemente los volúmenes, para evitar descalibrar las
pipetas). NUNCA fijar el volumen más allá de los límites de la pipeta.

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Figura 2. Manera de fijar el volumen deseado.

3. Colocar una punta desechable en el vástago de la pipeta (Fig. 3); asegurando que
esté bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsión y presionando. Tener
cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada
fuertemente dificultando retirarla.

Figura 3. Colocación de punta y toma de muestra.

4. Tomar la muestra presionando suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer
tope.
5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no más de 3 mm de la superficie
de líquido, manteniendo la pipeta en posición vertical (Fig. 4).
6. Succionar el líquido, relajando suavemente y controlando la presión con el dedo
pulgar, sin permitir que el émbolo suba por sí solo. Se espera un par de segundos
con la punta introducida en el líquido.
7. Retirar la punta de la muestra.
8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter, colocando la
punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solución.
9. Presionar el émbolo lentamente, llevándolo hasta el primer tope, continuando
inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del líquido que está
en la punta.
10. Con el émbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la pipeta, deslizando
la punta a lo largo de la pared del tubo.
11. Llevar el émbolo a la posición inicial, controlando con el dedo (sin permitir que el
émbolo suba por sí solo).
12. Retirar la punta de la pipeta, presionando el expulsor de puntas o tirando de ella,
(Fig. 4). En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la
mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja
y sube el émbolo repetidamente sin llegar al primer tope.
El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 5.

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Figura 4. Remoción de punta

Figura 5. Procedimiento general del uso de las micropipetas

Para que las medidas sean correctas se deben tener en cuenta, entre otras, las siguientes
consideraciones:

 La pipeta debe de mantenerse siempre en posición vertical durante todo el proceso

de pipeteo, nunca inclinada. También, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar
siempre en posición vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente
encima de la mesa y menos una vez que tenga líquido succionado.
 Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden
solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se puede
seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado. En éstas, no
se deben ajustar volúmenes superiores o inferiores a los que se recomiendan para
cada pipeta.
 Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 μL usan puntas amarillas (o
blancas), y las micropipetas que toman volúmenes superiores a 200 μL hasta 1 mL
usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas que manejan
volúmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 μL, pueden usar otro tipo de puntas
específicas.
 La pipeta se agarra como si se tomara una empuñadura. La parte superior debe de
reposar sobre su dedo índice (Fig. 1).
 Todas las pipetas tienen dos topes: Primer tope para tomar el volumen calibrado;
Segundo tope para expulsar de forma más eficiente el volumen tomado y se usa solo
cuando se está expulsando el contenido.
 Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomará un volumen
mayor al deseado, un volumen ERRÓNEO. El segundo tope es para sacar de forma
más eficiente el volumen establecido.
 Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe de realizar
lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas
dentro de la punta de la pipeta, que alterarían los volúmenes; así mismo se podría
ensuciar la parte interna de la pipeta.

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 También se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no está

bien ajustada a la pipeta.

Trabajo práctico

Cada equipo comprobará que su juego de micropipetas se encuentra calibrado mediante el

siguiente procedimiento:
1) Seleccionar la micropipeta y puntas adecuadas.
2) Colocar en la balanza un recipiente (Vaso de precipitados 50 mL o tapa de caja Petri)
y tarar a cero.
3) Transferir, siguiendo el procedimiento antes mencionado, el volumen de agua
indicado en la tabla 1.
4) Registrar el peso indicado en la balanza y tarar.
5) Repetir los pasos 3 y 4, de 3 veces para cada volumen indicado en la tabla, para
cada micropipeta.
6) Para el caso de soluciones viscosas como el glicerol, se debe de soltar el embolo
lentamente permitiendo que el líquido ascienda dentro de la punta, evitando que se
formen burbujas. Una vez tomado todo el volumen, limpiar la punta por fuera y
transferir el volumen a un microtubo.

NOTA IMPORTANTE
Cuando se pipetean solventes volátiles (como diclorometano, acetona, cloroetileno,
cloroformo, etc.) antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con el solvente. Esto
se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el émbolo repetidamente sin
llegar al primer tope. Finalmente teniendo la punta en el solvente bajar el émbolo hasta el
primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la posición inicial. Si no se satura, al
sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se volatiliza dentro de la misma.

Cuando se toman muestras viscosas o densas (como el glicerol), debe esperar a que suba
muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrará aire, formando
burbujas. Esto indica que aún no se había tomado todo el volumen y se debe repetir todo el
procedimiento.

Tabla 1. Volúmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas

Micropipeta 1000 μL 200 μL
Volumen 600 150
Peso 1
Peso 2
Peso 3
Media

Practicar con el profesor la toma de muestras volátiles dentro de la campana de extracción

de humos utilizando el solvente indicado por el profesor.

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C.2. Adiestramiento en el uso, funcionamiento y bases del

Espectrofotómetro y centrífugas

Fotometría

La fotometría o "medición de la luz" es un método óptico de análisis dentro del cual se

encuentran la colorimetría y la espectrofotometría, que miden la cantidad de luz absorbida o
transmitida por sustancias coloras e incoloras respectivamente.

La luz visible es una forma de energía electromagnética, igual que los rayos ultravioleta,
infrarrojos etc., que es irradiada a partir de una fuente energética en líneas o rayos
virtualmente rectos. Se propaga en el vacío sin necesitar sustancia transportadora. Dentro
de su trayectoria rectilínea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran
perpendicularmente a su dirección de desplazamiento.
Se denomina longitud de onda (λ) a la distancia entre dos picos sucesivos de una onda.
La luz que percibe el ojo humano se denomina luz visible y comprende desde 400 a 700 nm.
Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama infrarroja;
entre 100 y 400 nm es radiación ultravioleta (UV).
Cuando un objeto se interpone en la trayectoria de un haz de radiación, la energía puede
atravesar el objeto (transmisión, T), ser reflejada por el objeto (reflexión, R) o ser captada
por el objeto (absorción, A). Las medidas de absorción de luz se basan en dos leyes, la ley
de Lambert y la ley de Beer.

Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio

absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio
absorbente aumenta.

∙
I = I0 ⋅ 10 -K.L ∙ 10 log ∙
Dónde:
I = intensidad de luz transmitida I0 = intensidad de luz incidente
K= coeficiente de extinción molar
L= espesor de capa

K es el coeficiente de extinción, define la cantidad de luz que una substancia absorbe a cierta
longitud de onda, por unidad de masa o por concentración molar.

Ley de Beer. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente
(Figura 6), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la
concentración de la sustancia absorbente en el medio.

´∙
∙ 10 ´∙
Dónde:
C = concentración de la sustancia absorbente

Absorbente concentración C
Luz Rayo incidente  Rayo emergente 
monocromática

Intensidad I0 Intensidad I
Espesor de la solución L
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Figura 6. Diagrama del paso de luz monocromática a través de una solución

Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer:

∙ ∙
∙ 10 ∙ ∙

Dónde:
ε = coeficiente de extinción molar, es una medida de la energía absorbida cuando la solución
contiene un mol por litro.

El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele expresar como
un porcentaje

% ∙ 100

La expresión se conoce como absorbancia (A) o densidad óptica (DO)

. . ∙ ∙ ; para L=1, A = ε⋅c

T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T

ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFÓTOMETRO

Espectrofotómetros: Los métodos fotométricos de análisis utilizan los efectos de la

interacción de las radiaciones electromagnéticas con las moléculas. Los aparatos de
medición de la absorción de la radiación electromagnética se denominan
"espectrofotómetros" y generalmente constan de (Figura 7): Una fuente de luz, un
monocromador, que desdobla la luz en haces monocromáticos, de un colimador que tiene
una rendija de ajuste variable, pasando a través del mismo sólo luz de una determinada
longitud de onda (la utilización de la luz monocromática o de un intervalo pequeño de
longitudes de onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas
condiciones), la luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide sobre
el fototubo donde es detectada, La señal se envía a un registrador que convierte la señal a
un registro análogo, digital o gráfico.

En algunos colorímetros este registro consta de dos escalas, una mide absorbancias (A)
y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a ∞ , la de T va desde 0 a 100, en
sentido contrario.

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Colimador Fototubo

Registro 
Monocromador  Celda con 
muestra

Fuente de luz 
Figura 7. Esquema de las partes básicas de un espectrofotómetro
Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una
CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia = a cero de absorbancia.
Posteriormente, se introduce una celda con la muestra y se determina, ya sea la
transmitancia o la absorbancia a la longitud de onda determinada.

Colorímetros: Los métodos colorimétricos son una aplicación de la espectroscopia y se

basan en la medida de la absorbancia de una solución coloreada en la región visible del
espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele ser una lámpara de wolframio. Los
compuestos no coloreados se transforman en otros con color, susceptibles de ser medidos
colorimétricamente, mediante reacción con compuestos adecuados, y de esta forma se
puede analizar en la región visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar
sus posibilidades de utilización.

Trabajo práctico.

Los maestros de laboratorio indicarán cómo operar y programar los equipos. El

alumno deberá anotar en su bitácora cada paso y realizar un diagrama de flujo de los
pasos, así como las consideraciones que hay que tener en el manejo, mantenimiento
y limpieza del equipo. Existen diferentes modelos de espectrofotómetros en los
laboratorios de docencia, de investigación y una gran gama en el mercado. Para la
lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o desechables de plástico,
existen de diferentes volúmenes de operación 4, 2 y 1 mL. Antes de usar, siempre
regístrese en la libreta de control del equipo. Registrar cómo se ajusta el blanco, se
cambia la longitud de onda, se leen múltiples longitudes de onda, y relaciones de
longitudes de onda.

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CENTRÍFUGA

La centrifugación es una operación unitaria que consiste en aplicar un aumento en el campo

gravitacional de una región en la que se contiene una suspensión al hacer girar esta
rápidamente mediante un rotor. Esta operación logra que partículas suspendidas en un
solvente precipiten rápidamente y se acumulen al fondo del sistema, idealmente, dejando al
solvente libre de partículas suspendidas. Esta operación depende de diversos factores como
son: diferencia de densidades partícula-solvente, viscosidad del medio, diámetro de
partícula, forma de partícula, velocidad del rotor, ángulo del rotor, etc.

La mayoría de las operaciones en el laboratorio, emplean agua como solvente, en

centrífugas con rotores fijos. Por lo tanto, los únicos parámetros que se pueden ajustar para
controlar el resultado de la operación son el tiempo y la velocidad de centrifugación (en
algunas centrífugas, también la temperatura). La velocidad de centrifugación suele medirse
en dos formas: como revoluciones por minuto (RPM) o veces que aumenta la fuerza del
campo gravitacional (xg). Si bien, muchos protocolos indican la velocidad en RPM, es más
conveniente utilizar xg, ya que esta es la fuerza de la que depende la separación, y para una
misma velocidad en RPM, el valor de xg varía con el ángulo y diámetro del rotor.

Trabajo práctico.

La centrífuga emplea grandes fuerzas, por lo que es indispensable que el rotor se mantenga
equilibrado para evitar que este se venza hacia uno de sus lados. Para ello, el rotor cuenta
con camisas removibles, dentro de las cuales se colocan los tubos a centrifugar. Todos los
tubos que se desea centrifugar deben ser debidamente equilibrados, ajustando el peso del
tubo y la camisa a otro par tubo y camisa, adicionando agua en la camisa de uno de los
tubos, por medio de una balanza de dos platillos. Cuando la centrífuga no cuenta con
camisas removibles, se deben equilibrar pares de tubos. Cuando se desea centrifugar un
número impar de tubos, o no es posible adicionar o modificar al contenido de los tubos, se
emplean “tubos de equilibrio”, tubos a los que se coloca agua para equilibrar su peso con el
de los tubos de muestra.
Una vez equilibrados, los tubos equilibrados se colocan opuestos en el rotor, y los
distintos pares se reparten de manera lo más homogénea posible para procurar que todo el
diámetro del rotor se encuentra sujeto aproximadamente a la misma fuerza y este no se
venza hacia algún lado.

Con ayuda del profesor, reconocer las partes de las centrífugas del laboratorio, identificar
sus controles y conocer el procedimiento de operación.

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C.3. PREPARACIÓN DE REACTIVOS REQUERIDOS EN EL

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES.

Preparar las cantidades indicadas por los profesores de los reactivos indicados a
continuación, siguiendo las instrucciones presentadas en el Anexo I del manual.

Reactivo de Bradford,
Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS),
Amortiguador de fosfatos pH 6.0, 0.16 M,
Amortiguador de acetatos pH 4.5, 0.25 M,

C. 4. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES.

Los medios de cultivo son mezclas más o menos complejas, compuestas por diversas sales,
iones, micronutrientes, nutrientes complejos, entre otros. La composición de los medios varía
considerablemente dependiendo del sistema, célula, objetivo de la fermentación, etc. Los
mediossiempre contienen c una fuente de carbono (generalmente un azúcar), que suele ser
la fuente principal de energía para los microorganismos. En sustratos complejos diversas
enzimas catalizan reacciones sobre mono, di, oligo y polisacáridos.

Por todo esto, el conocer la concentración de azúcares en un sistema permite conocer el

transcurso de reacciones, tanto microbianas como enzimáticas. Existen diferentes tipos de
azúcares, y múltiples métodos para cuantificar cada uno de ellos. Dentro de estos, se
presentan dos de los métodos más sencillos y útiles para los fines del laboratorio.

Determinación de azúcares reductores mediante el reactivo DNS

1. Preparar una serie de microtubos de 1.5 mL (un microtubo por cada muestra y
adicionalmente un tubo que se utilizará como blanco), a cada uno de ellos se le adiciona
0.1 mL (100 µL de reactivo de ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS)
2. Adicionar a cada tubo (CON EL dns), 0.1 mL (100 µL) de cada una de las diluciones
preparadas de acuerdo a la curva tipo que se trabaje (Tabla 2) o de las muestras a
tratar. Se puede homogenizar la rección con pequeños golpes con los dedos o pasando
por la gradilla.
3. Se puede sellar la tapa del tubo con película plástica, para evitar que se abran durante
la ebullición, en tubos con tapas de rosca no es necesario.
4. Poner todos los tubos simultáneamente a baño maría en ebullición por 5 min.
5. Posteriormente pasar a baño de hielo por 5 min o hasta que estén a temperatura
ambiente.
6. Añadir 1 mL de agua destilada a cada tubo.
7. Homogenizar los tubos volteando los tubos, y pasar a una celda.
8. Determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm en el espectrofotómetro,
ajustando la absorbancia a cero con el blanco. Las lecturas con absorbancias mayores
a 1 no se consideran para la curva.
9. En el caso de que la absorbancia de una muestra sea mayor a 1 se deberá de realizar
una dilución de la muestra original y repetir todo el procedimiento antes descrito.

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Curva tipo de glucosa

La curva patrón se realiza con glucosa (glucosa+fructosa) en un intervalo de concentración

de 0 a 3 g/L. Preparar diluciones, por triplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratar cada muestra
de acuerdo a la técnica de azúcares reductores por DNS antes descrita.

Tabla 2. Diluciones para la curva patrón de maltosa o glucosa o glucosa + fructosa.

Concentración de Volumen de la Volumen de
azúcar (g/L) solución de 3 g/L agua destilada
Tubo (mL) (mL)
1. (Blanco) 0.0 0.0 1.0
2 0.3 0.1 0.9
3 0.6 0.2 0.8
4 0.9 0.3 0.7
5 1.2 0.4 0.6
6 1.5 0.5 0.5
7 1.8 0.6 0.4
8 2.1 0.7 0.3
9 2.4 0.8 0.2
10 2.7 0.9 0.1
11 3.0 1.0 0.0

Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje “y”) los valores
de absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las abscisas (eje ”x”) la concentración
de maltosa en g/L.

Obtener la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros:

y = mx + b; y el coeficiente de correlación r2

En donde “y” representa la absorbancia determinada a 540 nm. “x” representa la

concentración de maltosa determinada en g/L. La curva patrón será correcta cuando se
obtenga una correlación (r2) mayor o igual a 0.95.

15
  

C.5. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA

Las proteínas están presentes en los medios y en los cultivos como sustrato y como enzimas
sistetizadas por los microprganismos para llevar a acabo el metabolismo, pésima redacción.
Conocer la concentración de porteína en un medio o un extracto enzimático es parte
indispensable para la caracterización del medio y de las enzimas. Las proteínas son
polímeros de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Existen diversas técnicas
que ayudan a estimar la concentración de proteínas, ya sea a partir de reacciones con los
extremos amino y carboxilo, formación de complejos con el enlace peptídico o diversas
determinaciones para algunos grupos R de los aminoácidos.

Determinación de la concentración de proteína por espectrofotometría con luz UV a

280nm.

La determinación de la concentración de proteínas puede realizarse por varios métodos, uno

de los más sencillos consiste en determinar la absorbancia a 280 nm. A esta longitud de
onda, los grupos R de los aminoácidos aromáticos presentan un máximo de absorción. El
cálculo de la concentración de proteína puede realizarse fácilmente a partir de la
absorbancia de la muestra si se conoce el valor de su coeficiente de extinción molar (∈ [g-1L
cm-1]), por ejemplo para la albúmina de suero bovino (BSA) su *∈280 [g-1L cm-1] es de 0.667.
*∈280: coeficiente de extinción molar a 280 nm. Donde va el asterisco ¿

Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con albúmina de suero bovino
(BSA) o la proteína a trabajar, como se indica en la Tabla 3:

Donde se cita la tabla 6 no hay texto ni contexto ¡

Tabla 3. Curva patrón de BSA para lectura a 280 nm.

Conc. de BSA
(μg/mL)
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Sol. de BSA
1000 μg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
(mL)
Agua destilada
(mL)
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se determina la absorbancia a 280 nm
ajustando el equipo a una absorbancia de cero con un “blanco de reactivos” (el que no
contiene proteína). Con los datos, realizar una regresión lineal y obtener la ecuación de la
recta, con la que se calculará la concentración de la proteína “problema”.

Método de Bradford

El método de Bradford involucra la unión del azul brillante de Coomassie G-250 a la proteína.
Esta unión provoca un color con un máximo de absorción de 465 a 595 nm lo que permite
la cuantificación. Dicha unión es independiente de los aminoácidos que constituyen las
proteínas. La concentración de proteína se determina por medio de una curva tipo con
albúmina sérica bovina (BSA) y el reactivo de Bradford.

16
  

Curva tipo de proteína para el método de Bradford

Preparar diferentes diluciones de BSA entre 0 y 100 µg/mL, a partir de una solución de 100
µg/mL (Tabla 4).

Tabla 4. Curva Tipo de albúmina de suero bovino (BSA), para determinación de proteína
por el método de Bradford
Concentración
de BSA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(μg/mL)
Solución de
BSA 100 μg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
(mL
Agua destilada
(mL)
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

1. Adicionar 0.25 mL de cada concentración de la curva y de la muestra problema en un

una celda de espectrofotómetro..
2. Adicionar 0.75 mL del reactivo de Bradford y agitar (con la punta de la pipeta)
3. Incubar los tubos a temperatura ambiente por cinco minutos.
4. Determinar la absorbancia de los tubos a una longitud de onda de 595 nm, ajustando la
absorbancia a cero con el blanco (agua con Bradford).
5. Realizar una regresión lineal con los datos obtenidos y obtener la ecuación de la curva.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Absorbancia 280 nm
1. Preparar la serie de tubos de acuerdo a la tabla 5 . Determinar la absorbancia de las
muestras de la curva tipo de BSA a una longitud de onda de 280 nm, ajustando el
espectrofotómetro a cero utilizando agua como blanco
2. Con los datos, realizar una regresión lineal y obtener la ecuación de la recta, con la que
se calculará la concentración de la muestra “problema”.
3. Interpolar las absorbancias obtenidas de la muestras “problema”, las cuales las
proporcionará el profesor, en la ecuación de la curva estándar de proteína para lectura
a 280 nm.

Análisis de muestra problema

a) Realizar diversas diluciones (1:10, 1:20, 1:50, 1:100) de acuerdo a las instrucciones
del profesor de la muestra problema que se proporcione.
b) Leer la absorbancia de cada una de las diluciones a 280nm.
c) Tratar cada una de las diluciones por el método de Bradford (por duplicado).
d) Utilizar las absorbancias obtenidas de las diluciones de la muestra problema que se
encuentren dentro de los valores mínimo y máximo de absorbancia de la curva tipo
correspondiente. Estas absorbancias se interpolan en las ecuaciones de cada curva
tipo y así determinar la concentración de proteína.
e) Comparar los resultados obtenidos por ambas técnicas.

Referencias

Martin Holtzhauer (2006). Basic Methods for the Biochemical Lab. 1era edición en Inglés.
Springer Labor Manual, págs. 6 - 8.
Bradford MM (1976) Anal Biochem 72:248.
Whitaker JR, Granum PR (1980) Anal Biochem 109:155.
17
  

PRÁCTICA 1. Determinación de crecimiento celular por

turbidimetría (D.O.), peso seco y cuenta directa en cámara de
Neubauer
INTRODUCCIÓN

Cuando se emplean microorganismos en una Bioconversión, la concentración de células (N,

UFC/L) o de biomasa (X, g/L) presente en el sistema es un indicativo del avance de la
cinética microbiana y por tanto del proceso. Conocer el comportamiento de la biomasa a lo
largo del tiempo, permite identificar la fase de crecimiento y avance del crecimiento.

OBJETIVO GENERAL

Determinar la concentración celular de un cultivo microbiano utilizando las técnicas de

Densidad óptica, Peso seco y Conteo directo en cámara.

OBJETIVOS PARTICULARES

 Comprender el fundamento teórico de las técnicas de Densidad óptica, Peso seco

y Conteo directo en cámara.
 Realizar diluciones determinando la concentración celular con ayuda de las
técnicas de Densidad óptica, Peso seco y Conteo directo en cámara.
 Establecer la correlación entre la biomasa microbiana y la densidad óptica
graficando ambas variables
 Establecer la correlación entre la biomasa microbiana y el número de células
graficando ambas variables

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Densidad óptica

Es posible estimar la cantidad de biomasa en el medio de cultivo mediante la turbiedad

generada en el medio por esta. Únicamente se requiere de un espectrofotómetro para
comparar la absorbancia del cultivo respecto al medio limpio, al incrementar la concentración
de biomasa, la absorbancia aumentará. Es una técnica rápida y sencilla que da una lectura
relativamente confiable.

1. Se parte de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae con un crecimiento mínimo de 16

h.
2. Realizar una serie de diluciones utilizando solución salina como diluyente (puede en su
lugar emplearse medio de cultivo sin inocular o sobrenadante de centrifugación del
caldo). Las diluciones que se deben de preparar son las siguientes: 1:5, 1:10, 1:25, 1:50,
1:100.
3. Ajustar el espectrofotómetro a 600 nm. La longitud de onda a la cual se determina la
densidad óptica dependerá del tipo de microrganismo que se esté utilizando.
4. En una celda para espectrofotómetro, colocar un poco de medio de cultivo sin inocular,
y utilizar como blanco; ajustando a 0 la absorbancia.
5. Colocar cada una de las diluciones en celdas para espectrofotómetro.
6. Determinar la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm de cada una de las
muestras.

18
  

Las lecturas de absorbancia deben encontrarse dentro del intervalo de linealidad de la curva
estándar (depende de la técnica y el equipo en que se determina la absorbancia). En caso
de ser menores a cero, se considera un valor de cero, en caso de ser mayor el límite de
linealidad, se deben diluir utilizando un diluyente adecuado. La DO se puede graficar en
función de la concentración de proteína extracelular, peso seco, número de células, proteína
celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas para la estimación de manera rápida de todas
estas variables.

Peso seco

Una medida más precisa para estimar la concentración de biomasa es el peso seco; el cual
consiste en toma un volumen de cultivo homogéneo, que posteriormente se centrifuga y se
remueve el medio (medio de cultivo) y la pastilla celular se resuspende en un poco de agua
y se pasa a una charola de alumnio a peso constante, se introduce en una estufa a una
temperatura de 60 a 70 ºC, para ser secada y posteriormente pesada, la diferencia de pesos
proporciona la biomasa seca, determinar la biomasa en g/L considerando el peso de la
biomasa y el volumen de la muestra empleada.

1. El día anterior a la determinación, etiquetar charolas de aluminio (dos por cada muestra)
e incubarlas a 60°C por 24 horas en una estufa hasta alcanzar el peso constante.
2. En el momento de realizar la determinación, atemperar las charolas en un desecador y
pesarlas.
3. Tomar 10 mL de cada de una de las diluciones del medio de cultivo, y colocarlos en
tubos para centrífuga de 15 mL.
4. Equilibrar el peso de los tubos de dos en dos.
5. Centrifugar las muestras a 6000 rpm por 5 minutos.
6. Desechar el sobrenadante de centrifugación, y resuspender la pastilla en 1 mL de
solución salina con ayuda de un vortex.
7. Colocar las pastillas resuspendidas en cada una de las charolas previamente pesadas.
8. Incubar las charolas en una estufa a 60°C por 24 h.
9. Atemperar las charolas en desecador y pesar cada una

La biomasa en 10 mL se obtiene de la diferencia entre el peso final e inicial de cada charola.

Cuenta directa en Cámara de Neubauer

Otro método, preferentemente para células grandes como las levaduras o células
sanguíneas, es contar directamente al microscopio. Esto presenta la ventaja de evitar
interferencias (agentes ajenos a la biomasa que generan turbiedad o variaciones de peso)
presentes en otras técnicas. Otra ventaja de esta técnica, es que permite acoplar colorantes,
los cuales ayudan a diferenciar entre células vivas y muertas.
La cámara de Neubauer es una cámara adaptada para ser utilizada en un microscopio de
campo claro o de contraste de fases. En una cámara simple, la porción central, que es donde
se realiza el conteo, está dividida en 3 partes. En la parte central se encuentra grabada una
retícula cuadrangular. En el caso de las cámaras dobles, que son las más comunes, existen
2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje longitudinal de la cámara. (Figura 8).
La retícula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1
mm de lado cada uno. (Fig. 8. [1]).

En caso de recuento de sangre, los cuadrados de las esquinas son los destinados al
recuento de leucocitos. Al existir estos en menor número que los hematíes, se necesitan
menos líneas de referencia para realizar el conteo. El cuadrado central es el destinado al
recuento de hematíes, plaquetas, levaduras. Se divide en 25 cuadrados medianos de 0.1
mm de lado (Fig.8. [2]), y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados
19
  

pequeños. (Fig 8. [3]). El cuadrado central está por tanto formado por 400 cuadrados
pequeños.

Dependiendo del tipo de células que se desean contar se selecciona la cuadricula

correspondiente. En caso de levaduras se deben contar el número de células de cuatro o
cinco cuadros del área central (Fig 8. [3]). La concentración en la suspensión celular será:

Cél/mL = N x 25*104 X Fd (1)

Dónde:
 N: La media de las células contadas (suma de células contadas por
subdivisión/Número de subdivisiones contadas)
 25: números de subdivisiones
 104: factor para pasar el número de células en el volumen del cuadrado central a mL,
donde (volumen = 1 mm * 1 mm * 0.1 mm = 0.1 mm3) y 1000 mm3 = 1000 μL=1 mL,
por lo tanto 0.1 mm3 * 104 = 1000 mm3 = 1 mL
 Fd: factor de dilución realizado a la muestra original

Figura 8. Cuadrícula de conteo de la cámara de Neubauer. (Tomado de “Technical Note -

Fórmula de la cámara de Neubauer”. Oscar Bastidas)

El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma:

1. Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cámara de Neubauer.
2. Colocar el cubreobjetos sobre los canales.
3. Agitar la suspensión celular para tener una muestra homogénea.
4. Con ayuda de una pipeta serológica de 1 mL o con una pipeta automática de 100 µL,
tomar 0.1 mL de la suspensión y colocar la punta de la pipeta en el canal y el borde del
cubreobjetos; dejar que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que pase a
los canales laterales. Si se forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y
secando la cámara previamente.
5. Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x.
6. Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrícula de 25 cuadros de 0.04
mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar el número de células de 5 o
20
  

más subdivisiones. Evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna. Cuando una
célula se encuentra en alguno de los bordes, se elige si la célula cuenta o no según se
encuentre sobre el borde superior o inferior y derecho o izquierdo.
7. En caso de que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo, será
necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser tenida en
cuenta en la estimación final (Factor de dilución, F).
8. Calcular el número de células de acuerdo a la fórmula 1.

ANÁLISIS DE RESULTADOS.

1. Presentar en una tabla los valores obtenidos por las tres determinaciones (con sus
unidades correspondientes) para cada dilución.
2. Elaborar tres gráfivas con ecuación y correlación de :
a. absorbancia (x) vs peso seco (y).
b. absorbancia (x) vs número de células (y).
c. peso seco (x) vs número de células (y).

REFERENCIAS.

Oscar Bastidas. Technical Note - Neubauer Chamber Cell Counting. Celeromics, inc.
Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications and
procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).

21
  

PRÁCTICA 2. Determinación de actividad enzimática y efecto de la

concentración de enzima.

INTRODUCCIÓN

Dentro de toda célula se realizan miles de reacciones que son necesarias para el
crecimiento, mantenimiento y desarrollo de la célula (metabolismo celular); las moléculas
que llevan a cabo estas reacciones son las enzimas.

Las enzimas son proteínas con capacidad catalítica, es decir, reducen la energía de
activación de la reacción para acelerar la reacción. Las enzimas transforman el sustrato y se
obtiene un producto, pero a diferencia del producto que sufre una transformación, la enzima
no sufre ningún cambio después de realizada la reacción; para que se lleve a cabo la
reacción es necesario que la enzima y el sustrato estén en contacto, para esto la enzima
tiene un sitio catalítico donde entra el sustrato (existen dos modelos: el de “llave – cerradura”
y el de ajuste inducido) formándose el complejo Enzima – Sustrato y se llevan a cabo una
serie de pasos (estado transitorio) para finalmente obtener el producto de la reacción.

→ →
Para poder estudiar, o emplear una enzima, es necesario conocer su concentración, y si
bien es posible conocer de manera relativamente sencilla la cantidad de proteína en un
sistema, poder determinar cuánto de esas proteínas corresponde a la enzima de interés, o
cuánta de esa enzima se encuentra en forma total o parcialmente funcional es sumamente
complicado y costoso. Por ello, para facilitar el uso de las enzimas, en lugar de medir
directamente la cantidad de enzima en el sistema, se mide la capacidad catalítica de una
preparación enzimática.

La capacidad catalítica de una enzima se puede determinar al cuantificar, ya sea la

disminución de sustrato o la formación de producto. Dicho de otra manera, se obtiene la
velocidad de formación de producto o consumo de sustrato.

A la capacidad catalítica de una preparación de enzimas se le llama Actividad Enzimática,

que se puede definir como la concentración del sustrato transformado por min (g/ L min o
moles/L min o mmoles/L min, o µmoles/L min). La comisión de enzimas (EC) de la IUPAQ,
define la Unidad Internacional de Actividad enzimática (UI) como “la cantidad de enzima
necesaria para transformar 1 micromol de sustrato en un minuto” en condiciones definidas
de pH y temperatura. Otra medida importante, es la actividad específica de una
preparación, que es el resultado de dividir las unidades de actividad enzimática del
sistema entre la cantidad de proteína (en mg) en el sistema.

Además de la definición de Unidades Internacionales, existen otras unidades para ésta, por
ejemplo, las del Sistema Internacional de Unidades. El SI emplea como unidad de actividad
enzimática el katal (kat), que se define como la cantidad de enzima necesaria para
transformar un mol de sustrato por segundo. La existencia de estas unidades se debe a que
la velocidad de catálisis de cada enzima puede variar mucho con respecto a la de otras
enzimas, siendo complicado el uso de una misma unidad para todas las enzimas; por
ejemplo, el katal es una unidad demasiado grande para la actividad enzimática de casi todas
las enzimas, siendo más común el uso de submúltiplos, como el microkatal o nanokatal.

22
  

OBJETIVO GENERAL

Analizar el efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar la actividad enzimática de enzima (α-amilasa o invertasa)

 Calcular la actividad enzimática en las diferentes unidades.
 Determinar el efecto de la concentración de enzima en la actividad enzimática.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Materiales y Reactivos:

Reactivos:

Regulador de acetatos 0.025 M pH 5.0

Solución de invertasa en regulador de acetatos 0.025 M pH 5.0
Reactivo de DNS
Reactivo de Bradford
Solución de sacarosa 30 g/L en regulador de acetatos 0.025 M pH 5.0
Agua destilada.

Materiales:

Juego de Micropipetas.
Puntas de 200 y 1000 µL para micropipetas.
Agitador magnético.
Microtubos de 1.5 mL.
Baño maría.
Espectrofotómetro.
Celdas para espectrofotómetro.

Medición de la actividad catalítica de la enzima.

1. Antes de iniciar, preparar un baño maría en ebullición y un baño de hielo.

2. Preparar 36 microtubos de 1.5 mL adicionando a cada uno 0.1 mL (100 µL) del reactivo
DNS. Proteger los tubos de la luz.
3. Preparar un microtubo de 1.5 mL con 0.1 mL del reactivo DNS y adicionar 0.1 mL del
regulador de fosfatos en que se preparó la enzima. Este microtubo será el blanco del
ensayo. Adicionalmente preparar otro microtubo de 1.5 mL con 0.1 mL del reactivo de
DNS y adicionar 0.1 mL de la solución de sacarosa. Este microtubo será el testigo del
ensayo enzimático.
4. En otros 9 tubos Eppendorf, se agregaron 0.95mL de solución de sacarosa al 3%, 3
para cada concentración de enzima
5. Añadir a 3 tubos 0.05mL de la solución de Invertasa de una concentración en intervalos
de 30 s.
6. Una vez transcurridos 1 y 3 min de reacción de cada tubo, tomar 0.1mL de la solución
de reacción y transferir a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS por duplicado.
7. Repetir la reacción (punto 5 y 6) con las otras dos concentraciones de enzima.

23
  

8. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto con
el blanco y el testigo con la técnica de determinación de azúcares reductores

9. Determinar mediante el método de Bradford u UV (por duplicado), la concentración de

proteína en cada una de las soluciones enzimáticas proporcionadas por el profesor.
10. Utilizando la ecuación de la curva patrón de glucosa, interpolar las absorbancias para
calcular las concentraciones de azúcares reductores y determinar las actividades
enzimáticas

Una Unidad corresponde a la cantidad de enzima que libera 1 µmol de maltosa por minuto
a pH 6.0 y 25°C.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Medición de Actividad Catalítica.

Para obtener la actividad enzimática, es necesario conocer la cantidad de azúcares liberados

por minuto. Si bien, es un dato con el que ya se cuenta, es necesario considerar el testigo.
El testigo permite descartar la liberación de azúcares reductores no atribuible a la reacción
enzimática sino a otros efectos (hidrólisis ácida o térmica, efecto del tiempo de toma de
muestra, etc.). Una vez obtenidas las concentraciones de las muestras de la cinética
enzimática y también la del testigo, se procede a restar la concentración del testigo a todas
las demás concentraciones de las demás muestras.

La actividad enzimática se puede definir como la razón de cambio del producto o del sustrato
con respecto al tiempo por acción de la enzima.

Para poder calcular esta razón de cambio se procede a realizar una gráfica de dispersión de
las concentraciones de maltosa con respecto al tiempo (se grafica en el eje “x” el tiempo y
en el eje “y” las concentraciones de maltosa). Con estos datos se procede a realizar una
regresión lineal para obtener el valor de la pendiente de la ecuación obtenida; esta es la
razón de cambio, es decir, la actividad enzimática que se busca.

Una medida importante, además de la actividad enzimática es la actividad específica. Esta

es una medida de la pureza de la enzima, ya que determina la cantidad de unidades por
miligramo de proteína.

Determinar:
AE: en g/ L min , mol/L min
AE esp: en g/ L * min * mg de Port , mol/L* min *mg de Port
UI: cantidad de enzima necesaria para transformar 1 micromol de sustrato en un minuto
Katal: cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato por segundo.
Número de recambio Kcat (s-1): número de moléculas de sustrato convertidas en producto por
segundo por una molécula de enzima.

24
  

Efecto de la Concentración de enzima sobre la actividad enzimática.

 Comparar la actividad enzimática y la actividad específica para las diferentes

concentraciones de enzima
 Discutir los resultados de las actividades enzimáticas obtenidos por todos los equipos
del grupo.

REFERENCIAS

Andrés Illanes (Ed).(2008). Enzyme Biocatalysis. Principles and Applications. Springer

Science.
Durán P., E. y Muñoz A., M. (2003). Manual prácticas del laboratorio de biotecnología
alimentaria. México.

25
  

PRÁCTICA 3: Efecto de pH y temperatura en la actividad enzimática

de la invertasa

OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de los parámetros fisicoquímicos sobre la actividad enzimática
de la invertasa.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
 Evaluar el efecto del pH en la actividad enzimática.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materiales y Reactivos.

Reactivos:
 Regulador de Acetatos 0.1 M, pH 3.0, 4.0 y 5.0
 Regulador de Fosfatos 0.1 M, pH 6.0 y7.0
 Regulador de Boratos 0.1 M pH 8.0, 9.0 y 10
 Reactivo de DNS.
 Reactivo de Bradford.
 Agua destilada.

Materiales:

 Juego de Micropipetas.
 Puntas de 200 y 1000 µL para micropipetas.
 Vaso de precipitados de 20 mL.
 Agitador magnético.
 Microtubos de 1.5 mL.
 Baño maría a diferentes temperaturas.
 Espectrofotómetro.
 Celdas para espectrofotómetro.
 Potenciómetro.

Efecto del pH en la actividad enzimática.

1. Antes de iniciar, preparar un baño maría en ebullición y un baño de hielo.

2. Para cada valor de pH, preparar 2 microtubos con 0.95 mL del sustrato en el regulador
correspondiente.
3. Preparar, por cada valor de pH, 3 microtubos de 1.5 mL adicionando a cada uno 0.1 mL
(100 µL) del reactivo DNS.
4. En uno de los microtubo de 1.5 mL con 0.1 mL adicionar 0.1 mL de la solución de
sustrato al pH correspondiente; estos microtubos serán los testigos de los ensayos
enzimáticos.

26
  

11. Adicionar, con ayuda de una micropipeta, 0.05 mL (50 µL) a los 0.95 mL de sustrato a
un pH determinado en intervalos de 30 s.
12. Una vez transcurridos el tiempo exacto de reacción (3 min) de cada tubo, tomar 0.1mL
de la solución de reacción y transferir a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS por
duplicado.
13. Repetir la reacción (punto 12 y 13) para cada pH.
5. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto con
el blanco y el testigo con la técnica de determinación de azúcares reductores.
6. Utilizando la ecuación de la curva patrón de azúcares reductores, interpolar las
absorbancias para calcular las concentraciones de maltosa y llenar la tabla siguiente:
7. . Hacer la gráfica de Actividad enzimática y U vs pH de la reacción.
8. Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos los equipos
del grupo.
Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.

1. Antes de iniciar, preparar un baño maría en ebullición y un baño de hielo.

2. Para cada temperatura a ensayar (Temperatura ambiente (TA), 40, 55, 70 y 85°C),
preparar 2 microtubos con 0.95 mL de sustrato en regulador de acetatos 0.025 M, pH
5.
3. Preparar, por cada temperatura, 9 microtubos de 1.5 mL adicionando a cada uno 0.1
mL (100 µL) del reactivo DNS.
4. Se colocaron dos tubos con sustrato a baño maría a cada temperatura,
5. Posteriormente se agregaron 0.05mL de solución de invertasa a los tubos con solución
de sacarosa a diferentes temperaturas, con intervalos de 1 min entre cada reacción
6. Una vez transcurrido el tiempo de reacción se tomaron 0.1mL de la solución de
reacción y se agregó al tubo con reactivo de DNS.
7. Posteriormente se prosiguió con el protocolo del método de DNS anteriormente
descrito
8. A continuación se midió la absorbancia de las muestras a 540nm
9. Se determinó la concentración de azucares reductores en las muestras haciendo uso
de la curva patrón
10. Hacer la gráfica de Actividad enzimática y U vs temperatura de reacción.

ANÁLISIS DE RESULTADOS
Medición de Actividad Catalítica.
Para poder calcular la actividad enzimática de todos los ensayos realizados se procede
a realizar una gráfica de dispersión de las concentraciones de glucosa con respecto al tiempo
(se grafica en el eje “x” el tiempo y en el eje “y” las concentraciones de maltosa). Con estos
datos se procede a realizar una regresión lineal para obtener el valor de la pendiente de la
ecuación obtenida; esta es la razón de cambio, es decir, la actividad enzimática que se
busca.

Determinar
AE: en g/ L min , mol/L min
AE esp: en g/ L * min * mg de Port , mol/L* min *mg de Port
UI: cantidad de enzima necesaria para transformar 1 micromol de sustrato en un minuto
Katal: cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato por segundo.

27
  

Número de recambio Kcat (s-1): número de moléculas de sustrato convertidas en producto por
segundo por una molécula de enzima.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

Hacer la gráfica de unidades de actividad de la invertasa en función del pH.
Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos los equipos del
grupo.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Hacer la gráfica de unidades de actividad de la invertasa en función de la temperatura.
Discutir los resultados de las actividades enzimáticos obtenidos por todos los equipos del
grupo.

28
  

PRÁCTICA 4: Determinación de las constantes cinéticas de la

enzima libre

INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática analiza cuantitativamente los factores que intervienen en la velocidad

de reacción enzimática. Durante una reacción catalizada por una enzima, ésta reacciona
reversiblemente con el sustrato para formar un complejo enzima-sustrato. Posteriormente
este complejo participa en una reacción como reactante para dar origen a un producto y a la
enzima libre y activa, lista para participar en una nueva reacción. Esto puede ser expresado
como:

Donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente.

Uno de los factores más importantes que afecta la velocidad de una reacción enzimática es
la concentración de sustrato. A concentraciones elevadas de sustrato, la velocidad de
reacción es independiente de la concentración del sustrato; para concentraciones bajas, la
tasa de reacción es de primer orden, se ve afectada por la concentración total de enzima.
Uno de los modelos más conocidos y al que se ajusta una gran cantidad de enzimas
utilizadas comercialmente es el propuesto por Michaelis y Menten.
Sin embargo, estudiar este efecto en el laboratorio se torna difícil dado que la concentración
de sustrato varía durante el curso de la reacción. Un método que simplifica la realización de
experimentos de cinética es medir la velocidad inicial o V0 donde la concentración de sustrato
es mucho mayor que la concentración de la enzima. Bajo estas condiciones, cambios en la
concentración del sustrato son ínfimos y por lo tanto se considera que la concentración de
sustrato se mantiene constante. Cuando la concentración de enzima se mantiene constante
y la concentración de sustrato varía se obtiene la Vmax y Km (Fig. 1)

Figura 9. Gráfica de la ecuación de Michaelis‐Menten 

29
  

La velocidad V indica la cantidad de moléculas de sustrato que son catalizadas por una
preparación de enzima en determinada cantidad de tiempo. Partiendo de los datos de
concentración inicial del sustrato junto con la velocidad inicial de la reacción, puede
analizarse los datos siguiendo el modelo de Michaelis-Menten, de Lineweaver-Burk, Eadie-
Hofstee, Augustinsson; entre otros. Los últimos tres aplican transformación de los datos para
su linearización, haciendo más preciso el cálculo de los parámetros cinéticos por medio de
análisis gráfico y matemático.
Utilizando la forma original de la ecuación de Michaelis-Menten no es posible obtener un
valor preciso de la velocidad máxima, ya que los datos presentan un comportamiento
asintótico respecto a ésta.

Tomando los inversos de la ecuación se obtiene:

1 Km 1 1
  
V0 Vmax [ S ] Vmax
De donde graficando 1/V contra 1/[S] y ajustando una línea recta, se obtiene la Vmax de la
ordenada al origen y Km de la pendiente (u ordenada a las abscisas). Esta es la
aproximación de Lineweaver-Burk (Fig. 2).

Figura 2. Representación lineal de Lineweaver-Burk

Augustinsson relaciona la concentración de sustrato sobre velocidad [S] /V en función de la

concentración de sustrato [S]. La pendiente corresponde a 1/Vmax, el cruce con el eje de
las abscisas es la constante de Michaelis-Menten por menos uno. Y el cruce con la ordenada
al origen es Km/Vmax.
S 1 Km
 S 
V0 Vmax Vmax
Eadie-Hofstee, también llamado de Woolf-Eadie-Augustinsson-Hofstee o de Eadie-
Augustinsson, relaciona la velocidad de la reacción V, con la velocidad entre la
concentración de sustrato V / [S]: V
V0   Km   Vmax
S

Donde V representa la velocidad de la reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten,

[S] es la concentración del sustrato y Vmax, es el máximo de la velocidad de la reacción
La magnitud de Km y Vmax varía según el tipo de enzima y la naturaleza del sustrato. Es
también una función de la temperatura y del pH. Se determinarán las constantes cinéticas
Km y kcat de la enzima con las velocidades iníciales de la reacción.

30
  

El cálculo de las constantes se hará en forma comparativa usando tres métodos gráficos
que están basados en las formas lineales de la ecuación Michaelis-Menten, que fueron
antes mencionados

OBJETIVOS

General
Determinar por diferentes modelos las constantes cinéticas de una enzima libre.

Específicos
 Calcular las constantes cinéticas, Km y Vmax, de una enzima (invertasa).
 Determinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de las
reacciones enzimáticas.
 Determinar las velocidades iniciales de una reacción enzimática.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Reactivos:

Regulador de acetatos pH 5.0, 0.025 M,

Reactivo de DNS,
Invertasa 0.3 mg/mL
Reactivo de Bradford
Preparación del sustrato: sacarosa a 3, 9, 15, 30, 60, 120 g/L en regulador de acetatos pH
5.0, 0.025 M preparado como se indicó anteriormente.

Determinación de las velocidades enzimáticas a diferentes concentraciones de

sustrato.
1. Antes de iniciar, preparar un baño maría en ebullición y un baño de hielo.
2. Preparar 2 microtubos con 0.95 mL de sacarosa a la concentración de 9 g/L en el
regulador de acetatos.
3. Preparar 6 microtubos de 1.5 mL adicionando a cada uno 0.1 mL (100 µL) del
reactivo DNS. Proteger los tubos de la luz. Estos servirán para la toma de muestra
y a su vez detener la reacción enzimática.
4. Preparar un microtubo de 1.5 mL con 0.1 mL del reactivo DNS y adicionar 0.1 mL
del regulador de acetatos en que se preparó la sacarosa. Este microtubo será el
blanco del ensayo. Adicionalmente preparar una serie de microtubos de 1.5 mL con
0.1 mL del reactivo de DNS y adicionar 0.1 mL de la solución de sacarosa a 9 g/L.
Este microtubo será el testigo del ensayo enzimático.
5. Adicionar, con ayuda de una micropipeta, 0.05 mL (50 µL) de la solución de invetasa
a 0.3 mg/mL en regulador de acetatos a uno de los dos microtubo que contiene los
0.95 mL de sacarosa. Agitar por inversión rápidamente el tubo e inmediatamente,
otra persona deberá tomar, con ayuda de una micropipeta, 0.1 mL de la mezcla de
reacción y transferirla a uno de los microtubos que contiene 0.1 mL del reactivo DNS.
Esta muestra será el tiempo 0 min de la cinética enzimática.
6. Seguir tomando muestras de 0.1 mL de la mezcla de reacción a los tiempos de 0.5,
1, 1.5, 2 y 2.5 minutos y transferir cada muestra a un microtubo de 1.5 mL que
contiene 0.1 mL del reactivo de DNS.
7. Repetir el paso 5 y 6 con el microtubo restante que contiene los 0.95 mL de sacarosa
a la concentración a ensayar.
31
  

8. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto
con el blanco con la técnica para la determinación de azúcares reductores.
9. Repetir los pasos 2 al 7 por cada concentración de sacarosa.
10. Determinar mediante el método de Bradford (por duplicado), la concentración de
proteína en cada una de las soluciones enzimáticas proporcionadas por el profesor.
11. Utilizando la ecuación de la curva patrón de maltosa, interpolar las absorbancias
para calcular las concentraciones de maltosa y llenar la tabla siguiente:
Tabla 5. Resultados de la cinética enzimática para determinar las constantes cinéticas de
la invertasa.
Por cada concentración de sustrato
Sacarosa (g/L)
Tiempo Abs. Conc. de Concentración Actividad enzimática
(min) (λ=540 nm) glucosa de sacarosa (mM de sustrato
(g/L) (g/L) transformado /min)*
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*Considerando el control

ANÁLISIS DE RESULTADOS.
Para cada una de las concentraciones de sustrato, hacer una gráfica de Absorbancia con
respecto al tiempo y calcular las velocidades iníciales, con el trazo de la tangente a tiempo
cero del curso de la reacción.
Hacer la gráfica de velocidades iníciales (vo) vs concentración de sustrato.
Hacer las gráficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y calcule Km y Vmax, con
cada uno de los modelos. Presentar los valores de éstas en una tabla.
Determinar la constante catalítica de la enzima para esta reacción, suponer que la
preparación enzimática es 100% enzima, e investigar el peso molecular de ésta.
Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.

CUESTIONARIO:
¿Cuál son las principales causas por las cuales se determina la velocidad inicial en una
cinética enzimática?
¿Cuál es la funcionalidad de cada constante enzimática calculada para la caracterización
de una enzima?
Cite un ejemplo donde se analicen una o varias de estas constantes, donde se especifique
el objetivo del cálculo de éstas.
¿Por qué el uso de sustratos cromogénicos en algunos ensayos enzimáticos?
¿Cómo afecta la concentración del sustrato en la actividad enzimática y cuáles pueden ser
sus posibles causas?
¿Cuál es la finalidad de usar un testigo en la medición de la actividad?

REFERENCIAS:
Dubois, T., Jacquet, A., Scheneck, A. G. and Looze, Y. (1988). The thiol proteinases from
the latex of Carica papaya L. I. Fractionation Purification and Preliminary
Characterization. Biological Chem Hoppe-Seyler. 369: 733-740.
Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, Jeremy Berg, John Tymoczko. (2008). Bioquimica.
Editorial Reverté. 217-225.
Segel H. Irwin. (1976). Biochemical Calculations “How to solve mathematical problems in
general biochemistry”. John Wiley & Sons, Second Edition.

32
  

PRÁCTICA 5: Inmovilización de Enzimas

INTRODUCCIÓN.

Técnicas de inmovilización.

La inmovilización se define como el proceso por el cual el movimiento en el espacio de las

células, enzimas, orgánulos, etc. se ve restringido total o parcialmente por medio de un
soporte o una matriz. En la industria se usan frecuentemente enzimas o células
inmovilizadas debido a que éstas se pueden rehusar o usar en procesos en continuo.
Algunas ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son:

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

2. La reutilización de la enzima, por lo que disminuyen los costos del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la
aplicación de la enzima inmovilizada

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son:

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.

2. No hay heterogeneidad en la distribución de la enzima en el soporte.
3. Pérdida de actividad de la enzima inmovilizada.
4. Mayor costo en relación a la enzima libre.

En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos grandes categorías:

Retención física y Unión química.

Métodos de inmovilización de enzimas por retención física

Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida
porosa constituida generalmente por prepolímeros entrucruzables o polímeros del tipo
poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del
monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o
mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras,
que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada
en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida
dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento requiere un control
riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la
naturaleza del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína.

Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:

Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas
semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de
enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por
polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas
“micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños
comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular
33
  

simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se

lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos
Reactores de membrana: Estos reactores emplean membranas permeables al producto
final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante
una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor.

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA

Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor
información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener
resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente
separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran
variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos
materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los
encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas.
Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:

1. Soportes inorgánicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que
pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales
manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso,
alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)

2. Soportes orgánicos. Se pueden clasificar en:

Polímeros naturales: a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-
agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc) proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc).
Polímeros sintéticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polímeros acrílicos
(poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).

Adsorción
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones
iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno.

Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más
interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa
en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las
proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las
enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente
la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la
arginina y los ácidos aspártico y glutámico.

Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido
ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método del reticulado
consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las
moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos,
diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas
con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
34
  

Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas

Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en:

1. Aplicaciones analíticas: biosensores

2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de
tratamiento de residuos.

OBJETIVOS

General
Evaluar la capacidad catalítica de una enzima inmovilizada, respecto a su forma libre.

Específicos
 Inmovilizar una enzima (invertasa) por atrapamiento en alginato.
 Determinar la actividad enzimática de la enzima inmovilizada realizando cinéticas
enzimáticas de la invertasa inmovilizada.
 Determinar el porcentaje de inmovilización cuantificando la concentración de
proteína en el cloruro de calcio residual.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Material y equipo.
Materiales: Equipos:

Agitadores magnéticos. Balanza.

Coladores de acero inoxidable. Espectrofotómetro.
Cristalizador. Potenciómetro.
Espátula. Vórtex.
Vasos de precipitados Soporte universal.
Agitador magnético Parrilla con agitación.
Jeringa desechable de 10 mL
Juego de micropipetas.
Microtubos de 1.5 mL

Soluciones (Preparar soluciones por equipo):

1) 25 mL de solución de invertasa de levadura (1.2 mg/mL) en amortiguador de acetatos

0.025M, pH 5.0.
2) 15 mL de alginato de sodio al 2% (p/v) en amortiguador de acetatos 0.025M, pH 5.0.
3) 100 mL Cloruro de calcio 1.0%.
4) 20 mL Citrato de sodio 0.5 M o fosfato de sodio monobásico 0.5 M.
5) 10 mL Sacarosa al 3% (30 g/L) en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0.

Inmovilización de enzimas por atrapamiento con alginato de sodio.

Se debe trabajar en condiciones limpias (no es necesario trabajar en condiciones de

esterilidad).

35
  

1. En un vaso de precipitado de 50 ml mezclar 5 mL de enzima concentrada con 15 mL de

alginato al 2% que se encuentre a 40 °C. Agitar la mezcla alginato-enzima para
homogenizar y lograr una temperatura homogénea, de unos 40 °C.
2. Montar un sistema de inmovilización (Fig.1), que tenga con una jeringa con aguja con
punta roma (sujeta al soporte universal para mantener la altura, entre la aguja y la sol de
CaCl2, constante) y un vaso con solución de CaCl2, 1%; a temperatura ambiente; con
agitación constante y suave, por medio de una barra magnética.
3. Llenar la jeringa (quitar la aguja y succionar la solución alginato-enzima tirando del
émbolo y poner de nuevo la aguja), fijarla al sistema, a uno o dos centímetro de distancia
del CaCl2, e ir descendiendo, de forma constante, el embolo para obtener gotas
homogéneas, las cuales se irán depositando en la solución e CaCl2. Contar el número de
perlas de alginato formadas por cada mL y sacar un promedio final.
NOTA: El goteo debe realizarse a la altura precisa, de lo contrario se formará “lentejas”
al golpear con la superficie líquida (con un goteo desde una distancia mayor) o se
formarán esferas con una protuberancia (con un goteo desde una distancia muy corta
que no permita que se logre la esfericidad).
4. Dejar estabilizar el gel durante 20 min, con agitación ligera y a temperatura ambiente.
5. Pasar las perlas y un poco de CaCl2 a un tubo de centrífuga de 15 mL, etiquetar y
conservar en refrigeración.

Figura 10. Sistema para inmovilización de enzimas por atrapamiento.

Determinación de la cantidad de enzima inmovilizada (% de inmovilización).

Determinar la concentración de proteína, por el método de Bradford y por triplicado de:

a) invertasa libre (diluida),
b) de la solución de cloruro de calcio residual.
Usar como blanco amortiguador y cloruro de calcio, respectivamente.

Determinación de la actividad de la enzima inmovilizada y libre.

Posteriormente, se debe determinar la Actividad enzimática, Actividad enzimática específica

y constantes cinéticas de la enzima inmovilizada y comparar los resultados de las constantes
cinéticas de la enzima libre y la enzima inmovilizada.

36
  

Consideración: Esta segunda parte (actividad y constantes cinéticas), que es inicio de la

Práctica 4, puede dejarse pendiente, si no es posible realizarlo en las 3 horas que dura la
sesión.

1. Para cada preparación enzimática a ensayar, preparar 2 microtubos con 0.95 mL

sacarosa 3% en amortiguador de acetatos 0.025 M, pH 5.0.
2. Preparar 6 microtubos de 1.5 mL adicionando a cada uno 0.1 mL (100 µL) del reactivo
DNS. Proteger los tubos de la luz. Estos servirán para la toma de muestra y a su vez
detener la reacción enzimática.
3. Preparar un microtubo de 1.5 mL con 0.1 mL del reactivo DNS y adicionar 0.1 mL del
regulador de acetatos en que se preparó la sacarosa. Este microtubo será el blanco del
ensayo.
4. En el primer tubo, colocar la cantidad de esferas equivalente a 0.05 mL o el equivalente
a la masa de proteína de 0.05 mL de solución enzimática a 0.3 mg/mL e inmediatamente
tomar 0.1 mL de muestra a un tubo con DNS (Testigo, t0).
5. Seguir tomando muestras de 0.1 mL de la mezcla de reacción a los tiempos establecidos
por los porfesores y transferir cada muestra a un microtubo de 1.5 mL que contiene 0.1
mL del reactivo de DNS. (Paso 2).
6. Repetir el paso 4 y 5 con el microtubo restante que contiene los 0.95 mL de sacarosa al
3% (p/V).
7. Determinar la actividad enzimática de la enzima libre utilizando sacarosa a 3% como
sustrato y tomar muestras a los mismos tiempos que la cinética de la enzima
inmovilizada.
8. Una vez terminada la cinética enzimática tratar los microtubos de las muestras junto con
el blanco y los microtubos testigos con la técnica para la determinación de azúcares
reductores.
9. Determinar mediante el método de Bradford (por duplicado), la concentración de
proteína en cada una de las soluciones enzimáticas proporcionadas por el profesor.

Tabla 6. Resultados de la cinética enzimática de invertasa inmovilizada.

Tiempo Invertasa inmovilizada Invertasa libre (0.3 mg/mL)
(min) Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración
(λ=540 nm) de glucosa (λ=540 nm) de glucosa
(mg/mL) (mg/mL)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5

NOTA: Guardar el resto de la enzima libre e inmovilizada (con regulador) en refrigeración,

con éstas se determinará nuevamente la actividad a diferentes tiempos, y se compararán
los tiempos el inicial (primera sesión) y en sesiones posteriores, para determinar el efecto
de la inmovilización en la estabilidad de la enzima (Práctica 6).

37
  

Determinación de constantes cinéticas de la enzima libre e inmovilizada.

Para la determinación de las constantes cinéticas, es necesario evaluar la actividad

enzimática de las preparaciones a diferentes concentraciones de sustrato. Utilizar las
mismas concentraciones de sacarosa utilizadas en la práctica 4.

Repetir la metodología indicada en la sección anterior (3.3.4) para cada preparación de

enzima y concentración de sustrato.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

 Calcular la actividad enzimática de la enzima libre y de la enzima inmovilizada, en

las unidades solicitadas por los profesores.
 Determinar el % de inmovilización de la enzima.
 Calcular las constantes cinéticas de la enzima libre e inmovilizada.
 Comparar los parámetros cinéticos de la enzima inmovilizada contra la libre.

38
  

PRÁCTICA 6: Determinación de las constantes cinéticas y

estabilidad de la enzima Inmovilizada

4.1 INTRODUCCIÓN

La inmovilización puede alterar significativamente el comportamiento de las enzimas. En

primer lugar se producen cambios en su estabilidad; en segundo lugar, la enzima
inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen
en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.)
se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte
con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de
tipo difusional, estérico y del microambiente.

Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su
inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones:

1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones

multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere mayor rigidez
y se hace más resistente a la desnaturalización térmica o química. Este tipo de estabilización
se obtiene únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipo
covalente, como el reticulado o la unión a soportes activados. La inmovilización covalente
multipuntual se puede combinar con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor
rigidez a la estructura de la enzima.
2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de proteasas
a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis.
3. Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en
una determinada región del espacio.
4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la enzima
con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las nitrogenasas,
hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva
en el microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la concentración de
oxígeno disuelto será mucho menor en esa zona que en el medio de reacción. En otros
casos el soporte tiene un efecto tampón o buffer de tal manera que mantiene el pH óptimo
de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes
de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en
presencia de disolventes orgánicos, la “hidrofilia” del soporte o su capacidad para retener
agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del soporte, más agua
adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno para
mantener su conformación activa.

Efectos en la actividad enzimática

Tras la inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por
diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que:
La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al sitio activo está
impedido,
Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del sitio
activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima,
La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma
inactiva, las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización de la
enzima.

39
  

Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios (disminución

o aumento de la actividad enzimática) se deberán principalmente a efectos difusionales,
electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.

1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos

hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e
interno.
a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reacción, el
sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusión) que
rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentración de sustrato
es menor que en el resto de la disolución, puesto que existe un gradiente de concentración
a través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas
son siempre aparentes (km’);
b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el
interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima
inmovilizada.

2) Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma
carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción.
Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km’ aparente puede verse
reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolución.

3) Impedimentos estéricos o de tamaño de sustrato. En un principio, cualquier enzima puede

ser inmovilizada sin que haya una pérdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser
válido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos
con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye
drásticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes sólidos,
a pesar de que son muy activas frente a sustratos pequeños, muestran una actividad muy
baja hacia proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. Este “efecto estérico” se puede evitar
mediante una inmovilización covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte más
largo

4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente

al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El efecto
observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática
y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede
actuar. Por ejemplo, una enzima unida a un soporte cargado negativamente tendrá en su
microentorno una concentración mayor de iones hidrógeno que en el medio de reacción.
Como resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima
sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente.

4.2 OBJETIVOS

General
Evaluar la estabilidad de una enzima libre e inmovilizada a diferentes tiempos.

Específicos
 Determinar la actividad enzimática de una enzima libre e inmovilizada a diferentes
tiempos tras ssu preparación.
 Determinar las constantes cinéticas de una enzima libre e inmovilizada a diferentes
tiempos.
 Evaluar el efecto de la inmovilización sobre la estabilidad de la actividad
enzimática.
40
  

Evaluar el diferente comportamiento de la alteración de las constantes cinéticas de una

enzima con el tiempo en una enzima libre e inmovilizada.

4.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.3.1 Materiales
Materiales: Equipos:
Espátulas de acero inoxidable. Espectrofotómetro.
Matraces Erlenmeyer. Refrigerador comercial.
Flotadores Vórtex.
Gradillas para microtubos Parrillas con agitación
Termómetro Pipetas de 100, 200 y 1000 μL
Tubos eppendorf 1.5 mL

4.3.2 Determinación de actividades enzimáticas.

Se realizará en las siguientes 3 o 4 sesiones, posteriores a la práctica 3, en al cual se
inmovilizó y se conservó la enzima libre y las perlas de alginato con la enzima inmovilizada.

1. Para cada preparación enzimática (libre e inmovilizada) y concentración de sacarosa (3,

9, 12,15, 24 y 30 g/L) a ensayar, preparar 4 microtubos con 0.95 mL sacarosa en
amortiguador de acetatos y 7 microtubos de 1.5 mL con 0.1 mL de reactivo de DNS.
Preparar además un blanco (0.1 mL DNS con 0.1 mL de sacarosa).
2. En el primer tubo, colocar 0.05 mL de la solución enzimática correspondiente (0.05 mL
de enzima libre o el número de esferas equivalentes para la enzima inmovilizada) e
inmediatamente tomar 0.1 mL de muestra a un tubo con DNS (Testigo, t0).
3. Colocar 0.05 mL de la preparación enzimática en cada uno de los tres tubos con
sacarosa correspondientes (esperar 30 s entre cada tubo). Mezclar cada tubo por
inversión un par de veces.
4. Transcurridos 2 min de reacción, adicionar 0.1 mL de la mezcla de reacción en un tubo
con 0.1 mL de DNS.
5. Transcurridos 5 min de reacción, adicionar 0.1 mL de la mezcla de reacción en un tubo
con 0.1 mL de DNS.
6. Una vez que se tienen todos los tubos (blanco y los correspondientes a las dos
preparaciones), tratar siguiendo la técnica de DNS descrita en el apartado “actividades
previas”.
7. Por medio de la curva patrón de glucosa, transformar las absorbancias en
concentraciones y llenar la siguiente tabla.

41
  

4.4 ANÁLISIS DE RESULTADOS

Calcular la actividad enzimática de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes días y

concentraciones de sacarosa empleadas en µMsac/min.
Determinar los parámetros cinéticos de la enzima inmovilizada y la enzima libre e
inmovilizada a los diferentes días ensayados.
Con los datos de la práctica presente y la anterior, llenar las siguientes tablas:

Actividad enzimática máxima (Sacarosa 30 g/L)

Enzima Día 0 Día Día Día
Libre
Inmovilizada

Parámetros cinéticos
Día 0 Día Día Día
Enzima
Km Vmax Km Vmax Km Vmax Km Vmax
Libre
Inmovilizada
Km en µMsac
Vmax en µMsac/min

Comparar los parámetros cinéticos y actividad enzimática de la enzima inmovilizada contra

la libre el primer día (practica 3), a las 48 horas y a los 10 días.

42
  

PRÁCTICA 7: Conocimiento, preparación y esterilización de un

Biorreactor con medio de cultivo.

5.1 INTRODUCCIÓN.

Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos
medios son esenciales en las fermentaciones por lo que un control en su fabricación,
preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de
los resultados obtenidos.

Esterilización de Medios de Cultivo

Una fermentación se debe llevar a cabo, en general, en un medio ambiente controlado,
independientemente de que el propósito sea de investigación académica, desarrollo de
producto o proceso. Esto implica que debe garantizarse el crecimiento del microorganismo,
microorganismos u obtención del producto deseado libre de contaminación biológica. De
ahí que la esterilización sea una parte del proceso de fermentación que permite alcanzar
este objetivo.
La esterilización y el mantenimiento de las condiciones asépticas a veces conducen a la
pérdida o degradación de los nutrientes de los cultivos. El diseño del procedimiento de
esterilización depende de:
La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientes adicionales utilizados en
la fermentación.
El tamaño y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el material de construcción
de éstos.
Los servicios generales disponibles en el laboratorio.
Si los recipientes a ser esterilizados están vacíos o contienen medio de cultivo u otras
soluciones.
De la carga microbiana del medio.

Criterios para la Esterilización

Una probabilidad comúnmente aceptada en fermentaciones industriales es de 1x10-3; esto
es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen después de la esterilización. Se
pueden imponer criterios más estrictos, dependiendo de la consecuencia de una falla o el
riesgo que se quiera asumir. Un ejemplo es la de enlatado de alimentos, donde el criterio de
esterilización se apoya en la típica probabilidad de sobrevivencia de 1x10-12 de esporas de
Clostridium botulinum. Un criterio semejante aplicado a la fermentación se aplica para el
caso de patógenos o microorganismos genéticamente modificados. La determinación de
bacterias viables es un método sensible para determinar el número de bacterias que
sobrevivieron en el sistema.

Métodos de Esterilización
La selección del método de esterilización y el régimen a usarse deben ser hechos de acuerdo
a criterios apropiados de esterilización; los métodos pueden ser: Calor húmedo
Calor seco
Filtración
Compuestos químicos
Radiación

43
  

El método de esterilización más común para recipientes es el de calor húmedo. Al

monitorear el proceso de esterilización por calor húmedo se puede observar que el ciclo de
esterilización está formado por tres períodos:
Elevación de temperatura o calentamiento.
Mantenimiento de temperatura.
Descenso de temperatura o enfriamiento.

5.2 OBJETIVOS

Objetivo general
Adquirir conocimientos prácticos para establecer un birreactor con medio de cultivo para un
bioproceso.

Objetivos específicos
 Conocer las partes y funciones de un Biorreactor de laboratorio.
 Formular un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos.
 Conocer el funcionamiento de una autoclave.
 Esterilizar el biorreactor y medio por calor húmedo.
 Determinar cualitativamente la eficacia del proceso de esterilización por calor
húmedo.
 Conocer la manera de preparar el inóculo para una fermentación.
 Conocer la manera de inocular un biorreactor de laboratorio.

5.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL

5.3.1 MATERIALES
- Cajas de Petri
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
- Barras magnéticas para agitación (mosca)
- Guantes de asbesto
- Solución de Cloruro de Sodio al 0.85%
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Pipetas automáticas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Medio de cultivo para levaduras
- Matraces de 250 mL
- Medio de cultivo para levaduras

5.3.2 EQUIPO
- Biorreactor de Laboratorio
- Balanza analítica
- Incubadora con control de temperatura
- Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar vertical
- Microscopio óptico
- Agitador Vortex
- Placa de agitación magnética

5.5.3 Conocimiento del Biorreactor y sus partes

44
  

El profesor, en conjunto con los alumnos, reconocerá las partes del biorreactor y describirá
las funciones de cada una. Se explicará la correcta manera de ensamblar el biorreactor,
así como el manejo de éste y el módulo de control.

5.5.4. Evaluación del proceso de esterilización del Biorreactor.

1. Preparar de 2.5 L de medio de cultivo para levadura, composición por litro de medio:
Sacarosa, 30 g; Extracto de Levadura, 5 g; KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 2 g; MgSO4.
7H2O, 0.4 g. Ajustar a pH 5.
2. Preparar 14 cajas Petri con medio de cultivo sólido para levaduras adicionado al
medio 15 g/L de agar. También preparar 18 placas con agar nutritivo.
3. Antes de esterilizar el medio tomar muestra de 1 mL del medio de cultivo y almacenar
en refrigeración para su posterior análisis.
4. Siguiendo las instrucciones del profesor, ensamblar el biorreactor y prepararlo para
la esterilización.
5. Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo sin esterilizar.
6. El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave.
7. Esperar que la presión dentro de la autoclave sea de 1.05 Kg/cm2 o 15 lbs (indicado
por el medidor de presión) que equivale a 121°C (indicado por el medidor de
temperatura) y mantener (por medio del apagado y encendido de la autoclave)
durante 15 minutos.
8. Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de asbesto sacar el
biorreactor esterilizado.
9. Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar hasta temperatura ambiente antes
de utilizarlo.
10. Asépticamente tomar una muestra de 1.5 mL del medio de cultivo esterilizado.
11. Realizar diluciones seriadas (100-10-2) de las muestras antes y después de esterilizar,
y sembrar por extensión con varilla por triplicado.
12. Realizar una preparación en fresco del medio de cultivo antes y después de
esterilizado y observarlo al microscopio visible y otra en tinción de Gram.

5.4 REPORTE DE RESULTADOS

Esquematizar el biorreactor tipo tanque agitado presentado en el laboratorio y describir

brevemente la función de las partes observadas.
Describir brevemente el papel que juega cada una de las variables fisicoquímicas sobre la
actividad de los catalizadores biológicos.
Elaborar una tabla de resultados en donde se reporten los resultados del conteo de
microorganismos en cada una de las cajas Petri sembradas con las diluciones del medio de
cultivo, antes y después del proceso de esterilización. Comparar los resultados.
Calcular la concentración de contaminantes (UFC/mL) en el medio de cultivo antes y
después de esterilizar.
Discutir las observaciones de las preparaciones en fresco y tinción de Gram.
Comentar la importancia que juega la esterilización en las bioconversiones, así como de la
eficacia del método de esterilización por calor húmedo en autoclave eléctrica.

45
  

PRÁCTICA 8: Producción de enzimas con células libres

6.1 INTRODUCCIÓN

LAS ENZIMAS COMO METABOLITOS

Los metabolitos primarios producidos durante un proceso de fermentación representan
productos finales de bajo peso molecular usados para la producción de macromoléculas o
son convertidos en coenzimas. Así también, los metabolitos primarios pueden ser productos
intermediarios en vías metabólicas relacionadas con los productos finales. Los aminoácidos,
vitaminas, los nucleótidos y ciertas enzimas son considerados productos primarios.
En el caso de las enzimas, éstas son consideradas metabolitos primarios cuando la
evolución de su producción guarda una relación estrecha con el crecimiento microbiano.
Existen diversos tipos de enzimas y pueden ser obtenidas de diferentes fuentes.
Tipos de Enzimas y sus Fuentes
Al menos 75% de todas las enzimas industriales son de acción hidrolítica y son usadas para
la despolimerización de sustancias naturales. Las proteasas representan el tipo de enzimas
industriales predominantes (40%) utilizadas en la industria lechera y detergentes. Las
carbohidratasas utilizadas en las industrias de panificación, cervecería, destilación, almidón
y textiles representan el segundo grupo más grande de enzimas industriales.
Las enzimas pueden ser obtenidas de diversas fuentes como tejidos animales, plantas,
hongos y bacterias. Las enzimas microbianas representan 90% de las enzimas industriales.
Las enzimas de de origen vegetal más importantes son la papaína, la bromelina, algunas
enzimas amilolíticas de cereales, lipoxigenasas de soya y enzimas de frutas cítricas. En
cuanto a las enzimas de origen animal, estas incluyen a las lipasas y proteinasas
pancreáticas, pepsinas y esterasas.
Levadura
Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, es decir, un tipo de levadura que ha
servido como uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos,
por ser un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de las
bacterias pero compartiendo con ella muchas de sus ventajas técnicas.
Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza,
pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el
proceso de fermentación. En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras
rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto
no realiza la fermentación. Básicamente el proceso de fermentación se lleva a cabo cuando
esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares, como la sacarosa, y es por
ello que en su metabolismo necesita sintetizar una enzima que catalice la hidrólisis de
sacarosa en glucosa y fructosa, siendo una fuente productora de invertasa.
Invertasa
La invertasa, también conocida como sacarasa, es una enzima de interés industrial utilizada
en la hidrólisis de sacarosa para la obtención de jarabes fructosados, los cuales son
empleados ampliamente en la industria de los alimentos como en la industria refresquera, la
de conservas, lácteos, pastelería y confitería.
La invertasa desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa, donde a la mezcla resultante de
estos se le denomina “azúcar invertido” debido a la inversión de sus propiedades ópticas de
una rotación positiva a una negativa. También se cambian las propiedades químicas, por
ejemplo, en el caso de la sacarosa, el tipo de enlace que subsiste entre sus moléculas
entrelazadas (α para la glucosa y β para la fructosa) impide que dicha molécula contenga
terminales reductores, por lo que al hidrolizarse, estas moléculas que quedan libres
recuperan su poder reductor.
46
  

6.2 OBJETIVOS

Objetivo general
Adquirir los conocimientos prácticos para producir una enzima extracelular por medio de
una fermentación con células libres.

Objetivos específicos
 Producir invertasa con células libres de levaduras en cultivo sumergido.
 Monitorear y obtener la cinética de crecimiento de biomasa.
 Monitorear y obtener la cinética de producción de enzima.
 Determinar la actividad catalítica de la invertasa.
 Establecer las constantes cinéticas (Km, Vmax) de la invertasa

6.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL

6.3.1. Materiales
- Vasos de precipitado de diferentes volúmenes
- Barras magnéticas para agitación (mosca)
- Guantes de asbesto
- Agar nutritivo
- Medio de cultivo para levaduras
- Solución del reactivo DNS
- Solución de glucosa, 2 g/L
- Solución del reactivo de Bradford
- Solución de anthrona
- Solución de sacarosa, 30 g/L
- Solución buffer fosfatos 0.1 M a pH 6.9
- Solución estéril de cloruro de sodio, 0.09%
- Colorantes y soluciones para tinción de Gram
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos
- Charolas de aluminio de 5 cm de diámetro
- Tiras de pH

6.3.2. Equipos
- Biorreactor de laboratorio New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L con su
módulo de control, partes y electrodos.
- Centrífuga para tubos falcón de 30 mL
- Balanza analítica
- Espectrofotómetro visible
- Incubadora orbital con control de agitación y temperatura
- Autoclave eléctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar
- Microscopio óptico
- Agitador Vortex
- Baño de agua con control de temperatura

47
  

6.3.3. Preparación del Biorreactor.

1. Preparar el biorreactor de laboratorio de acuerdo a las instrucciones de la práctica 7.

2. Preparar 2 litros del medio adecuado para el microorganismo de trabajo. Verterlo en el
biorreactor.
3. Esterilizar el biorreactor conteniendo el medio de cultivo de acuerdo a las instrucciones
de la práctica 7.

6.3.3. Inoculación del Biorreactor.

4. Para la preparación del inóculo, se puede partir de un cultivo en tubo inclinado o en

placa, o también podría ser de un pre inóculo o pre cultivo líquido de la cepa deseada.
En el caso de levaduras puede ser de alguna presentación comercial como pasta o
polvo.
5. Tomar una asada del cultivo de Saccharomyces cerevisiae y se transfiere a un matraz
de 500 mL con 300 mL de medio de cultivo para levaduras (práctica 5) estéril (preparar
e inocular dos matraces). Se incuba a 30ºC durante 12 h a 18 h con una agitación de
120 rpm.
6. Antes de inocular el biorreactor con el medio de cultivo ya estéril, se prepara un frotis
de cada inóculo y tiñe con la técnica de Gram para corroborar la pureza del inóculo.

6.3.4. Cinética de Producción de enzimas con células libres.

1. Evaluar visualmente la esterilidad del medio en el biorreactor, preparado en la práctica

anterior.
2. Establecer por medio del módulo de control, las condiciones de operación en el
Biorreactor: aereación de 1 vvm, temperatura de 30 °C.
3. En condiciones de esterilidad, colocar un embudo estéril en uno de los puertos y a través
de él, verter en el biorreactor 250 mL de inóculo puro.
4. Después de inocular el biorreactor se toman muestras de 20 mL para cada tiempo en base
al siguiente programa de muestreo:

Tiempo Hora* Horas

T0 8:00 0
T1 10:00 2
T2 12:00 4
T3 14:00 6
T4 16:00 8
T5 18:00 10
T6 20:00 12
T7 8:00 24
T8 10:00 26
T9 12:00 28

La muestra del tiempo cero (T0) se toma justo después de inocular el biorreactor. Si en los
tiempos T7, T8 y T9, no hay cambios significativos en la evolución del crecimiento celular y
en la producción de invertasa, se procede a detener la fermentación.
* NOTA: El programa de muestreo anterior es una propuesta susceptible a modificación.

5. Las muestras pueden tratarse al momento de ser tomadas; o pueden almacenarse en

congelación, en tubos de plástico de 50 mL estériles para su posterior tratamiento.

48
  

6. Tras tomar la última muestra, detener la fermentación apagando la agitación y el módulo

de control. Cerrar el flujo de agua de enfriamiento.
7. Desmontar, esterilizar y limpiar el reactor, con mucho cuidado.

6.3.5. Análisis de las muestras de la cinética microbiana.

Se evaluarán los siguientes parámetros para cada una de las muestras:

1. Pureza del cultivo por medio de siembra en placa (estría simple) y tinción de Gram,
observando al microscopio.
2. Temperatura, en el módulo de control o por medio de un termómetro en el termopozo.
3. El pH se determina por medio de tiras reactivas.
4. Biomasa por densidad óptica (600nM) y peso seco.
5. Proteína extracelular por método de Bradford (sobrenadante de centrifugación).
6. Azúcares (sustrato) residuales, por el método de DNS (sobrenadante de cent.).
7. Actividad enzimática (sobrenadante) siguiendo la metodología de la práctica 3 (de ser
necesario, se pueden ajustar los volúmenes de enzima y sustrato a utilizar).

Las metodologías para estas técnicas, se encuentran en los apartados actividades previas,
práctica 1 y anexos. Sólo se presenta un esquema del tratamiento de las muestras.

Muestra (en  Tinción de Gram 
esterilidad)  Siembra en placa 

DO 600 nm  Muestra pH 

(Muestra) 

Centrifugar 
10 mL 

Sobrenadante  Pastilla celular 

DO 600 nm  Peso Seco 
(blanco) 

Sustrato residual 

Proteína extracelular

Actividad enzimática 

49
  

6.4 REPORTE DE RESULTADOS

Elaborar una tabla de los datos obtenidos.
Elaborar una gráfica de los resultados del crecimiento de la biomasa (mg de biomasa
seca/mL de caldo de cultivo), y de la densidad óptica a 600 nm contra tiempo (h).
Elaborar una gráfica de los resultados del consumo de sustrato contra tiempo (h).
Elaborar una gráfica de los resultados de la proteína extracelular (mg / mL) contra tiempo
(h).
Elaborar una gráfica de los resultados de la actividad enzimática (U/mL) contra tiempo (h).
Elaborar una gráfica del monitoreo de pH.
Elaborar una gráfica del monitoreo de la temperatura.
Discutir sobre el comportamiento de las cinéticas, explicando lo que ocurrió en cada fase de
la fermentación.
Anexar la “Hoja de control de la cinética de producción de enzima con células libres” utilizada
durante el desarrollo de la práctica.
Calcular los rendimientos globales de la fermentación.

6.5 CUESTIONARIO

6.5 REFERENCIAS
Bailey, J.E. and OllIs, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition, McGraw-Hill
International Editions, 1986, New York, 984 p.
Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San Diego, 439p.
López, Agustín; QUINTERO, Rodolfo. Tecnología Enzimática. UNAM. México, 1987.
Scragg, Alan. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos tecnológicos.
Editorial Limusa. México, 1999.
Segel H. Irwin, Biochemical Calculations (How to solve mathematical problems in general
biochemestry). Editorial John Wiley & Sons, Segunda edición, Estados Unidos de América
1976
Stanbury, P.F. and Whitaker, A. Principles of fermentation technology. Pergamon Press,
1984. Oxford, 255p.
Vogel, H.C. and Todaro, C.L. Fermentation and biochemical engineering handbook. 2nd
edition, Noyes Publications, 1997. New Jersey, 801p.

50
 HOJA DE CONTROL DE CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMA POR CÉLULAS LIBRES

CONDICIONES
Aireación (vvm)
Agitación (rpm)
Fecha y hora de inicio:
Fecha y hora de término:

Charola
Bradford
Tiempo Pureza de Charola con DO No de DNS (DO) se
Muestra T ( °C) pH (DO) de Observaciones
(h) Cultivo (+,-) (g) Muestra PS (600 nm) Cel/mL sobrenadante
sobrenadante
(g)
T0
T1
 

T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9

51
  

PRÁCTICA 9: Inmovilización celular y Producción de enzimas con

células inmovilizadas

7.1 INTRODUCCIÓN
Inmovilización de células: La inmovilización celular se define como la localización de
células en una región definida en el espacio con la preservación de las funciones
celulares. Esta región de inmovilización debe ser una fase sólida que permita el
intercambio de sustratos y productos con el medio exterior, no debe ser tóxica para las
células y debo ser fácilmente manipulable.

La inmovilización en soportes naturales y sintéticos ha mostrado por un lado,

estabilidad en las funciones celulares, por otro lado, permite alcanzar altas
concentraciones de microorganismos en volúmenes reducidos y permite la reutilización del
biocatalizador y la implantación de sistemas continuos da producción, facilitando las
etapas de separación.

Los procesos biotecnológicos pueden ser sustancialmente optimizados utilizando

microorganismos inmovilizados en comparación con los procesos que utilizan células
libres.

La utilización de la inmovilización celular permite:

a) Facilitar las etapas de separación de biomasa y producto.

b) La reutilización del biocatalizador microorganismos o células vegetales o
animales.
c) Facilitar la implantación de sistemas continuos de producción.
Prolongar la actividad metabólica de los microorganismos o células vegetales o
animales.
d) Prolonga el ciclo de vida de los microorganismos o células vegetales o animales.
e) Aumentar la tolerancia de las células a sustancias tóxicas.

Métodos de inmovilización: Las diferentes técnicas que se utilizan para la inmovilización

celular pueden ser clasificadas de la siguiente manera: adsorción física y enlaces
covalentes, micro encapsulación, agregación, y atrapamiento o inclusión celular.

- Adsorción y enlaces covalentes.

Las técnicas de adsorción y por enlaces covalentes se llevan a cabo en los espacios
libres de los poros del soporte, en donde existen grandes superficies. En este tipo de
inmovilización, una gran parte de la superficie de la célula está en contacto directo con
el medio, en contraste con la encapsulación o técnicas de atrapamiento, en donde un
fragmento grande de las células es capturado y las limitaciones de transferencia de
masa pueden estar presentes.

- Adsorción.
Las células pueden anclarse naturalmente a una superficie, las células se anclan al
soporte por atracciones electrostáticas (fuerzas de Van der Walls, iónicas y de puentes de
hidrógeno). El crecimiento produce una biopelícula en la superficie del soporte y las
limitaciones de transferencia de masa tienen lugar dentro de esta biopelícula.
52
  

Los soportes incluyen trozos de madera, arena, resinas de intercambio iónico y

materiales orgánicos corno la celulosa y carbón activado.

- Enlace covalente.
En este tipo de inmovilización el fuerte enlace de la célula-soporte reduce la pérdida
celular. La unión directa de las células a un soporte activado es posible por la
modificación química de la matriz por medio de la utilización de sustancias que sirvan de
puente de unión química. El glutaraldehído es usado para tal fin, sin embargo, el riesgo del
daño celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de la membrana celular, puede ser
una limitante.

- Micro-encapsulación.
La micro-encapsulación se usa en el área farmacéutica o en el campo de ¡ü medicina
para producción de fármacos e inmovilización de enzimas. Una microcápsula consiste
en una semi-membrana permeable, esférica, delgada y fuerte que rodea un centro
liquido, con un diámetro que varia de unas mieras a 1mm. La membrana sin/e como una
barrera semipermeable permitiendo la entrada cíe sustrato y la salida de metabolitos,
pero no permite el paso de células.

- Atrapamiento o inclusión.
De entre los métodos de inmovilización de células, el método de inclusión celular ha
mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilización y es el que preserva mejor
las funciones celulares. Este método consiste en atrapar las células en una red
tridimensional rígida de hidrogel; los soportes de inmovilización pueden ser sintéticos
(por ejemplo la poliacrilamida, el poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la
gelatina, el alginato y la carragenina). Una de las características particulares del
método de inclusión o atrapamiento celular está relacionada con las condiciones
de gelificación del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificación. La gelificación
se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de iones. Además, la
gelificación es reversible, así, bajo ciertas condiciones físicas se cuenta con una
suspensión celular que puede ser gelificada, quedando las células atrapadas;
posteriormente se puede volver a liberar las células aumentando la temperatura o
retirando los iones. Uno de ios materiales más empleados para realizar la inmovilización
por inclusión celular es la K-carragenina.

Kapa-carragenina.
La K-carragenina es un polisacárido no tóxico, de fácil adquisición, aislado a partir de algas
marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmética y alimentaria como agente
gelificante, espesante y estabilizante. Es un polímero, el cual esta constituido por una
estructura unitaria de sulfato de β-D galactosa y 3,6-anhidro-α-D-galactosa.
La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solución de algún agente
inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio.
Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilización puede efectuarse bajo
condiciones muy suaves, sin el uso de químicos que puedan inhibir la actividad
enzimática de las células.

Invertasa: la invertasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa, EC

3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-D-fructofuranosídicos de
fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más significado es, sin duda, la
sacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre de sacarasa. La denominación trivial
de invertasa, con la que también se conoce, hace referencia al hecho de que los productos de
la reacción son conocidos desde antiguo como “azúcar invertido” ya que mientras la sacarosa
53
  

es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es

levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del
valor de rotación óptica.

Sacarosa ([α] = +66,5º) + H O → D-glucosa ([α] = +52,5º) + D-fructosa ([α] = -92º)

D 2 D D

La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos

como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el catabolismo de fructanos y
más específicamente en el de la sacarosa, en especial en aquellos organismos en los que dichos
azúcares son utilizados como fuente de carbono y energía. El estudio de la actividad invertasa
presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación
aplicada, siendo uno de los enzimas más conocidos.
La invertasa es una enzima de interés industrial utilizada en la hidrólisis de sacarosa para la
obtención de jarabes fructosados (JF), los cuales son empleados ampliamente en la industria de
alimentos como la industria refresquera, la de conservas, lácteos, pastelería y confitería.
Aplicación biotecnológica y biorreactores con células inmovilizadas.
Los biorreactores más comunes usados con células inmovilizadas son: tanque agitado, lecho
fluidizado, columna empacada, y reactor air-lift (Fig. 1). El tipo de biorreactor a utilizar
depende del método de inmovilización empleado, del metabolismo las células y del
requerimiento de transferencia de masa
Salida de aire

Alimentación

Células
inmovilizadas

Aspersor de aire
Productos
A B
Productos Productos

Células
inmovilizadas

Alimentación
Alimentación

C inmovilizadas A, TanqueDagitado; B, air lift; C, Columna

Figura 1. Biorreactores con células
empacada; y D, Lecho fluidizado.

54
  

7.2 OBJETIVOS:

General:
El alumno producirá invertasa mediante Saccharomyces cerevisiae en estado libre e
inmovilizado en esferas de alginato de sodio, durante una fermentación en un biorreactor a nivel
laboratorio.

Específicos:
 El alumno inmovilizará células de S. cerevisiae en alginato de sodio.
 El alumno preparará el medio de cultivo para el crecimiento de la levadura y la producción
de la enzima.
 El alumno llevará a cabo la cinética de crecimiento de la levadura en estado libre e
inmovilizado.
 El alumno monitoreará la producción de proteína en las células (en estado libre e
inmovilizado) durante el tiempo de proceso.
 El alumno determinará la actividad enzimática y la actividad enzimática especifica de la
invertasa producida por las células en estado libre e inmovilizado.

7.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL

7.3.1 Material, Equipo y Reactivos

Probetas. Buffer pH 4
Termómetro Buffer pH 7
Autoclave Aceite de inmersión
Baño María Solución de antrona
Potenciómetro. Alcohol al 70 %
Microscopio óptico Solución de sacarosa
Centrífuga Pinzas
Balanza analítica Charolas de aluminio
Espectrofotómetro UV-VIS Baño de hielo
Campana de flujo laminar Sacarosa
Tubos Falcón Extracto de levadura
Tubos Eppendorf estériles (150 aprox.) Vasos de precipitado de diferentes
Portaobjetos volúmenes
Asa bacteriológica Barras magnéticas para agitación (mosca)
Lámpara de alcohol Jeringa de 10 ml con punta roma
Mechero de Bunsen Manguera de silicón de 2 mm de diámetro
Micropipetas para bomba peristáltica
Encendedor Agar nutritivo.
Portaobjetos Parrilla de agitación y calentamiento
Puntas para micropipetas Soporte Universal
Tiras de medición de pH Solución estéril de cloruro de calcio al 1%.
Charolas de aluminio secas Solución de alginato al 2%
Soluciones para realizar tinción de Gram Pipetas de 1 y 10 mL
Cristal Violeta 1 colador de cocina metálico
Lugol
Alcohol-cetona
Safranina
Reactivo DNS
Reactivo de Bradford
Solución de sacarosa al 30%
Agua destilada
55
  
7.3.2. Inmovilización de células de Saccharomyces cerevisiae.

Medio a utilizar en toda la práctica, composición por L de medio: sacarosa, 20 g; KH2PO4,

5 g; (NH4)2SO4, 7 g; NaCl, 0.5 g; MgSO4 7H2O, 0.5 g, CaCl2 2H2O, 0.25 g; extracto de
levadura, 5.0 g
Ajustar el pH a 5 con H2SO4 y NaOH 0.1 N, esterilizar a 120 oC y 1.5 Kg/cm2 durante 15
minutos.
1. Preparar, un día antes de iniciar el experimento, un inóculo de S. cerevisiae en
cuatro matraces de 250 mL con 50mL de medio estéril, pH 5.
2. El profesor proporcionará un cultivo en caja de petri de la cepa Saccharomyces
cerevisiae. De forma aséptica, tomar con el asa una porción de una colonia del cultivo
sólido proporcionado e introducirla en el medio de cultivo estéril del matraz. Incubar a
30°C, con agitación de 120 rpm y durante 14 a 16 horas (toda la noche).
3. Verificar la pureza del cultivo por tinción de gram.
NOTA: TODO el material donde se trabajará debe estar estéril, y manipular
en la campana hasta que esté montado en reactor. Prever tener todo el
material estéril, pipetas, coladores, matraces, mangueras, etc.
4. Centrifugar el cultivo celular de cada matraz en un tubo para centrífuga de 50 mL;
10 min a la máxima velocidad permitida por la centrífuga.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender la pastilla de cada tubo en 10 mL de
solución isotónica estéril.
6. Contar en cámara de Neubauer la población de la suspensión celular.
7. Adicionar a un matraz de 125 mL que contiene 40 mL de alginato de sodio 2.5 % a
40 °C la suspensión de biomasa de un tubo.
8. La mezcla se gotea a través de una jeringa con aguja invertida o por medio de una
bomba peristáltica hacia una solución de CaCl2 1%. De ser posible, contar el
número de esferas obtenidas por mL.
9. Mantener la solución con agitación mínima (aprox. 60 rpm) durante 30 min.
10. Por medio de un colador metálico, recuperar las esferas con células inmovilizadas.
11. Inocular 500 mL de medio de cultivo con las esferas resultantes de un tubo.
12. Inocular 500 mL de medio de cultivo con la suspensión celular procedente de un
tubo.
NOTA: Si se determina el porcentaje de inmovilización, ajustar el volumen
de inóculo con células libres para que sea equivalente al de células
inmovilizadas.

7.3.3. Determinación de la concentración celular inmovilizada.

1. Tomar una muestra de esferas para determinar el volumen y peso de la misma

y establecer el número de células por esfera.
2. Tomar una muestra del cloruro de calcio para determinar las células no
inmovilizadas, por cuenta en cámara de Neubauer.

7.3.4 Cinética de producción.

La cinética se seguirá por 24 h, tomando 5 o 6 mL de medio en cada tiempo para análisis;
Monitoreando los siguientes parámetros en el sobrenadante:
Densidad óptica (biomasa) (Volumen de muestra 1 mL máximo)
Cuenta en placa* (Volumen de muestra 0.1 mL)
Cuneta directa en cámara de Neubauer (Volumen de muestra 0.1 mL)
Tinción de Gram (Volumen de muestra 0.1 mL)

56  
 
  
7.3.5. Tratamiento de las muestras.
*Cuenta en placa se realizará al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final, por
triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando con 0.1
mL de la dilución correspondiente (100 a 10-9 y extendiendo con varilla en “L”. (Se requieren
de 54 cajas por equipo, puntas estériles de 1000 y 100 µL, para las diluciones: 30 tubos
eppendorf estériles, solución isotónica estéril)
En sobrenadante centrifugado a 5000 rpm 15 min determinar:
Proteína por Bradford (Volumen de muestra 0.75 mL)
Azúcares reductores (Volumen de muestra 0.3 mL)
Azúcares totales (Volumen de muestra 0.6 mL)
pH ((Volumen de muestra 1 mL)
Actividad enzimática: (Volumen de muestra 250 µL)

De cada muestra centrifugada, tomar 0.05 mL del sobrenadante y se transferir a un

microtubo. Adicionar 0.95 mL de solución de sacarosa 30 g/L y mezclar. Inmediatamente y
a los 5 min., tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo con 0.1 mL de reactivo de DNS.
Los tubos se colocan en agua hirviente durante 5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL
de agua destilada y medir absorbancia a 540 nm.

Notas:
IMPORTANTE, la única muestra que debe permanecer sin contaminar (tomada y
manipulada en condiciones de esterilidad) es la usada para cuenta en placa.
Tiempos recomendados: en función de los horarios de la clase, establecer el programa de
muestreo, la principal actividad se lleva a cabo en las primeras 12-18 horas, por lo que
dejar al inicio toda la noche el sistema puede hacer que se pierdan los puntos más
interesantes. Se recomienda dejar todo listo, enfriar e iniciar en la mañana.
Las muestras pueden ser tomadas y guardadas en refrigeración para el posterior análisis.
Se recomienda hacer de forma inmediata la cuanta en placa y Tinción de Gram (esta última
para asegurar que no hay contaminación).

7.4 RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

1.- Establecer el porcentaje de inmovilización de células

2.- Comparar la actividad y eficiencia de los dos reactores
3.- Establecer relaciones y correlaciones de los parámetros determinados. Curvas de
crecimiento, degradación, actividad enzimática, consumos de sustrato, etc.
4.- Discutir los resultados obtenidos

7.6 REFERENCIAS
Aehle, W. (2007). Enzymes in Industry - Production and Applications (Tercera edición ed.). Leiden:
Wiley-VCH.
Adrio, J. L., & Demian, A. L. (2005). Microbial Cells and Enzymes: A Century of Progress. En J.
Barredo (Ed.), Microbial Enzymes and Biotransformations (Vol. 17, págs. 1-18). Totowa, New Jersey,
United States of America: Humana Press.
Aranda Barradas J. S.; Salgado Manjarréz E. 2002. Saccharomyces cerevisiae biomass production
and its uses in the food industry. Tecnología de Alimentos, (37): 7-15
Knauf, M., & Kraus, K. (2007). Specific yeasts developed for modern ethanol production. Sugar
Industry , 131 (11), 753-757.
Líden, G. (2002). Undestanding the bioreactor. Bioprocess and Biosystems Engineering , 24 (5), 273-
279.

57  
 
  
M.E. Gregory, M. B.-H. (1996). Optimising enzyme production by bakers yeast in continuous
culture. Bioprocess Engineering (15), 239-245.
Leland, H. (1974). Saccharomyces cerevisiae cell cycle. Bacteriological reviews , Vol. 38 (2), 164-198.
Manchester, K. L. (1995). Louis Pasteur (1822–1895) — chance and the prepared mind. Trends in
Biotechnology , 13 (12), 511-515.
Stroh, W. (1998). Industrial enzymes market: growth experienced from new products and movement
into global market. Genetic Engineering News , 18, 11-38.
Prescott L., Harley J. y Klein D. (2004). Microbiología (Quinta edición ed.). Madrid, España: Mc Graw
Hill. 1240 págs.
White, M. D.; Glick, B. R.; Robinson, C. W. Bacterial, yeast, and fungal cultures. Effects of
microorganism type and culture characteristics on bioreactor design and operation. In Bioreactor
System Design; 1995; pp 47-87. Observaciones
HOJA DE CONTROL DE CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMA POR CÉLULAS LIBRES

sobrenadante
Bradford
(DO) de
Cel/mL sobrenadante
No de DNS (DO) se
Muestra PS (600 nm)
DO
Charola
con

(g)
Pureza de Charola
Cultivo (+,-) (g)
pH
Fecha y hora de término:

T ( °C)
Fecha y hora de inicio:

Tiempo
Aireación (vvm)
Agitación (rpm)
CONDICIONES

(h)
Muestra

T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9

58  
 
  

ANEXO I. Preparación de soluciones.

Ácido 3,5 Dinitrosalicílico, reactivo de

 
o Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta obtener
un volumen final de máximo 50 mL.
o Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada.
o Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada.
o Aforar a 100 mL con agua destilada.
o Guardar en obscuridad y en frasco ámbar.

Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado

con los volúmenes que se manejan, porque el volumen final no debe ser mayor
a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio agregando
agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de agua a la sal
por que dará un volumen mayor) .

Bradford, Reactivo de

Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al 95%.

A esta solución se le añaden 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). La solución
resultante se diluye a un volumen final de 1L con agua destilada. Las
concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de
Coomassie G-250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico.
Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser café. Si tiene un
tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar
el reactivo cuando sea necesario.

Medio e Cultivo para Saccharomyces cerevisiae

Composición por litro de medio: Sacarosa, 30 g; Extracto de Levadura, 5 g;

KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 2 g; MgSO4 . 7H2O, 0.4 g. Ajustar el pH a 5

Reactivos de Gram

a) Cristal Violeta
Disolver 0.5 g de cristal violeta en 100 mL de agua destilada.
b) Lugol
En un mortero, mezclar 0.3 g de yodo metálico y 0.6 g de yoduro de Potasio.
Disolver el contenido del mortero en 50 mL de agua. Con pequeñas
cantidades de agua, lavar el contenido del mortero, adicionándolo a la
solución y cuidando no rebasar los 100 mL de volumen total, al que se afora.
c) Alcohol-Acetona
Mezclar 33.3 mL de acetona con 66.7 mL de Etanol absoluto.

59  
 
  
d) Safranina
Disolver 1 g de Safranina en 100 mL de agua destilada.

Reguladores

 Regulador de Acetatos, 0.25 M

Preparar 250 mL de acetato de sodio 0.25 M.

Preparar 250 mL de ácido acético 0.25 M.
Tomar 200 mL de la solución de acetato de sodio en un vaso de precipitados
de 500 mL con agitación, y adicionar lentamente la solución de ácido acético
hasta alcanzar el pH deseado. Medir el volumen obtenido y diluir con el mismo
volumen de agua destilada.

 Regulador de Boratos, 0.1 M

Preparar 250 mL de borato de sodio 0.1 M.

Preparar 250 mL de ácido bórico 0.1 M.
Tomar 200 mL de la solución de borato de sodio en un vaso de precipitados
de 500 mL con agitación, y adicionar lentamente la solución de ácido bórico
hasta alcanzar el pH deseado.

 Regulador de Fosfatos 0.16 M

Preparar 250 mL de fosfato de sodio monobásico 0.1 M.

Preparar 250 mL de fosfato de sodio dibásico 0.1 M.
Tomar 200 mL de la solución de fosfato de sodio dibásico en un vaso de
precipitados de 500 mL con agitación, y adicionar lentamente la solución de
fosfato de sodio monobásico hasta alcanzar el pH deseado.

 Solución de sacarosa 3%

Pesar 3 g de sacarosa, y disolver en 100 mL del regulador deseado.

60  
 
  

ANEXO II. Técnicas y Determinaciones.

 Determinación de Azúcares Reductores mediante  DNS 
 
1. Colocar 0.1 mL de DNS en un tubo eppendorf de 1.5 mL .
2. Tomar 0.1 mL de muestra a analizar.
3. Adicionar la muestra al tubo con los 0.1 mL de DNS.
4. Preparar un blanco con 0.1 mL + 0.1 mL de blanco (agua o regulador).
5. Incubar en baño maría en ebullición por 5 min todos los tubos de manera
simultánea.
6. Pasar los tubos a baño frio por 5 min o que hasta que ya estén fríos.
7. Adicionar 1 mL de agua destilada a cada tubo y homogeinizar.
8. Leer a 540 nm, emplear el blanco para ajustar a cero de abs..

 Determinación de Bradford  

1. Colocar 0.25 mL de la muestra en una celda para espectrofotómetro

2. Adicionar 0.75 mL de solución Bradford u homogenizar con la punta (asegurar usar
una punta diferente)
3. Preparar el blanco con agua, buffer, o lo que corresponda (0.25 mL) y agregar
0.75mL de Bradford
4. Dejar reposar por lo menos 5 min.
5. Leer a 595 nm, emplear el blanco para ajustar a cero de abs.

 Determinación de Biomasa por Peso Seco 

1. Colocar 10 mL o un volumen conocido del de cultivo en un tubo para centrífuga de

15 mL.
2. Centrifugar por 5 min a 6,000 rpm.
3. Decantar el sobrenadante.
4. Resuspender la pastilla adicionando 1 mL de agua destilada.
5. Colocar la pastilla resuspendida en una charola a peso constante previamente
pesada.
6. Secar en una incubadora o estufa a 60 °C por 24 h.
7. Pesar la charola con la biomasa seca.

 Determinación de Biomasa por Densidad Óptica 

1. Para la determinación de biomasa, es necesario contar con una muestra de caldo

de cultivo apropiadamente homogenizada y el sobrenadante de centrifugación de la
misma muestra.
2. Se emplea como blanco el sobrenadante de centrifugación, para ajustar a cero la
absorbancia a 600 nm.
3. Se lee la muestra homogenizada.

61  
 
  

62