Instituto Politécnico Nacional 

Unidad Profesional Interdisciplinaria De Biotecnología 
 
 
 
 
 
 
Diseño de Procesos de Separación 
 
 
 
CROMATOGRAFÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Equipo: 

Burgos Vergara Ariel  

Carmona Figueroa Gabriel 

Cervantes Martínez Alejandra  

Salguero Romero Gustavo 

Saucedo López Rafael Eduardo 

 
Profesora: Adriana Nieves Hernández 
 
Grupo 7LV2 
 
 
 
 
 
Noviembre 28, 2018 
 
 
5.1 Definición del problema  
La  terapia  génica  es una técnica de tratamiento y prevención de enfermedades congénitas a 
través  de  vectores  que  permiten  la  edición  de  genes.  Un  vector  con  potencial  médico  es  el 
Adenovirus tipo 5, el cual es purificado mediante cromatografía de intercambio aniónico.  
 
La  capacidad  de unión entre las partículas virales y la resina se ve afectada por el tamaño de 
las  partículas  presentes  en  la  resina,  por  lo  que  es  necesario evaluar los diferentes tamaños 
de partícula disponibles comercialmente y encontrar el óptimo para llevar a cabo el proceso. 
 
 
5.1.1 Principio del proceso 
La  cromatografía  es  el  método  para  separar  en  sus  diferentes  componentes  (resolver)  una 
mezcla  de  solutos  y  es  empleada  con  el  propósito  de  purificar  productos de interés (Asenjo 
y  Andrews,  2009).  Ésta  se  efectúa  en  columnas  empacadas  con  adsorbentes  que  pueden 
ser  sólidos,  sólidos  porosos  o  geles.  El  adsorbente  constituye  la  fase  estacionaria  de  la 
columna.  En la operación de una columna cromatográfica se aplica una pequeña cantidad de 
muestra  en  la  parte  superior  de  la  columna.  Una  vez  colocada  la  mezcla  se  hace  pasar  un 
líquido que favorezca la desorción llamado eluyente (fase móvil). 
 
Conforme  avanzan  los  solutos  sobre  la  columna  éstos  se  separan  permitiendo  su 
purificación. 
 
En  la  cromatografía  por  elución  isocrática  la  composición  del  eluyente  se  mantiene 
constante  durante  el  proceso.  En  la  elución  por  gradiente  la  composición  del  eluyente  se 
varía  gradualmente.La  operación  de  una  columna  cromatográfica  es  similar  a  la  de  una 
columna  de  adsorción. Sin embargo, en la cromatografía por elución la columna no se satura 
completamente con soluto, sino que sólo se carga en forma controlada una porción de ésta. 
 
 
5.1.2 Definición de restricciones  
Las  restricciones  del  proceso  están  dadas  por  el  tipo  de mecanismo de separación entre las 
fases: 
 
● Polaridad  de  las  fases.  La  fuerza  con  la  que  es  adsorbido  un  componente  depende 
de  la  polaridad  de  este,  de  la  actividad  del  adsorbente  y  de  la  polaridad  de  la  fase 
móvil.  En  general,  cuando  más  polar  es  un  compuesto  más  fácilmente  será 
adsorbido. 
 
● Coeficiente  de reparto. Cuando la cromatografía está basada en la separación de una 
mezcla  de  sustancias  mediante  el  reparto  existente  entre  la  fase  móvil  y  la  fase 
estacionaria,  la  mayor  o  menor  migración  de  un  compuesto  estará  en  función  del 
coeficiente  de  reparto.  El  coeficiente  de  reparto  solo es utilizable en la separación de 
compuestos de polaridad media y alta. 
 
● Permeabilidad  de  la  fase  estacionaria.  La  permeabilidad  del  gel  o  de  la  matriz 
permite  separar  las  moléculas  por  su  tamaño  en  lugar  de  su  solubilidad o polaridad. 
 El  rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo de pesos 
moleculares  que  puede  ser  separados,  otro  parámetro  que caracteriza a este tipo de 
fases,  es  su  límite  de  exclusión,  que  se  define  como  el  peso  molecular  a  partir  del 
cual  los  compuestos  pasarán  a  través  del  lecho  estacionario  sin  experimentar 
retención. 
 
● En  la  cromatografía  por  intercambio  iónico  se  utilizan  tres  tipos  de  materiales: 
resinas,  geles  y  celulosas.  La  diferencia  fundamental  entre  ellos  reside  en  su 
microestructura.  El  tamaño  del  poro  de  la  resina  al  que  se  une  el  compuesto  móvil 
por  intercambio  iónico influye directamente en la capacidad de unión. En membranas 
cuyo  tamaño  de  poro  es  pequeño  (menor  de  600Å)  no  hay  espacio  suficiente  para 
unir  el  ión  dentro  de  dichos  poros  por  lo  que  la  cantidad  de  intercambiador  por 
unidad  de  superficie  es  menor.  Sin  embargo,  en  membranas  con  tamaño  de  poro 
mayor  (mayor  de  600Å)  se  puede  unir  el  compuesto  móvil  dentro  de  dichos  poros, 
con  lo  que  se  incrementa  la  cantidad  de  intercambiador  por  unidad de superficie. La 
porosidad busca una mayor superficie de intercambio 
 
● Interacción  entre  las  fases.  La  separación  por  intercambio  iónico  se  lleva  a  cabo con 
materiales  insolubles  y  de  textura  porosa,  los  cuales  presentan  grupos  reactivos 
asociados  a  iones  lábiles.  Esta  separación  se  basa  en  los  diferentes  equilibrios  de 
reparto de los iones de la mezcla entre el material de la columna y la disolución. 
 
● Compatibilidad  entre  las  cargas.  La  separación  por  cromatografía  de  intercambio 
iónico  depende  de  la  adsorción  reversible  de  una  molécula  de  soluto  cargada  a  un 
grupo de intercambiadores iónicos inmovilizados de carga opuesta.  
 
 
 
 
Figura  1.  Unión  de  la  proteína  a  la  matriz.  La  matriz  y  la  proteína  deben 
tener cargas opuestas. 
 
Matriz con carga positiva: intercambio aniónico. 
 
Matriz con carga negativa: intercambio catiónico. 
 
 
 
● La  ​fuerza  de  enlace  de  la  muestra  depende  de  la  magnitud de la carga. La fuerza de 
retención  es mayor y, por consiguiente la de elusión es menor, mientras más cargado 
se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes).   
 
● pH  del  sistema.  Se  debe  usar  un  pH  que  difiera  en  una  unidad  del  pI  de la proteína. 
La  proteína  debe  tener  una  carga  neta  suficiente  para  unirse  a  la  matriz,  pero  no 
tanta  para  que  se  requieran  condiciones  muy  extremas  para  ser  eluida.  Las  resinas 
ácidas  fuertes  siguen  ionizadas  incluso  en  disoluciones  muy  ácidas,  en  cambio  las 
 resinas  ácidas  débiles  se  protonan  a  un  pH  próximo  a  4  y  pierden  su  capacidad  de 
intercambio  catiónico,  reduciéndose  así,  el  tiempo  de  retención.  Los  grupos  muy 
básicos  de  amonio  cuaternario  siguen  siendo  catiónicos  a  cualquier valor de pH. Los 
básicos débiles de amonio terciario se 
desprotonan  en  disoluciones  moderadamente  básicas  y  pierden  entonces  su 
capacidad, reduciéndose también el tiempo de retención.  
 
● Tipos de matrices de intercambio iónico:  
Fuertes: permanecen ionizadas en todo el rango útil de pH.  
Débiles: disminuyen su ionización en función del pH.  
Si  las  condiciones  de  la  cromatografía  requieren  pH  extremos,  se  debe  utilizar  un 
intercambiador iónico fuerte.  
 
● Velocidad  de  la  fase  móvil.  La  resolución  de  la  columna  depende  de  la velocidad del 
flujo en la columna.  
 
● Número  de  platos  teóricos.  El  número  de  platos  de  una  columna  cromatográfica 
depende  de  su  longitud,  por  lo  que  para  comparar  la  eficacia  de  columnas  con 
diferente  longitud,  se  introduce  otro  término,  denominado  altura  equivalente  del 
plato teórico, que relaciona la eficacia de una columna con su longitud. 
 
● Tiempo  de  retención.  En  la  cromatografía  de  intercambio  iónico  la  retención se basa 
en  la  atracción  entre  iones  del  soluto  y  la  carga  complementaria  de  la  fase 
estacionaria.  
 
● Gradiente  de  concentración  entre  fases.  Aumentando  la  concentración  de  la  fase 
móvil,  los  iones  compiten  cada  vez  más  favorablemente con la muestra por los sitios 
activos cargados de la fase estacionaria. 
 
5.2 Análisis y modelación del proceso 
Para ver la capacidad de la columna de cromatografía se utiliza la siguiente ecuación 

 
Ap= Área de la partícula de resina=cm2 
Av= Área de la partícula de resina=cm^2 
eb= Volumen vacío 
fp= Factor de empacamiento  
Vp=Volumen de partícula de resina  
 
 
 
 
 
 
 
5.2.1 Desarrollo de las ecuaciones modelo 
Si sabemos que el área y volumen de una esfera está dado por: 

 
r=radio=cm 
Entonces la ecuación principal se puede expresar como: 

 
donde 
rv= radio del virus 
rp=radio de la partícula de la resina 
 
 
5.3 Determinación de información experimental faltante 
El  diámetro  de partícula del Adenovirus tipo 5 es de 120 nm aproximadamente, con un peso 
molecular de 1.65x10^8 g/mol. 
 
El  diámetro  de  partícula  de  la  resina  se  investigó  de  distintos  proveedores,  variando  desde 
15 hasta 85 µm. 
 
De  acuerdo a la literatura, el volumen hueco de una columna empacada correctamente es de 
0.38, con una fracción de empaque de 0.54 - 0.55. 
 
 
5.4 Diseño del proceso  
Tres  conceptos  se  combinan  para  lograr  un  diseño  apropiado  en  el  arreglo tipo columna de 
lecho fijo: 
● El modelo de la columna. 
● Los criterios para la evaluación técnica del comportamiento de la columna: 
● Resolución, Pureza y Rendimiento. 
● Los procedimientos de escalamiento y optimización de la columna 
 
 
5.4.1 Definición de variables de diseño 
Capacidad  de  la  columna:  Se refiere a la cantidad moléculas de compuesto de interés por ml 
de la resina a utilizar, puede estar dado en mg/ml , moléculas/ml, etc. 
 
Diámetro  de  partícula:  Es  la  medida  del  diámetro  de  la  esfera  de  la  partícula  de  interés  ya 
sea la resina o el compuesto a retener y está dado en cm,m. 
 
Factor  de  empaquetamiento:  Es  de  un  volumen  dado  la  proporción  de  este  que  está 
ocupado por átomos. 
 
Volumen vacío: Es la fracción del volumen total que está vacío en la columna. 
 
 
5.4.2 Determinación del problema  
Para  la  selección  de  una  resina,  es  importante  conocer  su  capacidad  de  adsorción  hacia  el 
soluto  de  interés.  Esta  capacidad  es  una  relación  del  área  de  la  partícula  disponible  con  el 
área del soluto, considerando la porosidad del lecho (volumen vacío).  
 
 
5.4.3 Solución del problema  
Sustituyendo  las  áreas  y  volúmenes  de  las  partículas,  se  obtiene  una  ecuación simplificada, 
dependiente de el radio de cada partícula. 

 
El mismo cálculo se realizó para diferentes tamaños de partículas de diferentes resinas 
comerciales. 
 
5.5 Definición de criterios de optimización  
 
Se desea comparar diversas marcas de resinas para determinar teóricamente su capacidad 
estática y finalmente elegir una de ellas para recuperar los viriones. 
 
Se utilizaron como resinas de estudio: 
● GE Source 15Q 
● Merck Fractogel EMD TMAE 
● Thermo Fisher POROS 
● Biorad Nuvia Q AER 
 
 
 
 
5.5.1 Búsqueda del óptimo  
 
Resina  Diámetro  Capacidad (mg/mL) 

GE Source 15Q  15 μm  0.82612 

Merck Fractogel EMD TMAE  30 μm  0.41306 

Thermo Fisher POROS  50 μm  0.24784 

Biorad Nuvia Q AER  85 μm  0.14579 

 
5.6 Discusión sobre las limitaciones y especificidad del diseño 
 
Como  se  definió  previamente,  la  capacidad  indica  la  cantidad  de  compuesto  de  interés 
recuperable  por  cada  mililitro  de  resina.  Por  el  pequeño  diámetro,  comparada  con  las  otras 
resinas, la GE Source 15Q tiene la mayor eficiencia de recuperación de virus. 
 
Este  modelo  se  limita  a  utilizar  como  parámetros  los  diámetros  de  partícula  y espacio vacío 
en  el  lecho,  despreciando  así  la  afinidad  de  la  resina  por  la  molécula  de  interés  y  la 
tortuosidad  o  los  canales  que  se  forman  para  que  la  fase  móvil  puede  desplazarse  en  la 
matriz.  Para  un  análisis  más  cercano  a  la  realidad  del  proceso,  se  recomienda  incluir  la 
tortuosidad y afinidad de la resina en las ecuaciones de diseño. 
 
 
Referencias  
 
● Asenjo, J.A.; Andrews, B.A.2009. Protein purification using chromatography: 
selection of type, modelling and optimization of operating conditions. J. Mol. Recognit  
● Coulson  J.  M.  y  Richardson  J.  F.  (2003).  Ingeniería  química,  operaciones  básicas. 
España: Reverté, S. A.  
● Tejeda,  A;  Rosa  María  Montesinos  C  y  Guzmán,  R.  (2011).  ​Bioseparaciones​. 
Pearson. 
● Warren,  McCabe  &  SMITH  Julian.  (1998).  Operaciones  unitarias  en  ingenieria 
quimica.  
● Harris,  Daniel  C.  “Análisis  Químico  Cuantitativo”,  3ª  Edición,  Editorial  Reverté. 
(Página 641).  
● Freifelder,  D.  “Técnicas  de  Bioquímica  y  Biología  Molecular”,  Editorial  Reverté. 
(Página 217).  
● Voet, Donald; Voet, Judith. “Bioquímica” 3a Edición 2006