Práctica 1

TECNICAS DE TINCIÓN SIMPLE, DIFERENCIAL Y SELECTIVA

Objetivo
Aprender las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas en el estudio
microscópico de cultivos microbianos, con el fin de obtener información básica para hacer
la descripción inicial de los microorganismos.

Introducción
Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y
cianobacterias), por los que no se observarán con facilidad en un microscopio óptico de
campo claro por la falta de contraste entre las células y el medio circundante, por lo que es
necesario fijarlos y teñirlos en un frotis. Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña
suspensión de los microorganismos sobre una superficie transparente que, posteriormente,
se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos; lo que causará la inactivación o muerte
celular y algunas modificaciones de sus características. Existen diferentes tipos de tinciones:
simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el número y tipo de colorantes utilizados y
de los objetivos de estudio. La tinción que hace uso de un solo colorante es la simple. Las
tinciones diferenciales permiten diferenciar microorganismos con características
superficiales distintas, por lo que requieren más de un colorante. La más utilizada en
bacteriología es la propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, que clasifica los
cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. Las
tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas que son útiles para la
clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite
identificar bacterias de tipo Bacillus y Clostridium.

Materiales y equipos

Por equipo: Por grupo:

1 mecheros
2 asas de inoculación
10 portaobjetos Medios y reactivos
1 piceta con agua destilada 4 juegos de colorantes de Gram
1 microscopio óptico 2 frascos gotero con verde de malaquita 5% en
agua
1 frasco gotero con aceite de inmersión
Etanol absoluto
Procedimientos
El profesor proporcionará cultivos líquidos y sólidos de cada una de las cepas de estudio y
un cultivo problema. El equipo de trabajo preparará frotis de los dos tipos de cultivos y hará
tinción simple de S. cerevisiae y la muestra problema; tinción de Gram de Micrococcus sp.,
Escherichia coli, Bacillus sp., así como la tinción selectiva de endosporas en cultivos de
Bacillus sp.

Preparación de frotis (Figura 1.1)

1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
2. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo.
Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si
los frotis son de cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota
de agua destilada.
3. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la
boca e introducir el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del
portaobjetos, extenderla suavemente en área circular de más o menos 2 cm de
diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.
4. En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se
realiza el mismo procedimiento antes descrito.

Fijación del frotis

5. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos
rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero.
6. Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol absoluto, que
se dejarán secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada del mechero).

Tinción simple
1. Cubrir el frotis de S. cerevisiae y de la muestra problema con 1 gota de azul de
metileno durante 60 segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante con la piceta de agua destilada y dejar secar al aire.

Figura 3.1 Preparación de un frotis.

Tinción de Gram
1. Cubrir el frotis de Micrococcus sp., E. coli, Bacillus sp. y de la muestra problema con
2 gotas de cristal violeta durante 60 s. Lavar cuidadosamente el frotis con agua
destilada para eliminar el exceso de colorante.
2. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 s. Lavar con
precaución el frotis con agua.
3. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más
colorante. Lavar de inmediato con agua.
4. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 s. Lavar de nuevo con agua, quitar el exceso
de agua y dejar secar al aire.

Tinción selectiva de endosporas

1. Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre un frotis de Bacillus sp.
2. Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la
preparación.
3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
4. Dejar durante 5 min evitando que se seque el colorante (agregar un poco más, si es
necesario).
5. Eliminar el colorante con agua destilada y cubrir con safranina durante 30 s.
6. Lavar nuevamente, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

Observación al microscopio.
1. Limpiar con precaución los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las
indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de
10X, después pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X colocar
previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el
exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

Resultados
1. Reportar las observaciones microscópicas en las Tablas 1.1, 1.2 y 1.3.
2. Comparar sus observaciones con la información reportada en la literatura.
Tabla 1.1 Observaciones de cultivos con tinción simple

Cepa 1: Cepa 2:
Característica
______________ ______________

Cultivo Líquido

Aumento total

Forma
(esféricas, ovales)
Agrupación
(sola, par, cadena, racimos)

Densidad

Cultivo Sólido

Aumento total

Forma
(esféricas, ovales)
Agrupación
(sola, par, cadena, racimos)

Densidad

Tabla 1.2 Observaciones de cultivos con tinción de Gram

Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3: Cepa 4:

Característica
______________ ______________ ______________ ______________

Cultivo Liquido

Aumento total

Forma
(coco, bacilo, etc.)

Agrupación
(par, cadena, racimos)
 Cultivo Liquido

Aumento total

Forma
(coco, bacilo, etc.)

Agrupación
(par, cadena, racimos)

Tabla 1.3 Descripción de endosporas

Cepa 1: Cepa 2:
Característica
______________ ______________

Descripción del cultivo

Forma y localización
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación y fijación de
frotis?
-El cristal violeta tiende a formar precipitados lo cual puede ser causa de observación
de estructuras falsas en el frotis. Si se observan precipitados se debe filtrar el colorante.
- La evaporación puede ser una causa de mal funcionamiento de los colorantes.
- Las placas sucias con residuos de polvo o grasa pueden ser causa de mala fijación y
tinción de la muestra.
- Sobrecalentamiento de la placa durante la fijación. El exceso de calor provoca un daño
físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retención de los
colorantes.
- Lavado muy fuerte de la placa durante la tinción.
- Cantidad insuficiente de los colorantes.

2. ¿Cuál es la descripción general de un microorganismo que puede reportar en un

estudio microscópico aplicando las técnicas de la práctica?

Los estudios microscópicos de los microorganismos proporciona datos fundamentales para

su identificación, como forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes y estructuras
celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar microorganismos, y permite
establecer características como la pureza, presencia de contaminantes, variedad o edad de
una población.

3. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción de Gram?

La edad de la bacteria, errores del operador y el uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de
bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglucano y teñirse como gram
negativos) y la técnica empleada pues al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede
correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas.

4. Si se aplica la tinción de Gram de Bacillus sp. con endosporas ¿Cómo se observarían

la célula vegetativa y la endospora? ¿Por qué?
Unos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su
interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.
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