UNMSM EAP Medicina Humana

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE

SAN MARCOS
(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE MEDICINA

Efecto protector del extracto

Alcohólico de Myrciaria dubia
en un modelo murino de asma

Medicina
Humana
UN
MSM

Patología Experimental Grupo 12

UNMSM EAP Medicina Humana

Título:
Efecto protector del extracto alcohólico de Myrciaria dubia
en un modelo murino de asma

Autores:
• Bermejo Cataño, Pedro Felipe
• Cardenas Gallegos, Jesús Kevin
• Chavarría Delgado, Janis Julio Eduardo
• Chavez Pichardo, Jimmy
• Cirilo Jacobo, Melany Mercedes
• Coronado Cumpa, Gunther Nick
• Diaz Retes, Javier Jesús
• Mendo Castillo, Carlos Antonio
• Motta Jara, Francisco Alex
• Oré Moreno, Isabel Gabriela

Alumno colaborador:
Chalco Huaman, Joel Leonidas

Alumnos de segundo año de la Facultad de Medicina

Humana
UNMSM

Asesora Estudiantil: Lizeth Katherin Chavez Conde

Profesor Asesor: Ernesto Nava Carrión

Patología Experimental Grupo 12

UNMSM EAP Medicina Humana

1. INTRODUCCIÓN

El asma es una enfermedad crónica de las vías aéreas que da

lugar a episodios de obstrucción, hiperreactividad bronquial e
inflamación que generalmente son reversibles. Esta
enfermedad inflamatoria es la más relevante en Latinoamérica,
siendo el Perú el país con más alta prevalencia pues aquí se
ha registrado el 27% de todos los casos.1 El asma es la
enfermedad más frecuente en pediatría, ya que existe 265 mil
de niños menores de 5 años que padecen esta enfermedad
situándose principalmente en Lima, dada a las condiciones de
humedad que presenta esta parte del país.1

Por otra parte, nuestro Perú es uno de los países con mayor
biodiversidad, tanto de flora como de fauna. Tenemos
conocimiento que en algunos lugares del Perú algunas de
estas plantas son empleadas como remedios caseros por
nuestros pobladores, quienes desde tiempos antiguos han
conocido sus propiedades medicinales. En estos últimos años
M. dubia (Camu camu), ha despertado el interés de la
comunidad científica. Esta es una fruta que crece en la
Amazonia peruana y que en pues se ha descubierto que es la
fruta que contiene la mayor cantidad de vitamina C, incluso
más que en recientes estudios se ha destacado su alto
contenido vitamínico, principalmente de acido ascórbico (Vit C)
pues su contenido es aproximadamente 30 veces la cantidad
de vitamina c de la naranja. Sin embargo, el camu camu
contiene, además de vitamina c, una alta cantidad de
antocianinas, un tipo de flavonoide, con propiedades
antioxidantes, antiasmáticas, antiinflamatorias, antidiabéticas y
antitumorales donde se puede reflejar su importancia. 2,3.
Conocida la problemática actual de salud en el país por la alta
prevalencia de asma en nuestra sociedad, el presente estudio

Patología Experimental Grupo 12

UNMSM EAP Medicina Humana

buscar darle una alternativa de solución usando un planta

nativa del Perú. Es por ello que nos enfocamos en demostrar el
efecto protector de la M. dubia en el asma sobre la base de sus
propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y conservar estos
en la preparación de un extracto alcohólico elaborado partir de
la cascara de esta fruta, para poder darle una aplicabilidad
futura en la prevención de esta enfermedad.

OBJETIVOS

GENERAL
Determinar el efecto del extracto alcohólico de Myrciaria dubia en
un modelo murino de asma

ESPECÍFICOS
De la fase piloto:
• Determinar la dosis del extracto Myrciaria dubia para la
protección en un modelo murino de asma.
• Corroborar la validez del protocolo murino de inducción de
asma.
• Adquirir destreza para la extracción de sangre, que se
empleará en el examen de inmunoglobulina E.
• Adquirir destreza para la administración intraperitoneal del
agente inductor
• Adquirir destreza para la administración vía oral por cánula
del extracto alcohólico de Myrciaria dubia

Bioquímico:
• Cuantificar y comparar los niveles séricos de
inmunoglobulina E (IgE) en todos los grupos al finalizar la
intervención.

Patología Experimental Grupo 12

UNMSM EAP Medicina Humana

Anatomo- patologico:
• Describir, evaluar y comparar la infiltración de eosinófilos
en los cortes histológicos de las vías respiratorias en
todos los grupos al finalizar la intervención.

2. MATERIAL Y MÉTODO

2.1 MATERIAL

BIOLOGICO
Se usaron ratones Hembra Balb/c de seis semanas de edad, con
peso promedio de 29.28g, adquiridos en el Instituto Nacional de
Salud (INS). Se mantienen con ratina® y agua ad libitum, en
condiciones adecuadas de temperatura (22.7±2ºC), humedad
relativa (66.03±0.5), con ciclo luz oscuridad de 12 horas cada una.

FITOQUÍMICO
Extracto alcohólico de Myrciaria dubia
Se realizó a partir de la cáscara del fruto de Myrciaria dúbia (camu-
camu) que fue adquirido en el mercado mayorista” La Parada”, el
cual procede de

Posteriormente fue certificado en el Museo de Historia Natural de

la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Patología Experimental Grupo 12

UNMSM EAP Medicina Humana

QUÍMICO
Ovoalbúmina
Agente inductor del asma. Fue adquirido en la Facultad de
Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San
Marcos (UNMSM), procedente del laboratorio

Hidróxido de Aluminio(Al(OH)3)
Coadyuvante de la ovoalbúmina en la solución. Fue adquirido en la
Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos (UNMSM), , procedente del laboratorio

Solución buffer de tampón fosfato (PBS)

Coadyuvante de la ovoalbúmina en la solución. Fue adquirido
en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), procedente del
laboratorio

Patología Experimental Grupo 12

 MÉTODO DE TRABAJO
2.2. MÉTODO
FLUXOGRAMA Extracto de Myrciaria dubia

PILOTO
Aclimatación
MUESTRA Aleatorización

Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo

Blanco Control EXP1 EXP2 EXP3 EXP 4 EXP 5
(n=4) (n=4) (n=4) (n=4) (n=4) (n=4)
(n=4)

EXPERIMENTAL
ANÁLISIS DE VARIABLES
IgE, Infiltración de Eosinófilos
MUESTRA

Grupo Grupo Grupo

Blanco Control Experimental

(n=8) (n=8) (n=8)

ANÁLISIS DE VARIABLES
IgE, Infiltración de eosinófilos

EXTRACCIÓN DE SANGRE

SACRIFICIO

ANÁLISIS MACROSCÓPICO

ANÁLISIS MICROSCÓPICO

INFORME Y PUBLICACIÓN PRESENTACIÓN PÚBLICA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ( p < 0,05)

2.2 MÉTODO
Tipo y diseño del estudio
Experimental incompleto, el diseño cuenta con aleatorización y grupo control.

PRUEBA PILOTO

Preparación del extracto alcohólico de Myrciaria dubia

El procedimiento de preparación del extracto alcohólico de Myrciaria dubia se llevo a acabo
en el Laboratorio de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos (UNMSM) y se procedió según los siguientes pasos

1) Se extrajo la cáscara de la fruta en el Laboratorio de la Facultad de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) luego de la cual se
pudo recepcionar la muestra.
2) La muestra se sometió a secado en estufa por 48 horas a 60 C° con humedad 30%
constante, resultando 200 gramos de aquella muestra.
3) Se molió con molino de atracción
4) Se maceró por 4 días con mezcla 85-10-5 de agua-etanol-metanol.
5) Filtración. Esta mezcla fue tamizada con un papel filtro durante 15 minutos. El etanol Lugo
fue evaporado a una temperatura máxima de 40° C en la estufa durante 24 horas.
6) La muestra fue liofilizada a -60 C° y a 250 mmHg por 24 horas
7) Luego la mezcla fue reconstituida con agua, en función a las dosis de acuerdo al peso del
animal de experimentación, para su administración.

Intervención 1
Se usaron 28 ratones, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente en siete grupos de 4
ratones cada uno: Grupos Blanco, Control y Experimentales 1, 2, 3, 4 y 5. Todos los
grupos, excepto el grupo blanco, fueron sensibilizados con 50ug de ovoalbúmina
emulsificada con 1mg de Al (OH)3 en un volumen total de 100uL de PBS, administrado por
vía intraperitoneal (i.p.) los días 1, 7 y 14. Mientras que el grupo blanco recibió suero
fisiológico. El día 18 los grupos sensibilizados fueron expuestos por vía inhalatoria a 1mg/ml
de ovoalbúmina en PBS durante 30 minutos, mientras que el grupo blanco recibieron sólo
PBS

Desde el día 12 los Grupos Experimentales 1, 2, 3, 4 y 5 fueron tratados con distintas

dosis del extracto alcohólico de Myrciaria dubia por vía orogástrica mediante cánula durante
1 semana. Mientras que el Grupo Control recibieron suero fisiológico por vía oral.

Dosis
Se calcularon a partir de un estudio previo de antocianinas y asma, siendo las siguientes:

-dosis exp1: 75mg/kg de peso (X/4)

-dosis exp2: 150mg/kg de peso (X/2)

-dosis exp3 : 300mg/kg de peso (X)

-dosis exp4: 600mg/kg de peso (2X)

-dosis exp5: 1200mg/kg de peso (4X)

Sacrificio

Se realizó por dislocación cervical al finalizar el último día de tratamiento. Las costillas se
extrajo con tijera y se procederá a la extracción de sangre con el tubo capilar de 25uL.
Antes de extraer el pulmón, el tejido pulmonar y la tráquea fueron embebidas con 4% de
paraformaldehido usando una ligadura alrededor de la tráquea. Luego, se extraerán los
pulmones y la tráquea, se lavarán con suero fisiológico y se mantendrán en formal al 10%
durante 24 horas para el fijado de las estructuras. Se realizarán cortes con micrótomo de
4um de grosor y las muestras serán teñidas con hematoxilina-eosina.

Procedimientos de recolección de información

Los análisis de los niveles séricos de Ig E se realizarán mediante enzimoinmunoanálisis

5
(ELISA) con la técnica de sándwich en el Hospital Nacional Dos de Mayo. Se calificará el
daño histológico en el pulmón con (0) no hay células inflamatorias, (1) mínima acumulación
de células inflamatorias, (2) una capa de células inflamatorias, (3) dos a cuatro capas de
células inflamatorias y (4) más de cuatro capas de células inflamatorias según E. J. Yan Et
4
al

Definiciones operacionales

El efecto protector de la Myrciaria dubia en el asma del animal de experimentación. La

Myrciaria dubia en extracción alcohólica, a concentraciones de Exp1, Exp2, Exp3, Exp4 y
Exp5 tiene el efecto protector en el asma provocado en animal de experimentación cuando
los valores séricos de Ig E de los grupos expuestos al extracto son significativamente
diferentes e inferiores a los del grupo control, y cuando el corte histológico evidencie menor
infiltración de células inflamatorias, predominantemente eosinófilos, en las vías respiratorias.
VARIABLES
Variables independientes

DIMENSIÓN ESCALA FORMA

DEFINICIÓN TIPO DE INSTRUMENTO INDICADOR
VARIABLE DEFINICIÓN DE LA DE DE
CONCEPTUAL VARIABLE Y/O TÉCNICA (UNIDAD)
OPERACIONAL VARIABLE MEDICIÓN MEDICIÓN

Resultado del M. dubia

Extracto preparado de procesado con Medido con una
Cuantitativa
alcohólico una planta en 75º de etanol, FITOQUÍMICA Razón Directa balanza y una mg/Kg
continua
de M. dubia alcohol para su liofilizado y probeta
administraciòn reconstituido
50ug de
ovoalbúmina
emulsificada
con 1mg de
Es la principal Medido con una
Ovoalbúmin Al(OH)3 en un Cuantitativa
proteína de la QUÍMICA Razón Directa balanza y una mg/Kg
a volumen total de continua
clara del huevo probeta
100uL de
Solución salina
tamponado
fosfato
Variable dependiente: ASMA
DEFINICIÓN CONCEPTUAL

DEFINICIÓN CONCEPTUAL

DEFINICIÓN OPERACIONAL
VARIABLE

DIMENSIONES

INDICADORES

FORMA DE MEDICIÓN

INSTRUMENTO

CRITERIO DE MEDICIÓN

TIPO Y

SUBINDICADOR
ESCALA
TÉCNICA O
ASMA

BIOQUÍMICA

DIRECTA
Enfermedad inflamatoria Nivel sérico de IgE Es el nivel en Nivel de IgE en 25uL ELISA- Normal: Cuantitativ mg/dl
crónica de las vías sangre de la IgE, de sangre medido técnica de Niveles a
respiratorias el cual está con sándwich. séricos de IgE Razón
caracterizadopor implicado en la enzimoinmunoanálisi Del grupo
hiperreactividad hipersensibilidad s (ELISA)- técnica de Blanco
bronquial; tipo I (alergia) y sándwich.
en la cual participan desencadena la Asma:
numerosos elementos degranulación de Valores
celulares y humorales, en los mastocitos superiores al
especial, los eosinòfilos y liberándose así la Del grupo
la IgE histamina. Blanco
ANATOMO-PATOLÓGICO

DIRECTA
Infiltración de Presencia de Presencia de escala de (0) no hay Cualitativa
eosinófilos leucocitos en la eosinófilos y células según E. J. células Ordinal
zona de inflamatorias en las Yan Et al inflamatorias,
inflamación vías respiratorias de (1) mínima
acuerdo con la escala acumulación
de según E. J. Yan Et de células
al inflamatorias,
(2) una capa
de células
inflamatorias,
(3) dos a
cuatro capas
de células
inflamatorias y
(4) más de
cuatro capas
de células
inflamatorias
Plan de análisis de resultados

El procesamiento de datos se realizará en Microsoft Excel 2007 y el paquete

estadístico SPSS versión 17.0. Los niveles séricos de IgE tras la medición serán
sistemáticamente ordenados, clasificados y codificados según la prueba de SHAPIRO-
WILK (muestra menor de 50) para analizar si presenta distribución normal,
posteriormente se realizarán las pruebas que el esquema muestra a continuación, en
función a la característica de la muestra. El valor de significancia para las pruebas será
de p < 0,05.

SHAPIRO- WILK (n<50)

IgE
Si tiene distribución Si no tiene distribución
normal normal

-ANOVA, -Kruskal Wallis,

(comparación de más (comparación de
de 2 grupos) más de 2 grupos)
-pruebas post hoc de -prueba Duncan
Tukey y Scheffé (comparación de 2 a
(comparación de 2 a 2 2 grupos)
grupos)

Aspecto ético

Se cumplen con los aspectos éticos para animales de experimentación según “The
Guide for the Care and Use of Laboratory Animal of National Academy Press
Washington” 2, con los siguientes detalles:

-los animales se encuentran de dos en dos en jaulas de 30cmx 15cm x 15cm.

-limpieza interdiaria de las jaulas

-agua y ratina® ad libitum

-Adquirir en una institución certificada

-No producir sufrimiento innecesario

3. RESULTADOS
Se logro cumplir con ciertos objetivos anteriormente planteados como:

 La adquisición de destreza para la administración intraperitoneal del agente

inductor.
 La adquisición de destreza para la administración vía oral por cánula del
extracto alcohólico de Myrciaria dubia.
 Se adquirió destreza para el proceso de la extracción de órganos y en el
preparado de las muestras que están siendo procesadas para los cortes
histológicos correspondientes.

Poner las fotos del proceso e informar la dificultad con la

sangre
4. RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES
Búsqueda de extracción de sangre
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ya lo arreglaremos en la noche

INTRODUCCIÓN
1. The International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) Steering Committe.
Worldwide variation in prevalence of symtoms of asthma, allergic rhinoconjunctivitis, and atopic
eczema: ISAAC. Lancet 1998;351:1225-32.

2
Nuñez Cocha.Camu Camu. CEDECAM
Disponible en URL:
http://www.camucamuperu.com/camucamu_informacion.htm
3
Camu Camu . Raintree Nutrition.
Disponible en URL:
http://translate.google.com.pe/translate?hl=es&sl=en&u=http://www.rain-
tree.com/camu.htm&ei=5zFvTOz4FsL48AaNtKCDDQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=12
&ved=0CEYQ7gEwCw&prev=/search%3Fq%3Dmyrciaria%2Bdubia%26hl%3Des%26prmd%3Di

CARACTERÍSTICAS Y SIGNIFICADO DEL PROBLEMA

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Disponible en URL:
http://www.epa.gov/asthma/pdfs/asthma_fact_sheet_sp.pdf

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Chivirico. MsC. Carlos Luis Milán Lemus, MsC. Andrés García Arpajón, Dra. Milagros V. Font
Difourt, Dr. Ricardo Grant López y Dra. Leidyana Ruiz Martín MEDISAN 2010; 14(1):12.
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 http://www.bvs.sld.cu/revistas/san/vol_14_1_10/san03110.pdf

(3) Aspectos fisiopatológicos. Neumología Pediátrica Ramiro González, M. Angélica Pérez

Departamento de Pediatría. Universidad de Chile Sede Sur Hospital Exequiel González.
Disponible en URL:
http://www.neumologia-pediatrica.cl/pdf/200612/AspectosFisiopatologicos.pdf

(4) Alteración de la actividad inflamatoria regulada por TH1-TH2 en asma. Rev instnal enfresp mex
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Disponible en URL:
http://www.medigraphic.com/pdfs/iner/in-2006/in062k.pdf
(5) Perspectivas de futuro en el tratamiento del asma. Carolina Cisneros Serrano, Mª
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Disponible en URL:
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Disponible en URL:
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DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA, M. DUBIA

1
Karla Pacci-Salazar, Lizette Nureña-Noriega, José Vásquez-Cerro, Guillermo Araujo-Espinoza,
Marco Gálvez-Niño. Eficacia tópica de Myrciaria dubia en la curación de quemaduras de segundo
grado en ratas Holtzman. Ciencia e Investigación Médica Estudiantil Latinoamericana 2009;
14(1).
2
Nuñez Cocha.Camu Camu. CEDECAM
Disponible en URL:
http://www.camucamuperu.com/camucamu_informacion.htm
3
Camu Camu . Raintree Nutrition.
Disponible en URL:
http://translate.google.com.pe/translate?hl=es&sl=en&u=http://www.rain-
tree.com/camu.htm&ei=5zFvTOz4FsL48AaNtKCDDQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=12
&ved=0CEYQ7gEwCw&prev=/search%3Fq%3Dmyrciaria%2Bdubia%26hl%3Des%26prmd%3Di
4
USDA.Myciaria Dubia. 2005.
Disponible en URL:
http://translate.google.com.pe/translate?
hl=es&sl=en&u=http://img.exigo.com/public/1428/websites/217/images/JD_camu_camu.pdf&ei=B
DBvTL7LM4L58AaF7OzKDQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=4&ved=0CCIQ7gEwAw&pr
ev=/search%3Fq%3Dcamu%2Bcamu%2Blimoneno%26hl%3Des
5
Clara E. Quijano Celis, Jorge A. Pino. CONSTITUYENTES VOLÁTILES DE LAS HOJAS
DE CAMU-CAMU Myrciaria dubia (HBK) McVaugh. Revista cubana de Quimica 2007. 19 (1).

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6.-Sondheimer E, Kertesz ZI. 1953. Participation of Ascorbic Acid in the Destruction of

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ASMA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL ASMA

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5. Foro Regional sobre el Control de Asma en el contexto

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DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA

Garzon, G. 2008. Anthocyanins As Natural Colorants And Bioactive Compounds: A Review. Acta
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1
Potencial del camu camu y sacha inchi en el mercado estadounidense. Kerry Hughes, M.Sc.
Consultor de EthnoPharm.
2
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JUSTIFICACIÓN Y APLICABILIDAD DE RESULTADOS

1
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2,3
diario El Comercio,10 Junio del 2009 http://www.rpp.com.pe/2009-06-10-alrededor-de-265-mil-
ninos-sufren-de-asma-en-el-peru-segun-laboratorio-noticia_187172.html
4
Disponible en URL: http://www.camucamuperu.com/camucamu_informacion.htm
5
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ESTADÍSTICA
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3.-Karla Pacci-Salazar, Lizette Nureña-Noriega, José Vásquez-Cerro, Guillermo Araujo-Espinoza,

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ASMA
(1) Porth, C. Fisiopatología Salud Enfermedad: Un enfoque conceptual. 7ma edición. Editorial
Médica Panamericana. 2007. Desordenes de la ventilación e intercambio gaseoso. p.495-507.
Lugar y fecha de presentación:
1º Presentación: Instituto de Patología, 6 de setiembre del 2010.
2º Presentación: Instituto de patología, 11 de octubre

Nombres y apellidos completos de los autores:

• Bermejo Cataño, Pedro Felipe
• Cárdenas Gallegos, Jesús Kevin
• Chavarría Delgado, Janis Julio Eduardo
 • Chávez Pichardo, Jimmy
• Cirilo Jacobo, Melany Mercedes
• Coronado Cumpa, Gunther Nick
• Diaz Retes, Javier Jesús
• Mendo Castillo, Carlos Antonio
• Motta Jara, Francisco Alex
• Oré Moreno, Isabel Gabriela

Alumno colaborador: Chalco Huaman, Joel Leonidas

Alumnos de segundo año de la Facultad de Medicina Humana
UNMSM

Asesora Estudiantil: Lizeth Katherin Chavez Conde

Profesor Asesor: Ernesto Nava Carrión

Dirección y teléfonos de referencia:

Delegado: Francisco Alex Motta Jara 980411662

Subdelegada: Isabel Gabriela Oré Moreno 971049923

Pedro Felipe Bermejo Cataño 987410110