UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

ANTEPROYECTO DE TESIS QUE PRESENTA:

Rebeca Paola Torres Ramírez
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE
Licenciado en Biotecnología Genómica

TÍTULO PROVISIONAL:
EFECTO DE LOS AMINOÁCIDOS CERCA DEL SITIO ACTIVO EN LA
ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS FITASAS CON ESTRUCTURA DE HÉLICE

DIRECTOR: Dr. José M Viader Salvadó

CO-DIRECTOR: Dra. Martha Guerrero Olazarán
1. INTRODUCCIÓN

El ácido fítico o fitato (1,2,3,4,5,6-hexafosfato de myo-inositol) es un compuesto

polifosfatado que representa entre el 60-90% del contenido total de fósforo en las

plantas. Se encuentra comúnmente en cereales, legumbres y semillas oleaginosa, por lo

que es un ingrediente común de alimento animal. Sin embargo, debido a la presencia de

enlaces fosfo-éster altamente estables se dificultan su degradación en el tracto digestivo

de animales no rumiantes. Por tal razón, el uso de fitasas para llevar a cabo la

degradación del fitato es indispensable en la formulación de alimentos para animales

monogástricos y agástricos, puesto que permite la presencia fósforo viable en su dieta.

Las fitasas utilizadas en la industria alimentaria animal requieren de ciertas

características específicas como, estabilidad en un amplio rango de pH, exhibir alta

actividad específica, estabilidad tanto durante como después de la granulación, y la

capacidad de degradar sustratos. Empero, no existe una fitasa en la naturaleza que

cumpla con todas estas especificaciones. Por tal motivo, se han diseñado nuevas fitasas

termoestables a partir de secuencias fitasas provenientes de diferentes organismos

empleando diferentes estrategias de ingeniería de proteínas

La descripción del funcionamiento de estas nuevas enzimas, así como el análisis

del impacto de las modificaciones realizadas, es fundamental para el diseño de nuevas

fitasas. En este trabajo se llevará a cabo la determinación de actividad específica de 3

fitasas con estructura de hélice (Beta- propeller) y se realizará una correlación entre los

diferentes aminoácidos que poseen cerca del sitio activo.

2. IMPORTANCIA
 La mayor parte de las enzimas utilizadas en la industria tienen un origen

bacteriano o fúngico. Sin embargo, estas enzimas no siempre tienen la actividad deseada

en las condiciones necesarias y por lo tanto no son óptimas para ciertos procesos

industriales. Debido a la importancia de las fitasas en la industria alimenticia animal, es

necesario la optimización y mejora de estas proteínas para lograr satisfacer la demanda.

Por lo que es necesario la comprensión de la influencia de aminoácidos que puedan

afectar al sitio activo y por consiguiente la actividad específica. De esta forma se harían

mas rentables los procesos de producción de esta enzima, ya al momento de

comercializar una enzima, su precio se fija en unidades enzimáticas y no en unidades de

masa.
 3. HIPÓTESIS

Las modificaciones realizadas cerca del sitio activo de las fitasas de estructura de

hélice alterarán la actividad específica de la enzima.

4. OBJETIVO

4.1 Objetivo General

Determinar la actividad específica de las fitasas FTEII, FTEIII y FTEIV y

realizar una correlación entre los aminoácidos que poseen cerca del sitio activo.

4.2 Objetivos Particulares

1. Producir y purificar las fitasas FTEII, FTEIII y FTEIV
2. Determinar la actividad específica de las fitasas FTEII, FTEIII y FTEIV,
3. Correlacionar la actividad específica calculada de las fitasas FTEII, FTEIII y FTEIV

con los aminoácidos que poseen cerca del sitio activo.

5 ANTECEDENTES

5.1 Fitasas

Las fitasas (EC 3.1.3.8., EC 3.1.3.26 y EC 3.1.3.72) son enzimas monoméricas

que pertenecen a una clase especial de fosfomonoesterasas denominadas fosfohidrolasas

de fitato, que son capaces de iniciar la liberación gradual de residuos de ortofosfatos del

fitato (Yao et al., 2012). Estas enzimas se han aislado de diversas fuentes, producidas en

una amplia gama de huéspedes, purificadas y replegadas mediante diversos métodos

bioquímicos. Dependiendo del origen de la fitasa nativa y/o del organismo productor, se

sabe w muestran propiedades fisicoquímicas (Vohra & Satyanarayana, 2003).

Con base en la presencia de un motivo de consenso específico y su estructura

tridimensional, las fitasas se clasifican en cuatro clases principales: (HAP, histidine acid

phosphatase), fitasas de cisteína (CPhy, cysteine phytase), fosfatasas ácidas púrpura

(PAP, purple acid phosphatase) y fitasas con estructura de hélice (BPP, beta-propeller

phytases). Alternativamente, en función de la posición del anillo de carbono donde se

inicia la eliminación de los grupos fosfato del fitato, la base de datos ENZYME

(disponible a través del ExPASy Proteomics Server; http://www.expasy.ch/enzyme/)

clasifica las fitasas en tres grupos diferentes: 3 -fitasa (nombre alternativo, 1-fitasa, EC

3.1.3.8), 4-fitasa (nombre alternativo, 6-fitasa, EC 3.1.3.26) y 5-fitasa (EC 3.1.3.72)

(Viader-Salvadó et al., 2010).

Las beta-propeller fitasas empezaron a estudiarse en el género Bacillus, pero

actualmente se sabe que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Estas

fitasas no muestran identidad de secuencia con ninguna de las fitasas conocidas. Están

constituidas por 6 hojas beta unidas, cada una compuesta por 4 a 5 cadenas β
antiparalelas, dispuestas en seis ejes de simetría formando un canal central lleno de

moléculas de agua ordenadas. La dependencia del catión calcio para la integridad

estructural es otra característica única de este grupo de fitasas. Estas proteínas tienen al

menos seis sitios de unión a Ca2⁺, dos de los cuales se encuentran en la periferia, uno en

el medio del canal central, y resto en la parte superior de la molécula. Estas fitasas

cuentan con actividades 3- y 6- fitasa, logrando hidrolizar fosfatos alternados de manera

secuencial de la molécula de fitato, produciendo Ins(2,4,6)trifosfato y

Ins(1,3,5)trifosfato. Estas enzimas cuentan, además, con un pH óptimo cercano a 7,

además de exhibir actividad dentro de un intervalo de pH mayor al presentado por otras

clases de fitasas y una temperatura óptima de 55°-70°C (Vohra & Satyanarayana, 2003).

Actualmente, los productos de fitasas con mayor comercialización pertenecen a la

familia HAP, debido a su alta actividad y su amplia especificidad y efectividad en la

degradación de sustrato. A pesar de esto, se ha visto que las fitasas con estructura de

hélice poseen un pH óptimo cercano a 7 y exhiben actividad dentro de un rango de pH

que es más amplio que el de las fitasas fúngicas. Estas características las hacen mas

útiles como aditivo alimenticio en animales como el pollo y el camarón (Viader-Salvadó

et al., 2010.

5.2 La actividad específica de una enzima y su importancia

La cantidad de una enzima pueden ser expresadas en moles, como en otros

compuestos, sin embargo, por motivos de funcionalidad es más común ser en términos

de actividad enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima

activa presente y del nivel de actividad de esta, por lo que esta ligada a las condiciones

del ensayo (Bisswanger, 2014).

 De acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades la unidad en que se mida la

actividad catalítica es el katal (kat), a pesar de esto al ser una unidad demasiado grande,

es más usada la unidad de actividad enzimática (UI). Una unidad de actividad

enzimática se define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de producto por

minuto a las condiciones de la realización del ensayo enzimático. Por otro lado, la

actividad específica de una enzima es una relación de la actividad catalítica de la

enzima, expresada en unidades de actividad enzimática, por unidad de masa de enzima

expresada en miligramos de proteína (Bisswanger, 2014).

A pesar de que es relativamente fácil medir el contenido de proteína de una

fracción celular, existe una relación variable entre el contenido de proteína y la función

enzimática específica. La actividad específica se puede utilizar como medida de la

pureza de una solución de enzima, ya que se ha visto que a medida que avanzan las

etapas del proceso de purificación este valor aumenta llegando a una meseta cuando esta

está prácticamente pura, por lo tanto, los valores para diferentes lotes de una enzima

pura deben ser los mismos, dentro del error experimental normal. Por esta razón para

determinar la actividad especifica de una enzima es necesario que esta esté pura

(Saraswat et al., 2010).

Las estrategias de purificación suelen dividirse en cuatro etapas: preparación de

la muestra, captura, purificación intermedia y pulido (CIPP). La implementación de

estas etapas ha ayudado a simplificar la planificación y la ejecución de la purificación de

proteínas. Ya que, marca las pautas sobre cómo combinar métodos de purificación de la

mejor manera para alcanzar los objetivos establecidos (Gräslund et al., 2010).
 La preparación de la muestra es el punto de partida de la estrategia de

purificación. El propósito de la preparación de la muestra es obtener un extracto

clarificado del material fuente. El extracto debe prepararse o ajustarse de acuerdo con las

condiciones que sean compatibles con el primer paso de cromatografía. En la etapa de

captura, los objetivos son aislar, concentrar y estabilizar el producto diana. El producto

debe concentrarse y transferirse a un entorno que conserve la actividad de la enzima. En

el mejor de los casos, también se puede lograr una eliminación significativa de

contaminantes críticos. Durante la etapa de purificación intermedia, el objetivo clave es

eliminar la mayoría de las impurezas a granel, como otras proteínas y ácidos nucleicos,

endotoxinas y virus. Si el paso de captura es eficiente, a menudo se omite la etapa de

purificación intermedia a favor de uno o más pasos de pulido. En la etapa de pulido, la

mayoría de las impurezas ya se han eliminado. Ahora solo quedan trazas de impurezas y

posiblemente proteínas estrechamente relacionadas con la proteína diana. En la etapa de

pulido, las impurezas restantes se eliminan y la proteína que se quiere purificar puede

transferirse a condiciones adecuadas para su uso o almacenamiento (Scopes, 2013).

Para determinar tanto el contenido de proteína como la actividad enzimática se

requieren dos procedimientos diferentes. Podemos medir la cantidad de proteína, o

podemos medir cinéticamente la actividad de la enzima. La combinación de los dos nos

dará la actividad específica (Bisswanger, 2014).

La cuantificación de proteínas es un paso de control importante para el manejo de

muestras de proteínas durante su aislamiento y la caracterización. Cuando se confronta

con la necesidad de determinar la concentración de proteína total de una muestra, uno de

los primeros aspectos a considerar es la selección de un método de ensayo de proteína

(Noble & Bailey, 2009).

Existen una gran variedad de métodos para la determinación de la concentración

de proteínas totales, de entre ellos los más comunes son: el método Kjeldahl, biuret,

ácido bicinconínico, unión de colorante Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB),

espectrofotometría UV-VIS (ultravioleta-visible) y ensayo Lowry. Algunos de los

métodos se utilizan en áreas específicas, por ejemplo, el análisis cuantitativo de

aminoácidos se utiliza en la industria alimentaria y ocasionalmente como método

estándar primario (Krohn, 2002). El método que se utilice debe adaptarse al proceso de

procesamiento de la proteína (Downatream) o pretratamiento de las muestras debido a la

presencia de sustancias que pueden interferir, además, que requiera la menor cantidad de

manipulación posible. De los métodos más comunes para este propósito son: ácido

bicinconínico, Bradford y espectrofotometría UV-VIS (ultravioleta-visible) (Sapan et al.,

2010).

La espectrofotometría UV-VIS puede utilizarse para determinar la concentración

de proteínas en un aislado, siempre y cuando se conozca el coeficiente de extinción de la

molécula. El coeficiente de extinción es el producto del contenido de triptófano, tirosina

y en menor escala de fenilalanina. La concentración de proteínas y mezclas de péptidos

se puede estimar si se asume una absorbancia de 1.0 a 280 nm para la concentración de 1

mg/ml después de la corrección de la absorbancia a 260 nm. Se recomienda determinar

un espectro de 210 nm a 500 nm para determinar si se requiere corrección por la

dispersión de la luz (Simonian et al., 2006). Para realizar el cálculo se utiliza la siguiente

formula:
 Figura1

Figura1: Formula para calcular la concentración de una proteína utilizando espectrofotometría UV-VIS

El método de Bradford es el ensayo más utilizado para la determinación de la

concentración de proteínas en procesos de purificación, ya que es relativamente fácil de

realizar. El ensayo se basa en un desplazamiento metacromático del colorante al unirse a

una proteína. s. El CBBG se une a los residuos de las proteínas produciendo una

absorción máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia

máxima a 470 nm. (Kruger, 2002). Tiene un rango lineal de 20 μg/mL a 500 μg/mL y

puede ser adaptado para el ensayo de proteína inmovilizada. (Kruger, 2009).

El ensayo de ácido bicinconínico (BCA), también conocido como el ensayo de

Smith es un método colorimétrico para cuantificación de proteínas totales en una

solución, su rango lineal va de los 0,5 μg/mL a los 1.5 mg/mL. El mecanismo de

formación de color para el reactivo de ensayo en este ensayo es similar al del reactivo

Lowry, sin embargo, existen algunas diferencias que lo hacen menos complicado y le

dan una mayor sensibilidad. El ensayo de BCA combina la reducción de Cu2+ a Cu+ por

la proteína en un medio alcalino con la detección colorimétrica altamente sensible y

selectiva del catión cuproso (Cu +) con el ácido bicinconínico. El producto de reacción

púrpura de este método se forma por la quelación de dos moléculas de BCA con un ion

cuproso. El aducto formado es soluble en agua y tiene una fuerte absorción a 562 nm

que es proporcional a la cantidad de proteína. La principal ventaja de este ensayo es que

la mayoría de los surfactantes son compatibles con este método (Walker, 2002).
Los ensayos enzimáticos son herramientas importantes para medir la actividad celular y

para controlar la proteína enzimática mientras se purifica. La medición de la cinética

enzimática proporciona información crucial sobre los mecanismos de la catálisis

enzimática y sobre las interacciones de las enzimas con sustratos, inhibidores, fármacos

y fármacos candidatos. Para este fin, normalmente es importante medir la velocidad

inicial de la reacción en condiciones en las que la velocidad es directamente

proporcional a la cantidad de enzima en el ensayo. Para obtener datos de velocidad

inicial, la concentración del sustrato debe exceder la concentración de enzima

(típicamente en varios órdenes de magnitud), y la cantidad de sustrato agotada durante el

ensayo debe ser inferior al 10%, por lo que su concentración permanece esencialmente

inalterada.

Para medir la velocidad de una reacción, se debe monitorear la formación del producto o

la reducción del sustrato como una función del tiempo. La medición de la formación del

producto o el agotamiento del sustrato varía de un ensayo a otro, pero generalmente se

basa en alguna característica única del sustrato o producto y la capacidad de separar el

sustrato del producto. Existe una gran cantidad de métodos diferentes para medir las

concentraciones de sustratos y productos, y muchas enzimas se pueden analizar de

diferentes maneras. Los bioquímicos generalmente estudian reacciones catalizadas por

enzimas usando tres tipos de experimentos: experimentos de velocidad inicial, de curva

de progreso, de cinética transitoria (Bisswanger, 2014).

Finalmente, la actividad específica de una enzima es directamente proporcional a

la actividad enzimática por molécula de enzima o número de recambio, el cual es una

medida de la eficiencia de la enzima. Es por lo que este parámetro es idóneo para

comparar la actividad enzimática por molécula de enzima entre dos enzimas de pesos

moleculares similares. Además, momento de comercializar una enzima, su precio se fija

en unidades enzimáticas y no en unidades de masa, por lo que la mayor producción de

unidades enzimáticas aumenta la rentabilidad del proceso de producción de la enzima

(Tabatabai, 1994).

5.5 Origen de la actividad

Las fitasas termoestables, son ampliamente requeridas como aditivos de

alimentación animal, ya que tienen la capacidad de conservar su actividad después de ser

expuestas al proceso de granulación de alimentación. Por tal motivo, se han diseñado

nuevas fitasas termoestables a partir de secuencias fitasas provenientes del género

Bacillus empleando una estrategia de secuencia consenso guiada por estructura. FTE y

FTEII fueron las primeras fitasas diseñadas en nuestro laboratorio con el propósito de

mejorar su termoestabilidad. Ambas enzimas mostraron una mayor termoestabilidad a

pH 5.5 que a pH 7.5. Las actividades específicas de las fitasas purificadas fueron 25.7

U/mg en el caso de FTE y 13.3 U/mg en FTEII esto a pH 7.5. Además, mostraron una

alta actividad residual después de 10 minutos de tratamiento térmico a 80°C y una

estabilidad a pH de 2.5 a 9 (Viader-Salvadó et al., 2010). Posteriormente se diseñaron,

dos nuevas fitasas con el objetivo de conservar las propiedades de termoestabilidad e

intervalo de pH de actividad de FTEII, pero con una mayor actividad específica,

generadas a través de ingeniería de secuencias consenso e información estructural. De

esta forma surgieron FTEIII y FTEIV. Para la selección de nuevas mutaciones en FTEIII

se realizó un análisis de frecuencias de 600 secuencias de proteínas de bacteria en las

posiciones correspondientes al sitio activo. La fitasa FTEIII presentó un valor de

actividad específica de 19.1 U/mg, que representa un aumento del 26% con respecto a la

actividad de 15.2 U/mg de proteína observada en su predecesora FTEII.

La actividad específica de las enzimas FTEII y FTEIII fue determinada a partir

de muestras semi purificadas, por lo tanto, los datos obtenidos podrían no ser

representados. Debido a esto, estos resultados no pueden usarse para análisis o

comparación por lo tanto es necesario que se repitan.

6. METODOLOGIA

6.1 Material biológico

Para la realización de los cultivos a mediana escala se utilizarán las cepas

KM71FTEII, KM71FTEIII y KM71FTEIV de P. pastoris. Todas las cepas se obtendrán

de conservas en YPD-glicerol al 15% del cepario del laboratorio L5. La cepa

KM71FTEII tiene integrada en su genoma la secuencia que codifica para una fitasa

FTEII, la expresión de esta secuencia está regulada por el promotor AOX1 (Viader-

Salvado et al., 2010). De igual forma, a cepa KM71FTEIII contiene la secuencia

codificante para la FTEIII regulada por el promotor AOX1. La cepa KM71FTEIV

contiene la secuencia codificante para la FTEIII regulada por el promotor GAP.

Los oligonucleótidos utilizados para la caracterización de las cepas se diseñaron

y probaron previamente en el laboratorio, y fueron sinterizados por Integrated DNA

Technologies (Coralville, IA). Se utilizarán combinaciones de los primers estándar para

caracterización de cepas en el laboratorio, estos hibridan en la región promotora y

terminadora de AOX y en una región especifica de la secuencia que codifica FTEIV.

 Para los estándares de los ensayos de determinación de concentración de

proteínas totales y las corridas de prueba en las cromatografías de exclusión molecular

se utilizó Albúmina sérica bovina (ASB).

6.2 Material y equipo de laboratorio

Para la realización de las cromatografías se utilizará el cromatógrafo BioLogic

LP System de Bio-Rad. Durante la cromatografía de intercambio aniónico se usará la

columna HiPrep DEAE FF 16/10. Para la cromatografía de exclusión molecular se va a

una columna de 30 mL con gel de poliacrilamida Bio-Gel P-60.

Para la realización de las mediciones correspondientes a la cuantificación de la

concentración de proteínas totales se utilizará el nanoespectrofotómetro P-300

(IMPLEN).

Para las incubaciones a 37° y 60° C que se requieren en los ensayos de actividad

enzimática y la cuantificación de la concentración de proteínas totales por BCA, se

utilizó el Eppendorf ThermoMixer® C. Del mismo modo para medir las absorbancias de

las muestras de estas técnicas se usará un espectrofotómetro DU-650 (Beckman, coulter

TM22R)

6.3 Estrategia general

En la figura 2 se muestra la estrategia general que se seguirá en el presente

trabajo. Primeramente, se llevará a cabo la identificación de las cepas KM71FTEII,

KM71FTEIII y KM71FTEIV de P. pastoris por PCR combinaciones de los

oligonucleotidos estándar para caracterización de cepas en el laboratorio, estos hibridan

en la región promotora y terminadora de AOX y en una región especifica de la secuencia

que codifica FTEIV. Posteriormente se llevará a cabo la producción de la producción a

nivel matraz de las fitasas. En el caso de las cepas KM71FTEII y KM71FTEIII se

llevará a cabo un cultivo alimentado con metanol de 72 hr. Mientras que para la cepa

KM71FTEIV se llevará a cabo un cultivo alimentado con glicerol de 30 hr. A partir del

medio de cultivo libre de células, se llevará a cabo la purificación de las fitasas mediante

cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión molecular.

Finalmente se realizarán los ensayos para la determinación de la actividad enzimática y

la cuantificación de proteínas totales por BCA, Bradford y Espectrofotometría UV-VIS,

con estos datos se determinará la actividad específica de las enzimas.

Figura 2. Estrategia general para la determinación de la actividad enzimática de las

fitasas.

6.3.1 Localización y caracterización de las cepas KM71FTEII, KM71FTEIII y

KM71FTEIV de P. pastoris.

Las cepas las cepas KM71FTEII, KM71FTEIII y KM71FTEIV de P. pastoris se

obtendrán de conservas en YPD-glicerol al 15% del cepario del laboratorio L5. Se

llevará a cabo la reactivación de las cepas en medio YPD y a partir de este material se

realizará el aislamiento de DNA genómico por la técnica de TSNT. Posteriormente se

hará la caracterización de las cepas por PCR. Para las cepas KM71FTEII y KM71FTEIII

se utilizarán los oligonucleótidos 5´AOX y 3´AOX, mientras que para KM71FTEIV se

usarán los oligonucleótidos 3qFTEIV y 3´AOX. Finalmente, las preparaciones de DNA

obtenidas para cada una de las muestras se analizarán mediante electroforesis en gel de

agarosa.

6.3.2 Producción en matraz de las fitasas FTEII, FTEIII y FTEIV a partir de las

cepas KM71FTEII, KM71FTEIII y KM71FTEIV a mediana escala

Para la producción de la proteína recombinante, se llevarán a cabo 3 cultivos

alimentados en tres fases. Las cepas KM71FTEII y KM71FTEIII se inocularán en medio

BMM-CaCl2 y serán incubados a 30oC a 250 rpm, agregando metanol a una

concentración final de 0.75% cada 12 horas y tomando 2 mL de muestra a las 0, 24, 48 y

72 horas. En el caso de la cepa KM71FTEIV se inoculará en medio BMG-CaCl2 y se

incubará a 30°C a 250 rpm, agregando glicerol a una concentración final 1% y tomando

muestra a las 20 hr. El cultivo tendrá una duración final de 30 hr.

6.3.3 Purificación de las fitasas FTEII, FTEIII y FTEIV a partir de los cultivos

celulares de la inducción de las cepas KM71FTEII, KM71FTEIII y KM71FTEIV

de P. pastoris cultivada a mediana escala.

Los cultivos celulares serán centrifugados a 5,000 rpm a 4°C durante 15 minutos

para obtener un medio libre de células. Posteriormente se filtrarán utilizando una

membrana DURAPORE de 0.45 µm. Después la muestra filtrada se pasará a través de la

columna de intercambio iónico HiPrep DEAE FF 16/10 previamente equilibrada con una

solución amortiguadora A (25 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 8.5). Las proteínas serán

eludidas con amortiguadora B (25 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0.5 M NaCl, pH 8.5)

usando un gradiente de elución lineal a una velocidad de elución de 3 mL/min. La

elución tendrá una duración aproximada de 150 min.

6.3.4 Purificación de las fracciones recuperadas de la cromatografía de intercambio

iónico por cromatografía de exclusión molecular.

Se prepararán 25 mL del Bio-Gel® P60 y se empacará en la columna

cromatográfica según las especificaciones del producto. Posteriormente se le añadirán 50

mL de solución amortiguadora A modificado (50 mM de NaCl, 25 mM Tris-HCl, 5 mM

CaCl2, pH 8.5). Para poder llevar un control de los pesos moleculares de las muestras,

se realizará una elución de prueba utilizando BSA (66.4 kDa) y acetona (58.08 g/mol),

estas se encuentran fuera del rango de exclusión del gel (3,000-60,000 kDa), por lo que

servirán para determinar el tiempo máximo y mínimo de la elución.

Las fracciones colectadas de la cromatografía de intercambio aniónico se concentrarán

utilizando el dispositivo de filtro para centrífuga Amicon Ultra-15 10 K (Milipore).

Después se pasará a través de la columna de exclusión molecular previamente

equilibrada con un amortiguadora A modificado. Las proteínas serán eludidas con

amortiguadora B (25 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0.5 M NaCl, pH 8.5) usando un

gradiente de elución lineal a una velocidad de elución de 3 mL/min. La elusión tendrá

una duración aproximada de 150 min.

6.3.5 Determinación de la actividad específica de las fitasas FTEII, FTEIII y

FTEIV. Utilizando el método de Bradford, BCA y Espectrofotometría UV-VIS para

cuantificar concentración de proteínas totales.

Después de cada etapa de purificación se determinará la concentración de

proteínas totales en las muestras mediante 3 métodos Bradford con azul brillante de

Coomassie G-250, BCA, y Espectrofotometría UV-VIS. En los ensayos colorimétricos,

Se empleará ASB (Albúmina Sérica Bovina) como estándar de concentración en

diferentes intervalos.

Para la determinación de la actividad de fitasa, se llevará a cabo un ensayo de

medición de punto final, donde se cuantificará el fosfato liberado del fitato de sodio a

través del fosfomolibdato a una absorbancia de 820 nm. Se emplearán estándares de

fosfato monobásico de potasio en un intervalo de 0.6 -1.6 mM. Una unidad de fitasa será

tomada como la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 μmol de fosfato en

un minuto bajo las condiciones del ensayo (fitato 5 mM, 37ºC y pH 7.5).

6.3.6 Correlacionar la actividad específica calculada de las fitasas FTEII, FTEIII y

FTEIV con los aminoácidos que poseen cerca del sitio activo.

Se acomodarán las actividades específicas de forma descendente. Posteriormente

se analizarán el efecto que tienen las modificaciones realizadas en cada una de las fitasas

con su interacción con el sustrato y los iones Ca2⁺. Se realizará una correlación apoyada

en literatura sobre cómo estás difrencias afectan en la actividad especifica de cada

enzima.

7. LITERATURA CITADA

1. Bisswanger, H. (2014). Enzyme assays. Perspectives in Science, 1(1-6), 41-55.

2. Charcosset, C. (1998). Purification of proteins by membrane chromatography.

Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 71(2), 95-110.

3. Ghosh, R. (2002). Protein separation using membrane chromatography:

opportunities and challenges. Journal of Chromatography A, 952(1-2), 13-27.

4. Gräslund, S., Nordlund, P., Weigelt, J., Hallberg, B. M., Bray, J., Gileadi, O., ...

& Ming, J. (2008). Protein production and purification. Nature methods, 5(2),

135.ISO 690

5. Huang, H., Zhang, R., Fu, D., Luo, J., Li, Z., Luo, H. & Yao, B. (2011).

Diversity, abundance and characterization of ruminal cysteine phytases suggest

their important role in phytate degradation. Environmental microbiology, 13(3),

747-757.

6. Huang, T., Long, M., & Huo, B. (2010). Competitive binding to cuprous ions of

protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. The open biomedical

engineering journal, 4, 271.

7. Krohn, R. I. (2002). The colorimetric detection and quantitation of total protein.

Current protocols in cell biology, A-3H.

8. Kruger, N. J. (2002). The Bradford method for protein quantitation. In The

protein protocols handbook (pp. 15-21). Humana Press. ISO 690

9. Kruger, N. J. (2009). The Bradford method for protein quantitation. In The

protein protocols handbook (pp. 17-24). Humana Press, Totowa, NJ.

10. Noble, J. E., & Bailey, M. J. (2009). Quantitation of protein. In Methods in

enzymology (Vol. 463, pp. 73-95). Academic Press.

11. Rao, D. E. C. S., Rao, K. V., Reddy, T. P., & Reddy, V. D. (2009). Molecular

characterization, physicochemical properties, known and potential applications

of phytases: an overview. Critical reviews in biotechnology, 29(2), 182-198.

12. Sapan, C. V., & Lundblad, R. L. (2015). Review of methods for determination of

total protein and peptide concentration in biological samples. PROTEOMICS-

Clinical Applications, 9(3-4), 268-276.

13. Saraswat, M., Musante, L., Ravidá, A., Shortt, B., Byrne, B., & Holthofer, H.

(2013). Preparative purification of recombinant proteins: current status and

future trends. BioMed research international, 2013.

14. Schenk, G., Mitić, N., Hanson, G. R., & Comba, P. (2013). Purple acid

phosphatase: A journey into the function and mechanism of a colorful enzyme.

Coordination Chemistry Reviews, 257(2), 473-482.

15. Scopes, R. K. (2013). Protein purification: principles and practice. Springer

Science & Business Media.ISO 690

16. Segovia, L., & Peimbert, M. (2010). Ingeniería de Proteínas y Evolución

Dirigida. Mensaje Bioquímico, 135-141.

17. Simonian, M. H., & Smith, J. A. (2006). Spectrophotometric and colorimetric

determination of protein concentration. Current protocols in molecular biology,

10-1.
 18. Tabatabai, M. A. (1994). Soil enzymes. Encyclopedia of Environmental

Microbiology.

19. Tran, T. T., Mamo, G., Búxo, L., Le, N. N., Gaber, Y., Mattiasson, B., & Hatti-

Kaul, R. (2011). Site-directed mutagenesis of an alkaline phytase: influencing

specificity, activity and stability in acidic milieu. Enzyme and microbial

technology, 49(2), 177-182.

20. Viader-Salvadó, J. M., Gallegos-López, J. A., Carreón-Trevino, J. G., Castillo-

Galván, M., Rojo-Domínguez, A., & Guerrero-Olazarán, M. (2010). Design of

thermostable beta-propeller phytases with activity over a broad range of pHs and

their overproduction by Pichia pastoris. Applied and environmental

microbiology, 76(19), 6423-6430.

21. Vohra, A., & Satyanarayana, T. (2003). Phytases: microbial sources, production,

purification, and potential biotechnological applications. Critical Reviews in

Biotechnology, 23(1), 29-60.

22. Walker, J. M. (2002). The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein

quantitation. In The protein protocols handbook (pp. 11-14). Humana Press.

23. Yao, M. Z., Zhang, Y. H., Lu, W. L., Hu, M. Q., Wang, W., & Liang, A. H.

(2012). Phytases: crystal structures, protein engineering and potential

biotechnological applications. Journal of applied microbiology, 112(1), 1-14.

8. Calendario de actividades
 Actividad Trimestre Resultados esperados
Localización y Enero-Marzo 2018 - Cepas KM7FTEII,
caracterización de las cepas KM71FTEIII y
KM7FTEII, KM71FTEIII KM71FTEIV
y KM71FTEIV por PCR. caracterizadas

Determinación de la Enero-Marzo 2018

actividad específica de - Aislado de la fitasas
FTEII FTEII

- Producción a
mediana escala de
las fitasas FTEIV
- Cromatografía de
intercambio
aniónico
- Cromatografía de
exclusión molecular

Determinación de la Enero-Marzo 2018 - Aislado de la fitasas

actividad específica de FTEIII
FTEIII

- Producción a
mediana escala de
las fitasas FTEIV
- Cromatografía de
intercambio
aniónico
- Cromatografía de
exclusión molecular

Determinación de la Enero-Marzo 2018 - Aislado de la fitasas

actividad específica de FTEIV
FTEIV

- Producción a
mediana escala de
las fitasas FTEIV
- Cromatografía de
intercambio
aniónico
- Cromatografía de
exclusión molecular