CLDC/ FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

Unidad de trabajo 3: MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE ANÁLISIS (II).

FOTOMETRÍA DE LLAMA Y ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN
ATÓMICA.

1. Fotometría de llama.
1.1. Instrumental necesario.
1.2. Técnicas de análisis.
1.3. Causas de error.

2. Espectroscopía de absorción atómica.

2.1. Instrumental necesario.
2.2. Técnicas de análisis.
2.3. Causas de error.

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1. FOTOMETRÍA DE LLAMA

Esta técnica espectral se basa en la capacidad que tienen algunos

metales para ser excitados por una energía térmica. Los átomos pasan
del estado fundamental al estado excitado y, al volver al estado
fundamental, emiten luz de una longitud de onda característica.
Se ap`lica únicamente a metales alcalinos y alcalinotérreos, y en clínica se
emplea para cuantificar sodio, potasio y litio en líquidos biológicos.
La energía térmica procede de una llama que se aplica sobre la muestra en
solución.
Los metales con la llama producen un color característico. Las longitudes de
onda que corresponden a estos colores son las empleadas para la
determinación de los iones correspondientes. El litio produce un color rojo, el
sodio un color amarillo y el potasio un color verde.
En el caso de otros metales como el Ca o el Mg, no son excitados tan
fácilmente por la llama convencional, por lo que no resulta tan sencillo aplicar
esta técnica con ellos por lo que no se utiliza.
En condiciones constantes y controladas, la intensidad luminosa a la longitud
de onda típicamente producida por cada uno de los átomos resulta
directamente proporcional al número de átomos que emiten energía, lo cual a
su vez es directamente proporcional a la concentración de ion en la muestra.

1.1. Instrumental necesario.-

• Fuente de excitación.
• Atomizador.
• Sistema de selección de longitud de onda.
• Fotodetector.
• Dispositivo de lectura.

1.1.1. Fuente de excitación.

es una llama que, generalmente, se obtienen de una mezcla de gas butano y
aire. También se puede usar acetileno o propano con aire u oxígeno. La
elección de unos u otros hará que la temperatura de la llama varíe. Para
determinar Na o K, es suficiente con una mezcla de propano-aire.
Es necesario que exista un regulador del flujo del gas para mantener constante
la Tª de la llama.

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1.1.2. Atomizador.
Consiste en un dispositivo que transforma la muestra en disolución en
finas gotas, antes de introducirlas en la llama.

1.1.3. Sistema de selección de longitud de onda.

Consiste en un sistema de rendijas y filtros que permite aislar la radiación

emitida por elemento analizado. Como en el caso de la espectroscopía
ultravioleta-visible, podemos emplear filtros o monocromadores, siendo estos
últimos los más selectivos.

1.1.4. Fotodetector.
Es un dispositivo fotográfico o electrónico capaz de medir la intensidad de la
radiación emitida por la muestra. Posee una superficie fotosensible que genera
una corriente eléctrica proporcional a la intensidad de la luz incidente.

1.1.5. Dispositivo de lectura.

Traduce las señales eléctricas en unidades de concentración, normalmente
miliequivalentes/litro (meq/l).

1.2. Técnicas de análisis.

En fotometría de llama existen 2 métodos de trabajo, la técnica directa o el

método del patrón interno.
Hay que tener en cuenta que solo entre un 1-5 % del ion contenido en la
muestra se excita produciendo color y por tanto emitirá energía, pero aún así
esto es suficiente para determinar el análisis cuantitativo de la muestra con
fiabilidad.

1.2.1. Técnica directa.

Consiste en realizar una curva de calibrado a partir de una serie de

disoluciones de concentración conocida de la sustancia analizada. En
este caso, se emplea como medida de concentración la intensidad de la
radiación emitida. A mayor concentración, mayor será la intensidad de la
emisión.
Es un método poco exacto, ya que pequeñas variaciones en la velocidad de
aspiración, atomización, viscosidad de la muestra y Tª de la llama, pueden
afectar al número de átomos excitados y, por tanto, al resultado final.

1.2.2. Método del patrón interno o estándar interno.

Es la técnica más empleada en la clínica. Consiste en preparar varias

diluciones de la muestra y añadir a todas ellas una cantidad igual y conocida de
una sustancia patrón. La intensidad de la emisión del elemento a determinar se
compara con la de un elemento agregado como estándar interno.
El estándar interno puede seer litio o cesio.
El litio para determinar Na y K, y el cesio para determinar Na, K o Li.

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Se emplean el litio y el cesio como estándares internos porque cumplen

dos requisitos imprescindibles:
- no están presentes en los líquidos biológicos.
- emiten radiación a una longitud de onda bastante alejada de la emitida por
el sodio o por el potasio.
El estándar interno funciona produciendo una señal de referencia frente a
la cual se puede medir la emisión de los otros elementos de modo que el
fotómetro hace una comparación de la emisión de los elementos dados y la del
elemento de referencia.
El e
En este método, las fluctuaciones en la viscosidad, atomización,
temperatura, etc., afectan por igual a la sustancia analizada y al patrón, de
modo que, aunque varíe la intensidad de las radiaciones emitidas, la relación
existente entre ambas permanece invariable.

1.3. Causas de error.

Existen varias limitaciones a esta técnica que pueden ser causa de error en
el resultado:

1.3.1. Inadecuada selección de la longitud de onda.

Un sistema defectuoso dejará pasar radiación procedente de otros

elementos excitados por la llama, dando lugar a resultados falsamente
elevados.

1.3.2. Bandas de emisión molecular.

Existen ciertas moléculas, como el radical cianuro, que emiten radiación a

longitud de onda semejante a los iones metálicos, de modo que se producen
resultados falsamente elevados, difíciles de evaluar.

1.3.3. Mantenimiento del aparato.

La fotometría de llama es una técnica, que está enormemente sujeta a

todos aquellos factores que dependen de la correcta entrada de la muestra en
la llama (atomización y aspiración), y del mantenimiento de una llama de
características constantes, por ello es preciso el mantenimiento de los
componentes del fotómetro en condiciones adecuadas:
• Mantener limpio y libre de obstrucciones (fibrina, proteínas, etc.) el
mecanismo de aspiración de la muestra.
• Mantener limpia la cámara de atomización.
• Vigilar los gases y supresión constante de salida.
• Mantener el quemador limpio para conseguir una llama homogénea.

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2. ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

Esta técnica está basada en la medida de radiación absorbida por los

átomos libres en su estado fundamental. En el proceso de absorción, el
átomo pasa de un estado energético inferior a otro superior, de forma que
la absorción se lleva a cabo por los átomos no excitados, mientras que
cuando los átomos excitados vuelven a su estado de reposo emiten
energía, que es directamente proporcional a su concentración.

En este caso, la radiación aplicada debe ser de una longitud de onda bien
definida y debe corresponderse con el espectro de absorción del átomo
estudiado. Ya que las bandas de absorción son muy estrechas, se definen
como espectro de líneas (0,001- 0,01 nm).
La característica de interés en las medidas por absorción atómica es la
cantidad de luz , a la longitud de onda seleccionada, que es absorbida,
cuando la luz pasa a través de una nube atómica. Con la ayuda de un
monocromador se selecciona la longitud de onda de interés, y se mide la
atenuación de la luz de la luz incidente a su paso por la nube atómica. Esta
atenuación es consecuencia de las interacciones de los fotones con los átomos
en estado fundamental que se encuentran en el vapor atómico.

A medida que el número

de átomos se incrementa
en el paso de la luz,
aumenta la cantidad de
luz absorbida. Lay de
Lambert beer es válida
para relacionar la concentración de átomos en la llama con la absorción de luz.
De esta manera, se puede efectuar una determinación cuantitativa del analito
presente, midiendo la cantidad de luz absorbida.
La nube de átomos requerida para las mediciones en absorción atómica es
producida por la adición de suficiente energía térmica a la muestra, para
disociar los compuestos químicos en átomos libres. Bajo condiciones
apropiadas de llama, muchos de los átomos permanecerán en estado
fundamental y serán capaces de absorber la luz de una determinada longitud
de onda.

En el laboratorio de diagnóstico clínico esta técnica se emplea para

determinación de calcio, magnesio, litio, cobre, cinc, y otros metales como
metales pesados, Hg, Pb.

2.1. Instrumental necesario.

En la siguiente figura se muestra, esquemáticamente, las partes de un

equipo de espectroscopía de absorción atómica:

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2.1.1. Fuente de radiación.

Se emplean lámparas de cátodo hueco, ya que permiten generar un
espectro de líneas muy estrecho que coincide con el espectro de absorción del
átomo que se va a estudiar.
Consisten en una ampolla de vidrio con una ventana de cuarzo, en el
interior de la cual se halla un gas inerte (argón o neón) y dos electrodos.
Uno de los electrodos (ánodo) es de tungsteno y el otro (cátodo) está
constituido por el metal que se pretende analizar. Al establecer una diferencia
de potencial elevada entre ambos electrodos, se produce la ionización del gas
interior. Los iones formados chocan contra la superficie del cátodo y liberan
átomos excitados del elemento a analizar. Estos átomos emiten radiación de
longitudes de onda semejantes al espectro de absorción de ese elemento.

Hay lámpara monoelemento y otras multielemento, pero estas últimas

tienen mayor desgaste que las primeras.
El inconveniente de las lámparas monoelemento, es que hay que realizar el
cambio de la lámpara para cada metal que se quiera determinar, además de
tener un coste más elevado que las multielemento.

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2.1.2. Nebulizador.

En esta técnica la muestra en disolución debe convertirse en un fino

aerosol antes de pasar al atomizador. El nebulizador se considera una parte
integrante del mechero.

2.1.3. Atomizador.

El proceso de atomización consiste en convertir los átomos combinados de

la muestra en átomos libres.
Cuando la atomización es adecuada, la mayor parte de los átomos de la
muestra permanecen en estado fundamental y son capaces de absorber la luz
de una determinada longitud de onda.
Solo aproximadamente el 1 % de los átomos se ionizan (no absorberán luz)
por lo que el efecto es despreciable.
Podemos emplear varias técnicas para conseguirlo:

Quemador: en este caso se emplea una llama, en el interior de la cual
las partículas microscópicas del aerosol se desintegran para dar átomos
libres. El solvente se evapora en este proceso. Se alcanzan
temperaturas muy elevadas, del orden de los 2300 ºC. El combustible
para la llama es acetileno o una mezcla de aire-acetileno.

Horno de grafito: ocupa el lugar de la llama y con él se consiguen
temperaturas capaces de producir la vaporización de los metales.
Reutiliza este sistema sobre todo para la determinación de metales
pesados.

Procesos químicos: también se usan para determinar metales
pesados sobre todo Hg, y consisten en la digestión de la muestra con
ácidos a la que posteriormente, se añade un agente reductor que
consigue convertir el mercurio al estado fundamental.

2.1.4. Monocromador.

Se asocia a las lámparas de cátodo hueco para facilitar la selección de las

líneas del espectro de absorción que nos interesan.

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2.1.5. Fotodetector.

Se emplea para medir la intensidad de la radiación antes y después de su

paso por la muestra.

2.1.6- dispositivo de lectura.

Transforma las señales eléctricas en unidades de concentración.

2.2. Técnicas de análisis.

El método de trabajo empleado en esta técnica consiste en realizar curvas

de calibración de cada uno de los elementos que se van a analizar, empleando
distintas soluciones de concentración conocida.

2.3. Causas de error.

Los principales problemas de esta técnica, son los problemas de

interferencias, siendo las más importantes las siguientes:

2.3.1. Interferencia de emisión.

Muchos metales, cuando se colocan en la llama, emiten fuertemente a la

misma longitud de onda a la que absorben. Esta radiación emitida es muy
intensa en átomos fácilmente excitables, como el litio y el calcio y pueden ser
causa de interferencias en el resultado final, dando éste algo más disminuido.
Este error puede evitarse modulando el sistema. Consiste en usar un
sistema (chopper) que hace que la luz proveniente de la lámpara incida sobre
la muestra en forma de pulsos o intermitentemente. La luz emitida por la
muestra, la interferencia, es continua. De esta manera, el sistema detector
puede separar la luz emitida de forma estable continua de la luz intermitente,
eliminando así la fuente de error.

2.3.2. Interferencia de ionización.

En ocasiones, los átomos de la muestra se ionizan por efecto de la llama y,

al no estar en reposo , no absorben energía, lo que hace que aparezcan
resultados falsamente disminuidos. Esto se puede corregir añadiendo a la
muestra una sustancia fácilmente ionizable, de modo que exista un exceso de
electrones libres y se favorece el estado de reposo de los átomos que estamos
analizando. Los electrones libres hacen que los átomos a medir, pasen al
estado fundamental.

2.3.3. Otras interferencias.

Existe una posibilidad de error cuando hay diferencia de composición

entre la muestra y los patrones. Por ejemplo, la presencia de proteínas en el
suero y no en los estándares.

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También se pueden dar interferencias por la presencia de ciertos

elementos químicos, aniones, que originan compuestos no disociables por la
llama. En el caso del calcio, que da lugar a complejos en presencia de iones
fosfato; esto se puede eliminar añadiendo a la muestra un elemento que
desplace al calcio y forme complejos más estables con los fosfatos; por
ejemplo, el lantano.

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