UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE

MORELOS
FACULTAD DE FARMACIA

LABORATORIO MODULAR DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 3. CARACTERIZACIÓN DE UNA ENZIMA

M. EN F. LORENA URIBE TOLEDO

GRUPO: 3° “E” EQUIPO 4

ALUMNOS:
● ESCOBAR AGUILAR EVER ÁNGEL
● PEREZ CALDERON OSWALDO
● SALGADO BAHENA ERICK HUMBERTO
● SOLARES MORENO CRISTIAN OMAR

FECHA DE REALIZACIÓN 28 DE FEBRERO DE 2019

FECHA DE ENTREGA 9 DE MARZO DE 2019
Introducción:
Las enzimas son el centro de todos los procesos biológicos, actuando en
secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las que se
degradan nutrientes, se conserva y transforma la energía química y se fabrican las
macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos. Las enzimas son
proteínas, su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación
proteica nativa. Algunas enzimas no requieren para su actividad más grupos
químicos que sus residuos aminoácidos, otras requieren un componente químico
adicional llamado cofactor. Un cofactor puede ser uno o más iones inorgánicos tales
como Hierro, Magnesio, Zinc, o una molécula orgánica llamada coenzima. Las
coenzimas actúan como transportadoras transportadoras de grupos funcionales
específicos. Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacciones que
catalizan. Todas las enzimas tienen números y nombres formales del sistema E.C.
Dentro de la enzima hay un ambiente específico dentro del cual una reacción
determinada puede transcurrir a mayor velocidad, este lugar se denomina sitio
activo. La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzima se
denomina sustrato.
El punto de partida tanto para reacción
hacia a la izquierda como a la derecha se
denomina estado basal, que es la
contribuyente a la energía libre del sistema
de una molécula promedio. Un estado de
transición es un momento molecular fugaz
en el que acontecimientos como rotura o
formación de enlaces y desarrollo de
cargas han llegado al instante preciso en el
que el colapso hacia sustrato o hacia
productos es igualmente probable. La
diferencia entre los niveles de energía del
estado basal y del estado de transición se denomina energía de activación. la
velocidad de una reacción refleja esta energía de activación, una energía de
activación más elevada corresponde a una reacción más lenta. las velocidades de
reacción pueden aumentarse incrementando la temperatura y/o la presión, mediante
las que aumenta el número de moléculas de energía suficiente para superar la
barrera energética.( Hammes-Schiffers, S. Y Benkovic, S.J. 2006)

Las enzimas son catalizadores extraordinarios, así mismo son muy específicos,
discriminando fácilmente entre sustratos con estructuras muy similares.
Los Inhibidores enzimáticos son moléculas que intervienen en la catálisis,
ralentizando o deteniendo las reacciones. Hay dos amplias clases de inhibidores
enzimáticos: reversible e irreversible. Un tipo de inhibición reversible frecuente es la
que se denomina inhibición competitiva, este compite con ei sustrato por el sitio
activo, ocupando el sitio activo impidiendo la fijación del sustrato a la enzima. Un
inhibidor mixto, es aquel que se fija en un lugar distinto al sustrato. Un inhibidor no
competitivo es aquel que se fija en un lugar diferente al sustrato, este solo se une al
complejo.(Raines, R.T. Y Hansen. D.E 19988)
Muchas enzimas comparten algunas propiedades cinéticas. Cuando se añade
sustrato a una enzima, la reacción llega rápidamente a un estado estacionario en la
que la velocidad a la que se forma el complejo ES se equilibra con la velocidad a la
que se descompone. Al aumentar S aumenta la actividad de una enzima a
concentración fija en el estado estacionario; este aumento produce una curva
hiperbólica que tiene a su máximo valor de velocidad V Max en el cual
prácticamente toda la enzima ha formado un complejo con el sustrato. La
concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de Vmas es
la constante de Michaelis, Km, que es característica para cada enzima que actúa
sobre el sustrato determinado. (Frey, P.A. Y Hegeman, A.DE. 2006)

La ecuación de Michaelis relaciona la

velocidad inicial con S y Vmax a través
de la Km. La cinética de Michaelis se
denomina también cinetica del estado
estacionario.
Km y Vmax tienen significados diferentes
para diferentes enzimas. La velocidad
limitante de una reacción catalizada por
una enzima en condiciones de
saturación se describe mediante la
constante Kcat o número de recambio. La relación Kcat/Km proporcionan una buena
medida de la eficiencia catalítica. La ecuación de Michaelis también es aplicable a
reacciones bisustrato, que tiene lugar a través de la formación de complejos
ternarios. Todas las enzimas tienen un pH óptimo en el que presentan la máxima
actividad.(Cleland, W.W. 2002)

Objetivos:
● Utilizar la levadura de panificación, zanahoria, papa e hígado como fuente de
enzima
catalasa, para determinar la especificidad de las enzimas de diferentes
fuentes biológicas por su sustrato (peróxido de hidrógeno, H 2 O 2 ).
● Observar el efecto que tiene la concentración de enzima, el pH y la
temperatura sobre su actividad.
● Determinar los parámetros cinéticos de la catalasa que proviene de diferentes
fuentes biológicas, usando las condiciones óptimas de reacción.
Metodología:
Resultados:

Actividad 1. Preparación del extracto enzimático y preparación del sensor de

O2,

Figura 1. Fotografía del ordenador con la interfaz Vernier conectada y siendo

calibrada.

Actividad 2. Evaluación del efecto de la concentración de Enzima

Tabla 1. Efecto de la concentración de enzima en la velocidad inicial de la

reacción enzimática

Cantidad de Velocidad inicial (%min)

enzima (mL o
cubos) Levadura Hígado Papa Zanahoria

1 0.4681 1.1251 0.388 -0.3194

2 1.3047 3.9559 0.0209 1.0616

3 5.8117 5.135 1.1246 1.0821

Tabla 1. Datos obtenidos de la evaluación del efecto de concentración sobre una

reacción de catálisis medido con sensor de O2
Gráfica 1.1,2,3. Graficación de los resultados de el porcentaje de oxígeno generado
(eje y) por unidad de tiempo (eje x) a diferentes concentraciones.
 Actividad 3. Evaluación del efecto de Temperatura con respecto a la actividad
enzimática.

Tabla 2. Efecto de la temperatura en la velocidad inicial de la reacción

enzimática
Temperatura Velocidad inicial (%min)
(°C)
Levadura Hígado Papa Zanahoria

0-5°C 0.1739 2.7253 0.157 0.6818

35-40°C 0.2933 4.348 0.5683 0.5209

55-60°C 6.223 4.9589 0.8348 0.6409

Tabla 2. Datos obtenidos de la evaluación del efecto de la temperatura sobre una

reacción de catálisis medido con sensor de O2
Gráfica 2.1,2,3. Graficación de los resultados de el porcentaje de oxígeno generado
(eje y) por unidad de tiempo (eje x) a diferentes temperaturas

Actividad 4. Evaluación del efecto de pH sobre la velocidad de reacción.

Tabla 3. Efecto del pH en la velocidad inicial de la reacción enzimática

pH Velocidad inicial (%min)

Levadura Hígado Papa Zanahoria

4 1.5425 1.0353 0.1194 0.4684

7 9.3 5.0915 0.3481 0.3432

10 3.9259 4.3675 7.4023 0.5156

Tabla 3. Datos obtenidos de la evaluación del efecto del pH sobre una reacción de
catálisis medido con sensor de O2
Gráfica 3.1,2,3. Graficación de los resultados de el porcentaje de oxígeno generado
(eje y) por unidad de tiempo (eje x) a diferentes valores de pH
Actividad 5. Cálculo de la KM de la catalasa proveniente de diferentes fuentes.

Tabla 4. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de levadura de

panificación

H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2

Vo(%/t) 0.2395 0.4238 6.3384 2.3884 6.6219

1/[S] (1/%) 0 2 1 0.66666 0.5

1/Vo(t/%) 4.17536534 2.35960359 0.15776852 0.41869034 0.15101406

Tabla 4. Datos obtenidos de la identificación de los parámetros cinéticos de la

catalasa de levadura a diferentes concentraciones de sustrato.

Tabla 5. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de hígado de

pollo

H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2

Vo(%/t) -0.2307 3.1551 5.0794 3.6709 4.7948

1/[S] 0 2 1 0.66666 0.5

(1/%)

1/Vo(t/%) - 0.31694716 0.19687365 0.27241276 0.20855927

4.33463372
Tabla 5. Datos obtenidos de la identificación de los parámetros cinéticos de la
catalasa de hígado a diferentes concentraciones de sustrato.

Tabla 6. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de papa

H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2

Vo(%/t) -0.1583 0.5457 0.1584 0.4588 0.3488

1/[S] (1/%) 0 2 1 0.66666 0.5

1/Vo(t/%) -6.31711939 1.8325087 6.31313131 2.17959895 2.86697248

Tabla 6. Datos obtenidos de la identificación de los parámetros cinéticos de la

catalasa de papa a diferentes concentraciones de sustrato.

Tabla 7. Identificación de los parámetros cinéticos de la catalasa de zanahoria

H2O2 (%) 0 0.5 1 1.5 2

Vo(%/t) 0.3457 0.3047 0.1228 0.4633 0.072

1/[S] (1/%) 0 2 1 0.666666 0.5

1/Vo(t/%) 2.89268152 3.28191664 8.14332248 2.15842866 13.8888889

Tabla 7. Datos obtenidos de la identificación de los parámetros cinéticos de la

catalasa de zanahoria a diferentes concentraciones de sustrato.

Modelos de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk para la catalasa de

distintas fuentes naturales.

Gráfica 4. Modelo de Michaelis-Menten para Levadura

Gráfica 5. Modelo de Lineweaver-Burk para Levadura

Gráfica 6. Modelo de Michaelis-Menten para Hígado

Gráfica 7. Modelo de Lineweaver-Burk para Hígado

Gráfica 8. Modelo de Michaelis-Menten para Papa

Gráfica 9. Modelo de Lineweaver-Burk para Papa

Gráfica 10. Modelo de Michaelis-Menten para Zanahoria

 Gráfica 11. Modelo de Lineweaver-Burk para Zanahoria
Cálculos

Cálculo de Km y Vmax del Hígado

y=1.7549-2.1304

Usando la siguiente fórmula:

Pasamos a:

Sustituimos valores :
1/Vo=1.7549(1/[S] )+(-2.1304)

Entonces:
1/Vmax=-2.1304 Vmax=1/(-2.1304) Vmax=-0.4693

Para Km es:

km/Vmax=1.7549 km/(-0.4693)=1.7549 km=(1.7549)(-0.4693)

Km= -0.8235745
___________________________________________________________________
Levadura
y= -0.3692x+1.7601

1/Vo=-0.3692(1/[S] )+(1.7601)

Entonces:
1/Vmax=1.7601 Vmax=1/(1.7601) Vmax=0.5681

Para Km es:

km/Vmax=-0.3692 km/(0.5681)=-0.3692 km=(-0.3692)(0.5681)

Km=-0.2097
___________________________________________________________________
Papa
y = 3.2003x - 1.281

1/Vo=3.2003(1/[S] )+(-1.281)
Entonces:
1/Vmax=-1.281 Vmax=1/(-1.281) Vmax=-0.7806

Para Km es:

km/Vmax=3.2003 km/(-0.7806)=3.2003 km=(3.2003)(-0.7806)

Km=-2.4981
___________________________________________________________________
Zanahoria
y=-0.9962x+6.9032
1/Vo=-0.9962(1/[S] )+(6.9032)

Entonces:
1/Vmax=6.9032 Vmax=1/(6.9032) Vmax=0.14486

Para Km es:

km/Vmax=-0.9962 km/(0.14486)=-0.9962 km=(-0.9962)(0.14486)

Km=-0.1443
___________________________________________________________________
Valores de Km y Vmax de todas las fuentes biológicas que se están
analizando
Hígado: Km= -0.8235745 Vmax=-0.4693
Levadura: Km=-0.2097 Vmax=0.5681
Papa: Km=-2.4981 Vmax=-0.7806
Zanahoria: Km=-0.1443 Vmax=0.14486

Discusión:
Durante la realización y análisis de los resultados de la evaluación del efecto de la
concentración sobre la velocidad de reacción
Al analizar los resultados de la evaluación del efecto de la temperatura sobre la
velocidad de reacción determinamos que el rango de temperatura en el cual la
catalasa de todas las fuentes naturales evaluadas en esta práctica tienen una
óptima actividad catalítica en una temperatura de 55-60°C, valor que coincide con el
indicado por Rivera, J.(2006). Al observar el comportamiento de la velocidad,
podemos inducir que a conforme aumente la temperatura, aumenta la velocidad de
reacción de la catalasa, esto podemos atribuirlo al aumento de la cinética de las
moléculas sin llegar al punto en que este aumento de la cinética molecular provoque
la desnaturalización de nuestra enzima.

En los resultados de la evaluación del efecto del pH sobre la velocidad de reacción

se observó que el pH en el cual se mostró una mejor actividad catalítica para todas
las fuentes naturales fue pH neutro (pH 7), valor que coincide con lo reportado por
Rivera, J.(2006) donde catalasa muestra una actividad óptima en un rango de pH
de 6.8 a 7.5, este valor de pH puede estar relacionado con que la presencia de la
catalasa es necesaria en sistemas biológicos que usualmente se encuentran en pH
neutro, ya que el peróxido de hidrógeno es una sustancia que se produce en el
metabolismo, pero que es necesaria eliminar por su alta toxicidad (Miranda, C.,
1996).

Analizando los valores de Km y de Vmax determinados a partir de los datos

obtenidos la identificación de los parámetros cinéticos observamos que la fuente
natural que menor Km obtuvo y por tanto mayor afinidad tenía fue la papa, con un
Km= -2.4981,confirmamos que el tubérculo conocido por su poder oxidante del
peróxido de hidrógeno (Mora, H. 2006) es una fuente natural de catalasa bastante
efectiva. Igualmente al analizar los valores de Vmax de todas las fuentes naturales y
compararlas entre ellas obtuvimos que la papa fue la fuente que mayor Vmax
obtuvo por lo cual también es la fuente que mayor velocidad máxima de reacción
catalítica tiene cuando está saturada la solución de sustrato, demostrando que la
papa es una fuente de catalasa muy efectiva.
Conclusión:
Se determinó la especificidad de la catalasa proveniente de diferentes fuentes
biológicas como la levadura de panificación, zanahoria, papa e hígado y se observó
que la que tenía mayor especificidad fue la catalasa de papa. Igualmente se observó
el efecto que tenía la concentración de enzima, el pH y la temperatura sobre la
actividad de la catalasa de cada una de nuestras fuentes naturales.
Por último se determinaron los parámetros cinéticos de la catalasa proveniente de
nuestras diferentes fuentes biológicas a condiciones óptimas de reacción y con base
en esos datos se obtuvieron los Modelos de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk
de cada uno de estos, así como sus valores de Km y de Vmax específicos.

Cuestionario:
1. ¿Por qué modificar la concentración de la enzima afecta la velocidad de
descomposición de H 2 O 2 ? Porque la velocidad inicial de una reacción enzimática
es siempre proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración
de sustrato según la ecuación de Michaelis-Menten V=Vmax[S]/( Km + [S]), ya que,
a diferencia de la concentración inicial de sustrato, que es saturable al alcanzar
cierta concentración, aumentar la concentración de enzima siempre hará aumentar
la velocidad de catalización.

2. ¿Qué pasaría con la velocidad de reacción si la concentración de enzima se

incrementara a 5 veces más? Aumentaría 5 veces más

3. ¿Por qué la actividad enzimática podría disminuir si la reacción enzimática se

llevará a altas temperaturas? Porque las enzimas son proteínas y al superar la
temperatura óptima a la que trabajan dichas proteínas se aumenta la energía
cinética de las moléculas lo que conlleva a una desorganización de la estructura
terciaria de la proteína y la desnaturalización de la misma, y al empezar a
desnaturalizar las proteínas,al reducirse la cantidad de enzimas que llevan a cabo la
actividad enzimática esta disminuye igualmente.

4. ¿Cómo afectaría un cambio en el pH a la velocidad de reacción? Podría reducir

drásticamente la velocidad de reacción de la catálisis, ya que al ser proteínas, las
enzimas son moléculas anfóteras que en presencia de pH ácidos o básicos la carga
eléctrica total de la molécula se ve modificada, lo cual modifica la estructura
tridimensional de la proteína, por lo que habrá un pH óptimo al cual la enzima tendrá
actividad catalítica y un cambio de pH podría cambiar la estructura terciaria de la
enzima y disminuyendo su actividad.
Bibliografía:
● Cleland, W.W. (2002) Enzyme kinetics: steady state. In Encyclopedia of life
science, John Wiley Y Sons, Inc/Wiley Interscience, www.els.net.
● Frey, P.A. Y Hegeman, A.DE. (2006) Enzymatic Reaction Mechanisms,
Oxford University Press, New York
● Hammes-Schiffers, S. Y Benkovic, S.J. (2006) Relating Protein motion to
catalytic toolkit. Annu. Rev. Biochem 75, 519-541
● Miranda, C., Ela, M., Hernández Lantigua, I., & Llópiz Janer, N. (1996).
Enzimas que participan como barreras fisiológicas para eliminar los radicales
libres: II. Catalasa. Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas, 15(2), 0-
0.
● Mora Herrera, M. E., & López Delgado, H. A. (2006). Tolerancia a baja
temperatura inducida por ácidos salicílico y peróxido de hidrógeno en
microplantas de papa. Revista Fitotecnia Mexicana, 29(Es2).
● Raines, R.T. Y Hansen. D.E (1988) An intuitive approach to steady-state
kinetics. J. Chem. Educ 65, 757-759
● Rivera, J. A. C., Duarte, L. E. B., & Cuenca, C. E. N. (2006). CATALASA,
PEROXIDASA Y POLIFENOLOXIDASA DE PITAHAYA AMARILLA
(Acanthocereus pitajaya). Revista Colombiana de Química, 35(1), 91-101.