UNIDAD DIDÁCTICA 9

4: “TINCIONES”

INDICE

0. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 1

1. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS VIVOS ................................................................................ 1

2. FACTORES QUE AFECTAN A TODA TÉCNICA DE TINCIÓN .............................................................. 2

3. PRINCIPALES TÉCNICAS DE COLORACIÓN ....................................................................................... 4

3.1. COLORANTES ................................................................................................................................... 4

3.1.1. Colorantes según su origen ......................................................................................................... 4
3.1.2. Colorantes según su comportamiento químico ........................................................................... 4
3.2. PREPARACIÓN DE UN FROTIS ....................................................................................................... 5
3.3. TÉCNICA DE TINCIÓN ...................................................................................................................... 6

4. TIPOS DE TINCIONES BACTERIANAS .................................................................................................. 7

a) Tinción simple .................................................................................................................................... 7
b) Tinción negativa................................................................................................................................. 8
c) Tinciones diferenciales ...................................................................................................................... 8
d) Tinciones estructurales ...................................................................................................................... 8
4.1. TINCIÓN SIMPLE............................................................................................................................... 9
4.2. TINCIÓN NEGATIVA........................................................................................................................ 10
4.3. TINCIONES DIFERENCIALES ........................................................................................................ 11
4.3.1. Tinción de Gram ........................................................................................................................ 11
4.3.2. Tinción de Zhiel-Neelsen ........................................................................................................... 12
4.4. TINCIONES ESTRUCTURALES. .................................................................................................... 13
4.4.1. Tinción de flagelos ..................................................................................................................... 13
4.4.2. Tinción de cápsulas ................................................................................................................... 13
4.4.3. Tinción de endosporas .............................................................................................................. 14
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0. INTRODUCCIÓN

La morfología bacteriana puede ser estudiada de dos formas distintas:

1) Por visualización de los microorganismos vivos sin teñir, lo que nos permite
además observar su posible movilidad.

2) Por visualización de los microorganismos teñidos mediante colorantes, con una

concentración tal que hacen morir a la bacteria y no permiten observar su
movilidad, pero sin embargo se mejora notablemente la visualización de su
morfología y otras estructuras según el tipo de tinción llevada a cabo.

En general todas las bacterias vivas son prácticamente incoloras, no presentando

suficiente contraste con el medio acuoso donde se encuentran suspendidas, con lo cual no
pueden ser observadas con claridad. Pero si se tiñen se produce un gran contraste con
respecto al medio que las rodea. Además, alguno de estos colorantes puede también teñir
estructuras internas de la bacteria, lo que nos sirve para su identificación.

Por todo esto, las principales ventajas de las técnicas de tinción son:

 Observar más adecuadamente su morfología.

 Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitirá

diferenciar distintos tipos morfológicos.

 Establecer una información complementaria sobre sus estructuras internas y/o

externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.

 Conocer sus características tintoriales orientándonos hacia un grupo

taxonómico u otro en la clasificación bacteriana.

1. OBSERVACION DE MICROORGANISMOS VIVOS

Para poder observar los microorganismos al microscopio hay que utilizar una serie
de técnicas adecuadas a cada tipo de microscopía, teniendo en cuenta qué es lo que
deseamos observar. Estas técnicas son muy distintas dependiendo de que se trate de
microscopía óptica o electrónica, siendo mucho más complejas las utilizadas en el segundo
caso.
Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante
microscopios ópticos, por lo que sólo describiremos las técnicas más comúnmente usadas
para realizar preparaciones para este tipo de microscopios.

Preparación en fresco
Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que esté vivo,
por lo tanto que no haya sido fijado.
Un estudio "in vivo" es aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten las
células, como es la fijación o la inclusión. No presenta dificultades añadidas a las de
cualquier técnica microscópica, pero sí que requiere la máxima limpieza.

 Preparaciones húmedas: para observar organismos acuáticos microscópicos (algas,

larvas, etc.). Se procede suspendiéndolo en una gota de agua colocada en un
portaobjetos, tomado directamente de la muestra o medio de cultivo, y cubriéndolo, sin
formar burbujas de aire, con un cubreobjetos. Se observa al microscopio de contraste de
fases.

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 Gota pendiente: se utilizan portaobjetos excavados sobre los que se pone el

cubreobjetos, que lleva adherido la gota del líquido que ha de ser observado. Así
podemos observar el movimiento de los microorganismos en el medio líquido, sin que
estén sometidos a la presión entre portaobjetos y cubreobjetos.

Esta técnica presenta varios problemas que hay que tener en cuenta:
1. La gota constituye una lente trémula que desvía los rayos de luz e interfiere con la
iluminación, esto resulta muy molesto cuando se emplea microscopio de contraste de fases.
2. Los portaobjetos excavados actúan como una lente divergente que puede modificar la
realidad de lo que se está observando.

Figura 7
Preparación en gota pendiente.

Esta preparación se realiza colocando una gota de la

suspensión bacteriana en un cubreobjetos en el cual
se ha hecho previamente un círculo con vaselina o
parafina
(a). La vaselina actúa como sellador.
(b) Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos
con una excavación central (portaobjetos escavados)
que queda adherido gracias a la vaselina
(c). Se invierte la preparación y se observa
colocándola en la platina del microscopio
(d). Las preparaciones en gota pendiente se utilizan
para observar microorganismos vivos

 Tinción vital Es una preparación en fresco en la que, en lugar de agua, se utiliza una
disolución de colorante diluida que, sin matar al microorganismo, hace que aumente el
contraste. Es poco frecuente.

2. FACTORES QUE AFECTAN A TODA TÉCNICA DE TINCIÓN

En general, las técnicas de tinción son imprescindibles para el estudio microbiológico

de las bacterias, constituyendo el primer paso en el examen bacteriológico que, para
completarse y conducir a la identificación, precisa de otras técnicas complementarias de
identificación como, por ejemplo, las pruebas bioquímicas.

Las técnicas de coloración, como primer paso, constituyen una práctica diaria en el
laboratorio de microbiología, por lo que se deberá considerar que son muchos los factores
que pueden alterar los resultados obtenidos en toda técnica de tinción.

Así pues, los principales factores que pueden afectar a una tinción son:

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 Pureza del colorante. A mayor grado de impurezas, mayor error, y menor calidad en
la tinción.

 Concentración del colorante. A mayor concentración, mayor error en la tinción, igual

que a menor concentración. Los valores ideales oscilan entre 0,2 y 2%.

 El pH del colorante. Este factor es elemental para realizar una tinción adecuada, ya
que según sea el pH del colorante hace que éste se fije o no a determinadas
estructuras del microorganismo, permitiéndonos distinguir unos gérmenes de otros.

 Conservación del colorante, que deberá ubicarse siempre en lugares frescos, secos
y oscuros, adecuadamente envasados y etiquetados.

 Elaboración. Aunque en muchos casos estos colorantes ya vienen preparados,

generalmente dicha elaboración se lleva a cabo a través de disoluciones acuosas o
hidroalcohólicas a partir de polvo de colorante en las cantidades precisas que permitan
su solubilidad.

 Técnica empleada. Se deberá ser escrupuloso a la hora de realizar una tinción; por
ejemplo, los portaobjetos y cubreobjetos deberán estar siempre limpios y
desengrasados, nunca se mezclarán unos colorantes con otros, se seguirá
rigurosamente paso a paso cada técnica de coloración, etc.

 Temperatura. Se aplicará en cada técnica, según se precise, el colorante a la

temperatura adecuada, que en muchos casos será la ambiental aunque en otros
requerirá de temperaturas altas para facilitar la penetración del colorante a ciertas
estructuras bacterianas como, por ejemplo, en la tinción de esporas con el verde de
malaquita.

 Cantidad de muestra. Deberá ser representativa y homogénea pero en ningún caso

muy grande, porque se apelotona y no se visualiza el microorganismo, ni tampoco
demasiado pequeña, porque se corre el riesgo de no observar nada.

 Realizar correctamente el frotis. Si se pretende visualizar una muestra ha de fijarse

previamente y, salvo excepciones, suele hacerse con calor. De no ser así, los
gérmenes no quedan adheridos al portaobjetos y a la hora de adicionar colorantes
mordientes y decolorantes dichos microorganismos son arrastrados y no se podrá
visualizar nada.

 Disoluciones mordientes. En ciertas ocasiones es necesaria la presencia de ciertas

sustancias que, no presentando capacidad tintorial como tal, actúan como
fijadores y ayudan a que el colorante se fije a las correspondientes estructuras
microbianas, por ejemplo, en la tinción de Gram, con el mordiente lugol, que
fijará el cristal violeta a las bacterias.
 Tiempos de tinción. Cuando se adiciona el colorante, el mordiente, etc, que se
precisa en cada tinción, es necesario que todas estas sustancias se
mantengan en la preparación un tiempo preciso, variable según la tinción, que es muy
importante y que generalmente oscila entre uno y diez minutos.

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3. PRINCIPALES TÉCNICAS DE COLORACIÓN

3.1. COLORANTES
Para teñir los microorganismos se dispone de un gran número de compuestos orgánicos e
inorgánicos con carácter coloreado: los colorantes. Dichos compuestos son más o menos
complejos en cuanto a su estructura molecular y, de acuerdo con esto, se clasifican en
diversos grupos:

3.1.1. Colorantes según su origen

a) Colorantes naturales: son extraídos de animales y sobre todo de plantas. Se
encuentran, por ejemplo, la hematoxilina extraída del tronco de una planta que
por oxidación origina la hemateína, el azul de índigo que corresponde al
extracto de una leguminosa o el carmín extraído de un animal, la cochinilla.

b) Colorantes artificiales: son preparados artificiales obtenidos en su mayor parte

de alquitrán de hulla, son colorantes de anilina y se distinguen colorantes
ácidos y básicos, que pueden presentarse formando sales, así como
colorantes neutros. Por ejemplo el cristal violeta, violeta de genciana, fucsina
básica, ácido pícrico, azul de metileno, etc.

3.1.2. Colorantes según su comportamiento químico

En general un colorante, dependiendo de su estructura físico-química, se unirá de una
forma más estable a la estructura que tiñe. Este tipo de colorantes está constituido
fundamentalmente por un anillo bencénico al que se unen distintos radicales, de los cuales
uno de ellos será coloreado y corresponderá al radical cromóforo que frecuentemente es de
carácter nitroso o de tipo amido, azo, alqueno, ciano, tiociano, etc.

Así pues, a mayor número de radicales cromóforos mayor será el poder colorante de la
solución. Por otro lado, al anillo bencénico se le unirán radicales no coloreados o
auxocromos que pueden ser de tipo hidroxilo, amino, metilo, alquilo, etc, que no poseen
capacidad tintorial pero proporcionan estabilidad al colorante, pudiendo facilitar que se tiñan
los radicales coloreados.

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Así pues, de acuerdo con lo dicho, aparecen:

 Colorantes ácidos o aniónicos: son aquellos donde la carga del radical del
colorante es negativa, corresponden fundamentalmente a colorantes
citoplasmáticos, ya que los citoplasmas de las células se consideran básicos,
captando muy bien los colorantes ácidos. Por ejemplo, las eosinas, las auraminas,
etc.

 Colorantes básicos o catiónicos: son aquellos donde la carga del ión cromóforo es
positiva. Corresponderán a colorantes que tiñen estructuras de carácter nuclear o
similares que son ácidas o ligeramente ácidas, es decir, cargadas negativamente.
Por ejemplo, los derivados del trifenil metano como la fucsina básica, cristal violeta o
violeta de genciana, así como los derivados de tiacinas como el azul de toluidina,
azul de metileno o las tioninas.

 Colorantes neutros: un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante

ácido y un colorante básico como, por ejemplo, el eosinato azul de metileno que en
general posee las propiedades de colorantes ácidos y básicos.

 Colorantes indiferentes: son colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol

donde no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa pero tampoco tiene un
carácter neutro; son los colorantes de los lípidos, por ejemplo Sudán III, Negro
Sudán, etc.

En bacteriología es especialmente frecuente la utilización de colorantes artificiales

básicos como la fucsina fenicada, violeta de genciana, azul de metileno, etc.; ello es debido
a la gran basofilia de los componentes nucleares ricos en ácidos desoxirribonucleicos y
componentes citoplasmáticos ricos en ácidos ribonucleicos.

En las tinciones donde se utiliza un colorante básico es frecuente que además se añada un
mordiente que ayude a fijar dicho colorante a las estructuras microbianas reforzando la
acción tintorial.

Los colorantes ácidos se suelen utilizar siempre como colorantes de contraste y los
colorantes neutros e indiferentes para coloraciones particulares.

El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones entre el colorante

y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula, de tal forma que los iones
teñidos del colorante reemplazan iones de los componentes celulares.

3.2. PREPARACIÓN DE UN FROTIS

Objetivo:

Realizar una extensión y fijar la muestra problema para posterior coloración y visualización al
microscopio.

Fundamento:

Consiste en poner en un portaobjetos, a través de un asa de siembra, una cantidad de

microorganismo problema suspendido en medio líquido estéril, extendiéndolo
adecuadamente hasta formar una fina película homogénea que, posteriormente, se fijará
generalmente con calor cuando sea requerido, según el método de tinción que se utilice.

Técnica:

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Consta de los siguientes pasos:

 Extensión: Si partimos de un producto líquido, se depositará en el centro del

portaobjetos una pequeña cantidad de producto con el asa de siembra,
extendiéndolo lo más fina y homogéneamente posible; si en algunos casos el
líquido problema es muy espeso, por ejemplo pus, se someterá a dilución la
muestra problema con unas gotas de agua estéril.

 Si se parte de una muestra sólida se deposita previamente en el portaobjetos,

perfectamente limpio y desengrasado, una pequeña gota de agua estéril y
posteriormente se añade con el asa de siembra una pequeña cantidad de
cultivo que se extenderá de forma que quede fina y homogénea.
 Secado. Realizada la extensión se dejará secar por sí solo, lo que a partir de
ahora se llamará frotis. No se debe secar con calor, pues corremos el riesgo de
hervir nuestra muestra y deteriorarla.
 Fijación: A continuación se realizará la fijación que, salvo excepciones, es
necesaria para evitar que los colorantes y decolorantes utilizados en la tinción
arrastren los microorganismos. Así pues, una vez que la extensión esté bien
seca se procederá a dicha fijación mediante el flameado de la preparación con
calor, aunque en algunos casos la fijación se podría hacer con alcohol. Esta
fijación, en general, se va a producir por la coagulación rápida de las proteínas
que permite que el microorganismo quede adherido al portaobjetos.

3.3. TÉCNICA DE TINCIÓN

Teñir supone una reacción de intercambio de iones de colorante a lugares activos de la
superficie o interior de las estructuras de la célula. Esto permitirá, contrastar mucho más
el microorganismo con respecto al medio que le rodea.

Toda técnica de tinción requerirá de los siguientes pasos:

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 Realización de un frotis y fijación posterior, generalmente por calor, considerando

que la intensidad máxima de calor para una adecuada fijación será la que
soporte el dorso de la mano.

 Coloración, utilizando generalmente colorantes básicos en disoluciones

hidroalcohólicas que teñirán componentes celulares ácidos. Los más utilizados
son, azul de metileno, violeta de genciana, verde malaquita, etc.

 Decoloración. Es frecuente, después de una coloración, someter la muestra de

tinción a la subsiguiente decoloración a fin de poder diferenciar si son o no
capaces de perder dichas bacterias el colorante bajo la acción de situaciones
drásticas para la bacteria, lo que permitirá diferenciar distintos grupos bacterianos.
Por ejemplo, las especies del Género Mycobacterium son resistentes a la
decoloración ácida diferenciándose del resto de las bacterias que no lo son.

 Lavado. Siempre entre paso y paso, en una tinción, se debe eliminar el exceso
de producto ya sea colorante, mordiente o decolorante, para evitar interferencias
entre un producto y otro que podrían inducir a error. Los lavados se llevarán a
cabo preferentemente con agua destilada.

 Coloración de contraste. Consiste en la utilización de colorantes generalmente

básicos que teñirán al final (porque es al final cuando se aplican) aquellas
estructuras que han sido decoloradas con el decolorante y, por lo tanto, no han
podido ser teñidas con el colorante inicial. Por ejemplo, la safranina en la tinción
de Gram que da el color rojo rosado a las bacterias Gram negativas que han sido
decoloradas con el alcohol de 96º.
 Desecación. Posterior al proceso de tinción, ha de realizarse a temperatura
ambiente, porque el uso de calor origina la cristalización del colorante por
evaporación brusca del agua y el resquebrajamiento de la capa de colorante en las
tinciones negativas.
• Observación al microscopio. Siempre se empezará por el objetivo de pocos
aumentos para comprobar que la muestra está adecuadamente distribuida y no existen
otros elementos, como por ejemplo cristales, restos de colorantes sin cristalizar,
partículas de polvo, etc. Posteriormente se irá aumentando el objetivo hasta llegar al de
inmersión con aceite de inmersión que nos permite visualizar la muestra problema con
gran exactitud si la tinción ha sido realizada correctamente.

4. TIPOS DE TINCIONES BACTERIANAS

a) Tinción simple
Se caracteriza por:

 Necesita fijación previa.

 Se utiliza un solo colorante.

 Permite la visualización de la morfología bacteriana.

Las tinciones simples se pueden clasificar a su vez en: tinciones simples con
colorantes básicos, ácidos o neutros.

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b) Tinción negativa
Es un tipo de tinción simple pero con ciertas diferencias, ya que nos permite observar
características estructurales de la bacteria además de su morfología. Ésta se caracterizará por:

 No necesita fijación previa.

 Se utiliza un solo colorante (de ahí que la tinción sea simple).

 Nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria además de

alguna otra característica estructural, como es la presencia de cápsulas.

c) Tinciones diferenciales
Las tinciones diferenciales presentan las siguientes características:

 Se necesitará fijación previa generalmente por calor.

 Se utilizarán dos colorantes, siendo el último el colorante de contraste.

 Nos permite visualizar su morfología y otras características, como pueden ser la

composición de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida, etc.;
como sucede en la tinción de Gram y en la tinción de Ziehl-Neelsen.

d) Tinciones estructurales
Las tinciones estructurales presentan las siguientes características:

 Requiere fijación previa, generalmente por calor.

 Utiliza al menos dos colorantes.

 Nos permite observar su morfología.

 Nos permite visualizar otras características de carácter estructural. Entre las

tinciones estructurales más importantes está la tinción de endosporas, la tinción
de cápsulas, la tinción de flagelos y cilios, la tinción de corpúsculos
metacromáticos, etc. Esta última requiere un solo colorante.

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4.1. TINCIÓN SIMPLE

Objetivos:

 Observar la morfología de la bacteria.

 Observar la agregación o tipo de distribución bacteriana.

Fundamento:

Se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos componentes celulares, ya que

las células bacterianas en medios a pH neutros suelen presentar una débil carga
negativa. Así pues, la bacteria cargada negativamente se combinará con los iones
positivos de los colorantes básicos, como por ejemplo, el azul de metileno, de tal forma
que la bacteria quedará coloreada. Esto explica porqué en las tinciones simples los
colorantes utilizados suelen ser de tipo básico como azul de metileno, violeta de
genciana, azul de toloudina o fucsina fenicada diluida, etc.

Técnica:

 Si la muestra es sólida se tomará con el asa de siembra y se extenderá de forma

uniforme por todo el portaobjetos, el cual, previamente limpio y desengrasado, presentará
una gota de agua preferiblemente estéril.

 Si la muestra problema es líquida se tomará con la pipeta Pasteur estéril una pequeña
cantidad y se añadirá al portaobjetos extendiéndola uniformemente con el asa de
siembra.

 Dejar que la muestra en el portaobjetos se seque al aire y una vez seca se fijará con
calor, haciendo pasar para ello la extensión de 2 a 3 veces por la llama del mechero,
ayudándonos de unas pinzas si fuese necesario.

 Ya realizado el frotis se pondrá éste sobre las paralelas que estará sobre la cubeta de
tinción. A partir de aquí se cubrirá la totalidad de la extensión con el correspondiente
colorante, que para la tinción simple suele ser azul de metileno, dejándole actuar durante
unos cinco minutos.

 Transcurrido este tiempo, se verterá agua abundantemente en la preparación, a fin de

eliminar los restos de colorante que pudiera haber.

 Dejar secar la preparación al aire.

 Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Resultados e interpretación:

Los microorganismos visualizados aparecerán teñidos de color azul en el caso de haber

utilizado el colorante de azul de metileno, violeta de genciana o azul de toluidina.
Aparecerán de color rojo si el colorante que se utilizó fue fucsina diluida.

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4.2. TINCIÓN NEGATIVA

Objetivos:

 Determinación morfológica rápida (la preparación no requiere fijación previa).

 Evidenciar la presencia de cápsulas.

Fundamento:

Consiste en la aplicación de un colorante ácido (cargado negativamente). Por ello, los

microorganismos, que también están cargados negativamente, no van a captar el
colorante, quedando claros y brillantes sobre un fondo teñido oscuro. Este método es
menos utilizado en bacteriología que otras técnicas de tinción, pero proporciona una
visión muy exacta de las células bacterianas y se consigue una imagen más real de su
forma y tamaño, además de permitirnos observar si presentan o no cápsulas.

Material:

 El material sería análogo al de la tinción simple a excepción de que, al no requerir fijación

previa, no necesita calor y, por lo tanto, no hace falta mechero Bunsen.

 El colorante utilizado para esta tinción es tinta china o solución acuosa de nigrosina al 1
%.

Técnica:

 Tomar con el asa de siembra previamente esterilizada una cantidad de muestra

y pasarla a un portaobjetos previamente limpio y desengrasado.

 A la muestra del portaobjetos se le añade una gota de solución de nigrosina al 1 % y se

mezcla cuidadosamente con el asa de siembra formando una capa fina. Si pretendemos
obtener una capa muy fina nos ayudaremos con el borde de otro portaobjetos,
graduando de esta forma el grosor, ya que si es demasiado gruesa impedirá el paso de
luz del microscopio además de formarse grietas al secarse la nigrosina. Tampoco
conviene un frotis demasiado fino ya que no proporcionará demasiado contraste entre el
medio y las células bacterianas.

 Una vez adicionada la nigrosina en la muestra se deja secar al aire.

 Ya seca se examinará con objetivo de inmersión.

Resultados:

 Se observarán las células bacterianas incoloras y un tanto brillantes sobre un fondo

oscuro.

 Se podrán también observar las cápsulas si las presentase en forma de un halo más
claro que rodea el cuerpo de la bacteria.

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4.3. TINCIONES DIFERENCIALES

Dentro de las tinciones diferenciales se pueden citar:

 Tinción de Gram.

 Tinción de Zhiel-Neelsen.

4.3.1. Tinción de Gram

Objetivos:

 Visualizar diferentes tipos bacterianos (Gram+, Gram-) en función de la distinta

composición de su pared bacteriana.

 Visualizar su morfología y disposición

Fundamento:

Es el método más empleado en bacteriología gracias al cual las bacterias se

pueden clasificar en dos grandes grupos (Gram+, Gram-). Este distinto
comportamiento en la tinción de Gram es debido a la distinta composición de la pared
de las células bacterianas. De acuerdo con esto, la tinción de Gram se va a basar en el
empleo de un primer colorante básico, generalmente cristal violeta o violeta de genciana,
que teñirá de color azul todas las bacterias. Posteriormente, un mordiente, el lugol,
aumentará la afinidad del primer colorante a las células, es decir, lo fijará; finalmente,
un agente decolorante decolorará solamente un tipo de bacterias que serán teñidas
con el colorante de contraste o segundo colorante. Este distinto comportamiento frente
a la decoloración es dependiente de la composición de la pared bacteriana, hecho que
servirá para clasificarlas como Gram+ (aquellas que no han sido decoloradas y que por
lo tanto quedan teñidas con el cristal violeta de color azul violáceo) o como Gram-
(aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teñidas con el colorante de contraste,
la safranina; por lo tanto, su color es rosa-rojo).

Material:

El descrito para la tinción simple, pero como colorante, utiliza cristal violeta o violeta de genciana,
safranina como colorante de contraste, el lugol como mordiente o fijador y alcohol de 96°
como decolorante.

Técnica:

 Realizar la preparación con la correspondiente fijación por el método ya explicado.

 Aplicar sobre el portaobjetos el primer colorante que corresponderá a cristal violeta

durante 1 minuto, o violeta de genciana durante 2 minutos.

 Lavar abundantemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

 Añadir un mordiente, el lugol, que actuará fijando el colorante anterior a las bacterias,
aplicándose durante 1 minuto.

 Se vuelve a eliminar el exceso mediante un lavado con abundante agua destilada.

 Decolorar con alcohol de 96° unos 20 segundos o hasta arrastrar todos los restos. Se
puede utilizar también alcohol de 90°.

 Lavar abundantemente con agua.

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 Cubrir el portaobjetos con el segundo colorante o colorante de contraste (safranina)

durante 1 minuto.

 Lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar.

 Observar con objetivo de inmersión.

Resultados:

En las distintas etapas de la tinción de Gram nos encontramos:

Resultado
Paso Técnica
Gram+ Gram -

Primer colorante Cristal violeta 1' Se tiñen Se tiñen

Mordiente Lugol 1' Se fija la coloración Se fija la coloración

Alcohol 96% hasta

Decoloración Permanecen violetas Se decoloran
arrastrar colorante

Segundo
Safranina 1' Permanecen violetas Se tiñen de rosa
colorante

Se observan por campo bacterias de color azul violáceo que corresponden a bacterias
Gram+ y/o bacterias de color rojo rosado que corresponden a Gram-.

4.3.2. Tinción de Zhiel-Neelsen

Objetivo:

Diferenciar del resto de las bacterias tipos bacterianos capaces de resistir la

decoloración ácida (Mycobacterium), hecho que es debido a la gran cantidad de
componentes micólicos que forman parte de la pared bacteriana de este tipo de
bacterias.

Fundamento:

Existen determinados grupos bacterianos que contienen en su pared una gran

cantidad de componentes lipoideos y céreos, de tal forma que este tipo de bacterias
presentarán grandes dificultades a la hora de teñirse con los colorantes convencionales
que no pueden penetrar en el interior de estas bacterias. De ahí que se necesiten, para
este tipo de tinciones, colorantes altamente concentrados así como la presencia de calor
que facilite su penetración al interior de dichas bacterias; de tal forma que, una vez que
dichas bacterias han quedado teñidas, su decoloración posterior no es posible,
resistiendo incluso a decoloraciones ácidas. Así pues, podemos diferenciar este tipo de
bacterias, como es el caso del Género Mycobacterium, del resto que no presentan esta
propiedad.

Dicha tinción se emplea principalmente para el diagnóstico y estudio de enfermedades

producidas por bacterias ácido resistentes, como son la tuberculosis (M. tuberculosis) y la

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lepra (M. leprae)

Técnica:

Se indica en la correspondiente práctica.

4.4. TINCIONES ESTRUCTURALES.

Permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la célula bacteriana, ej.: material
nuclear, membrana citoplasmática, flagelos, cápsulas (es un tipo de tinción simple), esporas,
etc.

4.4.1. Tinción de flagelos

Los flagelos bacterianos son apéndices largos y delgados, libres en un extremo y unidos a
la célula por el otro. Debido a que son estructuras muy finas y frágiles no es posible
observarlas directamente al microscopio óptico, sino sólo después de teñirlos con colorantes
flagelares especiales. Una de las tinciones más comunes es el uso del colorante fucsina básica
con el ácido tánico como mordiente.

El mordiente facilita la unión de las moléculas del colorante al flagelo, formando un precipitado
a lo largo de éste y haciéndolo visible al microscopio óptico. Los flagelos se pueden observar
fácilmente en el microscopio electrónico si están recubiertos con una fina película de un metal
pesado (sombreado).

Los flagelos pueden disponerse en las células bacterianas en forma polar o perítrica. En las
formas polares los flagelos están insertos exclusivamente en uno o en ambos extremos de la
célula. Acorde con el número y distribución, pueden ser: Monótricos (un flagelo en un polo),
lofótricos (un grupo de flagelos en un extremo o anfítricos (un grupo de flagelos en ambos
extremos. En la flagelación perítrica las células están completamente rodeadas de flagelos.

Los flagelos tienen importancia en taxonomía bacteriana para identificar especies.

Hay dos métodos: el de Loffler y el de Rodhes utilizando una secuencia de reactivos

específicos.

4.4.2. Tinción de cápsulas

Muchas bacterias segregan polímeros orgánicos de solubilidad limitada en agua y que
tienden a acumularse como capas sueltas y confluentes en la vecindad inmediata de las
células, justamente alrededor de la pared. Se denominan cápsulas si el material está dispuesto
de un modo compacto alrededor de la superficie celular. Si el material es laxo, de manera que
sólo forma una capa difusa, se denominan capas mucosas o viscosas.

Las cápsulas y las capas mucosas, normalmente están compuestas de polisacáridos,

polipéptidos o complejos de polisacáridos y proteínas.

Las características de producir cápsulas, es una propiedad hereditaria del organismo, pero
estas estructuras no son componentes celulares absolutamente esenciales, ya que cepas
mutantes sin cápsula, son capaces de crecer en cultivo puro.

Las cápsulas pueden hacerse visibles en preparaciones frescas, mediante la técnica de Burri o
tinción negativa que ha sido estudiada anteriormente.

Se suelen teñir con bastante dificultad, de ahí que los colorantes tiñan el fondo y permita

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ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS, (1º AC 2) 14

resaltar las cápsulas que quedan sin teñir.

Otro método para observar cápsulas es el método de Hiss:

 Realizar una suspensión de la bacteria en un portaobjeto con una gota de suero de

caballo normal o leche descremada.

 Secar al aire, o calentar suavemente a la llama de un mechero.

 Cubrir con cristal violeta (0,1 g de cristal violeta en 100 ml de H2O destilada) y calentar a
la llama hasta emisión de vapores.

 Lavar el cristal violeta con una solución acuosa de Cu SO4 · 5 H2O al 20%.

 Secar y observar al microscopio.

 Las cápsulas aparecen de color azul débil y el resto de la célula de un color púrpura
oscuro.

4.4.3. Tinción de endosporas

Las endosporas son esporas que se producen en el interior del protoplasma y que
constituyen una forma de resistencia en ciertas bacterias (Bacillus y Clostridium
principalmente). Son capaces de resistir en situaciones muy desfavorables, de ahí su
denominación de resistencia.

En general se tiñen muy difícilmente, requiriendo determinados colorantes muy

concentrados así como la presencia de calor que facilita su penetración. Ahora bien, una vez
teñidas es muy difícil perder el colorante, propiedad utilizada para demostrar su presencia.

Técnica:

Método de Wirtz, modificado por Bartolomew y Wittwer para tinción de endosporas

1. Fijar la preparación por calor.

2. Teñir 6 a 8 minutos con verde de malaquita al 7,6%, sin calentar (o calentar hasta
emisión de vapores por 3 a 4 minutos) impidiendo que el colorante se seque o se
queme..

3. Lavar con agua abundante 10 a 15 segundos.

4. Teñir 15 segundos con una solución al 0,25% de safranina como colorante de

contraste sin necesidad de calor.

5. Lavar, secar y observar a inmersión.

Las endosporas se tiñen de verde y el resto de la célula de color rojo.

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ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS, (1º AC 2) 1

ESQUEMA TINCIONES:

Examen en fresco
Sin colorear
Gota pendiente
MICROORGANISMOS

VIVOS

Coloreados Tinción Vital

Tinción Negativa
Sin fijación
¿ejemplo?

SIMPLE ¿ejemplo?
MICROORGANISMOS

MUERTOS

Con fijación previa Diferenciales ¿ejemplo?

COMPUESTA ------------------------------------------------------------------------------

Estructurales ¿ejemplo?

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