UT:8 RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Existen varias formas de cuantificar el crecimiento microbiano. Se puede medir

tanto la masa como el número de células en la población, porque el crecimiento origina
un incremento en ambos. Se pueden considerar todas las células presentes o sólo las
viables. Existen varios métodos para poder contar los microorganismos.

1. Medida de masa celular

Debido a que la masa celular es proporcional al número de células, se puede
utilizar la determinación de un parámetro para estimar el otro.

1.1 Determinación del peso húmedo:

1. se tara un tubo de centrífuga;
2. se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
3. se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía
depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del
empaquetamiento, etc.

1.2 Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se

seca antes de ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas
de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es
difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1
mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

1.3 Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.

1.4 Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN,

ARN, proteínas, etc.

2. Cámara de recuento
Se realiza un recuento directo al microscopio. Se utiliza una cámara de
recuento como la de Thoma, la Petroff-Hauser o la de Neubauer, que es un
portaobjetos que tiene en el centro una rejilla con 25 cuadrados grandes de 1 mm 2 de
área y un volumen de 0,02 mm3.
Se añade el cultivo líquido, se pone el cubre y se deja reposar en la plataforma
del microscopio durante unos minutos y se observa al microscopio. Se cuentan todas
las células de un cuadrado grande (en la práctica se cuentan las células de varios
cuadrados y se halla la media) se multiplica por 25 y se divide por 0,02 mm3,
obteniéndose así las células / mm3. Multiplicando por 103 obtendremos las células / ml
(cm3).
Ejemplo: Si contamos en un cuadrado 12 células tendremos:
12 x 25 x 50 x 103 = 1.5 x 107 cél / ml. (el factor 50 sale de dividir 1 entre 0,02 mm3).
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El contaje microscópico directo es una manera rápida de estimar el número de células

microbianas. Sin embargo tiene una serie de limitaciones:
1.- Las células muertas no se distinguen de las vivas.
2.- Las células pequeñas son difíciles de ver al microscopio y algunas de ellas
probablemente no se cuentan.
3.- Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisión por este método.
4.- Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no
está teñida.
5.- Este método no es bueno para una suspensión de células poco densa. En
el caso de bacterias, si la suspensión tiene menos de 106 células/ml se verán
pocas células en el campo del microscopio. En muestras diluidas pueden sin
embargo contarse, si previamente se concentran por centrifugación en un
pequeño volumen.

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3. Contador electrónico de células ("cell counter"):

Es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Fue

comercializado por Coulter Electronics.
El sistema está formado por los siguientes elementos:
• Dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se
introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se
introduce directamente en dicha suspensión
• Un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y
una escala, conectados a los electrodos.

Cuando la válvula se abre, 0`5 mL de la suspensión entran en

el interior del tubo por el pequeño orificio.
Durante ese tiempo, los electrodos están conectados y
registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal
las oscilaciones de resistencia que detectan.
Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una
variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se
registran para ser analizados posteriormente.

4.-Turbidimetría

Consiste en la estimación de cantidad de células relacionándola con la turbidez del

medio líquido. Esta turbidez, medida como Absorbancia o Densidad Óptica con un
Espectrofotómetro, está relacionada con el número de células por ml según la Escala
de McFarland: formada por una batería de 10 tubos cada uno de los cuales tiene
distinta turbidez según la concentración de sulfato de bario y que sirven de patrones
para las distintas concentraciones de microorganismos. Cada tubo de distinta
concentración de BaSO4, numerados del 1 al 10, corresponderá a una determinada
concentración de microorganismos ("Escala de Mac-Farland").
Se utiliza un instrumento óptico denominado espectrofotómetro (Figura 8.7) para medir
la turbidez de la muestra. Un espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite
una disolución o un cultivo líquido de células microbianas. Cuanta mayor masa de
células tenga un cultivo, mayor será su turbidez, se transmitirá menos luz y la lectura
en el espectrofotómetro será mayor (mayor absorbancia). Puesto que un
espectrofotómetro mide con exactitud lo que vemos cuando examinamos visualmente
un cultivo líquido, no es muy sensible con respecto al número de células bacterianas.
Para que el líquido se vea turbio, el cultivo líquido debe contener alrededor de 10
millones de células bacterianas de un tamaño intermedio por mililitro y, por lo tanto, un
espectrofotómetro no es útil para detectar una pequeña contaminación. Al igual que
para la mayoría de los cultivos bacterianos, el espectrofotómetro también puede
emplearse para cultivos de levaduras.
Generalmente, el espectrofotómetro se utiliza para estimar la masa de un cultivo
relativamente denso, y poder así registrar el crecimiento de una población microbiana
(Figura 8.7). Para medir la masa o el número de células con un espectrofotómetro, es
necesario, en primer lugar, preparar una curva patrón, o gráfica en la que se
relacionan las medidas del espectrofotómetro con la masa celular de un determinado
cultivo. Generalmente, los distintos tipos de bacterias producen una turbidez diferente
aunque se suele usar una escala hecha con sulfato de bario para todos.
Posteriormente, se puede determinar a partir de la gráfica la masa celular (número de
células/ml) que se corresponde con cualquier lectura en el espectrofotómetro.
Como cualquier otro instrumento, el espectrofotómetro tiene ventajas y desventajas.
Sus medidas son rápidas y reproducibles. Sin embargo, sólo puede utilizarse para

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cultivos relativamente densos, y no puede distinguir entre células muertas y vivas.

Tampoco puede utilizarse con células que tiendan a formar agregados, porque dejan
de suspenderse rápidamente y desaparece la turbidez.

TUBO Cl2Ba 1% H2 SO4 1% u.f.c / ml

1 0,1 9,9 3,0x108
2 0,2 9,8 6,0x108
3 0,3 9,7 9,0x108
4 0,4 9,6 1,2x109
5 0,5 9,5 1,5x109
6 0,6 9,4 1,8x109
7 0,7 9,3 2,1x109
8 0,8 9,2 2,4x109
9 0,9 9,1 2,7x109
10 1,0 9,0 3,0x109

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5.- Recuento de viables: Siembra en placas

En muchos casos interesa contar sólo células vivas. Para ello se han
desarrollado métodos de contaje para viables. Una célula viable se define como la que
es capaz de dividirse para dar lugar a descendencia. En la mayoría de estos métodos
de recuento se siembra una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos
sobre una superficie de agar sólido.

Se utiliza mucho para contar bacterias y otros microorganismos en muestras como

alimentos, agua y suelo. Las diluciones seriadas y la posterior siembra en placas
es uno de los métodos disponibles para el contaje de viables en una muestra.

Las diluciones seriadas son necesarias porque en la mayoría de las muestras

ambientales no se conoce el número de viables a priori. Los cultivos de laboratorio
contienen cientos o miles de millones de células por ml, de manera que para poder
proceder al recuento en las placas, es preciso diluir previamente. Las muestras deben
producir entre 30 y 300 colonias por placa para obtener resultados significativos.

➢ Más de 30 colonias para evitar fluctuaciones estadísticas

➢ Menos de 300 para que sea viable contarlas

Una vez contadas directamente o con el contador de colonias, se multiplica el

número obtenido por el factor de dilución (inverso de la dilución) y nos da las UFC/ml.

Siendo: N= Valor medio de las colonias contadas

n = inverso de la dilución en placa
V= volumen del inóculo en placa (en mL)

Las técnicas utilizadas son:

- Siembra por Extensión en superficie (que se realiza en medio sólido extendiendo

0,1 ml de la muestra o de la dilución sobre la superficie con un asa de Digralsky)

- Siembra en Profundidad o en Masa (utiliza agar en sobrefusión aproximadamente

a 45º C, que se mezcla con 1 ml de la muestra o de su dilución que previamente se ha
echado en la placa de Petri, donde son mezclados haciendo una serie de rotaciones
sin levantar de la mesa de trabajo)

- Siembra de Filtros de membrana (En esta técnica se pasa una muestra a través de
un filtro de membrana especial de un determinado tamaño de poro. Luego, el filtro se
coloca sobre un medio con agar y se incuba hasta que cada célula forme una colonia
separada. Un recuento de colonias permite obtener el número de microorganismos
presentes en la muestra filtrada)

El agar caliente que se utiliza en la siembra en profundidad puede dañar o

matar células sensibles. El organismo que vaya a ser contado debe resistir
temperaturas de 40-45 º C Por ello, la siembra en placa por extensión ofrece a veces
recuentos superiores.

Las técnicas de siembra en placa son sencillas, sensibles y se utilizan mucho

para contar bacterias y otros microorganismos. Se pueden obtener recuentos bajos si
no se separan las agrupaciones de células y no se dispersan bien los

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microorganismos. Como no es posible estar totalmente seguro de que cada colonia

proceda de una célula individual, los resultados suelen expresarse en Unidades
Formadoras de Colonias (UFC), en lugar de “número de microorganismos”. Por
supuesto, el recuento será también bajo si el medio con agar empleado no puede
mantener el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes.

FUENTES DE ERROR EN EL MÉTODO DE CONTAJE EN PLACA

El número de colonias obtenido en un contaje de viables depende del tamaño

del inóculo, del medio de cultivo y de las condiciones y tiempo de incubación. Las
células depositadas sobre el medio de cultivo no desarrollarán colonias al mismo
tiempo, de modo que si el tiempo de incubación es corto se obtendrá un número más
bajo del real. Además el tamaño de las colonias varía ampliamente de modo que
colonias muy pequeñas pueden no ser contadas.
En la práctica lo que se hace es estandarizar las condiciones de incubación
(medio, temperatura, tiempo) para que den el número máximo de colonias para un
organismo dado. El contaje de viables puede ser fuente de errores muy grandes de
modo que hay que tomar muchas precauciones y replicar las placas de las diluciones
claves. Para representar el resultado más claramente, el contaje de viables a menudo
se expresa como unidades formadoras de colonias (UFC) en lugar de células viables,
ya que una unidad formadora de colonia puede contener más de una célula.
A pesar de las dificultades asociadas con el contaje de viables, este procedimiento
da la mejor información posible, y por tanto se utiliza mucho; sobre todo en industrias
alimentarias, medicina y microbiología acuática. El método tiene la virtud de la alta
sensibilidad. Se pueden procesar muestras con muy pequeño número de células.
Además, la disponibilidad de medios de cultivo altamente selectivos, permite el contaje
de un tipo particular de MO a partir de muestras heterogéneas.

6. RECUENTO EN PLACA

Las directrices de la ICMSF (Comisión Internacional de Especificaciones

Microbiológicas de los alimentos) dicen que los resultados se expresan en ufc/g o mL
en función del estado de agregación de la materia del alimento (sólido o líquido
respectivamente).

En general, el recuento se realiza en las placas de la misma dilución cuyo

contenido en colonias esté comprendido entre 30 y 300. Para expresar el resultado
basta generalmente con hacer la media aritmética de los valores obtenidos para esa
dilución y multiplicar por el factor de dilución decimal (el inverso del factor de dilución)

ufc = p1 + p 2 Siendo p1 y p2 el número de MO correspondientes a

2 las placas 1 y 2 de la misma dilución

Para determinar la validez del recuento, se calculan los límites de fiabilidad al 95%
según:
Donde n representa el número de placas de la misma
(nX )  1,96 (nX ) dilución utilizadas en la determinación (generalmente
dos) y X la media aritmética de los valores obtenidos en
n el recuento de las placas

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Existen casos en los que los recuentos dan valores inferiores a 30 o superiores a
300 colonias, encontrándonos varios casos:

1. Si las placas sembradas de la dilución más concentrada no presenta

crecimiento, daremos como resultado el valor de  1 · FDD de la dilución más
concentrada.
2. Si las placas sembradas de la dilución más concentrada presentan recuentos
inferiores a 30 colonias, el resultado se da como  30 · FDD de la dilución más
concentrada.
3. Si todas las placas sembradas presentan recuentos superiores a 300 colonias,
el resultado se da como  300 · FDD de la dilución más diluida.
4. En el caso de que una de las placas de la dilución elegida presente algo menos
de 30 colonias o algunas más de 300, los recuentos se llevan a cabo como en
el caso general, se recuentan todas las colonias, expresando el resultado como
recuento estándar en placa.

Ejemplo: A partir de una muestra de harina se preparan las diluciones decimales

necesarias para sembrar por duplicado en masa con PCA e incubar a 37ºC / 48 h
para obtener los resultados de la tabla:

Dilución 10-2 10-3 10-4

Placa 1 140 14 2

Placa 2 160 16 1

¿Qué puede afirmarse de la muestra?

7.- Recuento de viables en medio líquido: Número Más Probable

Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y
producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realización de una serie de diluciones
seriadas decimales de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el
crecimiento de dicho organismo (Figura 8.10). Posteriormente, se incuban las
muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como
para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron
inoculados con una o más células microbianas a partir de la muestra, se pondrán
turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán
transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto
en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al
determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede
determinar el numero más probable de microorganismos presentes en la muestra
original, utilizando para ello una tabla estadística. En la página 7 se muestra una tabla
del NMP.
La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se
usan, aunque cinco tubos por dilución se considera como una relación apropiada
entre la precisión y la economía.
El método se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar
en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo
mixto que pueden crecer en un medio líquido determinado:
Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el
número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias

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probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de

E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.

Figura 8.10 El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al
aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo
y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres
diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el número más probable de células
estadísticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de números más
probables (Tabla 8.6). Este valor, multiplicado por el factor de dilución (en nuestro caso 103) nos
proporciona el número de células viables de la muestra.

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CÁLCULOS

Para cada dilución podemos encontrarnos con 3,2,1 o 0 tubos positivos, por lo
que obtendremos para las tres diluciones un código de tres dígitos. Así para las
diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (muy habituales), obtenemos tres positivos para la dilución
10-1, dos positivos para la 10-2 y uno positivo para la dilución 10-3, el código será
(3,2,1). Introducido en la tabla arroja un resultado de valor de NMP de 150 MO/mL en
la muestra original.

Además del cálculo del NMP debe calcularse el límite de confianza aproximado
al 95% de confianza, según la fórmula:

NMP
a NMP · 4,68
4,68

Ejemplo: En la determinación de un parámetro microbiológico para carne picada y a

partir de las diluciones decimales, 10-1, 10-2 y 10-3, se siembran por triplicado 1 mL de
cada dilución en 10 mL de caldo lactosado con campana Durham. Tras incubar a 37º
C durante 24 horas, se observa que los tres tubos de la dilución –3 y uno de la dilución
–2 permanecen inalterados; los restantes tubos presentan turbidez y presencia de gas
¿Qué puede afirmarse?

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Si se emplean diluciones mayores, se emplea el mismo procedimiento. En tal

caso el multiplicador (el factor de dilución) se aumenta para relacionar la cantidad de
material realmente inoculado a los valores proporcionados en la Tabla (para 10, 1.0 y
0.1 g (ml) de material). Para calcular el NMP a partir de tres diluciones sucesivas, debe
emplearse el factor de la dilución intermedia.

TABLA DE NMP USANDO 5 TUBOS POR DILUCIÓN

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La tabla considera el empleo de 10, 1.0 y 0.1 ml de material analizado. Si se

emplean como inóculo otras cantidades, los valores de NMP deducidos de la tabla
deben multiplicarse por el número adecuado, para considerar la cantidad real de
material introducido en los tubos, así como para obtener el NMP por g (o ml) de
material en lugar de por 100 ml (g), que aparece en la tabla.

Consideremos positivos los siguientes cultivos:

(1) 5 tubos inoculados con 10 ml de la dilución –1 (1/10) del material : los cinco (5)
son postivos
(2) 5 tubos inoculados con 1 ml de la dilución –1 (1/10) del material: solo uno (1) es
positivo
(3) 5 tubos inoculados con 1 ml de la dilucion –2 (1/100) del material: ninguno (0) es
positivo

La lectura debe realizarse en la “Pos” de la Tabla I correspondiente a la lectura 5-1-0

(corresponde a un NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml) de
material.

Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas con las que
se construyó la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse por 10, lo que proporciona
un valor de 33 x 10 = 330 organismos por 100 g (ml) de material. Como usualmente
se expresa por g (ml) de material, este valor (330) debe dividirse por 100. El recuento
obtenido por el NMP es en este caso de 3,3 organismos por g (ml) de material
analizado

Si se emplean diluciones mayores, se emplea el mismo procedimiento. En tal

caso el multiplicador (el factor de dilución) se aumenta para relacionar la cantidad de
material realmente inoculado a los valores proporcionados en la Tabla (para 10, 1.0 y
0.1 g (ml) de material). Para calcular el NMP a partir de tres diluciones sucesivas, debe
emplearse el factor de la dilución intermedia.

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