22/6/2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE TECNOLOGIA
PPG EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

Aplicações Biotecnológicas das

Enzimas

Prof. Dr. Jesus Souza

Biotecnologia
Importância do seu conhecimento nos dias atuais
Muitas aplicações importantes para a:

Indústria química
Indústria farmacêutica

Indústria de alimentos

Agricultura e Pecuária Preservação do meio ambiente

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Biotecnologia
Importância do seu conhecimento nos dias atuais
Interação da biotecnologia com outros ramos do conhecimento

Biotecnologia
Importância do seu conhecimento nos dias
atuais e sua influência no dia a dia
Interação da biotecnologia com outros ramos
do conhecimento
Múltiplas aplicações importantes para a
indústria
Alimentos transgênicos / Biossegurança
Fermentação e Bioprocessos

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BIOPROCESSOS
• Os Bioprocessos compreendem um conjunto de
operações que incluem o
– tratamento da matéria prima;
– preparo dos meios de propagação e produção;
– esterilização e a transformação do substrato em produto(s);
– processos de produção;
– processos de separação e purificação de produto(s).

• A distinção entre bioprocessos e processos químicos

está calcada na natureza dos catalisadores utilizados
em suas reações. Os bioprocessos são conduzidos
mediante ação de:
– microrganismos;
– células animais ou vegetais;
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– enzimas.

BIOPROCESSOS
Principais etapas de um bioprocesso
Microrganismo
selecionado Meio de cultura Matérias primas
(laboratório) selecionado
Upstream

Esterilização
Preparo do
inoculo
(laboratório)
Células

Preparo do
inoculo Separação das
Bioreator células
(industria)
Industrial

Caldo fermentado
Ar

Recuperação do
Fermentação produto
Compressor Esterilizador de ar

Produto Residuo
E onde entram as enzimas ? Downstream 6

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Importância dos microrganismos

em biotecnologia
Relação microrganismos x homem (evolução de ambos)

Fermentação de alimentos Decomposição de alimentos 7

Importância dos microrganismos

em biotecnologia
A célula é uma unidade extremamente complexa !

Célula procariótica:
procariótica:
Bactérias: aeróbias e
anaeróbias, Gram + e -

Célula eucariótica:
Fungos, animais e plantas
Fungos: Bolores e
leveduras

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Importância das enzimas em biotecnologia

• Enzimas : são proteínas com atividades catalíticas

S
P

E ES EP E

E+S ES EP E+P
As enzimas atuam nas vias metabólicas das células 9

Bioprocessos aplicados a alimentos

Produtos comerciais para a indústria de alimentos

1. Produção de alimentos consumidos diretamente

Iogurtes, cogumelos e queijos
2. Produção de suplementos alimentares
Produção em massa de leveduras, bactérias a partir
de meios de baixo custo como fonte de proteínas
3. Produção de bebidas alcoólicas
Cerveja, vinhos e outras bebidas
4. Substâncias químicas de valor comercial
Ácidos orgânicos, vitaminas e enzimas 10

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Bioprocessos aplicados a alimentos

Todos os produtos originam-se do metabolismo das células !

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Reatores com células/enzimas imoblizadas

Principal característica: uso de alguma estrutura
física de confinamento e que obriga as células a
permanecerem em uma região particular de um
biorreator.
2 tipos de processos fermentativos:
– Os que não necessitam que as células estejam vivas
quando imobilizadas; somente deve estar ativo o sistema
enzimático envolvido na conversão bioquímica requerida
– Os que precisam de células viáveis, devido os produtos a
serem formados requererem múltiplos passos de
transformações , regenerações de coenzimas, presença de
cadeia respiratória, vias metabólicas geradoras de
intermediários e outros mecanismos inerentes às células
vivas. 12

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Reatores com enzimas imoblizadas

Tanto enzimas extracelulares quanto intracelulares encontram-
se disponíveis e são usadas em processos industriais.
Os custos relacionados com o isolamento da enzima e sua
imobilização devem ser minuciosamente avaliados, frente às
potenciais vantagens de se utilizar um processo enzimático.
No momento é impensável o uso desta técnica para processos
multienzimáticos.
Quando comparadas aos MO, as enzimas isoladas poderão
fornecer maior rendimento num dado produto, já que
substâncias contaminantes não seriam formadas.
As formas solúveis e insolúveis de uma enzima depende da
natureza do processo de conversão e da estabilidade
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operacional das duas formas.

Vantagens de sistemas com células/enzimas imobilizadas:

1. Possibilidade de utilização de altas concentrações celulares no volume reacional,
implicando em maiores velocidades de processamento;

2. Operação de sistemas contínuos;

3. Eliminação de problemas com reciclos externos de células através de uso de

sedimentadores, filtros e centrifugas que pode acarretar contaminações;

4. Provável obtenção de fatores de conversão de substrato ao produto desejado

maiores ;

5. Possibilidades de adequação dos biorreatores as necessidades dos sistema

biológico utilizado;

6. Maior proteção ao sistema biológico em relação ao estresse ambiental

ocasionado por elevadas concentrações de substratos, pH e cisalhamento;

7. Possibilita utilização de fermentação submersa para cultivo de células de

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mamíferos.

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Métodos de imobilização
“A imobilização é conseguida com o contato de um
material utilizado para imobilização com as
células/enzimas que se pretende imobilizar”

- Principais características dos suportes:

a) Não toxidez às células
b) Alta capacidade de retenção
c) Resistência ao ataque químico e microbiano,
d) Pouca sensibilidade às possíveis solicitações mecânicas
e) Alta difusibilidade de substratos e produtos
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Métodos de imobilização
Principais materiais utilizados na produção de suportes para imobilização de células vivas
Polímeros naturais Polímeros sintéticos Meteriais inorgânicos

Alginato Poliacrilamida Alumina

K-carragena Cloreto de polivinila Sílica

Agar Poliestireno Zircônia

Pectina Poliuretano Vidro

Celulose Poliestileno glicol Diatomita

Dextrana Vermiculita

colágeno

Existem 3 métodos de imobilização de células em suporte:

Adsorção, ligação covalente e envolvimento 16

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Métodos de imobilização: Adsorção

Adsorção: Adesão de células em suporte que não
foram especialmente funcionalizados para a
ocorrência de ligação covalente.
As forças de interação entre a superfície celular e a
superfície do suporte são complexas e envolvem
múltiplos tipos de ligações:
- Interações eletrostáticas entre cargas opostas da parede
celular e da superfície do suporte
- Ligações iônicas entre grupos aminícos e carboxilícos da
parede celular e um grupo reativo da superfície do suporte
- Formação de ligações covalentes parciais entre grupos
aminícos da parede celular e grupo hidroxila ou silano (SiO-)
do suporte. 17

Métodos de imobilização: Adsorção

Limitações:
Estão relacionadas a influência das condições ambientais
promovidas pelo meio de cultivo na capacidade de
retenção das células no suporte relacionadas com a
concentração iônica, pH e idade da população celular que
se deseja imobilizar
Os materiais mais comuns são:
Materiais inorgânicos e polímeros sintéticos submetidos a
tratamentos superficiais, visando a obtenção de estruturas
macroporosas, com o intuito de se aumentar a capacidade
de retenção do suporte.

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Métodos de imobilização: Adsorção

Suportes comerciais utilizados no método de adsorção
Nome comercial Material Diâmetro Densidade Célula
(mm) (g/mL)
Cytodex Dextrana 0,20 1,04 mamifero

Cytopore celulose 0,23 1,03 Mamifero

Microrganismo
Cytoline Polietilen e 2,0 a 2,5 1,03 a 1,3 Mamifero
silica Microrganismo
Siran Vidro poroso 1,0 a 2,0 1,6 Microrganismo

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Métodos de imobilização: Ligação covalente

Neste método os suportes são especialmente
funcionalizados para conter um grupamento
químico, que será responsável pela imobilização
da célula ao suporte
Principal técnica e a silanização de esferas de
vidro, seguida de reação com glutaraldeído.
A grande limitação dessa metodologia para
imobilização de células viáveis é a potencial
toxicidade de sistema, conferida pela presença do
glutaraldeído.

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Métodos de imobilização: Ligação covalente

Preparação de suporte para imobilização de células por ligação covalente

vidro
APTS: aminopropil-trietoxisilano

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Métodos de imobilização: Envolvimento

É o método mais utilizado pela sua facilidade, baixíssima toxidez
e alta capacidade de retenção celular;

Esta técnica consiste no confinamento físico de uma população

celular em uma matriz polimérica formadora de um gel
hidrofílico.

Os poros da matriz formada são menores que as células contidas

no seu interior

Em contato com o meio de cultura, há um fluxo de substratos

para dentro das partículas de gel, onde são consumidos pela
população imobilizada. Em seguida, os produtos formados
difundem-se através do gel e se acumulam no meio de cultura.
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Métodos de imobilização: Envolvimento

Os materiais mais usados para produção das partículas de gel
são: Agar, k-carragena, alginato e pectina

A gelificação do Agar ocorre com a diminuição da T°C, e para os

outros através da ação de cátions mono e bivalentes, como K+
ou Ca2+

A principal vantagem desta técnica é a limitação imposta pela

difusão intraparticula de substrato e produtos metabolitos

O tamanho da partícula, a difusibilidade das espécies através

da matriz polimérica e a concentração celular na partícula
devem ser otimizadas, no sentido de se minimizar esses efeitos.

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Métodos de imobilização: Envolvimento

Imobilização de células por envolvimento em gel hidrofilico induzida por Ca2+ e K+

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Tipos de biorreatores empregados

« A maior parte dos biorreatores
estudados para sistemas com
células imobilizadas, constituem-
se de colunas operadas
continuamente; contendo um
leito fixo ou fluidizado das
particulas com as células
imobilizadas. »

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Tipos de biorreatores empregados: Leito fixo

• Utiliza-se 3 tipos de disposição do biorreator:
– Leito fixo vertical (a)
– Leito fixo horizontal (b)
– Leito fixo de fluxo paralelo (c)

Desvantagem:
- Dificuldade de controle de processo (pH, oxigênio dissolvido e temperatura),
- Dificuldade de remoção de biomassa e de CO2 produzido pelo processo 26

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Tipos de biorreatores empregados: Leito fluidizado

Leito expandido
Constitui-se de uma coluna vertical de seção
circular onde as partícula e células completam
até 70% do volume util.
Fluidização ou expansão:
Introdução na base da coluna de ar atmosférico ou de
um gás inerte (N2 ou CO2) (b)
Reciclo parcial do efluente da coluna (a)
Movimentação interna do fluido promovida por
agitação mecânica (c)
Eventualmente pelo próprio CO2 formado no processo
Vantagens em relação ao leito fixo:
Facilidade de remoção de gases
Facilidade de retirada do excesso de biomassa
Controle de variáveis do processo facilmente
contornáveis 27

Processos que utilizam células imobilizadas

Iniciou-se com a fermentação acética a partir do vinho, que circulava
através de um leito fixo formado de suporte, o qual abrigava uma
população nativa de microrganismos acidogênicos;

Imobilização de microrganismos em gel hidrofílico de alginato de cálcio.

Aplicações:
Produção de etanol

Produção de antibióticos

Tratamento de resíduos

Produção de metabolitos utilizando células animais

Utilização de microrganismos geneticamente modificados

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Reatores com enzimas imoblizadas

• Exemplos de enzimas industriais
ENZIMA INDUSTRIA USO
α-amilase Panificação Redução da viscosidade da massa; acelerar o
crescimento da massa
Cervejaria Liquefação do amido
Papel Produção de gomas
Têxtil Remoção de gomas de amido
Glicoamilase Açucareira Produção de xaropes de glicose
Proteases Lavanderia Incorporação de detergente
Curtume Curtir e depilar o couro
Alimenticia Fabricação de queijos, amaciamento de carnes
Penicilina-amidase Farmacêutica Produção de antibioticos
Pectinases Alimenticia Clarificação de sucos
Papaina Alimentícia Evita turbidez da cerveja
Glicose isomerase Alimentícia Produção de xaropes de frutose
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Reatores com enzimas imoblizadas

Tipos:
Reator de batelada
Usada em processos onde, terminada a reação, a enzima imobilizada
pode ser separada da mistura final com relativa facilidade (filtração,
decantação, etc.)
Reator agitado continuo
Entrada e saída continua de fluido que eventualmente uma certa
quantidade de enzima pode ser arrastada pelo efluente, devendo acoplar
um sistema que permita recuperá-la (filtração, centrifugação, etc.)
Reator de leito fixo
Semelhante ao células imobilizadas
Reator de leito fluidizado
Semelhante ao células imobilizadas 30

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Reatores com enzimas imoblizadas

Fatores a considerar na escolha do reator:
Uso e custo do reator
Deve-se observar o custo de mão-de-obra, a possibilidade de automação e
a constância das condições de reação.
Reutilização da enzima
A reutilização dependerá de ordem técnica e de custo, as enzimas de
maneira geral são instáveis para uso prolongado em reatores.
– Relação custo do catalisador/custo total do processo
Requisitos operacionais
Os requisitos operacionais do processo podem limitar a escolha do reator
A maioria das reações bioquímicas requer controles de temperatura e pH.

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Reatores com enzimas imoblizadas

Exemplos de processos enzimáticos:
Isomerização da glicose (transformada em frutose pela
glicoseisomerase)

Hidrolise da lactose (produz glicose e galactose pela ação da β-

galactosidase, também chamada de lactase)

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