Licenta Finala Cais Horticultura

UNIVERSITATEA DIN ORADEA
FACULTATEA DE PROTECȚIA MEDIULUI

SPECIALIZAREA: HORTICULTURĂ
LICENȚĂ
ORADEA,
2019
1
UNIVERSITATEA DIN ORADEA
FACULTATEA DE PROTECȚIA MEDIULUI
SPECIALIZAREA: HORTICULTURĂ
Cercetări privind studii de fenotipaj pentru screeningul unor

descendente hibride în urma infecțiilor cu Plum-Pox Virus
(PPV) la cais
ORADEA,
2019
2
CUPRINS
CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII ÎN DOMENIUL TEMEI ABORDATE . 5
1.1 Caisul – caracterizare generală ...................................................................................................... 5
1.1.1 Importanța economică și valoarea alimentară a caiselor ....................................................... 6
1.1.2. Originea si aria de raspandire a caisului ................................................................................ 8
1.1.3. Particularități de creștere și fructificare ............................................................................... 10
1.2. Descrierea principalelor boli virotice ale caisului ....................................................................... 12
1.2.1. Apoplexia sâmburoasă ........................................................................................................ 12
1.2.2. Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila) ........................................................................... 13
1.3 Originea și răspândirea virusului ................................................................................................. 14
1.4. Principalele trăsături ale plum pox-ului ....................................................................................... 16
1.4.1 Gazde naturale ale virusului ................................................................................................ 16
1.4.2 Patologia virusului Plum pox .............................................................................................. 17
1.4.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox ........................................................................ 18
1.5. Identificarea și caracterizarea principalelor virusuri la cais ........................................................ 19
1.5.1. Metode de identificare a virusurilor .................................................................................... 20
1.5.1.1. Testul de floculare ............................................................................................................... 21
1.5.1.2. Testul ELISA........................................................................................................................ 21
1.5.2. PCR (Polymerase chain reaction)........................................................................................ 23
1.5.3. Alte virusuri ale caisului....................................................................................................... 23
CAPITOLUL II CONTRIBUŢII PROPRII ............................................... Error! Bookmark not defined.
2.1 Justificarea temei .......................................................................................................................... 26
2.2. Obiectivele cercetărilor ................................................................................................................ 27
2.3 Material şi metodă .........................................................................................................................27
2.3.1. Materialul biologic folosit pentru specia cais (Armeniaca vulgaris) ................................... 27
3
2.3.2. Material viral ....................................................................................................................... 30
2.3.3. Metodele de cercetare abordate pentru specia cais.............................................................. 30
2.3.3.1 Testul imunoenzimatic ELISA ........................................................................................... 32
2.3.3.2 Determinări moleculare -Testul PCR (tehnica de amplificare genetică) ........................... 35
2.4 Rezultate obţinute........................................................................................................................ 38
2.5 Concluzii şi recomandări ............................................................................................................. 50
BIBLIOGRAFIE ....................................................................................................................................... 52
4
CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII ÎN DOMENIUL
TEMEI ABORDATE
1.1 Caisul – caracterizare generală

Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole
sâmburoase. Acest fapt se datorează scăderii calităţii fructelor şi pierderilor cauzate de căderile
premature ale acestora (Nemeth, 1994). Virusul este prezent în livezile din Europa, fiind semnalat
cu 20-30 ani în urmă. Pierderi importante s-au semnalat în special în estul şi sud-estul Europei.
Boala s-a semnalat şi în Turcia, Cipru şi Siria. În Polonia şi Grecia pierderile înregistrate de acest
virus sunt de peste 7o%, în Jugoslavia de 15 milioane de pomi, în Bulgaria peste 80%. În ţările
unde viroza este răspândită, exportul de ramuri altoi şi portaltoi este interzisă.
În România, acest virus este răspândit în toate arealele de cultură ale fructelor samburoase
şi provoacă pierderi masive de producţie. Motivaţia alegerii acestei teme s-a datorat faptului că în
ţara noastră la momentul începerii cerecetărilor nu era cunoscută distribuţia tulpinilor virusului
Plum pox în România, ţara noastră fiind printre puţinele ţări europene care nu avea o strategie de
eradicare sau limitare a impactului acestui virus. O astfel de strategie nu poate fi realizată fără a
cunoaşte gradul de răspândire a PPV-ului şi distribuţia tulpinilor acestuia.1
Plum pox, cunoscuta si sub denumirea de Sharka, este cea mai devastatoare boala virala a
fructelor samburoase din genul Prunus. Boala este cauzata de virusul Plum Pox ( PPV ), cat si de
tulpini derivate ale acestuia, care pot infecta o mare varietate de specii de fructe samburoase, cum
ar fi : caisul, piersicul, prunul, nectarinul, cat si ciresul. Speciile ornamentale si salbatice ale
genului Prunus pot fi, deasemenea, infectate de tulpinile acestui virus.
Până în prezent au fost identificate şi caracterizate serologic şi molecular şapte tulpini de
PPV: Suşa D (dideron) izolată pentru prima dată la cais în sud-estul Franţei; Suşa M (marcus)
identificată la piersic în nordul Greciei (Kerlan şi Dunez, 1979; Myrta şi colab., 1998); Suşa Ea
(el amar) descrisă în Egipt la cais (Wetzel şi colab., 1991a); Suşa SoC (sour cherry) detectată în
Republica Moldova (Kalashyan şi colab., 1993); Suşa SwC (sweet cherry) identificată în Italia
(Crescenzi şi colab., 1996); Suşa PPV-Rec rezultată din recombinarea celor două tulpini majore
1
Myrta A, Di Terlizzi B, Boscia D, Caglayan K, Gavriel I, Ghanem G, Varveri C, Savino V 1998, Detection and
serotyping of Mediterranean plum pox virus isolates by means of strain-specific monoclonal antibodies.
ActaVirologica. English Ed. 42, 251–254.
5
(M şi D), fiind descoperită în Albania, Bulgaria, Cehia, Germania şi Slovacia (Glasa şi colab.,
2004).Suşa PPV-W(Winona) a fost identificată în Canada (James şi Varga, 2004a).
Recombinarea joacă un rol important în evoluţia ribovirusurilor, determinând apariţia unor suşe
noi cu efecte nepredictibile asupra patogenităţii (Worobey şi Holmes,1999). Recombinarea
naturală dintre tulpinile PPV-D şi PPV-M a constituit apariţia unei noi tulpini virale, numită
PPV-Rec, ce a fost raportată prima dată de Glasa şi colab. (2002 ).
Primele cercetări din România privind identificarea şi diferenţierea tulpinilor virusului
Plum pox, prin tehnici moleculare şi serologice au fost realizate la Staţiunea de Cercetare
Dezvoltare Pomicolă Bistriţa (SCDP Bistriţa) (Zagrai şi colab., 2005a).
Caracterizările serologice şi moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV) efectuate de
către cercetătorii din Europa Occidentală au permis stabilirea apartenenţei acestora la diferite
tulpini virale, dar şi la identificatea unor forme recombinate.
Sursa:www.pomifructiferi.com
Fig.11., fig. 1.2 Caise atacate de Plum Pox
1.1.1 Importanța economică și valoarea alimentară a caiselor

Insusirile calitative si tehnologice ale fructelor situeaza caisul printre speciile pomicole
foarte mult apreciate de catre consumatori.
Fig.1.3., fig. 1.4 Caise
6
Caisele sunt foarte căutate de consumatori, atât ca fructe de desert cât şi prelucrate în
diverse moduri. Cererea mare de fructe este determinată de însuşirile lor calitative şi tehnologice,
compoziţia biochimică complexă şi gustul foarte plăcut, aroma specifică, etc.2
Este recomandat consumul de fruct proaspat datorita continutului ridicat in zaharuri,
saruri minerale (Mg, P, Fe, Ca, K, S, Na, Mn, Fl, Co, Br), vitamine si acizi, compozitie care le
confera o mare valoare alimentara.
Compozitia chimica a fructelor difera in functie de soi, iar limitele de variatie determinate
sunt prezentate in Tabelul 1.a.
După cum reiese din datele de mai jos, prin compoziţia biochimică caisele asigură
organismului uman toate componentele de care are nevoie pentru efectul lor favorabil în digestie,
datorat reacţiei alcaline, în producerea hemoglobinei, în anemie, etc. Valoarea alimentară ridicată
a caiselor şi a produselor finite pe bază de caise, au determinat specialişti din domeniul cercetării
ştiinţifice să diversifice mult sortimentul, prin cearea sau introducerea în cultură a unor soiuri
care să se comporte bine în condiţiile climatice din România.
Tabel 1.a.
Limitele de variatie ale unor componente chimice din fructele de cais
Elementul determinat Limitele de variatie
Apa 78,3 – 89,4 g %
Substanta uscata 10,60-21,71 g %
Zahar total 6,00-15,68 g %
Aciditate totala 0,34-2,61 g %
Pectine 0,55-1,10 g %
Proteina bruta 1,09-1,64 g %
Substante tanoide 0,017-0,303 g %
Substante minerale din care: 0,60-0,86 g %
Potasiu 75,4-112,0 mg %
Fosfor 21,3-32,0 mg %
Calciu 6,6-16,4 mg %
Vitamina A 0,41-3,20 mg %
Vitamina C 0,8-27,0 mg %
Vitamina P 35,0-38,0 mg %
Vitamina E 0,72-1,80 mg %
2
Mircetich S., 1982, Phytophtora root and crown of apricot trees. Acta Horticulturae
7
Finetea pulpei, aroma specifica, raportul armonios intre continutul in zahar si aciditate
precum si continutul bogat in substante pectice sunt cateva insusiri care fac din caise, fructe
foarte apreciate pentru industrializare.
Caisele sunt prelucrate sub forma de compot, gem, dulceata, peltea, marmelada, sucuri
sau nectar. Pot fi prelucrate de asemenea sub forma de bauturi nealcoolizate, ca suc sau nectar,
sau alcoolizate sub forma de distilat si lichior.
Sunt foarte apreciate atat pe piata interna,cat si la export sub forma de fructe uscate, iar
pentru multe popoare din zonele cu climat rece fructele de cais sunt considerate delicatese.
Samburii de caise sunt foarte bogati in substante nutritive, continand 29,5-57,7% grasimi;
28% substante pectice si 3,1% saruri minerale si se folosesc in cofetarie, alaturi de migdale sau in
industrie, ca materie prima pentru extragerea unor uleiuri industriale.
Din punct de vedere tehnologic, caisul este apreciat de cultivatori deoarece pomii intră
repede pe rod şi au o mare capacitate de producţie.
Capacitatea de adaptare redusă la anumite condiţii de mediu, diferite de cele în care s-au
format soiurile şi mai ales slaba rezistenţă la îngheţul de revenire, împiedică extinderea în masă a
acestei specii. Prin alegerea judicioasă a soiurilor şi a zonei de cultură, caisul se poate cultiva cu
succes în partea de sud şi vest a ţării.
Caisul este o specie de mare valoare pentru zonele în care se poate cultiva, dar în ultimii
ani a înregistrat un regres datorat instabilităţii recoltelor, afectate sever de condiţiile anormale din
timpul iernii şi mai ales de gerul de revenire.Endocarpul este utilizat in industria chimica pentru
prepararea tusului si a carbunelui active, iar lemnul de cais se foloseste pentru confectionarea
obiectelor de artizanat.Astfel, caisul este o specie cu largi utilizari in industrie si alimentatie.
1.1.2. Originea si aria de raspandire a caisului
Fig.1.5., fig.1. 6 Cais Prunus armeniaca L.
8
Caisul comun (Prunus armeniaca L., Armeniaca vulgaris Lam, Prunus armeniaca var.
typica Max) apartine familiei Rosaceae Juss, subfamilia Prunoideae Focke, genul Armeniaca
Juss. Dovezi certe privind timpul si locul unde caisul a fost luat in cultura nu exista, dar dupa
Bretschneider, caisul era cultivat in China in jurul anului 3000 i.e.n., iar in anul 2000 i.e.n. pe
vremea imparatului Shi-iu, caisele erau fructele cele mai apreciate.
In urma sapaturilor arheologice din valea Fergana s-au gasit samburi cu o vechime de
7000 – 8000 ani, fapt ce l-a determinat pe N.V. Kovalev (1963) sa afirme ca aceasta specie este
luata in cultura din timpuri stravechi.
În prezent, caisul se cultivă mult în emisfera nordică, unde se şi produce peste 90% din
producţia mondială de caise. Cele mai mari producţii de caise se obţin în Europa, Asia, America
Centrală şi de Nord şi mai puţin în Africa, Oceania şi America de Sud (Tabelul 1.b).Dintre
marile ţări producătoare de caise se pot aminti: Ex. U.R.S.S., Italia, Spania, Grecia, Franţa,
Maroc, etc. (Tabelul 1.c)
Buletin FAO, 1999

Ţara 1997 1998 1999
SUA 549000 393000 627000
Spania 388851 202600 272800
Italia 104678 87958 87958
Maroc 86800 65700 40000
Tunisia 51000 58700 60000
Iran 74396 111992 111992
Grecia 43224 34763 34763

Sursa: www.faostat.com
Dupa datele FAO, in 2000 productia de caise pe plan mondial a fost de 2511000 tone; in
Europa producandu-se 45% din aceasta, urmata de Asia cu 32%. Cea mai mare productie de caise
provine din Turcia cu 427000 tone, Italia cu 161000 tone, Spania cu 148000 tone, Franta cu
142000 tone, S.U.A cu 86000 tone, Grecia cu 62000 tone.
În România, cultura caisului este zonată în principal în partea de sud a ţării. Producţia de
caise şa nivelul anului 1997 a fost de circa 27,6 mii tone, din care peste 77% (21.384 t) a fost
9
obţinută din sectorul particular. Judeţele cu producţie mai mare de caise sunt: Constanţa, Galaţi,
Călăraşi, Teleorman, Prahova, Giurgiu, Ialomiţa (Tabelul 1.d).
Pierderea mugurilor de rod sau de flori din cauza inghetului de revenire, face ca productia
de caise sa fie foarte instabila in timp. Dacă în anul 1986, producţia era de 60 mii tone şi în 1987
de 54 mii tone, aceasta scade continuu până în anul 1990 când se realizează numai 28 mii tone.
Alte motive care au afectat productia dupa anii 1990, au fost reprezentate de desfrisarea
unor suprafete de teren, cat si de agrotehnica deficitara in unele livezi. Astfel ca in present se
realizeaza o medie de circa 25-27 mii tone anual.
Tabel 1.d
Producţia de caise şi defalcarea pe principalele judeţe (t)
Judeţul Producţia totală d.c.: în sectorul particular
t % t %
Total d.c.: 27623 100 21384 100
Galaţi 2524 9,1 2143 10
Constanţa 2304 8,3 824 3,8
Călăraşi 2229 8,0 1964 9,1
Ialomiţa 1834 6,6 1536 7,1
Olt 1363 4,9 801 3,7
Teleorman 1377 4,9 961 4,9
Dolj 1289 4,6 897 4,2
Dâmboviţa 1291 4,6 1149 5,4
Brăila 1260 4,5 909 4,2
Tulcea 1260 4,5 539 2,5
Ilfov 1129 4,0 719 3,3
Sursa: Anuarul Statistic al României, 1998
1.1.3. Particularități de creștere și fructificare

Creşterea şi ramificarea sistemului radicular este dependentă de portaltoi. Altoit pe zarzăr
(caisul sălbatic), îşi dezvoltă un sistem radicular foarte ramificat şi bine ancorat; pe prun
rădăcinile sunt mai puţin ramificate dar mai profunde, iar pe corcoduş, sistemul radicular este mai
superficial.
10
Partea aeriană are un ritm intens de creştere în tinereţe, formând ramuri de peste un metru,
cu 2-3 valuri pe perioada de vegetaţie. După intrarea pe rod, ritmul de creştere se reduce,
ajungând ca în peroiada de maximă producţie, coroanele să rămână la aceleaşi dimensiuni. Din
perioada de maximă producţie, începe procesul de uscare a ramurilor de rod şi uneori a
semischeletului, din partea inferioară a coroanei, proces care, dacă nu este bine controlat prin
tăieri, duce la degarnisirea coroanei şi scăderea potenţialului de producţie.
Caracteristice caisului, sunt arcadele care apar pe ramurile de schelet şi chiar semischelet
sub greutatea rodului, formând creşteri viguroase în punctele de maximă curbură. Aceste arcade
se întinereasc prin transferarea creşerii pe ramurile tinere din zona curburii, menţinând astfel
potenţialul ridicat de producţie a ramurii respective. Ramurile de rod caracteristice sunt cele
lungi, mijlocii ramificate şi anticipate, în special la pomii tineri, ceva mai târziu, fructificarea se
mută pe ramurile mijlocii şi pe buchete. În funcţie de cantitatea de lumină de care dispun pomii,
ramurile anuale au o viaţă mai mare sau mai mică. De obicei, buchetele trăiesc puţin, 2-4 ani, în
lipsa luminii, uneori se usucă în anul formării. Ramurile mijloci ramificate de vigoare slabă, se
usucă destul de repede dacă, nu se corelează distanţa dintre pomi cu vigoarea acestora sau dacă
orientarea rândurilor nu se face pe direcţia nord-sud. Printr-o agrotehnică corespunzătoare, caisul
poate fructifica 20-25 de ani.
Caisul este o specie cu o mare fertilitate, în sensul că, diferenţiază un număr foarte mare
de muguri de rod, atât pe ramurile lungi, cât şi pe cele scurte şi anticipate. Formarea eşalonată a
mugurilor pe aceste ramuri determină şi o diferenţiere eşalonată a lor, ceea ce are avantaje pentru
cultivator în primăverile mai dificile, când apar îngheţuri de revenire.
Un alt aspect cu implicaţii negative asupra producţiei îl constituie lungimea perioadei
repausului profund. În urma cercetărilor, s-a constatat că, repausul profund la cais se încheie la
sfârşitul lunii decembrie, şi după această dată, dacă condiţiile climatice permit, caisul este apt de
a porni în vegetaţie. Aşa se întâmplă în ferestrele de iarnă, (perioadă cu temperature peste pragul
biologic) când după 7-8 zile calde caisul începe să-şi hidrateze mugurii, rezistenţa la iernare
scade foarte mult şi la revenirea frigului degeră mugurii de rod. De obicei, umflarea mugurilor de
rod are loc după acumularea a 40°C peste pragul biologic (6°C) şi calendaristic, în anii normali
procesul se realizează în a doua şi a treia decadă a lunii martie.
Înflorirea caisului are loc după acumularea a circa 170-200°C temperatură activă.
Majoritatea soiurilor existente în cultură, sunt autofertile, deci nu există probleme legate de
11
asigurarea polenizării. Plantatea mai multor soiuri în parcelă are drept scop eşalonarea recoltării
fructelor, care sunt perisabile şi se maturează simultan. Dacă se plantează suprafeţe mari cu un
soi, este greu de recoltat în 5-7 zile, zeci sau sute de tone, iar fructele mature cad din pom şi se
depreciază.
Capacitatea de producţie a caisului este mare, începe să fructifice din anul 3-4 de la
plantare şi recolte economice se realizează din anul 5-6. Longevitatea plantaţiilor este de 20-25
de ani din care 15-20 de producţie. Altoit pe prun şi amplasat în zone foarte favorabile, produce
economic chiar până la 30 de ani.
1.2. Descrierea principalelor boli virotice ale caisului

1.2.1. Apoplexia sâmburoasă
Raspandire. Este o boala destul de frecventa la cais si alte samburoase, care produce
pagube de importanta economica foarte mare.
Simptome. Frunzele de cais de la baza lastarilor se rasucesc in forma de linura si se
clorozeaza. Celelalte Frunze aparute mai tarziu sunt deformate, cu marginile zdrentuite, groase
casante, asemanatoare cu frunzele de salcie. Pomi atacati au lastari scurti, subtiri, ramificati
anormal. Liberul se necrozeaza si ramurile ingheata in timpul iernii. Temperaturile ridicate din
timpul verii duc la mascarea simptomelor de atac. Uscarea brusca, apoplexia, survine in cateva
zile si are loc de regula in iulie-august pet imp secetos si foarte calduros. Pomii atacati drajoneaza
puternic. Cei mai atacati sunt pomii de 5-12 ani. Cauzele care duc la pieirea premature a caisului
sunt de natura parazitara si neparazitara.
Agentul fitopatogen si biologia acestuia. Principalii agesti fitopatogeni implicate in
pieirea prematura a caisului : mycoplasma, virusurile, B. spongiosus, Fusarium sp., Verticillium
dahliae. Agentii patogeni de predispozitie la apoplexie sunt : Minilinia cinerea, Coryneum
beijerinchii, Xanthomonas pruni. Factorii de natura neparazitara : temperaturile prea scazute din
timpul iernii si oscilatiile de temperature dintre zi si noapte care debiliteaza pomii, ingheturile
tarzii de primavera si timpurii de toamna, verile reci si ploioase, altoirea caisului pe portaltoi
nepotriviti (incompatibili), sunt altecauze care condul la aceasta pieire premature a caisului.
Combaterea. Se recomanda cultivarea caisului in zone cu climat mai dulce, ierni mai
blande, soare mult, fara oscilatii mari de temperatura. Terenurile sa fie scurse, drenate, usoare.
Caisul se va altoi pe portaltoi compatibili, rezistenti la intemperii. Se va evita supraproductia care
12
epuizeaza pomii si ii predispun atacului parazitilor. Se mai recomanda combaterea agentilor
fitopatogeni de predispozitie, infiintarea plantatilor cu pomii liberi de viroze si mycoplasma,
combaterea insectelor si a buruienilor gazda pentru unii agenti fitopatogeni. 3
Sursa:www.hortaltoi.ro
Fig.1.7 Apoplexia sâmburoasă
1.2.2. Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila)

Raspandire. Boala prezinta importanta economica deosebita prin faptul ca ataca puternic
fructele, reduce productia, ciuruieste frunzele si slabeste pomii.
Simptome. Ciuperca ataca frunzele si fructele si in mai mica masura lastarii si ramurile.
Pe Frunze apar numeroase pete circulare, brune cu margini violacee, cu diametrul de 3-5 mm,
care se ususca si cu timpul se desprind si cad, frunzele ramanand ciuruite. Pomii atacati se
desfrunzesc timpuriu si se debiliteaza. Fructele sunt atacate foarte de timpuriu, de cand au
marimea unei alune. Pe suprafata lor apar la inceput pete punctiforme, brun-roscate care se
maresc cu timpul, contopindu-se, pielita prezinta denivelari, apoi crapa. Fructele se deformeaza,
sunt fade la gust, au concentratia in zahar redusa si cad in masa de timpuriu.
Atacul pe ramurile tinere se manifesta prin aparitia unor pete ceroase, brun-roscate, putin
cufundate in tesut. In urma atacului seva este brusc oprita din circulatie, ceea ce duce la vestejirea
varfurilor la lastarii tineri, iar buchetele florale se usuca. Scoarta moarta este acoperita de gome
cleioase. Daca uscarea nu se produce in cursul perioadei de vegetatie, aceasta se va face cu
siguranta in timpul iernii datorita diminuarii rezistentei la ger.
3
Ioan Roşca, Rada Istrate, 2001, Prognoză, avertizare şi carantină fitoasanitară a dăunătorilor din agricultură.
Bucureşti.
13
Agentul patogen si biologia acestuia. Boala este produsa de ciuperca Ascospora
beijerinckii. Ciuperca ierneaza sub forma de miceliu si conidia in ramurile atacate. Miceliul este
format din hife cilindrice, brune, articulare, cufundate in tesuturile atacate. Pe hifele de sub
epiderna scoartei se formeaza conidioforii cu conidiile care sunt puse in libertate prin ruperea
epidermei. Conidioforii sunt simpli, incolori sau bruni, filamentosi, septati. Conidiile sunt ovoidal
– cilindrice, incolore, neseptate la inceput,apoi galben-brune.
Combatere. Pentru combaterea bolii sunt obligatorii operatiunile de igiena culturala, de
indepartare a organelor afectate, precum si tratamente fitosanitare cu produse de protectie a
plantelor omologate in urmatoarele faze de vegetatie : in perioada de repaus vegetative, la
umflarea mugurilor, etc.
Fig.1.8 Stigmina carpophila
1.3 Originea și răspândirea virusului

Virusul Plum Pox Potyvirus (PPV), face parte din familia Potyviridae, fiind considerat
pentru mult timp ca singurul virus din aceasta familie care infecteaza speciile pomicole
samburoase.
Denumită şi Sharka, simptomele bolii au fost pentru prima dată evidenţiate în Bulgaria
între anii 1915-1918, la sfârşitul Primului Război Mondial (Atanasoff,1932). Însă au existat unele
rapoarte ce indicau prezenţa simptomelor bolii în Macedonia, în anul 1910. Acest virus distruge
fructele pomilor infectati in asa masura, incat acestea nu mai pot fi folosite nici in consumul
current, nici in industria prelucrarii fructelor.
Virusul Plum pox este cel mai distuctiv agent patogen viral al speciilor pomicole
sâmburoase, producând grave pierderi de producţie mai ales soiurilor sensibile, care pot fi
calamitate în proporţie de 100%.
14
Este de retinut faptul ca primul articol despre descrierea acestui virus a aparut abia in anul
1932 numit de catre Atanosoff,,Sarka po slivite’’, adica ,,Pox of Plum’’.
Christoff a observant Sharka afectand caisele in Bulgaria in 1933, iar la inceputul anilor
1960 s-a raportat prezenta virusului in Ungaria. Se constata ca intre perioada anilor 1932-1960
boala s-a mutat la nord si la est de Bulgaria in : Iugoslavia, ungaria, Romania, Albania,
Cehoslovacia, Germania si Rusia. Boala a fost observata mai ales in prune si caise.
În ultimii 10 ani virusul s-a răspândit în ţările mediteranene, cum ar fi: Spania (Llacer şi
colab., 1985), Portugalia (Lourno şi Monte Corvo, 1986) şi Egipt (Wetzel şi colab., 1991a). De
asemenea prezenţa virusului a fost raportată în India (Thakur şi colab., 1994), Chile (Roy şi
Smith, 1994), SUA (Levy şi colab, 2000) şi Canada (James şi colab, 2003).
După cel de-al Doilea Război Mondial Sharka a progresat spre vestul Europei, ajungând
în Germania şi Austria în anul 1950. La mijlocul anilor’60 prezenţa virusului a fost semnalată în
Olanda, Elveţia, Grecia, Anglia şi Turcia; mijlocul anilor’70 în Franţa, Italia şi Belgia; mijlocul
anilor’80 în Spania şi Portugalia; sfârşitul anilor’80 în Egipt, Siria, Cipru. Levy şi colab (2000)
ne prezintă un tablou al răspândirii plum pox-ului ce arată astfel:
 răspândire limitată: Albania, Austria, Cipru, Cehia, Franţa, Luxembourg, Italia,
Moldova, Norvegia, Slovenia, Spania, Turcia, Ucraina, Anglia, SUA.
 răspândire largă: Germania, Grecia, Bulgaria, Ungaria, Polonia, România,
Slovacia, ex-Iugoslavia
 prezent, probabil eradicat: Suedia, Olanda, Belgia
 prezent, dar neextins: Lituania, India, Egipt, Bosnia-Herţegovina
 statutul recent necunoscut: Danemarca şi Chile
Cele mai noi date globale în ceea ce priveşte diferenţirea şi distrubuţia izolatelor din
România (regiunile Transilvania, Moldova şi Muntenia) arată o răspândire foarte largă a tulpinii
PPV-D, cu o rată medie de 74% pe cele trei regiuni. Cu o frecvenţă medie sunt tulpinile PPV-
REC (12,6%), urmată de infecţiile mixte (PPV-D+ rec), cu 13,3%.
Raspandirea acestui virus a dus la infintarea in 1970 a unei Grup Internationat de
Cercetare, care impreuna cu Organizatia Europeana si Mediteraneana Pentru Protectia Plantelor
(OEPP/EPPO) coordoneaza cercetarea si schimbul de informatii intre tari.
15
Plum pox este o problemă serioasă la nivel mondial, cu un impact sever asupra
productivităţii şi calităţii fructelor din specia Prunus (PPV), un virus împotriva căruia nu este
disponibil nici un fel de tratament curativ chimic sau biologic. Soluţia actuală pe termen scurt
este de eradicare a pomilor infectaţi şi plantarea de material liber de viroze.
Intre anii 2007-2013 a debutat un proiect cofinantat de UE numit SharCo pentru

cercetarea epidemiologiei PPV. La acest proiect au luat parte 17 institute de cercetare si
universitati din 12 tari europene, dintre care si Statiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru
Pomicultura Bistrita (SCDP Bistrita) din tara noastra.
SCDP Bistrita este una dintre cele mai importante staţiuni de cercetare implicate în
investigarea virusului Plum pox în România. Activitatea sa se concretizează pe impactul PPV
asupra productivităţii şi calităţii fructelor, caracterizarea tulpinilor şi epidemiologie. Misiunea
globală a parteneriatului între SCDP Bistriţa şi SharCo este de a obţine informaţii suplimentare
despre epidemiologia PPV în România şi dezvoltarea unor noi modalităţi de limitare a răspândirii
PPV.
1.4. Principalele trăsături ale plum pox-ului
1.4.1 Gazde naturale ale virusului

Speciile afectate de acest virus sunt cele din genul Prunus, cum ar fi: caisul
(P.armeniaca), piersicul (P.persica), prunul (P. Domestica şi P. Salicina). Migdalul şi ciresul pot
fi infectate cu acest virus, dar simptomele nu sunt foarte evidente (Festic, 1978; Kalashyan şi
colab, 1994).
Virusul a fost transmis artificial şi la cireşi şi vişini, dar infecţiile au rămas locale,
neexistând dovezi că s-ar fi răspândit (Dosba şi colab, 1987). Infecţii naturale la specia P.Cerasus
au fost raportate de Kalashyan şi colab. (1994), dar infecţia cu PPV a cireşelor este considerată
extrem de neobişnuită, fiind practic neintâlnită în cea mai mare parte a Europei.
Specii sălbatice şi ornamentale aparţinând genului Prunus pot servi ca a doua gazdă a
PPV şi pot avea impact asupra epidemiologiei şi controlului acestui virus (Polak, 1997). Astfel că
multe din speciile sălbatice ale genului Prunus sunt susceptibile: P.bessey, P.cerasifera,
P.insititia, P.tomentosa, P.spinosa, P.mahaleb, P.pumila, P.davidana, P.nigra, P.maritime,
P.americana .
16
Rezultatele obţinute în Iugoslavia infirmă faptul că speciile menţionate mai sus ar fi gazde
naturale ale virusului, dar s-a descoperit alt virus, virusul necrotic ring spot (Rankovic şi Dulic-
Markovic,1992). Practic toate speciile din genul Prunus cultivate în scop comercial în Europa
sunt afectate mai mult sau mai puţin de acest virus. Multe specii ce nu aparţin genului Prunus, ce
fac parte din noua familie de plante au fost infectate artificial cu una sau mai multe tulpini ale
virusului sau în unele cazuri s-au găsit plante infectate în mod natural. Multe dintre acestea sunt
plante ierboase anuale, câteva fiind perene sau lemnoase şi pot servi ca şi gazdă: Campanula
rapunculoides, Chenopodium quinoa, C. Species, Lamium album, L. Amplexicaule, L.
Purpureum, Lupinus albus, Lycium barbarum, L.Halimifolium, Medicago lupulina, Trifolium
dulcamara, T. pratense, T. repens, Zinnia elegans.
1.4.2 Patologia virusului Plum pox
Vărsatul prunului este produs de Prunus virus 7 Christoff şi aparţine grupei potyvirus,
având ca şi reprezentant virusul Y al cartofului. Criptograma virusului a fost stabilită de Kerlan şi
Dunez (1976) şi se prezintă astfel: R/1; 3,5/5,2; E/E; S/Ap. Din descifrarea criptogramei rezultă
că genomul viral este alcătuit din acid ribonucleic cu o singură spirală de nucleotide.
Dimensiunea genomului este de 10 kb iar la capătul 3` se află o regiune poly(A). În capătul 5` se
leagă cu legătură covalentă o proteină specifică.
Proteina răspunzătoare pentru proprietăţile serologice este proteina CP (Coat protein), ce
este implicată şi în răspândirea virusului prin afide. Greutatea moleculară a acidului nucleic este
de 3,5 x 106 daltoni şi constituie 5,2% din particula virală. Particulele virale se prezintă sub
formă alungită , cu lungime de 750nm şi diametru 15nm. Temperatura de inactivare a virusului
este de 550 °C, diluţia limită este de 10-3, iar longevitatea în suc de 35 de ore la temperatura de
200 °C şi de 5-7 zile la temperatura de 40 °C.
Perioada de incubaţie în livadă durează 9-10 luni la plantele lemnoase şi 1-2 luni în seră la
puieţi, iar la plantele ierboase 1-3 săptămâni. Viteza de răspândire în ţesuturi depinde de vârsta
pomilor, sensibilitatea ţesuturilor şi viteza de propagare în întreg pomul.
17
Fig.1.9 Plum pox
Spre exemplu, la soiul Vânăt de Italia în vârstă de 4 ani prin inoculare cu muguri infectaţi,
virusul a cuprins întreg pomul după 4-5 ani, iar la soiul Bistriţa în 1-2 ani.
Viteza de răspândire a virusului în livadă depinde de marimea sursei de infecţie şi de
prezenţa sa în interiorul său în afara plantaţiei.
1.4.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox
Fig.1.10 Frunze de cais atacate de virusul Plum pox
Plum pox este o boală foarte gravă deoarece produce simptome severe pe fructe, frunze,
sâmburi, uneori pe trunchi şi pe ramurile de schelet (Minoiu, 1997). Simptomele de PPV sunt
foarte evidente pe frunzele de primăvară ce se manifestă sub forma unor decolorări de culoare
18
verde deschis, pete clorotice, cercuri concentrice, deformări ale frunzelor. În unele cazuri se
constată o cădere prematură a fructelor bolnave.
Prezenţa sau intensitatea simptomelor variază în funcţie de specie şi soi, tulpina virală,
starea fitosanitară a gazdei cu privire la alţi viruşi, sezon şi locaţie. PPV influenţează într-o mică
măsură vigoarea şi longevitatea longevitatea şi pomilor infectaţi.
Nemeth (1986) descrie simptomele la unele soiuri de prun, chiar şi moartea unor pomi,
dar nu s-a putut confirma că simptomele au fost induse de PPV. Atanassoff (1932,1935) a descris
simptomele plum pox-ului la diferite specii ale genului Prunus.
OEPP/EPPO (1983), Nemeth (1986) au descris simptomele PPV la prunul european, cais
şi piersic. Llacer şi colab (1985), Llacer şi Cambra (1986) descriu simptomele PPV la prunul
japonez. Simptomele virusului prezent la vişin şi cireş au fost descrise de Crescenzi şi colab
(1997), Nemchinov şi colab (1998).
Infectarea cu acest virus poate duce la pierderi considerabile. Aproximativ 100 de
milioane de pomi aparţinând speciilor sâmburoase din Europa sunt infectate , la unele soiuri
sensibile pierderile pot fi de 80-100% (Kegler, 1998). În estul şi centrul Europei soiurile sensibile
de prune pot prezenta căderi premature ale fructelor şi fisuri pe suprafaţa lor.
Nemchinov şi colab (1998) descriu simptomele la cireş şi le prezintă astfel: pete circulare
de natură clorotică sau necrotică, căderi premature ale fructelor.
1.5. Identificarea și caracterizarea principalelor virusuri la cais

Identificarea virusurilor ghidandu-ne numai dupa simptome poate fi dificila pentru ca
unele virusuri sunt complexe avand smptopme similar, iar in alte cazuri infectiile nu produc
simptome evidente.
In cele mai multe cazuri, plantele sunt infectate cu doua sau mai multe virusuri, astfel ca
simptomele induse de un virus pot fi mascate de simptomele celorlalte virusuri. De aceea,
semnalarea prezenţei bolilor virale, identificarea şi caracterizarea virusurilor sau a anumitor
tulpini virale, depind în mare măsură nu numai de simptomatologia produsă, dar şi de aplicarea
unor tehnici adecvate.
19
1.5.1. Metode de identificare a virusurilor
Identificarea infecţiilor cu virusuri la plante prezintă importanţă teoretică, dar mai ales
practică. Pentru identificarea infecţiilor virotice se folosesc diferite metode din care amintesc :
 Inoculari mecanice
 Indexari pe plante lemnoase si ierboase
 Microscopia electronica
 Analiza serologica
 Analize ale acizilor nucleici.
Utilizarea indicatorilor erbacei si lemnosi pentru determinarea virusurilor, furnizeaza

informaţii importante cu privire la cele mai bune plante gazdă pentru multiplicarea virusului,
menţinerea unor izolate noi, purificarea virusului şi producerea de antiseruri. Dintre indicatorii
erbacei si lemnosi folositi mentionam :
Indicatori erbacei:
- Chenopodium quinoa - pentru PNRSV;
- Cucumis sativus - pentru PNRSV şi PDV.
Indicatori lemnoşi:
- Prunus persica (puieţi de GF 305 sau Elberta) - pentru PNRSV şi PDV;
- Prunus tomentosa (hibridul IR473xIR474) - pentru PNRSV, PDV şi PPV;
-Prunus serrulata (Shirofugen, Kwanzan)-pentru PNRSV şi PDV.
Datorită apariţiei a numeroase soiuri, cât şi diversificării tulpinilor din interiorul agenţilor
patogeni de tip viral, se impune abordarea de noi tehnici (ELISA, PCR, culturi in vitro), care să
permită atât identificarea rapidă a acestora, cât şi eliberarea de acest tip de agenţi infecţioşi.
Tehnicile serologice sunt foarte precise, dau rezultate rapide, sunt laborioase şi permit
efectuarea unui număr foarte mare de teste. Cele mai multe dintre ele au fost preluate din
medicina umană şi au fost adaptate pentru studiul virusurilor fitopatogene. Reacţia serologică are
la bază contactul dintre suspensia virală şi antiserul specific. Evidenţierea reacţiei specific dintre
20
antigen şi antiser se realizează prin diferite teste, precum testul de floculare, testul de difuzie în
gel, testul ELISA etc.
1.5.1.1. Testul de floculare
Când particulele virale interacţionează cu anticorpii specifici, în mediu lichid, formează
combinaţii care precipită. Aceste precipitate pot fi observate în tuburi (testul tub) sau în picături
plasate pe suprafeţe netede (testul de microprecipitare). Testul de microprecipitare se utilizează,
în principal, pentru diagnoza virusurilor alungite. De obicei, se foloseşte sucul plantei purificat
prin centrifugare şi aşezat în vase Petri, sub formă de picături.
1.5.1.2. Testul ELISA

Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este un test imunologic foarte
sensibil al cărui principiu se bazează pe interacţiunea antigen-anticorp. Această tehnică a fost
introdusă în virologia vegetală în anul 1976 (Clark şi Adams, 1977).
Spre deosebire de testele de difuzie în gel şi de floculare, ELISA permite detectarea
virusurilor care se găsesc în concentraţie foarte mică în plante şi chiar direct din vectorii lor.
Datorită sensibilităţii ridicate a testului, virusurile se pot evidenţia înaintea manifestării
simptomelor.
Testul ELISA utilizează o metodă de dozare imunoenzimatică de tip “double antibody
sandwich”(DAS), în care anticorpi specifici sunt cuplaţi direct cu o enzimă (fosfatază alcalină).
Antigenul (A) este capturat pe faza solidă, de către anticorpii (IgG) fixaţi anterior. În următoarea
etapă, 24 anticorpii cuplaţi cu fosfataza alcalină vin şi se leagă pe antigen. În final, hidroliza
substratului (p-nitrofenilfosfat) de către enzimă duce la obţinerea unei coloraţii galbene a cărei
intensitate poate fi măsurată fotometric prin citirea densităţii optice la 405 nm (valoarea
absorbţiei). Testul ELISA este folosit pentru detectarea a numeroase virusuri la plante (Clark şi
Adams, 1977; Flegg şi Clark, 1979 etc.).
Avantajele metodei ELISA sunt următoarele:
§ sensibilitate pentru detectarea unei cantităţi foarte mici de virus (o concentraţie a
antigenului de 1 -10 mg/ml);
§ viteză de reacţie mare (rezultate în 6-24 ore);
§ testare la scară mare a probelor (pot fi manipulate câteva sute de probe individual sau în
grup);
§ specificitate pentru diferenţierea serotipurilor;
21
§ este potrivită atât pentru virioni intacţi cât şi fragmentaţi cu morfologie sau
mărimi diferite;
§ oferă posibilitatea de a face măsurători cantitative;
§ posibilitatea automatizării şi standardizării testelor prin producerea de kit-uri comerciale
specifice fiecărui agent patogen;
§ costuri scăzute şi o durată de viaţă relativ lungă a reactivilor;
§ testul poate fi efectuat atât în suc crud cât şi în suspensie virală purificată;
§ tehnică economică cu un minim de dotare de bază.
Există câteva variante ale tehnicii, în funcţie de modul în care antigenul este morfologic
fixat. Pentru indexarea la scară largă a virusurilor, cea mai utilizată metodă şi cu bune rezultate,
este DAS - ELISA standard (directă) - sandwich dublu de anticorpi. Câteodată specificitatea
ridicată a metodei DAS - ELISA directă ridică probleme de aceea, este preferată ELISA indirectă
care se mai foloseşte şi pentru a stabili relaţiile serologice dintre virusuri (acelaşi conjugat poate
fi folosit pentru diferite virusuri sau tulpini virale).
1. DAS-ELISA directă
2. BiotinăDAS-ELISA
3. DAS - ELISA indirectă
4. DIBA
5. Imunofluorescenţă IFA
Dintre numeroasele variante ELISA utilizate pentru identificarea virusurilor la plante, cea
mai folosită metodă este double antibody sandwich (Clark şi Adams, 1977).
Tehnica ELISA a fost folosită de mulţi cercetători pentru detectarea a numeroase virusuri
la pomii fructiferi: Plum pox virus (Clark şi Adams, 1976, ş.a.), Prunus necrotic ring spot (Tresh
şi colab., 1977, ş.a.), prune dwarf (Casper, 1977, ş.a.).
În prezent, la noi în ţară, tehnica ELISA este utilizată pentru majoritatea virusurilor la
pomii fructiferi, în laboratoarele de la I.C.D.P. Piteşti-Mărăcineni şi la S.C.D.P. Vâlcea, Bistriţa
şi Băneasa.
Atât organele şi ţesuturile ce pot fi utilizate ca sursă de antigen, cât şi momentele optime
de prelevare a probelor diferă de la un virus la altul, în limite foarte largi (Maxim, Isac şi colab.,
2002).
22
1.5.2. PCR (Polymerase chain reaction)
O altă tehnică abordată pe plan mondial, iar în ultimul timp şi în ţara noastră, o constituie
utilizarea metodelor moleculare de evidenţiere a bolilor virotice şi a tulpinilor acestora la speciile
pomicole (RT-PCR, IC-RT-PCR).
Efectuarea testărilor moleculare pentru punerea în evidenţă a tulpinilor virale, necesită un
protocol special de lucru. PCR (Polymerase chain reaction) este o tehnică de foarte mare precizie
dar şi foarte costisitoare.
Această metodă a biologiei moleculare de identificare a ADN-ului sau ARN-ului este cea
mai precisă în identificarea tipului de tulpină virală.
Amplificarea unei scurte şi bine definite părţi a acidului nucleic, trebuie foarte bine
condusă pe baza unor primeri specifici care sunt reprezentaţi de secvenţe de nucleotide care
conţin bazele azotate specifice pentru tulpina virală respectivă.
Tehnica de amplificare genică sau PCR este o metodă extrem de sensibilă de evidenţiere a
acidului nucleic specific din probă. Secvenţa ţintă din acidul nucleic, care urmează a fi detectat,
se amplifică exponenţial prin reacţii în lanţ catalizate de ADN-polimeraza. 4 Tehnica are trei
etape:
§ denaturarea dublului helix, care va servi ca matriţă;
§ cuplarea primerului (primerannealing);
§ extensia lanţului catalizată de ADN-polimeraza (Maxim, Isac şi colab.,2002).
Cele trei etape se desfăşoară într-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler care permite
repetarea ciclică a fiecărei etape. Temperaturile la care se desfăşoară cele trei etape sunt diferite:
denaturarea la 90 - 95°C, cuplarea la 40 - 60°C, iar extensia la 70 - 75°C. După 20-30 de cicluri,
în care se amplifică secvenţa vizată, aceasta poate fi decelată prin una dintre metodele de
hibridare a acizilor nucleici (Maxim, Isac şi colab., 2002).
1.5.3. Alte virusuri ale caisului

Pe langa virusului Plum Pox descris intr-un capitol anterior, mai exista alte doua virusuri
cu incidenta economica majora care fac parte din grupa ILAR virus, si anume :
4
Revers, F., Le Gall, O., Candresse, T., Maule, A.J., 1999, New advances in understanding the molecular biology of
plant-potyvirus interactions.Mol.Plant-Microbe Interact. 12, 367–376.
23
Prunus Necrotic Ring Spot Virus (PNRSV) - face parte din grupa virusurilor ILAR
(Izometric Labil Ring Spot). Această grupă este caracterizată de particule izometrice cu
dimensiuni cuprinse între 22-24 mm. PNRSV a fost descris pentru prima dată în anul 1931. Este
întâlnit în special la prun şi este răspândit în întreaga lume.
Este prezent şi la piersic şi cais. Se manifestă în special pe frunze sub forma unor pete
gălbui-clorotice, sub formă de inele, cu centrul necrotic. Ţesuturile necrozate se desprind şi cad,
frunzele rămânând ciuruite şi cu aspect clorotic. Creşterea pomilor poate să nu fie afectată, însă
producţia poate să scadă cu 15-45% la soiurile sensibile.
La acest virus se întâlnesc două tulpini care pot produce pătarea inelară sau declinul
pomilor. Poate fi transmis prin inoculări mecanice, prin sămânţă sau prin polen.
Sursa: http://en.wikipedia.org/wiki/Prunus_necrotic_ringspot_vir
Fig.1.11 Clasificarea virusului
Prune Dwarf Virus (PDV) - face parte, de asemenea, din grupa virusurilor ILAR
(Izometric Labil Ring Spot). Această grupă este caracterizată de particule izometrice cu
dimensiuni cuprinse între 22-24 nm. Este larg răspândit în lume iar la noi în ţară se întâlneşte
frecvent în plantaţii şi pepiniere.
Sursa: http://en.wikipedia.org/wiki/Prune_dwarf_virus
Fig.1.12.Clasificarea virusului
24
Simptomele produse pe frunze sunt următoarele: pomul infectat are frunze înguste, mici,
cu limbul foliar îngroşat, uneori cu numeroase pete galbene dispuse neregulat. De asemenea,
creşterea pomilor şi a lăstarilor infectaţi este redusă, în pepiniere pomii infectaţi având jumătate
din înălţimea normală. Poate fi transmis prin inoculări mecanice, prin sămânţă sau prin polen.
25
CAPITOLUL II
STUDIU DE CAZ
2.1 Justificarea temei

În prezent, când sortimentul este în continuă schimbare, studierea modului de comportare
a unor soiuri valoroase din sortimentul mondial şi naţional este de foarte mare actualitate.
Pentru a păstra linia obiectivului general al prezentei lucrări și anume rezistența genetică
naturală la boli, unde în cazul de față se referă la rezistența la Plum pox virus, la specia măr ne-
am propus obținerea de descendențe hibride prin folosirea în procesul de polenizare a unor
genotipuri cu rezistență genetică naturală la shanka și evaluarea acestora prin tehnici moleculare.
Studiile în condiții de infecție artificială a acestor hibrizi rezistenţi la boli și corelarea acestor
manifestări fenotipice cu rezultatele genotipice constituie un prim pas în acest nou program de
ameliorare bazat pe selecția asistată cu Markeri moleculari (MAS).
Pe plan mondial tot mai mulţi cercetători îşi îndreaptă atenţia către studiul diferitelor
soiuri rezistente în combinaţie cu diferiţi portaltoi.
Avalanşa de soiuri străine şi apariţia a numeroase soiuri autohtone au cerut eforturi din
partea cercetătorilor pentru verificarea rapidă şi valorificarea în producţie a celor mai bune dintre
ele. Pentru toate combinaţiile soi-portaltoi s-au efectuat şi sunt în continuă desfăşurare cercetări
privind stabilirea sortimentului la nivel zonal şi agrotehnicii diferenţiate în funcţie de soiurile
folosite.Comportarea bună a soiurilor de măr cu rezistenţă genetică la boli, chiar în condiţii de
netratare cu fungicide şi, ca urmare cu o reducere importantă a consumului de pesticide şi a
poluării mediului, îndreptăţeşte necesitatea studiului implicarii acestor soiuri în procesele de
ameliorare in vederea obtinerii de genotipuri din ce în ce mai competente pentru noua viziune a
unei agriculturi biologice competitive pe piața mondială.
Pentru realizarea acestui obiectiv major ne-am stabilit o serie de obiective sintetice, dintre
care:
 identificarea de genotipuri rezistente la Sharka;
 folosirea acestora în hibridări încrucișate;
 obținerea generației F1;
 evaluarea acestor descendențe hibride în ce privește rezistența la PPV;
26
 folosirea selecției cu markeri moleculari pentru evaluarea genotipică a acestor hibrizi.
Implementarea tehnicilor noi de biologie moleculară şi folosirea selecţie asistate cu markeri
moleculari constituie o etapă importantă în scurtarea perioadei de obţinere de noi soiuri
performante pentru piaţa natională şi internaţională. De asemenea, valorificarea judicioasă a
fondului românesc de germoplasmă permite deschiderea de noi perspective în ameliorarea
speciilor pomicole româneşti.
2.2. Obiectivele cercetărilor

Referitor la genotipurile de cais studiate acestea sunt reprezentative in ceea ce priveşte
atat sensibilitatea cat şi rezistenţa la PPV. Suşele alese pentru studiu şi anume suşa D (Dideron) şi
suşa M (Marcus) sunt cele mai vechi cunoscute (comparativ cu suşa Sour Cherry-(SoC)
descoperită destul de recent) dar şi cele cu cel mai mare impact negativ asupra plantaţiilor
pomicole şi totodată cele mai bine cunoscute şi studiate.
La specia de cais, obiectivele propuse se refera la :
 identificarea de genotipuri rezistente la Sharka;
 folosirea acestora in hibridări incrucisate;
 obținerea generației F1;
 evaluarea acestor descendențe hibride in ce privește rezistența la PPV prin infectii artificiale
cu PPV;
 fenotipajul descendentelor hibride prin teste serologice si moleculare.
Implementarea tehnicilor noi de biologie moleculară şi folosirea Selecţie Asistate cu Markeri
Moleculari constituie o etapă importantă in scurtarea perioadei de obţinere de noi soiuri
performante pentru piaţa natională şi internaţională. Pentru aceasta fenotipajul descendentelor
hibride este o etapa extreme de importanta in cadrul pasilor ce trebuiesc parcursi De asemenea,
valorificarea judicioasă a fondului romanesc de germoplasmă permite deschiderea de noi
perspective in ameliorarea speciilor pomicole romaeşti.
2.3 Material şi metodă
2.3.1. Materialul biologic folosit pentru specia cais (Armeniaca vulgaris)

Materialul biologic folosit pentru această spectie este constituit din diferite combinaţii
hibride F1 . Hibrizii de cais luaţi in studiu au fost obţinuţi la USAMV București și S.C.D.P Valul
27
lui Traian, Constanța. Aceștia au fost testați in condiţii de infecție artificială la USAMV
București in condiții de izolare fiind vorba de un virus de carantină și in laboratorul de biologie
moleculară din catedra de Pomicultură. Pentru o evaluare concretă a rezistenței genetice la PPV
in studiu au fost făcute infecții artificiale in condiții controlate (seră pentru limitarea răspandirii
PPV-ului). Soiurile şi hibrizii luați in studiu au fost altoiți pe portaltoii: piersic GF 305, piersicul
GF 305 fiind indicator PPV.
Sursa: fotografii proprii
Fig. 2.3.1., fig. 2.3.2. Indexarea genotipurilor de cais pe portaltoii de piersic GF 305
Evaluarea in ce priveşte rezistența la PPV a unor combinații hibride de cais ameliorate la

SCDP Constanța – Valul lui Traian, și cele de la USAMV București in condiţii naturale de
infectie dar şi in condiții de infecție artificială cu PPV este un prim pas in implementarea Selecţie
Asistate cu Markari moleculari (MAS) la aceste genotipuri.
Interesant pentru noi este faptul că in aceste hibridări au fost folosite soiuri rezistente cum
sunt NJA 2 și Stark Early Orange (SEO) ca genitori purtători ai genelor de rezistență la PPV.
Aceşti hibrizi au fost testaţi serologic la infecţia cu PPV in condiţii de presiune virală normala in
camp.
Plum pox virus (PPV) este agentul responsabil al bolii Sharka, principala boală virală a
arborilor fructiferi din genul Prunus, gen care cuprinde mai multe specii importante din punct de
vedere economic cum ar fi piersicul, caisul sau cireşul. Acestă maladie afectează si samburoasele
din tot bazinul mediteranean şi din majoritatea ţărilor europene. Situaţia este in continuare critică
in ţările din Europa de Est unde boala este endemică cu o rată de contaminare cuprinsă intre 15-
70%. In general lupta contra maladiei virale a plantelor este dificilă datorită lipsei mijloacelor
28
curative. In momentul actual viruşii patogeni nu pot fi combătuţi decat prin metode profilactice.
Drept urmare lupta contra bolii Sharka se bazează in principal pe plantaţiile certificate şi pe
campanii de eredicare sistematică a pomilor atacaţi. 5
Din 1980 centrele INRA din Bordeaux şi Avignon au lansat un program de ameliorare
pentru rezistenţa la PPV a caisului, piersicului şi prunului. Acest program a fost dezvoltat pe baza
hibridării intraspecifice pentru cais, pentru care exista un număr restrans de specii rezistente şi pe
baza hibridării interspecifice pentru prun şi cireş pentru care nu se cunoaşte nici o varietate
rezistentă printre speciile cultivate.
Efectul infectării virale la plantele erbacee a fost deja abordat. Whitham şi colaboratorii
au identificat la Arabidopsis thaliana, plantă cu o sensibilitate crescută, genei indusă de 5 virusuri
diferite printer care şi Potato Virus X (virusul X al cartofului). Aceste virusuri provoacă
modificări de expresie la genele plantelor cu sensibilitate ridicată..
Factori ai gazdei se presupune că intervin in ciclul de infectare al virusului pe mai multe nivele
(replicare, propagare, mişcare şi suprimarea răspunsurilor de apărare ale gazdei). In acest timp,
până in prezent, nici o lucrare similară nu a fost realizată plecand de la o plantă parţial rezistentă.
In această lucrare este vorba de studierea interacţiunii unor genotipuri din genul Prunus
cu virusul PPV, planta gazdă fiind deci o plantă lemnoasă.
Tehnica cDNA-AFLP a permis punerea in evidenţă la Prunus Armeniaca, a unor gene a
căror exprimare este modulată, in continuarea inoculării cu PPV. Acest studiu are ca scop
validarea implicării a acestor gene prin interacţiune compatibilă sau incompatibilă a PPV-ului cu
planta sa gazdă lemnoasă. Genele reprimate pot fi implicate fie in mecanismul de apărare a
gazdei, fie in procesul de infectare a virusului.
Dintr-un punct de vedere fundamental - Sistemul Prunus/PPV care constituie un model
interesant de cercetare a interacţiunilor plantă-potyvirus, ţinand cont de specificaţiile plantelor
perene, varietăţi altoite, inmulţiri vegetative şi un ciclu lung de selectare. Pe de altă parte, acest
studiu prezintă un obiectiv aplicat: o mai bună inţelegere a bazelor genetice de rezistenţa la
Sharka va permite dezvoltarea unor marcatori genetici de rezistenţă şi de punere in practică a
unor tehnici, ca de exemplu selectarea asistată prin marcatori (SAM) ai varietaţilor (soiurilor)
5
Roy AS & Smith I.M. 1994, Plum pox situation in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin24, 515–523.
29
rezistente la PPV. Materialul viral a fost constituit din sursee locale de PPV (Marcus si Dideron)
provenite de la SCDP Bistrița Romania.
2.3.2. Material viral

Materialul viral a fost constituit din sușe locale de PPV < Marcus și Dideron ?provenite
de la SCDP Bistrița Romania.
Fig. 2.3.3., fig. 2.3.4 Atac de PPV pe frunze si fructe și schema genomului PPV-ului
2.3.3. Metodele de cercetare abordate pentru specia cais

 Metoda altoirii
- in ochi dormind
- cu ramura detasata
 Metoda fenotipajului
 Testul serologic Elisa
 Testul molecular RT-PCR
La plante sunt numeroase metode de diagnosticare a bolilor produse de virusuri, dintre

care: inoculări mecanice, indexări pe plante lemnoase şi ierboase, microscopie electronică,
analiză serologică, analize ale acizilor nucleici. Utilizarea indicatorilor biologici ierbosi şi
lemnoşi poate ajuta doar la identificarea unor virusuri, deoarece simptomele care apar pot fi
specifice unei anumite tulpini virale. Prin studiul indicatorilor erbacei pot fi furnizate informaţii
importante cu privire la cele mai bune plante gazdă pentru multiplicarea virusului, menţinerea
unor izolate noi, purificarea virusului şi producerea de antiseruri. Ca indicatori biologici ierbosi şi
30
lemnoşi pentru câteva virusuri ale speciilor sâmburoase (PPV, PDV, PNRSV), recomandaţi de
către Grupul Internaţional de Lucru pentru Virusurile Pomilor Fructiferi din cadrul Societăţii
Internaţionale de Ştiinţe Horticole (ISHS) în anul 2000 pot fi enumeraţi:
Indicatori erbacei:
- Chenopodium quinoa - pentru PNRSV;

- Cucumis sativus - pentru PNRSV şi PDV.
Indicatori lemnoşi:
- Prunus persica (puieţi de GF 305 sau Elberta) - pentru PNRSVşiPDV;
- Prunus tomentosa (hibridul IR473xIR474) - pentru PNRSV, PDV şi PPV;
-Prunus serrulata (Shirofugen, Kwanzan)-pentru PNRSV şi PDV.
Datorită apariţiei a numeroase soiuri, cât şi diversificării tulpinilor din interiorul agenţilor
patogeni de tip viral, se impune abordarea de noi tehnici (ELISA, PCR, culturi in vitro), care să
permită atât identificarea rapidă a acestora, cât şi eliberarea de acest tip de agenţi infecţioşi.
Tehnicile serologice, spre deosebire de procedeele tradiţionale de testare, sunt mai laborioase,
mai precise, cu specificitate foarte mare şi permit efectuarea unui număr mare de teste în timp
foarte scurt. Introducerea şi utilizarea pe scară tot mai largă a testului ELISA (Clark şi Adams,
1977) a permis înregistrarea unor progrese marcante în detectarea virusurilor.
Cele mai multe dintre tehnicile serologice au fost preluate din medicina umană şi adaptate
la virusurile plantelor. ELISA, Enzyme - Linked immunosorbent assay (ELISA), este o metodă
serologică ce permite detectarea virusurilor care se găsesc în concentraţie foarte mică în plante şi
chiar direct din vectorii lor. Această metodă se foloseşte din 1971, când cercetătorii Clark şi
Adams au dezvoltat protocolul pentru virusurile plantelor. Serologia este o tehnică tradiţională
bazată pe folosirea anticorpilor. Anticorpii, cunoscuţi de asemenea ca imunoglobuline sunt
proteine care se găsesc în sânge sau fluide ale corpului vertebratelor capabile să se unească
specific cu antigenele, respectiv bacterii sau virusuri.
Anticorpii sunt folosiţi de sistemul imunologic pentru a identifica şi neutraliza obiectele
străine, aşa numitele antigene. Prin serologie se pot detecta doar virusurile cunoscute, nu boli de
origine necunoscută. (Viroizii nu pot fi detectaţi prin această metodă).
Schematic, antigenele virale sunt prinse prima dată de anticorpul specific al virusului care
căptuşeşte (acoperă) suprafaţa internă a unor godeuri de polistiren, şi apoi de anticorpul viral
31
conjugat cu enzimă. În final, substratul care se adaugă induce o reacţie colorimetrică în prezenţa
complexului antigen - conjugat - enzimă - anticorp.
Prezenţa antigenelor virale specifice din sucul infectat este detectată printr-o
reacţie colorimetrică care se dezvoltă datorită reacţiei unei enzime conjugate cu anticorpii în
prezenţa unui substrat potrivit.
2.3.3.1 Testul imunoenzimatic ELISA

Acest test sau tehnică a fost introdus în anul 1976 de către Clark şi Adams, iar primul test
a fost făcut chiar pentru determinarea prezenţei PPV-ului la sâmburoase. Există numeroase
variante în ceea ce priveşte numele acestui tip de test cel mai des întâlnit fiind “double antibody
sandwich”. Tehnica permite detectarea virusurilor chiar în cantităţi foarte mici, iar dacă este
nevoie viruşii pot fi detectaţi chiar direct din vectori.
Principiul pe care se bazează acest test este posibilitatea de cuplare a anticorpilor cu o enzimă
şi de fixare a acestora. Astfel pentru detectarea prezenţei virusului într-o plantă nu trebuie decât
ca în prezenţa unui eşantion din planta care ne interesează să adăugăm anticorpii corespunzători
patogenului pe care dorim să îl depistăm:
§ dacă antigenul este present se formează un complex imunologic asociat cu enzima fixată
de anticorpi, în prezenţa unui substrat al acestei enzime, iar hidrolizarea acestui substrat
este pusă în evidenţă prin apariţia unui produs colorat.
§ dacă planta este sănătoasă nu se va forma complexul şi nu va avea loc reacţia de culoare.
§ dacă eşantionul este infectat cu un alt virus el nu va fi recunoscut de către anticorpii
specifici utilizaţi, astfel nici în acest caz nu va avea loc vreo reacţie sau formarea unui
complex.
Sursa:fotografie proprie
Figura 2.3.5 Testul serologic Elisa
32
Pentru metoda ELISA frunzele (eșantioane) au fost mojarate în tampon de extracție (AFT
0,2% + Dieca 2% + PVP - 10) și au fost plasate în orificiile unei placi speciale Elisa tapisată
anterior cu anticorpi policlonali conjugați, imunoglobuline conjugați (anti-PPV) și se incubează
la 4 0C pentru 16h. După 3 spălări (cu AFT-Tween) s-au adăugat 200 μI anticorpi monoclonali
specifici pentru PPV și se incubează la 37 0C timp de 2 ore. Ultimul pas a fost adaugarea de
imunoglobuline conjugate cu fosfatază alcalină 1:1000 (200μI) și se incubează timp de 2 h la
temperatura de 37 0C. Citirea a fost făcută la o lungime de unda de 405 nm, luând în considerare
valorile pozitive depășesc de două ori valoarea de citire test negativ (T-x 2). Pentru realizarea
testului ELISA este nevoie de un suport reprezentat de către o placă de polistiren, de anticorpi
specifici virusului pe care îl detectăm (imunoglobuline de tip G:IgG), de aceeaşi anticorpi cu o
enzimă şi de un substrat cu această enzimă.
Placa de polistiren are 96 de compartimente cele de pe margine nefiind utilizate astfel
pentru test rămân 60 de compartimente disponibile. Se folosesc de asemenea două probe, una de
la o plantă sănătoasă şi una de la plantă infectată (probele trebuie sa fie extrase din acelaşi tip de
organ, iar plantele din care sunt extrase probele să aparţină aceleiaşi specii vegetale căreia
aparţine şi planta pentru care se efectuează testul) cât şi o probă martor. Eşantioanele din plantele
ce trebuie testate sunt amestecate cu o soluţie tampon de bază BPS-tween (specific PPV-ului), iar
apoi sunt centrifugate sau filtrate (ceea ce rezultă din această filtrare/centrifugare este folosit în
determinarea propriu-zisă). Pentru a evita contaminarea, proba extrasă din planta sănătoasă este
pregătită prima, iar cea din planta infectată ultima. Fazele de desfăşurare a testului sunt
următoarele:
 peliculizarea plăcii de polistiren cu soluţie IgG (în soluţie tampon cu pH de 9,6), această
fază are o durată cuprinsă între 3 şi 6 ore la o temperatură de 37˚C;
 în cea de-a 2 fază are loc legarea antigenului viral de anticorpul fixat (formarea
complexului anticorp-antigen). Antigenul (provenit din diferite ţesuturi şi organe ale
materialului vegetal) extras cu o soluţie tampon este introdus în compartimentele plăcii de
polistiren unde are loc cuplarea acestuia cu anticorpii. Durata acestei etape este de 18 ore
la o temperatură de 4˚C;
 în faza cu numărul 3 are loc reacţia antigenului cu conjugatul imunoenzimatic (IgG
marcat). Pentru cuplarea conjugatului cu antigenul de adaugă soluţie diluată de conjugat
33
în fiecare compartiment, după care placa se incubează din nou la o temperatură de 37˚C
pentru 3-6 ore;
 în cea de-a 4 fază şi ultima are loc reacţia cu substrat specific. Această etapă se bazează
pe reacţia ce are loc între substratul specific. Această etapă se bazează pe reacţia ce are
loc între substrat şi enzimele de conjugat cu formarea de produşi coloraţi. Intensitatea
reacţiei de culoare ce măsoară cantitatea de anticorpi specifici legaţi de antigene, prezenţi
în serulu concentrate, se determină fotometric. Reacţia poate avea o durată cuprinsă între
5 minute şi 2 ore, temperaturade desfăşurare fiind cea a ambientului;
Densitatea optică a soluţiei colorate se evaluaează în raport cu densitatea optică a martorului
sănătos. Rezultatele astfel obţinute sunt interpretate în 3 moduri (fiind luată ca valoare de
referinţă cifra de 0,1):
 eşantion negativ când planta studiată este liberă de virus sau când cantitatea de virus este
prea mică pentru a fi detectată (în acest caz valoarea este mai mică de 0,08); prezenţa unei
cantităţi prea mici de virus poate fi datorată şi faptului ca PPV-ul este reprezentat diferit
în plată;
 eşantion dubios sau suspect cu valoare cuprinsă între 0,08-0,12, acest verdict dându-se
doar după o a doua testare care se încheie tot cu un rezultat inconcludent;
 eşantion pozitiv când valoarea obţinută este mai mare de 0,12, în acest caz, putându-se
afirma cu siguranţă că virusul este prezent în plantă;
Se recomandă o interpretare foarte prudentă a rezultatelor în special în situaţiile în care avem
de- a face cu eşantioane negative sau dubioase, implicaţiile unui verdict greșit sunt foarte mari
atât în plan profesional cât şi în plan economic. De aceea se recomandă, unde este cazul, şi când
este posibil testul ELISA cu un test PCR.
Avantajele metodei ELISA sunt următoarele:

 sensibilitate pentru detectarea unei cantităţi foarte mici de virus (o concentraţie a
antigenului de 1 -10 mg/ml);
 viteză de reacţie mare (rezultate în 6-24 ore);
 testare la scară mare a probelor (pot fi manipulate câteva sute de probe individual sau în
grup);
 specificitate pentru diferenţierea serotipurilor;
34
 este potrivită atât pentru virioni intacţi cât şi fragmentaţi cu morfologie sau mărimi
diferite;
 oferă posibilitatea de a face măsurători cantitative;
 posibilitatea automatizării şi standardizării testelor prin producerea de kit-uri comerciale
specifice fiecărui agent patogen;
 costuri scăzute şi o durată de viaţă relativ lungă a reactivilor;
 testul poate fi efectuat atât în suc crud cât şi în suspensie virală purificată;
 tehnică economică cu un minim de dotare de bază.
2.3.3.2 Determinări moleculare -Testul PCR (tehnica de amplificare genetică)

O altă tehnică abordată pe plan mondial, iar în ultimul timp şi în ţara noastră, o constituie
utilizarea metodelor moleculare de evidenţiere a bolilor virotice şi a tulpinilor acestora la speciile
pomicole (RT-PCR, IC-RT-PCR).
Efectuarea testărilor moleculare pentru punerea în evidenţă a tulpinilor virale, necesită un
protocol special de lucru. PCR (Polymerase chain reaction) este o tehnică de foarte mare precizie
dar şi foarte costisitoare.
Această metodă a biologiei moleculare de identificare a ADN-ului sau ARN-ului este cea
mai precisă în identificarea tipului de tulpină virală. Amplificarea unei scurte şi bine definite părţi
a acidului nucleic, trebuie foarte bine condusă pe baza unor primeri specifici care sunt
reprezentaţi de secvenţe de nucleotide care conţin bazele azotate specifice pentru tulpina virală
respectivă.6
Tehnica de amplificare genică sau PCR este o metodă extrem de sensibilă de evidenţiere a
acidului nucleic specific din probă. Secvenţa ţintă din acidul nucleic, care urmează a fi detectat,
se amplifică exponenţial prin reacţii în lanţ catalizate de ADN-polimeraza. Tehnica are trei etape:
 denaturarea dublului helix, care va servi ca matriţă;
 cuplarea primerului (primerannealing);
 extensia lanţului catalizată de ADN-polimeraza (Maxim, Isac şi colab.,2000).
Cele trei etape se desfăşoară într-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler care permite
repetarea ciclică a fiecărei etape. Temperaturile la care se desfăşoară cele trei etape sunt diferite:
6
Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E.F. 1989 Molecular cloning. A laboratory manual.2nd ed. Cold Spring
HarbourLab. Press
35
denaturarea la 90 - 95°C, cuplarea la 40 - 60°C, iar extensia la 70 - 75°C. După 20-30 de cicluri,
în care se amplifică secvenţa vizată, aceasta poate fi decelată prin una dintre metodele de
hibridare a acizilor nucleici (Maxim, Isac şi colab., 2002).
Calitatea fructelor este o componentă critică a programelor de cercetare în ce priveşte
arborii fructiferi din grupa sâmburoaselor la genul Prunus. O importanţă particulară în cadrul
programului de interacţiune plantă-patogen, o are rezistenţa la boli şi dăunători. Sharka (variola)
este o problemă serioasă pentru toata Europa, producţia şi calitatea fructelor fiind complet
devastate; Plum pox virus este o boală descoperită în Bulgaria în anul 1917. Între anii 1920-1930
s-a răspândit în estul Europei, iar după al II-lea război mondial a pătruns şi în Germania, Elveţia,
Olanda, Franţa, Italia, Anglia.
Agentul patogen ce cauzează boala, PPV (Plum pox virus) este clasificat ca organism de
carantină prezent în UE, fiind transmis prin intermediul afidelor. Controlul populaţiilor deafide ca
vectori prin folosirea insecticidelor nu rezolvă problema evoluţiei în forme rezistente la
tratamente odată ce s-a instalat boala.
Pentru bolile produse de virusuri nu există tratamente fitosanitare. Unele ţări europene au
demarat un program de eradicare (în Franţa au fost eradicate 30.000 de exemplare de pomi în
anul 1999), însă este dificil a se dezvolta un program eficient de eradicare prin diminuarea
populaţiilor de afide. O soluţie pe termen lung ar fi exploatarea rezervelor de rezistenţă genetică
la PPV. Deci, Sharka, constituie o ameninţare pentru plantaţiile de pomi fructiferi din genul
Prunus. Drept urmare, un obiectiv important de ameliorare a genului Prunus ar fi crearea de
soiuri cu rezistenţă genetică la aceasta boală.
Sursa: www.pomifructiferi.com
Fig. 2.3.6, fig. 2.3.7 Consecinţe ale atacului de Plum Pox Virus asupra culturilor din genul
Prunus
36
Sursa: Andy Vierstaete, 1999
Figura 2.3.8 Etapele de desfăşurare ale testului RT-PCR

Aceste etape se desfășoară într-un dispozitiv numit DNA Thermal Cycler care permite
repetarea ciclică a fiecărei etape. Produșii primului ciclu sunt în continuare denaturați cu ajutorul
căldurii, ciclul putându-se repeta de până la 20 – 30 de ori. La fiecare ciclu numărul de copii ale
fragmentului de ADN se dublează, ajungându-se astfel după 20 de cicluri la 1.048.576 molecule,
iar dupã 30 de repetiții la uimitoarea cifră de 268.435.456 fragmente.
Folosirea tehnicii PCR permite printre altele obținerea de rezultate concludente chiar și cu
niște cantități foare mici de acizi nucleici. Hibridările moleculare, tehnici clasice nu sunt atât de
precise încât să detecteze cantități infime de ADN sau ARN. Astfel în cazul ARNm care este
prezent în celule doar în cantități foarte mici pot sã apară probleme la detectarea acestuia. O
tehnică numită RT-PCR a fost dezvoltată pentru a permite detectarea și punerea în evidență a
acumulării unui ARNm rar din țesuturi, organe sau chiar dintr-o celulă. Principiul constă în
extragerea ARN-ului total din țesutul studiat și copierea acestuia in vitro în ADNc monocatenar
cu ajutorul acțiunii transcriptazei inverse.
Moleculele de ADN obținute servesc apoi ca matrice a unei reacții PCR care folosește un
cuplu de amorse specifice secvenței de ARN pentru care există interes. Fragmentele PCR
obținute după desfășurarea ciclului PCR sunt analizate apoi cu ajutorul gelului de electroforeză.
Una dintre problemele cu care se confruntă această metodă o reprezintă posibilitatea de
contaminare a ARN-ului cu ADN genomic, astfel amorsele se fixează foarte bine și pe acest
ADN. Pentru a evita acest neajuns se poate folosi ARN purificat cu ajutorul unei dezoxinucleaze
37
capabilă se elimine toate urmele de ADN genomic prezente în eșantionul de analizat. Tehnica
PCR este cu adevãrat revoluționară în ceea ce privește cercetările din domeniul biologiei
moleculare și își găsește numeroase aplicații în clonare și în ceea ce privește studiul exprimării
genelor, dar în același timp joacă și un rol important în studierea polimorfismului genetic.
Caracterizarea moleculară a fost finalizată prin secvențierea a patru produși amplificați
aparținând regiunii genomice (Cter) CP și a unui produs aparținând regiunii genomice (C-ter)
NIb / (N-ter) CP . Ampliconii obținuți în urma PCR-lui au fost migrați în gel de agarozǎ 1,5% și
au fost evidențiați cu ajutorul fluorocromului bromurǎ de etidium (0.5 μg/ml). Purificarea
produșilor PCR a fost efectuat cu kitul Wizard SV Gel and Clean-Up System de la Promega,
respectând protocolul de lucru recomandat de producător. După purificarea probelor, acestea au
fost migrate în capilar, folosind aparatul ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). Utilizând versiunea 5.0.9 din pachetul de softuri BioEdit s-au întocmit
aliniamentele secvențelor care, ulterior, au fost analizate comparativ cu cele existente în băncile
de date ale NCBI și Gene Bank.
2.4 Rezultate obţinute

In urma infectiilor artificial cu PPV (prin cipp budding) au fost monitorizate infectiile
prin observatii vizuale, serologice si molecular. Pentru fenotipaj aceste descendențe luate în
studiu, și care nu au relevat simptomele bolii Sharka pe lăstarii în creștere au fost supravegheate
vizual, serologic folosind testul imunoenzimatic (ELISA) și în completare s-au efectuat teste
PCR la genotipurile care au fost negative (fară simptome) la inspecțiile viziale și serologice.
Deci infecția cu PPV a fost evaluată pe parcursul a trei perioade consecutive de creștere prin
determinări vizuale și Elisa
Fig. 2.4.1, fig. 2.4.2 Aspecte din momentele realizării fenotipajului la descendențele hibride de
cais.
38
Scurtarea a fost efectuată la începutul fiecărei perioade de creștere pentru a induce
viguroare lăstarilor noi și pentru a favoriza apariția simptomelor.
Infectiile artificiale cu PPV effectuate atat la parinti cat si la descendentele hibride.
Simptomele au fost evaluta le 14 zile si au fost confirmate prin testele serologice Elisa si RT-
PCR. Eficienta inocularii cu PPV a fost foarte ridicata in ceea ce priveste portaltoiul GF 305 de
95%. Distributia simptomelor a fost foarte neregulata in randul plantutelor tinere prezentand
simptome virale cu faze intermediare de infectie.
Fig. 2.4.3, fig. 2.4.4 Plantele scurtate

Tabel 2.4.1
Răspunsul genotipurilor studiate in urma infectiilor artificiale cu PPV
Nr Raspuns in urma
Genotip Elisa test RT- PCR
crt infectiilor virale
1 Kesth_Phor’ + + susceptibil
2 Viceroy + + susceptibil
3 H2+ - - rezistent
4 Mari de Cenad + + susceptibil
5 NJA 17 - - rezistent
6 Cristal - - rezistent
7 Sirena + + susceptibil
8 Tabriz + + susceptibil
9 SEO - - rezistent
39
10 Pop3-175 - - rezistent
11 Pop3-183 + + susceptibil
28 Pop1-43 - rezistent
40
47 pop4-33 - - rezistent
48 pop5.55 - - rezistent
50 pop5-53 + + susceptibil
Sursa: tabel realizat după date proprii
Dintr-un numar de 50 plante analizate se observa ca 30 dintre hibrizi au manifestat

rezistenta la PPV in urma infectiilor artificiale insemnand un procent de 60%
Fig. 2.4.5, fig. 2.4.6 Analiza serologica ELISA pentru portaltoiul GF305 si hibrizii de caisi
apricots
41
Genotipurile, care nu au dezvoltat simptome la PPV nici vizual și nici prin testul ELISA,
au fost testate prin reacția de transcriere inversă în lanț a polimerazei (RT-PCR) folosind primerii
specifici pentru PPV: P1 și P2 (Wetzel et al. 1991), care amplifică un fragment de 243 bp situat la
C -terminal al genei PPV CP. PPV-ul a fost prins cu anticorpi PPV-policlonali adsorbiți pe pereții
unui Eppendorf micro-tub. Kit procurat de la Sigma și utilizat pentru RT-PCR.
Schema ciclurilor termice utilizată a fost următoarea: RT-30 min la 50 ° C, denaturare /
RT inactivare - 2 min la 94 ° C, urmată de 35 de cicluri de denaturare a matriței: - 30 s la 94 ° C,
alinierea primerului - 45 s la 61 ° C și ADN-alungire 60 s la 72 ° C. Ca urmare a ultimului ciclu,
ADN-ul amplificat a fost alungit timp de 10 min la 72 ° C. O parte „alicotă” din produsele
amplificate (10 μI) au fost fracționate într-ungel de agaroză de 1,5% cu electroforeză în tampon
TBE 1x. Fragmentele au fost vizualizate prin colorarea cubromura etidiu de sub lumina UV.
(Kegler și colab.1998, Wetzel și colab. 1991).
1Kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Sursa: fotografie proprie
Figura 2.4.7 Gel de electroforeză care revelează manifestarea genetică a hibrizilor de cais in
urma RT-PCR.
Fig. 2.4.8, fig. 2.4.9 Cais
42
Plantele au fost clasificate ca rezistente, dacă acestea nu au prezentat simptome și reacții
pozitive ELISA sau RT-PCR în ultimele trei perioade de creștere care au fost evaluate timp de
trei cicluri de vegetatie.
Fig.2.4.10, 2.4.11 Kb 1 2 3 4 5 6 78
Tabel 2.4.2
Simptome pe GF305
Nr Combinatii hibride Testul serologic Testul RT-PCR Manifestare
crt Elisa simptome
1. POP VIII - C41/68-SELF POL-1 + + sensibil
POP VIII - C41/68-SELF POL-2 + sensibil
POP VIII - C41/68-SELF POL-3 - + sensibil
POP VIII - C41/68-SELF POL-4 - + sensibil
POP VIII - C41/68-SELF POL-5 + + sensibil
2. POP-I - MARI DE CENAD x - - rezistent

SEO-1
POP-I - MARI DE CENAD x - - rezistent

SEO-2
43
SEO-3

SEO-4
3. POP-II - SIRENA x NJA 42-1 - - rezistent
POP-II - SIRENA x NJA 42-2 - + sensibil
POP-II - SIRENA x NJA 42-3 + + sensibil
POP-II - SIRENA x NJA 42-6 - - rezistent
POP-II - SIRENA x NJA 42-7 - - rezistent
4. POP-IV - CRISTAL x NJA 21 + + sensibil
POP-IV - CRISTAL x NJA 21-1 + + sensibil
POP-IV - CRISTAL x NJA 21-4 - - rezistent
POP-IV - CRISTAL x NJA 21-5 - + sensibil
POP-IV - CRISTAL x NJA 21-6 - - rezistent
5. POP XI - AMIRAL x NJA 21-1 - - rezistent
POP XI - AMIRAL x NJA 21-2 - + sensibil
POP XI - AMIRAL x NJA 21-3 - + sensibil
POP XI - AMIRAL x NJA 21-4 + + sensibil
POP XI - AMIRAL x NJA 21-7 - - rezistent
POP XI - AMIRAL x NJA 21-8 - - rezistent
44
6. POP-III - NJA 21 x KESTH - + sensibil
PHOR-1
POP-III - NJA 21 x KESTH - + sensibil

PHOR-2

PHOR-3

PHOR-4
POP-III - NJA 21 x KESTH + + sensibil

PHOR-5

PHOR-6

PHOR-7

PHOR-8

PHOR-9

PHOR-10

PHOR-11
POP-III - NJA 21 x KESTH - - rezistent

PHOR-12

PHOR-13

PHOR-14

PHOR-15

PHOR-16
45
PHOR-17

PHOR-18

PHOR-19

PHOR-20

PHOR-21

PHOR-22

PHOR-23
7. POP XII - TRAIAN x TABRIZ- - - rezistent

1
POP XII - TRAIAN x TABRIZ- - - rezistent

2
POP XII - TRAIAN x TABRIZ- - - rezistent

3
8. POP VI - VICEROY x NJA 2-1 - + sensibil
POP VI - VICEROY x NJA 2-2 - + sensibil
POP VI - VICEROY x NJA 2-4 - - rezistent
9. POP X - NJA 42 x VICEROY-1 + + sensibil
46
POP X - NJA 42 x VICEROY-2 + + sensibil
10. POP XIII - NJA 17 x TRAIAN-1 - - rezistent
POP XIII - NJA 17 x TRAIAN-2 - - rezistent
11. POP IX - TRAIAN x CRISTAL- - - rezistent

1
POP IX - TRAIAN x CRISTAL- - - rezistent

2
POP IX - TRAIAN x CRISTAL- - + sensibil

3

4

5
12. POP V - SULMONA x NJA 17- - + sensibil

1
POP V - SULMONA x NJA 17- - + sensibil

2
POP V - SULMONA x NJA 17- - - rezistent

3
POP V - SULMONA x NJA 17- + + sensibil

4
13. POP VII - WARLEY'S x + + sensibil

TABRIZ-1
POP VII - WARLEY'S x + + sensibil

TABRIZ-2
47
TABRIZ-3

TABRIZ-4

TABRIZ-5

TABRIZ-6

TABRIZ-7

TABRIZ-8
TOTAL 97 individuals
Sursa: tabel realizat după date proprii
In urma observatiilor serologice si moleculare se observa ca dintr-un numar de 97 plante

analizate au fost relevate 33 plante hibride. Rezultatele obtinute in urma fenotipajului vor fi
corelate cu cele ale genotipajului. Pentru continuarea lucrarilor a fost izolat ADN ul de la toti
indivizii strudiati si de la parintii acestora pentru a fi apoi analizati cu marker molecular specifici
care pun in evident genele ce sunt implicate in rezistenta genetic naturala la PPV.
Izolarea ADN
Izolarea ADN-ului genomic a fost efectuată din frunze proaspete de cais folosind
hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) protocol descris de catre Eldredge et al. (1992).
Concentrația de AND a fost măsurată cu minifluorimeter (TKO100, Hoefer Scientific). Soluția de
ADN genomic la concentrație de 100 ng/μl în TE buffer (pH 8.0) a fost preparată pentru analiza
cu markeri SSR (Simple sequence repeat).7
7
Zagrai, I. 2003, Rezistenţa genetică durabilă – element cheie în protecţia livezilor. Buletin Documentar Informativ
al SRH, fil.Bistriţa
48
49
Fig.2.4.12, fig. 2.4.13 Precipitatul ce constituie ADN-ul genomic la hibrizii de cais
2.5 Concluzii şi recomandări
CONCLUZII
Aceste constatări sugerează faptul că rezistența la PPV în ce priveste genul Prunus este o
întrebare cu diferite grade de răspuns, și nu una absolută. Pentru acesta va fi important să se
continue evaluarea soiurilor românest de cais din fondurile de germoplasmă pentru o mai bună
întelegere a mecanismului și controlul genetic al rezistenței, în scopul de a ajuta la aspectele de
reglementare ale răspândirii bolii variolei la speciile sâmburoase și pentru a oferi fructe
sănatoase pe piață, dar și oferind surse unice de rezistență la PPV pentru programele de
ameliorare.
Datorită faptului că multe dintre soiurile romanești de cais nu sunt suficient de bine
susținute și promovate pe piața Românească în această lucrare ne-am propus evaluarea unor
descendente hibride de cais în ceea ce priveste rezistența acestora la PPV. În urma indexării
acestora pe GF305 și în urma analizelor serologice și molecular o serie de soiuri cum ar fi
“Traian x NJA 17” s-au dovedit a fi rezistente la PPV.
Identificarea unor noi surse naturale de rezistenţă la PPV,folosirea acestor genotipuri în
programele de ameliorare în care sunt folosite soiuri comerciale românești bine adaptate în țara
noastră şi de asemeni implementarea SelectieiAsistate cu Markeri moleculari (MAS), bazat pe
strânsa asociere a acestora cu rezistenţa la PPV, sunt măsuri de simplificare în mod semnificativ
a procesului de ameliorare ce poate fi o strategie promiţătoare pentru a obține soiuri de cais cu
rezistenţă genetică naturală la PPV.
50
În ceea ce priveşte izolarea AND-ului genomic, calitatea şi cantitatea acestuia depinde de
atenţia şi minuţiozitatea modului de operare a cercetatorului. Metoda clasică de izolare bazată pe
folosirea soluţiilor mamă deşi este mai laborioasă este mai ieftină decâ tcea cu Kituri.
Recomandările se referă la:
 Obținerea F2 și stabilitatea caracterului de rezistență la PPV pentru genotipurile

selecționate prin noi beak-crossuri;
 Continuaarea identificarii de noi genotipuri cu rezistenta genetica naturala la PPV;
 Explorarea de noi combinatii hibride,
 Reintroducerea in studiile de ameliorare a soiurilor autotone si in special acelor vechi,
pentru o mai buna revitalizare si reorientare catre conditiile specifice acestei tari.
51
BIBLIOGRAFIE
1 Ioan Roşca, Rada Istrate, 2001, Prognoză, avertizare şi carantină fitoasanitară a

dăunătorilor din agricultură. Bucureşti.
2 Ion Ligia, 2007 Pomicultură, Editura Ceres, Bucureşti.
3 Ion Ligia, 2008 Microinmultirea plantelor horticole si initiere în biologie moleculară.
Editura Ceres, București.
4 Ion Ligia, Moale C. 2013, – Studiul.tehnologiilor de cultură şi metode de detecţie a
virusurilor la cais şi piersic. Editura Estfalia 2013.
5 Mircetich S., 1982, Phytophtora root and crown of apricot trees. Acta Horticulturae
6 Myrta A, Di Terlizzi B, Boscia D, Caglayan K, Gavriel I, Ghanem G, Varveri C, Savino V
1998, Detection and serotyping of Mediterranean plum pox virus isolates by means of
strain-specific monoclonal antibodies. ActaVirologica. English Ed. 42, 251–254.
7 Pelet F, Bovey R. 1968 Les symptoˆmes de la Sharka sur les pruniers, pruneautiers,
abricotiers et peˆchers. Agriculture Romande 7
8 Polák J., 1994, Breeding for resistance to plum pox potyvirus in the Czech Republic. EPPO
Bull. 24:781–782.
9 Pop, Ioan V., 1975,Virusurile plantelor pomicole şi combaterea lor. Editura Ceres
Bucureşti.
10 Quiot, J.B., Labonne, G., Boeglin, M., Adamolle, C., Renaud, L.Y., Candresse, T., 1995
,Behaviour of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees. Firsts
results. Acta Horticulturae
11 Ranković M., Ogašanović D., Paunović S., 1994, Breeding of plum cultivars resistant to
sharka (plum pox) disease. ActaHortic (The Hague) 359: 69–74.
12 Ravelonandro M., Scorza R., Callahan A., Levy L., Jacquet C., Monsion M., Damsteegt V.
2000, The use of transgenic fruit trees as a resistance strategy for virus epidemics: the plum
pox (sharka) model. Virus Res 71:63–69.
13 Revers, F., Le Gall, O., Candresse, T., Maule, A.J., 1999, New advances in understanding
the molecular biology of plant-potyvirus interactions.Mol.Plant-Microbe Interact. 12, 367–
376.
52
14 Roy AS & Smith I.M. 1994, Plum pox situation in Europe. Bulletin OEPP/EPPO
Bulletin24,
15 Roy, A. S., and Smith, I. M. 1994, Plum pox situation in Europe. EPPO Bull. 24:515-523.
16 Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.V. 1984, Ribosomal DNA
spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and
population dynamics. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 8014–8019.
17 Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E.F. 1989 Molecular cloning. A laboratory manual.2nd
ed. Cold Spring HarbourLab. Press.
18 Sosinski B., Gannavarapu M., Beck L.E., Rajapakse S., Ballard R.E., Abbott A.G. 2000
Characterization of microsatellite markers in peach [Prunuspersica (L.) Batsch].TheorAppl
Genet 101
19 Trandafirescu M., 1989, Reacţia unor soiuri şi hibrizi de cais faţă de atacul ciupercii
Monilinia laxa (Aderh et Ruhl) Honey. Probleme de genetică teoretică şi aplicată, Vol. XXI,
nr. 2: 75-80.
20 Van Oosten, H. J. 1975, Susceptibility of some woody plant species, mainly Prunus spp., to
sharka (plum pox) virus.Neth. J. Plant Pathol. 81:199-203.
21 Vanacker H., Carver T.L.W., Foyer C.H. 1998a, Pathogen-induced changes in the
antioxidant status of the apoplast in barley leaves. Plant Physiology
22 Varveri C., Ravelonardo M., Dunez J., 1987, Construction and used of cloned cDNA probe
for the detection of plum pox virus in plants. Phythopathology
23 Vilanova S., Romero C., Abbott A.G., Llacer G., Badenes M.L. 2003a An apricot
(Prunusarmeniaca L.) F2 progeny genetic linkage map based on SSR and AFLP markers
mapping plum pox virus resistance and self-incompatibility traits. Theor Appl
Genet107:.239–247.
24 Vilanova S., Romero C., Abbott A.G., Llacer G., Badenes M.L. 2003, An apricot (Prunus
armeniaca L.) F2 progeny genetic linkage map based on SSR and AFLP markers mapping
plum pox virus resistance and self-incompatibility traits.Theor Appl Genet 107:239–247.
25 Wallis, C. M., Fleischer, S. J., Luster, D., and Gildow, F. E. 2005, Aphid (Hemiptera:
variability using immunocapture-PCR. EPPO Bull. 24:585-594.
26 Wetzel T, Candresse T, Raveloanndro M and Dunez J, 1991 A polymerase chain reaction
assay adapted to plum pox potyvirus detection. Journal of Virological Methods 33: 355-365.
53
27 Wetzel, T., Candresse, T., Ravelonandro, M., Delbos, R. P.,Mazyad, H., Aboul-Ata, A. E.,
1991 Nucleotide sequence of the 3′-terminal region of the RNA of the El Amar strain of
Plum pox potyvirus. Journal of General Virology
28 Zagrai I., Ravelonandro, M., Scorza, R., Gaboreanu Ioana, Ferencz Beatrix, Popescu O.,
Zagrai Luminiţa, Maxim, A. 2005,- Serological and Molecular Variability of Plum Pox
Virus in Transgenic and Conventional Plums. Bulletin of the University of Agricultural
Sciences and Veterinary Medicine Cluj – Napoca, seria Horticulture, vol. 62: 84-90. ISBN
1454-2382; Seria Zootehnie și Biotehnologii vol. 61
29 Zagrai, I. 2003, Rezistenţa genetică durabilă – element cheie în protecţia livezilor. Buletin
Documentar Informativ al SRH, fil.Bistriţa
30 Zagrai, I., Ravelonandro, M., Gaboreanu Ioana, Ferencz Beatrix, Scorza, R., Zagrai
Luminita, Capote Nieves, Pamfil, D., Popescu, O., Rosu Smaranda, 2006, – Environmental
impact assesment of transgenic plums on the diversity of Plum pox virus populations. XXth
International Symposium on Virus and Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops,
Antalya, Turkey, May 22-26, Book of Abstracts
54

Licenta Finala Cais Horticultura

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Licenta Finala Cais Horticultura

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE PROTECȚIA MEDIULUI

Cercetări privind studii de fenotipaj pentru screeningul unor

CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII ÎN DOMENIUL TEMEI ABORDATE . 5

1.1 Caisul – caracterizare generală ...................................................................................................... 5

1.1.1 Importanța economică și valoarea alimentară a caiselor ....................................................... 6

1.1.2. Originea si aria de raspandire a caisului ................................................................................ 8

1.1.3. Particularități de creștere și fructificare ............................................................................... 10

1.2. Descrierea principalelor boli virotice ale caisului ....................................................................... 12

1.2.1. Apoplexia sâmburoasă ........................................................................................................ 12

1.2.2. Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila) ........................................................................... 13

1.3 Originea și răspândirea virusului ................................................................................................. 14

1.4. Principalele trăsături ale plum pox-ului ....................................................................................... 16

1.4.1 Gazde naturale ale virusului ................................................................................................ 16

1.4.2 Patologia virusului Plum pox .............................................................................................. 17

1.4.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox ........................................................................ 18

1.5. Identificarea și caracterizarea principalelor virusuri la cais ........................................................ 19

1.5.1. Metode de identificare a virusurilor .................................................................................... 20

1.5.1.1. Testul de floculare ............................................................................................................... 21

1.5.1.2. Testul ELISA........................................................................................................................ 21

1.5.2. PCR (Polymerase chain reaction)........................................................................................ 23

1.5.3. Alte virusuri ale caisului....................................................................................................... 23

CAPITOLUL II CONTRIBUŢII PROPRII ............................................... Error! Bookmark not defined.

2.1 Justificarea temei .......................................................................................................................... 26

2.2. Obiectivele cercetărilor ................................................................................................................ 27

2.3 Material şi metodă .........................................................................................................................27

2.3.3. Metodele de cercetare abordate pentru specia cais.............................................................. 30

2.3.3.1 Testul imunoenzimatic ELISA ........................................................................................... 32

2.3.3.2 Determinări moleculare -Testul PCR (tehnica de amplificare genetică) ........................... 35

2.4 Rezultate obţinute........................................................................................................................ 38

2.5 Concluzii şi recomandări ............................................................................................................. 50

1.1 Caisul – caracterizare generală

Fig.11., fig. 1.2 Caise atacate de Plum Pox

1.1.1 Importanța economică și valoarea alimentară a caiselor

Fig.1.3., fig. 1.4 Caise

Fig.1.5., fig.1. 6 Cais Prunus armeniaca L.

Buletin FAO, 1999

SUA 549000 393000 627000

Spania 388851 202600 272800

Italia 104678 87958 87958

Maroc 86800 65700 40000

Tunisia 51000 58700 60000

Iran 74396 111992 111992

Grecia 43224 34763 34763

1.1.3. Particularități de creștere și fructificare

1.2. Descrierea principalelor boli virotice ale caisului

Fig.1.7 Apoplexia sâmburoasă

1.2.2. Ciuruirea frunzelor (Stigmina carpophila)

Fig.1.8 Stigmina carpophila

1.3 Originea și răspândirea virusului

 prezent, probabil eradicat: Suedia, Olanda, Belgia

 prezent, dar neextins: Lituania, India, Egipt, Bosnia-Herţegovina

 statutul recent necunoscut: Danemarca şi Chile

Intre anii 2007-2013 a debutat un proiect cofinantat de UE numit SharCo pentru

1.4. Principalele trăsături ale plum pox-ului

1.4.1 Gazde naturale ale virusului

1.4.2 Patologia virusului Plum pox

Fig.1.9 Plum pox

1.4.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox

Fig.1.10 Frunze de cais atacate de virusul Plum pox

1.5. Identificarea și caracterizarea principalelor virusuri la cais

Utilizarea indicatorilor erbacei si lemnosi pentru determinarea virusurilor, furnizeaza

- Cucumis sativus - pentru PNRSV şi PDV.