INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

“ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS”

MÉTODOS DE ANÁLISIS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

PRACTICA:
“EFECTO DEL PH Y LA CONCENTRACIÓN EN LA
INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE
RIBOFLAVINA”

PROFA: CABRERA MARTINEZ ROSA MARTHA

ALUMNA: JIMENEZ GURRION EDSON JOSHUA

GRUPO: 4IM2

SECCION 3
OBJETIVOS:
a) Conocerá el manejo de un fluorómetro de filtros.
b) Determinará el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de
fluorescencia.
c) Determinará el efecto de la concentración de riboflavina en la intensidad de
fluorescencia.
FUNDAMENTO:
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o
espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la
fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz
ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y
provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible.
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas
por la absorción de radiación electromagnética. Los métodos de fluorescencia se
aplican menos que los métodos de absorción debido al número relativamente
limitado de sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer.
Es un tipo de vitamina B. Es hidrosoluble, lo cual significa que no se almacena en
el cuerpo. Usted debe reponer la vitamina en su cuerpo todos los días. La
podemos obtener del huevo, leche, legumbres, nueces, etc.
Funciones: La riboflavina (vitamina B2) trabaja con otras vitaminas del complejo B.
Es importante para el crecimiento del cuerpo y la producción de glóbulos rojos.
También ayuda en la liberación de energía de las proteínas.

RESULTADOS:
TABLA 1: RESULTAOS DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE RIBOFLAVINA EN
DIFERENTES MEDIOS.
Intensidad Intensidad
Intensidad Intensidad de
de de
Riboflavin de fluorescencia
fluorescenci fluorescenci
a (ppm) fluorescenci en CH3COOH
a en HCl a en NaOH
a en H2O 0.9M
0.1M 0.1M
0.0 5.00 5.00 5.00 4.96
1.0 5.88 5.13 5.62 4.77
2.0 6.70 5.25 6.24 5.00
3.0 7.46 5.35 6.88 4.80
4.0 8.19 5.49 7.46 5.01
5.0 8.81 5.54 7.95 4.82
10.0 11.53 5.99 10.11 4.84
50.0 17.11 6.38 14.55 5.10
pH 5.0 1.0 3.0 13
GRAFICA 1. CURVA DE CALIBRACION DE RIBOFLAVINA EN DIFERENTES
MEDIOS.
18
16
14
12
10
Rfu

8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 10 50
Riboflavina ppm

H2O HCl CH3COOH Na OH

GRAFICA 2. CURVA DE CALIBRACION DE RIBOFLAVINA EN DIFERENTES

MEDIOS.
10
9
8
7
6
5
Rfu

4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6
Riboflavina ppm

H2O HCl CH3COOH Na OH

DISCUSION:
El Fluorometro es diferente al espectrofluorometro ya que este tiene filtros y el otro
no, además que estos métodos de intensidad de emisión de fluorescencia son
demasiado sensibles a comparación del método espectrofotométrico, ya que las
concentraciones de analito que estamos utilizando se encuentran en partes por
millón (ppm) lo cual genera una gran ventaja para este método y al igual tiene
factores que afectan la determinación de concentración del analito estas pueden
ser: metales pesados, luz, incrementos de temperatura, entre otros. Lo que se
determina es la eficiencia cuántica del analito (el % de moléculas que regresan
emitiendo radiación) dependiendo el pH de la solución en la que este se
encuentre. En la línea de H 2O se muestra un claro aumento proporcional de la
concentración con el efecto de la fluorescencia. En la línea de HCl se muestra que
la concentración y el efecto de la fluorescencia casi no se incrementa debido a que
los protones y los iones hidroxilo impiden la fluorescencia. En la línea del
CH3COOH se muestra un comportamiento parecido al del agua, pero con un poco
de variación en la concentración respecto a la cantidad emitida de fluorescencia.
En la línea de NaOH se presenta una curva parecida a la del HCl debido a la
misma razón ya que los iones H + y OH- no permiten la deslocalización para el
efecto de fluorescencia, pero sin embargo se presenta un mayor efecto en el
NaOH debido al peso molecular del ion ya que afecta de mayor manera su
deslocalización. El pH más idóneo para el efecto de fluorescencia es el neutro ya
que al estar neutra la solución la deslocalización del compuesto se lleva acabo de
manera total, entre más nos acercamos a este pH se mostrará un mayor índice la
proporcionalidad de la concentración respecto a la fluorescencia.
CONCLUSION:
Conocimos el manejo y funcionamiento de los fluorómetros de filtros al igual que
de que esta constituido, al igual que a mayor concentración de riboflavina habrá un
incremento en su intensidad de fluorescencia. A pH neutro el incremento de
concentración es proporcional a la intensidad de fluorescencia, mientras que en
ácidos el incremento en la intensidad de fluorescencia por el aumento de la
concentración es muy nulo y en pH básico la riboflavina es inestable.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y
de máxima emisión?

Ya que, estas son excitadas por fotones los cuales pasan por dos
monocromadores que lo modificaran a una determinada longitud de onda,
el primer monocromador nos ayuda a modificar a la absorción máxima de la
muestra, es necesario usarlo a la absorción máxima ya que si lo usamos a
una longitud menor la absorción cae en un intervalo en el cual puede
absorber más o menos con la misma longitud, es más fácil si lo
visualizamos en una gráfica Absorción vs Longitud de onda la cual nos dará
una campana, si nos situamos en la absorción máxima vemos que en la
parte superior de la gráfica por un momento es constante por lo tanto el
margen de error es menor, pero sí lo vemos en otro punto de la campana
donde la pendiente es positiva esta va incrementando es por eso que a esa
longitud el resultado de absorción varia. En este monocromador los fotones
son de mayor longitud de onda, con una menor energía; lo contrario que en
el monocromador de emisión ya que tienen menor longitud de onda pero
 mayor energía y en este segundo monocromador igual usamos la emisión
máxima para tener la mejor aproximación a la absorbancia sin errores como
se explicó anteriormente. Tanto la excitación como la emisión no son
exactas.
2. Diga cuáles son las formas enzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel
en el metabolismo celular.
La riboflavina se absorbe de manera activa a partir del intestino delgado y
en su interior sufre un proceso de fosforilación, ya que para su absorción es
necesario que las formas FAD (Flavin-adenin dinucleótido, que se forma a
partir del FMN por condensación con ATP) y FMN (Flavin-mononucleotido,
que se forma por la unión de un grupo fosfato a la riboflavina) (presentes en
los alimentos a excepción de la leche, que sí presenta riboflavina libre) se
conviertan en riboflavina por acción de las fosfatasas y pirofosfatasas. Una
pequeña proporción de la vitamina es sintetizada por la flora intestinal.
Además, su absorción se incrementa gracias a la presencia de alimento en
el tracto gastrointestinal. Una vez absorbida la vitamina viaja al hígado, y
posteriormente parte de la riboflavina circula en la plasma unida a algunas
inmunoglobulinas y débilmente a la albumina. Cuando la vitamina se
encuentra en el interior de la célula, se convierte en sus formas co-
enzimaticas por medio de la flavocinasa; esta transformación ocurre dentro
del citoplasma celular en la mayoría de los tejidos, en especial en el
intestino delgado, hígado, corazón y riñones. El hígado es el encargado de
metabolizar la riboflavina, y el almacenamiento de ésta es escaso, por lo
que se excreta a través de la orina y el sudor, así como por vía biliar y las
glándulas mamarias
3. Mencione 3 estructuras resonantes de la riboflavina pH ácido, neutro y
básico.

Ruptura de la riboflavina en medio alcalino, formándose urea y ácido:

En medios acidos se protona:

 Riboflavina en medio neutro:

4. Mencione 3 diferencias en fluorescencia y fosforescencia.

o Tiempo en que los electrones después de ser excitados regresan a
su estado basal esto debido a que en la fosforescencia existe una
inversión en el spin y al querer regresar a su estado basal se tarda
en invertirlo a su forma original por esto es más tardado.
o La fosforescencia tiene menor energía, pero mayor estabilidad.
o La fluorescencia proviene del fósforo y la fluorescencia proviene del
flúor.

BIBLIOGRAFIA:
Christopher K. Mathews, Kensal E. Van Holde, Kevin G. Ahern 3ª Edición
Bioquímica.
Adela Mauri Aucejo, María José. Laboratorio de análisis instrumental, Editorial
PUV ER.
https://www.fasaworld.es/blog/diferencia-fluorescente-fosforescente.