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2. ALCANCE
3. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Cantidad de platos teóricos (N): es una medida de la eficiencia de la columna. Para los
picos gausianos, se calcula por las ecuaciones:
(t2-t1)
R = ---------------------
½ (w2 + w1)
Factor de asimetría: es una medida de la simetría del pico, es la unidad para los picos
perfectamente simétricos y su valor aumenta en la medida que aumenta a medida que
la asimetría es más pronunciada (ver figura 1).
Figura 1. Pico cromatográfico asimétrico
4. REFERENCIAS
4.1 Método AOAC 979.08 "Benzoato, cafeína y sacarina en bebidas soda"- Método por
cromatografía. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists.
2005
4.2 PA-06-GM-403-G44 Guía operativa para el manejo del cromatografo líquido marca
Agilent
5. RESPONSABILIDADES
6. CONDICIONES PREVIAS
7.1 MATERIALES
7.1.1 EQUIPOS
7.1.2 ACCESORIOS
7.2 REACTIVOS
7.2.1. Soluciones
Fase Móvil:
Solvente A: CH3COOH 15% ajustada a pH 3.0 con solución saturada de acetato de sodio.
Filtre con ayuda de vacío la solución resultante a través de filtro mixto de 0,2 um.
Solvente B: Isopropanol HPLC. Filtre con ayuda de vacío la solución resultante a través de
filtro mixto de 0,2 um.
7.3.1. Estándares
Solución estándar de cafeína [1] 500 mg/l: Pesar 100 mg de cafeina, disolver con agua,
transferir a un balón de 200 ml y completar a volumen con agua HPLC
Solución estándar de cafeína [3] 100 mg/l: Tomar 20 ml de solución estándar [1] , transferir
a un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC
Solución estándar de cafeína [4] 50 mg/l: Tomar 10 ml de solución estándar [1], transferir
a un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC
Solución estándar de cafeína [5] 25 mg/l: Tomar 5 ml de solución estándar [1], transferir a
un balón de 100 ml y completar a volumen con agua HPLC
Después de inyectar todos los estándares, el estándar de 250 mg/l debe ser inyectado
para hacer una verificación de la calibración.
Preparar la unidad o unidades que conforman la muestra de análisis, homogenizar, tomar una
muestra representativa y almacenarla en un recipiente de vidrio ámbar, rotulado y de cierre
hermético.
7.5.1.1 Bebidas carbonatadas: Desgasifique por agitación o tratamiento con ultrasonido. Filtre a
través de membranas tipo mixto de 0.45 μm para filtración de muestras, descartando los
primeros mililitros de filtrado. Transvase a un vial para automuestreador Agilent.
7.5.1.2. Bebidas que contengan partículas: Filtre a través de membranas tipo mixto de 0.45 μm
para filtración de muestras, descartando los primeros mililitros de filtrado. Si hay gran cantidad
de partículas presentes en la muestra, centrifugue antes de filtrar. Transvase a un vial para
automuestreador Agilent.
7.6.1 Preparación de la columna: Equilibre la columna con la fase móvil de trabajo durante 30
minutos.
Configuración instrumental:
Bomba cuaternaria
Desgasificador en línea
Automuestreador
Detector de ultravioleta visible de longitud de onda variable
Software para manejo de la señal instrumental.
PC
Condiciones cromatográficas:
Columna de fase reversa C18 ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 x 150 mm, 5 um
Fase móvil: Solvente A (CH3COOH 15% ajustada a pH 3.0 con solución saturada de acetato
de sodio):solvente B (isopropanol) en proporción (98.2)
Volumen de inyección: 10 ul
Temperatura de columna: 20 ºC
Tiempo de corrida: 10 minutos
Flujo: 2 ml/min
Longitud de onda: 254 nm
7.6.3.1 Inyectar una solución blanco de fase móvil en la primera inyección seguido de un
blanco de reactivos (agua HPLC)
7.6.3.2 Inyectar los estándares de trabajo de 25 a 500 mg/l preparados según numeral 7.3.2.1.
7.6.3.3 Inyectar una solución blanco de reactivos (agua HPLC) después de la curva de
calibración
7.6.3.4 Inyectar estándar de verificación de 250 mg/l
7.6.3.5 Inyectar una solución blanco de reactivos (agua HPLC) después del estándar de
verificación
7.6.3.6 Inyectar las muestras de análisis y la muestra con valor asignado cuando este
disponible.
7.6.3.7 Inyectar estándar de verificación de 250 mg/l
Precaución: Las sales de acetato de sodio en alta concentración se depositan en las tuberías y
partes del cromatógrafo ocasionando obstrucción de la bomba y de las tuberías por lo cual
debe programarse el método de lavado una vez finalizada la secuencia.
7.6.4 Análisis de los datos
7.7 VERIFICACIONES
7.7 VERIFICACIONES
La curva de calibración se lee cada vez que se realice un análisis y se determina su coeficiente
de correlación, la pendiente y el intercepto.
Los tiempos de retención de la muestras están dentro del valor asignado al estándar ± 2.5 %
Aptitud del sistema cromatográfico (sistem suitability test): Evalue el desempeño del sistema
cromatográfico con los resultados de la solución de control QC.
REGISTROS
9.ANEXOS