Grupo laboratorio de Microbiología, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Escuela de

ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales,

Universidad de los Llanos. Vereda Barcelona. Villavicencio, Colombia.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
ASOCIADOS AL CICLO DEL NITROGENO
Laura Katherin BG 117003907; Sebastián Steven BJ 117003905; Gabriela Maite CM 117003913;
Yeison BR 117003906.
Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales.
Ingeniería agroindustrial

RESUMEN
En esta práctica para el aislamiento de microorganismos asociados al ciclo de nitrógeno teniendo en
cuenta que: La fijación biológica comienza con el proceso que realizan fas bacterias que transforman
el N2 hasta NH3. Las más importantes son las del género Rizobium, que viven en simbiosis en
las raíces de las plantas leguminosas, cuyas células vegetales proporcionan la energía necesaria para
la reducción de N2 a NH3, por parte de las bacterias. Se forman compuestos orgánicos nitrogenados
que quedan ya incorporados a la planta para formar proteínas y otras moléculas orgánicas vegetales.
Después, el nitrógeno orgánico vegetal pasa a los animales que se alimentan de estas plantas. Otras
bacterias que viven libres en el suelo (Azotobacter, Clostridium) fijan el N2 hasta amoníaco (NH3) y
éste se acumula en el suelo. Del mismo modo lo hacen las cianobactenas o algas verde-azuladas en
el agua. además, se tuvieron como objetivos, Aislar y seleccionar microorganismos utilizados como
biofertilizantes a partir de muestras de suelo, recuperar Rhizobium sp a partir de nódulos de plantas
de leguminosas en agar manitol levadura y aislar y seleccionar bacterias del género Azotobacter sp
mediante la técnica gránulos de suelo sobre agar Ashby. Cada objetivo fue logrado gracias a la
metodología trabajada; y así se obtuvieron resultados que se podrían decir los esperados.
Palabras Clave: Azotobacter sp, Rizobium, aislamiento, manitol.
ABSTRACT
In this practice for the isolation of microorganisms associated with the nitrogen cycle taking into
account that: Biological fixation begins with the process that make bacteria bacteria that transform
N2 to NH3. The most important are those of the genus Rizobium, which live in symbiosis in the roots
of leguminous plants, whose plant cells provide the energy necessary for the reduction of N2 to NH3,
by the bacteria. Nitrogenous organic compounds are formed that are already incorporated into the
plant to form proteins and other organic plant molecules. Then, the organic nitrogen plant passes to
the animals that feed on these plants. Other bacteria that live free in the soil (Azotobacter,
Clostridium) fix ef N2 to ammonia (NH3) and it accumulates in the soil. So do cyanobacteria or blue-
green algae in the water. In addition they were aimed to isolate and select microorganisms used as
biofertilizers from soil samples, to recover Rhizobium sp from legume plant nodules in yeast mannitol
agar and to isolate and select bacteria of the genus Azotobacter sp by the technique of soil granules
On Ashby agar. Each objective was achieved thanks to the methodology worked; And thus obtained
results that could be said as expected.
Key Words: Azotobacter sp, Rizobium, isolation, mannitol

1. INTRODUCCIÓN. El N está presente en varias formas, las cuales

. La comunidad microbiana asociada con el
ciclo del nitrógeno (N) representa una ventaja
evolutiva al fijar N2 atmosférico y convertirlo
en formas asimilables para otros organismos.
son transformadas a lo largo del ciclo por la
acción de microorganismos amonificantes
(AMO), proteolíticos (PRO), oxidantes de
amonio (BOA), oxidantes de nitrito (BON) y
denitrificantes (DEN), entre otros (Loomis y
Connor, 2002).
El conocimiento sobre la diversidad y
capacidad metabólica de los microorganismos
del suelo asociados con el ciclo del N es escaso.
No obstante, hay diferentes métodos para
analizar las comunidades microbianas
dependientes y no-dependientes de los cultivos
(Nannipieri et al., 2003). Entre los primeros se
encuentra la técnica del número más probable
(NMP) que estima de manera indirecta la
densidad de una población sin hacer conteo real
de microorganismos o colonias. A pesar de que
la información generada se restringe sólo a las
comunidades que pueden ser cultivadas y es
sensible a la densidad de inóculo (Kirk et al.,
2004), es una técnica rápida y económica que
genera información útil para estimar la
abundancia de la comunidad microbiana en el
suelo.
El tipo de uso del suelo se considera un factor
que controla directa o indirectamente la
estructura de comunidades de
microorganismos en el suelo (Han et al., 2011).
La biomasa microbiana es uno de los
indicadores que mejor refleja las respuestas al
cambio ambiental, incluso mejor que
parámetros físicos y químicos (Kaschuk et al.,
2011), y por tanto, es fundamental para la
evaluación de la calidad del suelo (Acosta-
Martínez et al., 2008).
El páramo se encuentra entre 3200 y 4500
m.s.n.m. y constituye un ecosistema frágil de
gran importancia para el almacenamiento y la
regulación hídrica (Hofstede et al., 2003). En
Colombia este ecosistema abarca cerca de
30,000 km2, siendo el país con mayor área de
páramos (Ramírez, 2011) y en el Parque
Nacional Natural de los Nevados (PNNN) es el
ecosistema más representativo con un área
estimada de 38,600 ha (66.21%) (PNN de
Colombia, 2011).
En los páramos colombianos se cultiva papa y
se desarrollan actividades ganaderas, sin
embargo, no se conoce el efecto de estas
prácticas sobre las propiedades del suelo y las
comunidades microbianas. Por tanto, el
objetivo de este estudio fue estimar la densidad
poblacional de microorganismos asociados con
el metabolismo de N en suelos de la vereda El
Bosque del PNNN, utilizados para cultivo de
papa y ganadería, comparados con suelos de
páramo con vegetación nativa. Se espera
establecer posibles relaciones entre el uso del
suelo y la presencia de microorganismos
pertenecientes a los diferentes grupos
funcionales asociados con el metabolismo de
N.
2. MATERIALES/ METODOS
 Aislamiento de Rhizobium sp.
Se empieza por tomar la raíz de la planta,
observar la apariencia y la localización de los
nódulos, se selecciona varios nódulos jóvenes
y se lavan con agua corriente para eliminar la
mayor cantidad de partículas de suelo
adheridas a las raíces, con ayuda de las pinzas
y la cuchilla se cortan los nódulos y se llevan a
un tubo con hipoclorito al 0,5% se agitan
durante 2 minutos, se sacan del alcohol y se
pasan por la solución de alcohol etílico al 70%,
se agitan durante 5 minutos y se repite la misma
acción pero con agua destilada estéril. Luego
de esto se colocan los nódulos sobre una lámina
portaobjetos y se maceran cerca del mechero
hasta obtener un material líquido, con ayuda de
un asa redonda se debe tomar una muestra y
realizar un frotis en otra lámina portaobjetos
para coloración de Gram. Se observa la
presencia de células alargadas y en forma de Y.
Paralelamente se toman dos cajas de agar
Manitol y se realiza una siembra por
aislamiento de la preparación anterior. Se
Incuba 28°C durante 48h, una vez transcurrido
el tiempo de incubación se realiza una
coloración de Gram y se describe a nivel macro
y microscópico las colonias.
  Aislamiento de Azotobacter sp. Aislamiento de Azotobacter sp.
Transcurridas los ocho días de incubación a
Se toma la muestra de suelo y con ayuda de 28° C, se obtuvo:
unas pinzas se toman gránulos de suelo y se
colocan sobre las cajas de agar Ashby se
cierran las cajas y se llevan a incubar a 28°C
durante 8 días.

3. RESULTADOS
Aislamiento de Rhizobium sp.
Como primer procedimiento, se realizó la siembra,
pasadas las 48 h a una temperatura de 28°C, se obtuvo:
Fig 3. Cajas de Petri de medio agar Ashby con
Azotobacter sp.

Al hacer la coloración de Gram se pudo

apreciar bacilos Gram negativos.

Fig 1. Cajas de Petri de medio agar manitol

con Rhizobium sp.

Se observó el Rhizobium casi

imperceptible en forma de gotas de agua en las
dos cajas de Petri, luego se realizó una
coloración de Gram, y se observó en el
microscopio donde se pudo apreciar cocos y Fig 4. Vista microscópica de Azotobacter sp.
diplococos Gram negativos
3. ANALISIS DE RESULTADOS
Para que una bacteria sea capaz de realizar
fijación de nitrógeno, debe poseer la
información genética para sintetizar la
nitrigenasa, enzima que permite la ruptura
del triple enlace entre los dos átomos de
nitrógenos hasta reducirlos en amonio. Entre
los mecanismos que utilizan estas bacterias
están los de entablar una relación simbiótica
y una fijación libre de nitrógeno.
Fig. 2. Vista microscópica de Rhizobium
En la práctica, se sembraron 2 muestras de
sp.
Rhizobium por el método de agotamiento
en agar Manitol levadura. Es importante
destacar que los microorganismos del
 género rhizobium “Son microorganismos
capaces de inducir la formación de nódulos
5. BIBLIOGRAFIA
fijadores de nitrógeno atmosférico en las
 Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., & Helinski,
raíces de las plantas de la familia
leguminosae (y en sólo otra no leguminosa,
parasponia). algunos rizobios también son
capaces de inducir nódulos en el tallo de
leguminosas (sesbania, aeschynomene)”
 Yates, M. G. (1970). Effect of non‐haem iron
(EcuRed) por lo tanto, se emplearon
nódulos presentes en la planta de soya para
la siembra.
Al realizar la tinción y observar una de las 
colonias aisladas, se encontró que dichos
microorganismos eran bacilos gram
negativos, correspondiendo asi con (L. 
Garzón., G. Ruth;2012) “Son bacilos 
móviles, Gram-negativos, con dos capas de
pared celular (la primera capa esta hecha
por carbohidratos y proteínas, y la segunda
capa por lípidos y carbohidratos)”
Posteriormente se realizó una siembra en
agar Ashby empleando la técnica de los
gránulos de suelo, con el fin de aislar
colonias de azotobacter. Pero en esta, al
realizar el conteo no se encontró presencia
de dichos microorganismos debido a que no
hubo presencia de hexopolisacáridos
alrededor de los gránulos de suelo. El
resultado de esta última pudo verse
afectado debido a la calidad de la muestra
de suelo empleado para el análisis.
4. CONCLUSIONES
 Gracias al montaje de la tinción de Gram se
pudieron identificar si los microorganismos
sembrados eran gram negativos o gram
positivos.
 Se comprobo la presencia de microorganismos
asociados al ciclo de nitrógeno tanto en la tierra
como en las raíces( nódulos).
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148.
6. CUESTIONARIO
 ¿ Azotobacter sp como realiza la
fijación biológica de nitrógeno?
La fijación de nitrógeno es un proceso muy
importante para la existencia de vida en este
planeta. Es un proceso mediante el cual el
nitrógeno del aire (sustancia inerte) se
convierte en una sustancia asimilable por los
seres vivos y puede ser incorporado por estos
en diferentes moléculas y estructuras como
proteínas y ácidos nucleicos; se lleva a cabo
casi exclusivamente por microorganismos del
suelo (bacterias) a los que se les llama
fijadores de nitrógeno; y al tratarse de un
proceso biológico, se conoce como fijación
biológica de nitrógeno (fbn).
El proceso de fijación está relegado a
organismos procariontes, que son capaces de
reducir el nitrógeno molecular a amonio tanto
en vida libre como en simbiosis con
organismos superiores. A continuación, se
presenta un resumen de los principales grupos
de microorganismos fijadores entre ellas:
Bacterias aerobias o microaerófilas
- Quimiótrofas: Azospirillum, Aquaspirillum,
Azotobacter Azomonas, Beijerinckia, Derxia,
Rhizobium, Agrobacterium, Thiobacillus,
Corynebacterium
- Fotótrofas: Gloeocapsa, Anabaena,
Calotrhix, Nostoc, Spirulina, Oscillatoria,
Lyngbya.
 ¿Cómo ocurre la interacción
simbiótica entre la planta y Rhizobium?
Una de las características más sobresalientes
de las leguminosas es su capacidad para
establecer una relación muy particular con las
bacterias del suelo fijadoras de nitrógeno.
Durante esta interacción, las bacterias
inducen la formación de un nuevo órgano, en
las raíces o tallos de las leguminosas,
llamados nódulo.
Estas estructuras son el sitio en el cual se lleva
a cabo la fijación biológica de nitrógeno. Las
bacterias fijadoras de nitrógeno capaces de
establecer esta asociación con las le-
guminosas reciben el nombre genérico
de rhizobia.
A la interacción leguminosa-rhizobia es a lo
que se le conoce como una simbiosis, es decir,
una interacción en la que ambos organismos
se ven beneficiados. La planta recibe
directamente una fuente de nitrógeno,
derivada de la FBN (amoniaco), mientras que
la bacteria recibe de la planta una fuente de
carbono (azúcares), derivada de la
fotosíntesis. Para que se lleve a cabo esta
interacción, las rhizobia son capaces de
detectar a las raíces de las leguminosas debido
a la presencia de moléculas de bajo peso (de
tipo flavonoide) que las raíces de estas
secretan hacia el suelo. Las rhizobia poseen
cierta especificidad por su planta hospedera,
dicha característica está determinada por el
tipo de compuesto que sea secretado por la
planta, ya que, como respuesta a la detección
de los compuestos flavonoides,
las rhizobia sintetizarán otras señales
específicas conocidas como factores Nod
(Nodulación). Los Nod son resultado de la
actividad de los llamados genes nod. Gracias
a la actividad de estos factores de naturaleza
proteica las plantas son capaces de reconocer
a las bacterias, de este modo se forma el
nódulo
 ¿Por qué el medio Manitol y Ashby
no tienen fuente de nitrógeno?
El agar manitol es un medio de cultivo
importante y muy utilizado en microbiología
ya que es capaz de distinguir los
microorganismo patogénicos en un corto
periodo de tiempo. Permite el crecimiento
de bacterias Gram-positivas mientras inhibe
el crecimiento de Gram-negativas. Contiene
una alta concentración (~7.5%-10%)
de sal (NaCl), haciéndolo selectivo
para Staphylococcus (y 'Micrococcaceae)
debido su alta concentración de NaCl es
inhibitorio para la mayoría de las bacterias
Gram negativas. Además
contiene manitol otro inhibidor de bacterias
Gram negativas y un indicador de pH
indicador de fermentación ; rojo de fenol.
 Explique que son las Auxinas,
Giberelinas y el Acido Indol Acético. Y
explique para que sirve cada una.
Las auxinas son hormonas
vegetales, fitohormonas, indispensables para
la regulación del crecimiento y el tropismo de
los órganos vegetales. Junto con
las citoquininas y las giberelinas regulan la
mayoría de los procesos fisiológicos en
vegetales. Las auxinas se han descrito en todo
el mundo vegetal, desde algas y bacterias
hasta plantas superiores y hongos. El ácido
indolacético o Acido Indol Acético (IAA) es
la auxina más común en las plantas y se
forma a partir del L-triptófano.
Las auxinas estimulan el crecimiento, la
división o la elongación, de las células. La
elongación de las células viene dada por el
aumento de su volumen interno. Al llegar a la
célula la auxina causa dos reacciones. La
primera más rápida estimula el movimiento
de las vesículas de la célula, así como
la síntesis de ATPasas y enzimas que
degradarán la pared celular, para dar sitio al
crecimiento celular. La
respuesta lenta estimula la transcripción de
genes implicados en la síntesis de una
nueva pared celular.
Las citoquininas o citosinas son hormonas
vegetales, fitohormonas, imprescindibles en
la regulación del desarrollo y mantenimiento
de los tejidos vegetales.
Las citoquininas controlan el ciclo
celular regulando la acumulación de ciclinas,
haciendo entrar a la célula en fase de
crecimiento G1, después de la mitosis y
G2 tras la fase de síntesis. Inducen la división
celular en cultivos de tejido vegetal. A nivel
de planta es la hormona encargada
del crecimiento apical de la parte aérea,
controlando los genes claves como STM
(shoo tmeristem less) en meristemos
embrionarios o CLV3 (CLAVATA3) en el
meristemo apical. Las citoquininas
sintetizadas en la raíz se movilizan por el
xilema hasta os frutos y las hojas donde se
acumulan, preferentemente en primavera.
Cuando las hojas alcanzan el máximo
desarrollo se exportan por el floema a los
frutos.
Las giberelinas son un tipo de regulador de
crecimiento que afecta a una amplia variedad
de fenómenos de desarrollo en las plantas,
incluidas la elongación celular y la
germinación de las semillas.
Las giberelinas podrían facilitar el
movimiento de las expansinas para que se
sitúen en la posición correcta en la pared
celular. Además, aumentan la concentración
celular de auxina, lo que podría explicar su
increíble efecto en la elongación celular.