Unique origins of replication

Unique origins of replication merupakan asal tunggal replikasi, yang disebut oriC, memiliki
panjang 245 pasangan nukleotida dan mengandung dua urutan pengulangan yang berbeda

Satu urutan 13-bp hadir sebagai tiga pengulangan tandem. Ketiga pengulangan ini kaya akan
pasangan basa A: T, memfasilitasi pembentukan daerah pemisahan untai terlokalisasi yang
disebut sebagai gelembung replikasi. Dua untai daerah kaya AT DNA menjadi lebih mudah
terpisah dengan input energi yang lebih sedikit. Pembentukan zona denaturasi yang terlokalisasi
merupakan langkah pertama yang esensial dalam replikasi semua DNA untai ganda. Komponen
lain yang dilestarikan dari oriC adalah urutan 9-bp yang diulang empat kali dan diselingi dengan
urutan lainnya. Keempat sekuens ini merupakan situs pengikatan untuk protein yang memainkan
peran kunci dalam pembentukan gelembung replikasi.

Inisiasi replikasi DNA pada Escherichia coli terjadi pada bagian yang unik oriC. walnya
dipetakan menggunakan genetika lambda fage dan diisolasi sebagai urutan replikasi otonom
(ARS) yang mendorong replikasi minichromosome. Dengan mengelompokkan urutan ARS ini
menjadi plasmid tipe-ColE1, menjadi mungkin untuk menganalisis penghapusan wilayah oriC,
termasuk yang mematikan, yang mengarah pada pembentukan oriC minimal 245 bp. Kloning
oriC juga memungkinkan Kornberg dan rekan untuk melakukan percobaan inisiasi bertahap
menggunakan protein murni. Studi-studi in vitro ini mengarah pada model umum untuk inisiasi
replikasi di mana pengikatan bersama protein inisiator aktif, Dna-AATP, ke beberapa situs
pengikatan kognitif menghasilkan kompleks nukleoprotein tingkat tinggi yang menginduksi
distorsi heliks dan peleburan dupleks dalam AT yang berdekatan.

Visualisasi garpu replikasi dengan autoradiografi

Ketika film dari autoradiografi ditampilkan dapat terlihat bahwa kromosom Ecoli memiliki
struktur yang berbentuk lingkaran yang ada sebagai bentuk perantara selama replikasi.

Replikasi dari kromosom e coli terjadi secara dua arah dari ORI (origin of replication) atau
sebagai awal mula terjadinya replikasi. Setiap struktur yang berbentuk Y adalah garpu replikasi
dan dua garpu replikasi bergerak dalam arah yang berlawanan secara berurutan disekitar
kromosom yang melingkar.
Replikasi dua arah pertama kali dijelaskan oleh percobaan virus yang menginfeksi Ecoli.
Bakteriphage lambda (phage ʎ) mengandung molekul linear tunggal.

Ujung beruntai tunggal tersebut kohesif atau lengket atau saling melengkapi satu sama lain.
Dengan demikian, ujung kromosom lambda yang kohesif dapat berpasangan membentuk struktur
melingkar yang terikat hidrogen.

Ketika kromosom lamda disuntikkan kedalam sel inang adalah akan mengalami konversi
molekul melingkar yang tertutup secara kovalen. Konversi ini dari bentuk yang melingkar
berikatan dengan hydrogen ke bentuk melingkar yang tertutup secara kovalen dikatalis oleh
DNA ligase yaitu suatu enzim penting yang menyegel atau melindungi kerusakan untai tunggal
didalam heliks ganda
Gambar diatas dapat menunjukkan bahwa kedua titik cabang merupakan garpu replikasi yang
bergerak berlawanan arah disekitar kromosom yang melingkar.

Replikasi dna pada prokariotik

 Replikasi DNA terjadi di dalam sitoplasma

 Memiliki satu daerah origin pada tiap molekul DNA
 Pemutusan ikatan hidrogen antar pasangan basa dibantu oleh DNA gyrase.
 Intermediet pada replikasi DNA menghasilkan dua struktur seperti garpu dan satu
struktur menyerupai gelembung.
 Sintesis DNA pada untai leading dan lagging dilakukan oleh DNA polimerase III.
 Panjang fragmen Okazaki 1000-2000 nukleotida.
 Laju replikasi sangat cepat yakni 2000bp per sekon.

Hasil studi replikasi DNA dengan autoradiografi dan mikroskop electron menunjukkan dua
untaian keturunan disintesis di masing-masing garpu replikasi diperluas dalam keseluruhan arah
yang sama di tingkat makromolekul. Sintesis terjadi pada akhir ujung 5 pada satu untai (3’-5’
perpanjangan) dan pada akhir ujung 3 dari satu helai lainnya (5’-3’ perpanjangan). Namun enzim
mengkatalis dari replikasi DNA, DNA polymerase hanya mensintesis DNA dalam arah 5’ ke 3’.

Continuous synthesis of one strand; discontinuous synthesis of the other strand

DNA Polimerase hanya dapat melakukan proses katalis sintesis dalam arah 5’ ke 3’ saja. Berarti
sintesis satu untai DNA bersifat kontinu sedangkan sintesis helai lainnya teputus-putus. Sintesis
untai diperpanjang secara keseluruhan dari 5’ ke 3’ dinamakan dengan leading strand. Untaian
yang diperpanjang secara keseluruhan dengan arah 3’ menuju ke 5’ disebut dengan lagging
strand.

a. Rantai DNA diperpanjang di arah keseluruhan yang sama di masing-masing garpu

replikasi.
b. Replikasi untai lagging tidak kontinu — Membentuk fragmen pendek yang disintesis
dalam arah 5 '3' dan kemudian bergabung dengan DNA ligase.
Enzim mereplikasikan satu untai ( untai pendahulu) secara kontinu dalam arah 5’ ke 3’ dengan
arah maju secara keseluruhan. Enzim ini juga mereplikasi untai lain secara diskontinu sambil
membentuk polimer nukleotida dalam letupan-letupan singkat 150-200 nukleotida. Letupan ini
adalah fragmen kecil .Fragmen kecil DNA ini dinamai dengan fragmen okazaki.

Penutupan ikatan jovalen nicks dalam DNA dengan ligase DNA

Jika untai lagging DNA disintesis secara terputus-putus diperlukan mekanisme untuk
menghubungkan fragmen Okazaki bersama-sama untuk menghasilkan untaian DNA besar yang
ada dalam kromosom dewasa. Mekanisme ini dilakukan oleh enzim DNA ligase. DNA ligase
mengkatalisasi penutupan kovalen dari torehan (hilangnya hubungan fosfodiester; tidak ada basa
yang hilang) dalam molekul DNA dengan menggunakan energi dari nikotinamid adenin
dinukleotida (NAD) atau adenosin trifosfat (ATP). Ligase DNA E. coli menggunakan NAD
sebagai kofaktor, tetapi beberapa ligase DNA menggunakan ATP.
DNA ligase mengkatalisasi penutupan kovalen dari torehan dalam DNA. Energi yang
dibutuhkan untuk membentuk hubungan ester disediakan oleh adenosin trifosfat (ATP) atau
nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD), tergantung pada spesies.

Inisiasi replikasi DNA

Replikasi kromosom E. coli dimulai pada oriC, urutan unik di mana replikasi dimulai, dengan
pembentukan daerah terlokalisasi pemisahan untai yang disebut gelembung replikasi.
Gelembung replikasi ini dibentuk oleh interaksi protein prapriming dengan oriC.
 a. Protein DnaA mengikat ke empat pengulangan 9-bp yang ada pada oriC.
b. Molekul tambahan protein DnaA mengikat secara kooperatif, membentuk kompleks
dengan oriC yang dilapisi di permukaan.
c. Protein Dna B (DNA helicase) dan protein Dnac bergabung dengan kompleks inisiasi dan
menghasilkan gelembung replikasi.

Inisiasi rantai DNA dengan RNA primer

RNA polimerase merupakan enzim kompleks yang mengkatalisis sintesis molekul RNA dari
templat DNA, mampu memulai sintesis rantai RNA baru di lokasi spesifik pada DNA. Ketika ini
terjadi, hibrida RNA-DNA terbentuk di mana RNA yang baru lahir terikat hidrogen ke templat
DNA. Karena DNA polimerase mampu memperpanjang rantai DNA atau RNA yang
mengandung 3’-OH bebas, para ilmuwan mulai menguji gagasan bahwa sintesis DNA mungkin
dimulai dengan menggunakan primer RNA. Hasil mereka membuktikan bahwa hal ini benar.
Inisiasi untai DNA dengan primer RNA. Enzim DNA primase mengkatalisis sintesis untaian
RNA pendek (panjang 10 hingga 60 nukleotida) yang saling melengkapi dengan untai cetakan.
Primer RNA kemudian dieksisi dan diganti dengan rantai DNA. Langkah ini dilakukan oleh
DNA polimerase I dalam E. coli. DNA polimerase I memiliki dua aktivitas exonuclease:
aktivitas 5’ → 3’ exonuclease, yang memotong kembali untai DNA mulai dari 5’ termini, dan
aktivitas 3’ → 5’ exonuclease, yang memotong nukleotida dari 3’ termini untai DNA. Oleh
karena itu, DNA polimerase I mengandung tiga aktivitas enzim yang berbeda, dan ketiga
aktivitas tersebut memainkan peran penting dalam replikasi kromosom E. coli.

Tiga aktivitas DNA polimerase I di E. Coli yakni:

(a) 5’ → 3’ aktivitas polimerase,

(b) 5’ → 3’ aktivitas exonuclease,

(c) 3’ → 5’ aktivitas exonuclease

Setelah DNA polimerase I mengganti primer RNA dengan rantai DNA, 3’-OH dari satu fragmen
Okazaki berada di sebelah grup 5’-fosfat dari fragmen Okazaki sebelumnya. Produk ini adalah
substrat yang sesuai untuk DNA ligase, yang mengkatalisis pembentukan hubungan fosfodiester
antara fragmen Okazaki yang berdekatan.

Pelepasan DNA dengan helikase, protein pengikat DNA, dan topoisomeras

Replikasi semikonservatif mensyaratkan bahwa dua untai molekul DNA induk dipisahkan
selama sintesis untaian pelengkap baru. Karena heliks ganda DNA mengandung dua untaian
yang tidak dapat dipisahkan tanpa melepaskannya secara bergantian, replikasi DNA
membutuhkan mekanisme pelepasan.

Proses pelepasan melibatkan enzim yang disebut DNA helikase. Replikasi DNA helikase utama
pada E. coli adalah produk dari gen dnaB. DNA helicakase melepaskan molekul DNA
menggunakan energi yang berasal dari ATP. Enzim helikase memutuskan ikatan-ikatan hidrogen
yang menyatukan kedua untaian DNA sehingga terbentuk garpu atau cabang replikasi. Enzim
helikase berfungsi membuka putaran segmen DNA tepat di bagian depan garpu replikasi. Enzim
helikase mengikat ATP dan mengikat rantai tunggal DNA.

Kromosom E. coli mengandung molekul DNA melingkar. Dengan DNA E. coli berputar pada
3000 putaran per menit untuk memungkinkan gulungan untaian parental selama replikasi (_
Gambar 10.20). Sumbu rotasi yang diperlukan selama replikasi molekul DNA sirkular
disediakan oleh enzim yang disebut DNA topoisomerase. Topoisomerase mengkatalisasi
pemutusan sementara pada molekul DNA tetapi menggunakan ikatan kovalen dengan diri
mereka sendiri untuk berpegang pada molekul yang terpecah.
Terdapat dua jenis enzim tropoisomerase, yakni:

(1) Enzim topoisomerase I DNA menghasilkan istirahat untai tunggal sementara atau goresan
pada DNA,

(2) Enzim DNA topoisomerase II menghasilkan istirahat ganda sementara merek dalam
DNA. h. Enzim topoisomerase yang berperan dalam replikasi DNA adalah topoisomerase
tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim ini mengurangi ketegangan superheliks
DNA dengan menciptakan istirahat sementara pada satu atau kedua untai DNA.