CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA, ETANOL Y PROTEÍNAS

I.INTRODUCCIÓN

En un proceso biotecnológico es deseable el aumento de la población de los

microorganismos a los cuales se les refiere normalmente con el nombre de biomasa, así
como también es deseable la obtención de un producto secundario o resultante. Para que la
biomasa muestre un crecimiento en su población, es necesario que los microorganismos
cuenten con condiciones ambientales óptimas para su desarrollo. Estos microorganismos
tienen un metabolismo cambiante y poco predecible, lo cual indica; que si hay cambios,
aunque sean de poca magnitud en las condiciones (temperatura, pH, velocidad de agitación,
etc.), y los elementos que componen el medio ambiente en el cual se encuentran, afectan de
manera directa el desarrollo de los microorganismos impidiéndoles crecer. (Flores-Morfin,
J., 1999)

La gran mayoría de métodos instrumentales requieren una calibración, proceso que

relaciona la señal analítica medida con la concentración del analito. Uno de los métodos
más frecuentemente utilizados es el uso de una curva de calibración. Para realizar el
método de la curva de calibración se procede a realizar una serie de soluciones de
concentración conocida de analito, los cuales se introducen en el instrumento y se registra
la señal instrumental. Normalmente esta señal se corrige por medio de la señal de una
blanco analítico en el que se establece el cero de absorbancia, este blanco contiene todos los
componentes de la matriz de análisis (ejemplo: solución de glucosa, etanol) a excepción de
analito que se desea medir. (Skoog, D. A., 2001)

II. MARCO TEORICO

Espectrofotometría: La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite

determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida
depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por
una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la
absorbancia se puede usarla ley de Lambert- Beer, esta ley expresa la relación entre
absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un
cromóforo en solución. La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su
concentración, a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto
mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción, que
es específica de cada cromóforo. La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se
realiza en espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la
incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros
constan de:

Figura 1. Partes de un espectrofotómetro.

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda:

filtros, prismas, redes de difracción.

3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que

contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV
se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.

4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales

eléctricas.

5. Un registrador o sistema de lectura de datos. Desde el punto de vista operativo, el primer

paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida.
Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna
el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y
transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone
en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta. (Abril, Bárcena,
Fernández, Galván, Jorrín, Peinado, Meléndez &Túnez).

III. MATERIALES

• Micropipeta de 1000μL

• Micropipeta de 200μL

• Micropipeta de 100μL

• Baño termostático

• Vórtex.

• Espectrofotómetro

• Baño de hielo

• Tubos tapa rosca

• Gradillas

• Balones volumétricos de 100 ml

• Glucosa

• DNS

• Solución madre de levadura

IV. PROCEDIMIENTO
  Preparación del reactivo DNS

▪ Pesar 2 g de NaOH y Disolverlos

de 100 mL de agua destilada y 37,5
g de Tartrato de Sodio y potasio.

▪ Agregara 1,25 g de DNS, bajo

calentamiento a baño de Maria

Aforar a 250 mL con agua

destilada.

Almacenar a temperatura ambiente

y proteger de la Luz

 Elaboración de la curva estándar de glucosa

• Preparar una solución madre de • Hacer las siguientes diluciones en

glucosa a 1,0 g/L en un balón de tubos de ensayo usando las
200 ml. micropipetas

• Tomar 1 mL de cada una de las

diluciones preparadas, servir en
otro tubo de ensayo y adicionar a
cada una 1000 μL de DNS,
incluyendo al blanco.
 Tapar cada tubo para evitar
pérdidas de muestra por
evaporación.
Leer las absorbancias de las
soluciones a 540 nm.
Realizar una curva de
calibración de concentración
de glucosa en g/L versus
absorbancia.
 Elaboración de la curva estándar de biomasa
Preparar una solución madre
de levadura de panadería de
200 mL.
V. RESULTADOS
• En el caso de no poder trabajar
inmediatamente con las soluciones,
guardar todos los tubos en un lugar
oscuro para evitar que el DNS
comience a reaccionar.
• Llevar todas las soluciones al
• Pasados los 5 minutos exactos, baño termostático a una
llevar las soluciones a un baño de temperatura de 80-90°C durante 5
hielo durante 5 minutos o hasta el minutos.
momento que se vaya a realizar las
lecturas de las absorbancias.
• Hacer un ajuste lineal de
los datos.
•Hacer las siguientes
• Leer las absorbancias de
diluciones partiendo de una
las soluciones a 600 nm.
dilución en la cual el valor
de absorbancia corresponda
a 1,0:
• Realizar una curva de calibración
de concentración de biomasa en
g/L versus absorbancia.
  CURVA ESTANDAR DE BIOMASA

N° de tubos Concentración Absorbancia Promedio ABS

1 0.1 0.231-0.230-0.233 0.231
2 0.2 0.421-0.422-0.422 0.422
3 0.3 0.613-0.612-0.611 0.612
4 0.4 0.791-0.792-0.795 0.793
5 0.5 0.985-0.985-0.984 0.985
6 0.6 1.084-1.083-1.083 1.084
7 0.7 1.207-1.206-1.207 1.207
8 0.8 1.300-1.302-1.301 1.301
9 0.9 1.351-1.350-1.351 1.351
10 1.0 1.417-1.418-1.418 1.418
Tabla 1. Resultado final de absorbancia de la prueba de biomasa

BIOMASA
1.2
1
0.8 f(x) = 0.72x - 0.13
ABSORBANCIA

R² = 0.96
0.6 CONC
Linear (CONC)
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
CONCENTRACION

Grafica 1. ABS vs Concentración de biomasa

 CURVA ESTÁNDAR DE GLUCOSA

 N° de tubos Concentración Absorbancia Promedio ABS
1 0.1 0.127-0.127-0.128 0.127
2 0.2 0.370-0.369-0.369 0.369
3 0.3 0.504-0.506-0.507 0.505
4 0.4 0.860-0.866-0.868 0.864
5 0.5 1.166-1.166-1.169 1.167
6 0.6 1.380-1.383-1.384 1.382
7 0.7 1.667-1.671-1.674 1.670
8 0.8 1.718-1.722-1.725 1.721
9 1.0 2.172-2.182-2.181 2.178
Tabla 1. Resultado final de absorbancia de la prueba de glucosa

GLUCOSA
1.2
1
f(x) = 0.42x + 0.04
0.8 R² = 0.99
absorbancia

0.6 Concentración
Linear (Concentración)
0.4
0.2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
concentracion

Grafica 1. ABS vs Concentración de glucosa

VIII. DISCUSIONES

Se desarrolló con eficacia un procedimiento para determinar la concentración de (azúcares

reductores) por el método del ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS); la determinación de estos
azúcares se realizó para obtener una curva de calibración, con este reactivo (DNS) que tiene
capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se
pueden medir con una longitud de onda de 540nm en el espectrofotómetro.
Las gráficas muestran resultados satisfactorios ya que el valor de R, obtenidos tanto en la
prueba de azúcares como de Biomasa fueron de 0.9875 y 0.9612 respectivamente.

Existe una relación entre intensidad de color y la concentración de la sustancia, con base en
la Ley de Lambert-Beer podemos afirmar que la absorbancia de una solución es
directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor
interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la
solución a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más
moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad
denominada coeficiente de extinción que es específica de cada cromóforo.

IX.BIBLIOGRAFÍA

1.Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman (2001) Principios de Análisis Instrumental. 5ta
Edición, Editorial McGraw‐Hill.

2.Gamero-Inda, E.; Flores-Morfin, J.; “Fuzzy control of a biotechnology process”

FuzzyInformation Processing Society, 1999. NAFIPS.