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Capítulo 4

Biosensores basados ​en ADN

Soy Oliveira Brett

4.1 INTRODUCCION

Hay cientos de compuestos que se unen e interactúan con el ADN. Estas

Las reacciones causan cambios en la estructura del ADN y la secuencia de bases.
Conduce a perturbaciones en la replicación del ADN. Es muy importante explicar
Los factores que determinan la afinidad y la selectividad en las moléculas de unión a
ADN, porque, según lo descrito por Larsen [1], una comprensión cuantitativa de la
Las razones que determinan la selección de los sitios de reacción del ADN son útiles en
diseño de moléculas de unión a ADN específicas de secuencia para su aplicación en
Quimioterapia y en la explicación del mecanismo de acción neoplásico.
las drogas La investigación sobre los complejos de ácidos nucleicos de iones metálicos avanzó cuando
Se descubrieron actividades antitumorales de los compuestos de platino (II).
Durante la transferencia de información genética, las interacciones entre el ADN
y los iones divalentes desempeñan un papel esencial en la promoción y el mantenimiento de la
Funcionalidades del ácido nucleico. Algunos son reconocidos por su carcinogenicidad como
Dañan las moléculas de ADN y alteran la fidelidad de la síntesis de ADN. Níquel,
así como el cromo y el cadmio, parece ser reconocido como el más
carcinógenos eficaces. Muchos compuestos inorgánicos de níquel han sido probados y
su efecto en una célula o tejido se ha establecido como una interacción con el
sistemas donadores de bases, especialmente en las partes sin enrollar de los ácidos nucleicos.
La modificación química de las bases de ADN se llama mutagénesis. Sustituciones,
las eliminaciones e inserciones causan mutaciones en la secuencia de bases del ADN,
Según Saenger [2]. La exposición a sustancias químicas tóxicas es la causa de muchos
cánceres humanos; estos carcinógenos actúan dañando químicamente el ADN.
Por lo tanto, es importante identificar estos productos químicos y determinar su potencia para
Que la exposición humana a ellos puede ser minimizada.
En una perspectiva de prevención de la salud, la necesidad del análisis de genes.
Secuencias, daño oxidativo al ADN y la comprensión del ADN.
Las interacciones con moléculas o iones llevaron al desarrollo de ADN basado en
biosensores [3–8]. El biosensor basado en ADN es un dispositivo que incorpora

Química Analítica Integral XLIV 179

 L. Gorton
q 2005 (editor)
Elsevier BV Todos los derechos reservados.

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ADN inmovilizado, como elemento de reconocimiento molecular en el activo biológico.

Capa en la superficie, y mide procesos de unión específicos con ADN.
Principalmente utilizando transductores electroquímicos, ópticos y piezoeléctricos. El hecho
que las secuencias de ADN son únicas para cada organismo significa que cualquier auto-
La replicación del organismo biológico puede ser discriminada. El ADN basado
El biosensor es también una herramienta complementaria para el estudio de biomoleculares.
Mecanismos de interacción de compuestos con ADN bicatenario (ADNds).
permitiendo la detección y evaluación del efecto causado a dsDNA por la salud
Compuestos peligrosos y sustancias oxidantes.
Sin embargo, la relación estructura-función de la interacción ADN-ligando
en las interfaces tiene que establecerse y la adsorción de monocapas y
multicapas de ADN, ligandos y complejos ADN-ligando en el transductor
Investigado para caracterizar y optimizar el funcionamiento del biosensor. La química
La selectividad de los biosensores se deriva de materiales biológicos interconectados a la
Superficie de dispositivos transductores. Los eventos de reconocimiento molecular condujeron a
Respuesta escópica adecuada para mediciones analíticas. Las tecnicas de
Elipsometría, microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica y escaneo.
microscopía de túnel (STM) mencionada por Krull et al. [9] son ​importantes para
Investigar aspectos de la estructura física interfacial de monocapas y
Multicapas de materiales biológicos en interfaces biosensor.
Muchos biosensores basados ​en ADN (genosensores) se basan en la capacidad de
Cadenas complementarias de ácido nucleico para formar selectivamente complejos híbridos. los
hebras complementarias se recocen entre sí en una forma de Watson-Crick de
emparejamiento de bases. Métodos de hibridación utilizados en la actualidad, como placas de microlitro o
Los métodos basados ​en gel, por lo general son bastante lentos, y requieren de horas a días para producirlos.
Resultados confiables, según lo descrito por Keller y Manak [10]. Los biosensores ofrecen una
Alternativa prometedora para ensayos de hibridación mucho más rápidos.
La base de operación de un biosensor de hibridación de ADN es la
Acoplamiento complementario entre el ADN monocatenario específico (ADNss)
secuencias (el objetivo) dentro del analito, que también contiene
cadenas ssDNA lementarias, y las secuencias específicas de ssDNA (la sonda)
inmovilizado sobre el soporte sólido (el transductor). Lo específico y selectivo.
La detección de secuencias de ADN, con una capacidad de detección de desajuste de base única, es
Un gran reto en la biosensibilidad del ADN. Análisis de hibridación in situ en tiempo real.
Ofrece la oportunidad de obtener información biológica, como la especificidad.
y cinética de unión de biomoléculas. Estos darán una idea de la
Relación entre las estructuras y funciones de la molécula.
Biosensores actualmente en desarrollo para la detección de ADN.
La hibridación se basa principalmente en ondas acústicas ópticas, de superficie y
Transductores electroquímicos. La detección de secuencias específicas de ADN, utilizando

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Biosensores basados ​en ADN

 La hibridación de ADN es muy importante ya que muchas enfermedades hereditarias son
Ya conocido y es un procedimiento útil para la detección de microorganismos.
En control médico, ambiental y alimentario. La detección de genéticamente.
Los organismos modificados (OGM) son de gran relevancia para el análisis de alimentos. Resultados
utilizando tres biosensores de ADN basados ​en electroquímicos, piezoeléctricos y
Las estrategias ópticas fueron comparadas por Mascini y colaboradores [11] y mostraron
Las grandes ventajas de la tecnología biosensor, mucho más simple que el etidio.
Electroforesis de bromuro, el método de referencia en el análisis de OGM.
La inmovilización de dsDNA y ssDNA a superficies puede lograrse muy
Fácilmente por adsorción. No se producen reactivos o modificaciones de ADN ya que el
La inmovilización no implica la formación de enlaces covalentes con la superficie.
Inmovilización de superficie de ssDNA por enlace covalente, descrito por Thompson
y colaboradores [12], es conveniente en la detección de hibridación de ADN porque
Permite la flexibilidad de la estructura de la sonda con respecto a los cambios en su conformación.
que ocurra, de modo que la hibridación pueda tener lugar sin que la sonda se
retirado de la superficie del sensor. Sin embargo, la adsorción no selectiva de
ssDNA complementario, agregado a la solución a granel, también ocurre en múltiples sitios en
las regiones intersticiales en la superficie del sensor entre ssDNA inmovilizado
hebras Los efectos de la unión selectiva y no selectiva influyen en el
Detección de la hibridación de las hebras inmovilizadas, según lo encontrado por Krull y
compañeros de trabajo [13].
Dos proteínas grandes, avidina y estreptavidina (70 kDa), cada una con cuatro
sitios de unión con afinidad muy alta (K d ¼ 10 215 M) para la biotina, formando un
El complejo avidina / estreptavidina-biotina, se ha utilizado ampliamente para unir un
SsDNA secuencia a la superficie de varios transductores. La proteína es lo primero.
adsorbido en la superficie del transductor y luego se expone a un acuoso
Solución de ácido nucleico biotinilado. La gran estabilidad de la avidina-biotina.
El complejo hace que el sistema sea fácil de emplear, pero la presencia del subyacente
capa de proteína produce posibles sitios múltiples para adsorción no específica y
según Thompson y colaboradores [14] no todos los sitios de unión de biotina son
disponible.
El uso de ácido nucleico peptídico (PNA), desarrollado originalmente por Nielsen et al.
[15] como reactivo específico de secuencia de ácido nucleico, como capa de reconocimiento en el ADN
Biosensores, posee amplio potencial biológico y aplicaciones de diagnóstico. PNA es
un análogo de ácido nucleico en el que el esqueleto azúcar-fosfato de la proteína natural
ácido nucleico ha sido reemplazado por un esqueleto peptídico sintético formado a partir de
Unidades de N- (2-amino-etil) -glicina, que dan como resultado un imitador quiral y sin carga.
PNA es químicamente estable, resistente a la escisión hidrolítica (enzimática) y
por lo tanto, no se espera que se degrade dentro de una célula viva, pero la captación celular es
Muy lento según Ray y Nordén [16]. PNA puede hibridar con

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Soy Oliveira Brett

secuencias complementarias de ADN o ARN después de la hidroelectricidad de Watson-Crick

esquema de vinculación gen. Estos complejos híbridos exhiben buena estabilidad térmica.
y han sido utilizados como una sonda de hibridación específica de secuencia por Wang [17]
Con transductores electroquímicos, ópticos y piezoeléctricos.
Se han descrito otros sensores de ADN menos comunes, como el uso de
microperlas magnéticas sobre un sustrato sólido, para detectar y caracterizar muchos
 Eventos individuales de interacción biomolecular utilizando simultáneamente el concepto.
de medir los cambios en las fuerzas intermoleculares mediante matrices de microfabricación
sensores de ADN magnetorresistivos, desarrollados por Baselt et al. [18].
El desarrollo de sensores miniaturizados, basados ​en hibridación y base.
el emparejamiento, es la base de la tecnología de producción de microarrays de ADN descrita
por Schena [19]. Este arsenal de ADN oligonucleótido consiste en una ordenada
Disposición de oligonucleótidos en un solo chip, lo que permite automatizar y
Monitoreo rápido de muestras de ADN conocidas y desconocidas. Basado en chip
Los microsistemas para el análisis genómico están permitiendo una gran cantidad de reacciones.
para ser estudiado dentro de un área muy pequeña y en muy poco tiempo como lo muestra
Sanders y Manz [8]. Como consecuencia, el concepto de total miniaturizado.
Sistemas de análisis (m-TAS) para análisis biológicos, combinando microelectrónica.
y biología molecular, se ha desarrollado y aplicado a una variedad de sustancias químicas
y los problemas biológicos descritos por Mello y colaboradores [20].
Independientemente de cómo se fabrican los biosensores basados ​en ADN, de acuerdo con
Steel et al. [21], una mayor comprensión de los factores que influyen en la
La estructura de las capas de ADN inmovilizadas es necesaria para diseñar las superficies que exhiben
Mayor actividad biológica y selectividad. Un ssADN más corto tiende a organizarse en
una alta densidad de superficie, mientras que un ADNss más largo conduce a una disminución de la superficie
Cobertura con longitud de sonda.
Los sensores basados ​en ADN deben tener un tiempo de respuesta rápido y deben ser
Cuantitativos, sensibles, adecuados para la automatización, rentables, desechables y
resolver problemas analíticos en una amplia gama de contextos industriales con el fin de ser
comercialmente viable. Los desarrollos alcanzados hasta el momento por diferentes transducciones.
Los sistemas de cing serán revisados.

4.2 BIOSENSORES DE ADN ÓPTICO

Varios métodos ópticos se han utilizado para la detección de ADN, tales como
luminiscencia, fluorescencia Raman u óptica, guía de ondas, estructura
troscopia y resonancia de plasmones superficiales (SPR). Varios inmovilizacion
estrategias para adjuntar ssDNA a superficies con el objetivo de alcanzar el máximo
Se han descrito selectividad y sensibilidad.

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Biosensores basados ​en ADN

Dos métodos para la inmovilización covalente de ADN monocatenario en

Fibras ópticas de sílice fundida utilizando varios enlazadores para el desarrollo de
Krull y sus colaboradores informaron sobre los biosensores [22]. Un método involucró a
hidrófobo y el otro brazo espaciador hidrófilo y se determinó
qué enlazador proporcionaría la mejor eficiencia de inmovilización, hibridación
Cinética, y mínima adsorción no específica a la superficie.
Colorantes fluorescentes intercaladores y de unión de surcos que se asocian con
Se usó dsDNA para la detección de hibridación. Sin embargo, una específica
Ejemplo de una situación en la que se producen interacciones de tinte y tinte a concentraciones de
colorantes que son relevantes para el uso de biosensores y pueden conducir a cambios inesperados y
Los cambios de longitud de onda de emisión no deseada y el enfriamiento de fluorescencia entre
Krull y sus colaboradores [23] describieron las acciones y sugiere advertencias y
Consideraciones para el desarrollo de biosensores cuantitativos y biochips.
 Termodinámica de dos dominios de unión al ADN con y sin conjugado
Thompson y Woodbury estudiaron los tintes de cianina [24] utilizando fluorescentes
Técnicas para determinar la contribución a actividades específicas y no específicas.
unión en términos de polielectrolito y efectos hidrófobos, lo que indica que
La unión no específica es más sensible a los cambios en la concentración de sal. los
Parámetros termodinámicos característicos del ADN específico y no específico.
Unión por cada uno de los dominios de unión al ADN y sus respectivos conjugados
fueron presentados. Un sistema de imágenes llamado escaneo cerca de campo óptico /
microscopio de fuerza atómica (SNOM / AFM), utilizando una fibra óptica doblada como voladizo,
para obtener imágenes para la interacción de un colorante con moléculas de ADNss se utilizó
por Kim et al. [25].
Un biosensor de fibra óptica para la detección fluorimétrica de T / AT triple helicoidal.
La formación de ADN fue utilizada por Krull y colaboradores [26]. Hibridación entre
Oligonucleótidos de ácido decaadenílico inmovilizados en óptica fusionada funcionalizada
Las fibras y oligonucleótidos complementarios de la fase de solución fueron
Detectado por fluorescencia a partir de bromuro de etidio. Una correlación entre la
temperatura de fusión del triplex (T m por debajo de 258C) y la temperatura a la cual
El coeficiente de temperatura de la intensidad de fluorescencia cambia de
de negativo a positivo se investigó y permitió la detección de
Hoogsteen T / AT triplex hélice formación.
Las balizas moleculares (MB) son oligonucleótidos en forma de horquilla que informan
La presencia de ácidos nucleicos específicos. Los MB han sido inmovilizados por Tan.
y colaboradores [27] en sondas de fibra óptica ultra pequeñas a través de avidina - biotina
Unión. El biosensor MB-ADN detectó sus moléculas de ADN objetivo, en real
tiempo, con selectividad para un solo par de bases no coincidentes. Este MB-ADN-
Biosensor fue utilizado por Perlette y Tan [28] para el monitoreo en tiempo real de
mRNA-DNA hibridación dentro de una célula viva.

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Soy Oliveira Brett

Se desarrolló un sensor microfluídico para detectar ADN marcado con fluorescencia.

por Khur y colaboradores [29]. Photopatring se obtuvo con carbeno.
generando fotobiotina y permitió la fabricación de regiones homogéneas de
biotina inmovilizada y el control de la distribución espacial de los ADN en una
Sensor basado en flujo de microcanales.
La idoneidad del vidrio de microcanal de flujo tridimensional.
Sustratos para híbridos de fluorescencia de ácido nucleico heterogéneos multiplexados
Los ensayos de ización fueron demostrados por Cooper y colaboradores [30]. Óptico
pinzas en una microplaca, molécula de ADN individual, cubierta de deslizamiento construida para
estudiar la cinética de la reacción entre dsDNA y formamida fueron
descritos por Bhattacharyya y Feingold [31] que muestran que parcialmente
El ADN desnaturalizado era un producto intermedio. La cinética de una sola molécula.
Se obtuvo a partir del cambio en la longitud del contorno del ADN.
Hibridación en tiempo real de oligonucleótidos diana marcados con 5 0 -fluorosina
fue descrito utilizando un sensor de ADN de fibra óptica por Ehrat [32], Lu [33] y co-
trabajadores, y un conjunto de sensores de ADN de fibra óptica capaces de identificar positivamente
una mutación puntual de un producto de PCR marcado con cebador de biotina se informó por
Walt [34].
Un sistema de sensor óptico de ADN fue propuesto por Cass y colaboradores [35]
Basada en la combinación de hibridación en solución sándwich, perla magnética.
 Captura, inyección de flujo y quimioluminiscencia para la detección rápida de ADN.
hibridación. La hibridación en solución sándwich utiliza dos conjuntos de sondas de ADN,
Uno etiquetado con biotina, el otro con un marcador enzimático e hibridación
Se realiza en solución donde la movilidad es mayor y la hibridación.
El proceso es más rápido, en lugar de sobre una superficie. Los híbridos estaban ligados a la
Perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina mediante la unión de biotina-estreptavidina
reacción. Un biosensor de fibra óptica de quimioluminiscencia para la detección de
hibridación de ADN complementario marcado con peroxidasa de rábano picante a
Zhou y colaboradores [36] desarrollaron sondas de ADN inmovilizadas covalentes.
Se fabricó un biosensor de ADN basado en varias capas de silicio poroso.
utilizando un diseño de resonador de microcavidad oxidado desarrollado por Chan et al. [37],
El silicio poroso que contiene nanocristales de silicio que pueden luminiscencia.
Eficientemente en lo visible.
Cuantificación de la elipsometría y detección visual rápida de ADN híbrido
La utilización de secuencias diana biotiniladas sobre silicio amorfo y
Carbono similar al diamante depositado en una membrana de policarbonato poroso, creando
Una superficie de prueba reflectiva de color dorado recubierta con captura de ssDNA inmovilizada
La sonda fue descrita por Ostroff et al. [38].
La construcción de matrices biomoleculares mediante dos métodos fotolitográficos.
fue realizado por Chrisey y colaboradores [39] para la formación de patrones

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Biosensores basados ​en ADN

Especies de ADN únicas o múltiples en sustratos de SiO 2 . El ADN biotinilado.

Los patrones se visualizaron utilizando una estreptavidina-peroxidasa de rábano picante
conjugado.
Cámaras de micro-reacción para el ciclo térmico de amplificación de ADN.
por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en silicio por maquinado a granel usando
Moore y sus colaboradores han fabricado grabado anisotrópico en húmedo.
[40]. Los rápidos ciclos de temperatura y el pequeño tamaño de las cámaras.
Se puede combinar con un transductor apropiado en un miniaturizado.
Sistema analítico.
SPR mide el cambio en el índice de refracción de las moléculas de analito cercanas
una superficie que se produce durante la formación del complejo o la disociación basada en la
Difracción anómala debida a la excitación de las ondas plasmónicas de superficie y
ha sido revisado por Gauglitz [41]. SPR es una oscilación de densidad de carga que
puede existir en la interfaz de dos medios con constantes dieléctricas de opuestos
Signos, por ejemplo, un metal y un dieléctrico. La instrumentación disponible es
Capaz de caracterizar reacciones de unión en tiempo real sin etiquetado.
requisitos como se muestra por Rich y Myszka [42].
Biosensores de ADN basados ​en SPR utilizando la estreptavidina-biotina de alta afinidad
El sistema para inmovilizar fragmentos de ADN ha sido aplicado por Nygren y
colaboradores [43] para el monitoreo en tiempo real de la hibridación y la cadena de ADN
separación, así como las técnicas que incluyen la acción enzimática, como la ligadura,
Escisión de endonucleasa y síntesis de ADN. Otra aplicación, por Mascini.
y colaboradores [44], fue para la detección de OGM utilizando sondas inmovilizadas
Específico para las secuencias promotoras y terminadoras características de los OGM. Anterior
Para la detección de SPR, las muestras amplificadas por PCR, que eran ADNds, fueron
disociada a pH alto y la separación física de las dos cadenas fue
 Obtenido por el uso de partículas magnéticas recubiertas con inmovilizado.
estreptavidina
Mediciones de imágenes de SPR de microarrays de ADN fabricados en oro
Superficies para monitorear las interacciones ADN-ADN, ARN-ADN y proteína-ADN.
Hasta las concentraciones nanomolares fueron utilizadas por el maíz y sus colaboradores [45].
Canales microfluídicos en experimentos de imágenes SPR para la detección de ADN
y la adsorción de ARN sobre superficies de oro modificadas químicamente también se emplearon
Por maíz y colaboradores [46]. Las sondas de ADN fueron oligonucleótidos modificados con tiol.
mareas Los canales microfluídicos se utilizaron para la fabricación de la línea de ADN 1D.
Arrays para hibridación. Fabricación de matrices de hibridación 2D de dsDNA
los puntos de prueba fueron posibles después de conectar un segundo conjunto de microcanales a la
superficie perpendicular a la matriz de líneas de ADN 1D para entregar moléculas diana a
La superficie, minimizando el volumen total de la muestra utilizada hasta 1 m l.

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Soy Oliveira Brett

Detección SPR de cinética de hibridación y desnaturalización para atados

ssDNA tiol en oro se logró mediante el seguimiento de la ganancia o pérdida de ADN en el
Interfaz en presencia de un campo electrostático aplicado. Las reacciones redox fueron
Se evitó y la corriente medida se limitó a la capacidad capacitiva, no faradaica.
corriente de carga, a potenciales seleccionados aplicados a la interfaz del electrodo de oro,
según lo descrito por Georgiadis y colaboradores [47]. El tiol específico del ADN.
Las películas en monocapa eran robustas y podían reutilizarse.
El espejo resonante es un sensor de onda evanescente, que ha sido
Diseñado para combinar la construcción de dispositivos SPR con el mejorado
sensibilidad de los dispositivos de guía de onda, y fue aplicada por Watts et al. [48] ​para real-
tiempo de detección y cuantificación de la hibridación de ADN utilizando varios
Sondas inmovilizadas de oligonucleótidos biotinilados. Una comparacion de sondas
indicó que la posición relativa de la secuencia complementaria y la longitud
De la sonda afectó la respuesta de hibridación obtenida. Regeneración de la
La sonda de superficie inmovilizada fue posible, lo que permitió su reutilización sin un efecto significativo
Pérdida de actividad de hibridación.
Se sabe que las enzimas de restricción se unen y escinden el dsDNA y son altamente
Específicos en su sitio de reconocimiento. Unión y actividad catalítica del tipo II.
endonucleasa de restricción EcoRI sobre ADN inmovilizado se ha observado en
Scheller y colaboradores [49] en tiempo real, utilizando tres elementos evanescentes diferentes
biosensores de onda, acoplador de rejilla, SPR y fluorescencia generada en la superficie y
Dos técnicas diferentes de inmovilización, el acoplamiento estreptavidina-biotina
La reacción o el apego covalente. La combinación de diferentes evanescentes.
Las técnicas de onda dieron acceso al mecanismo catalítico y permitieron la
determinación de la etapa de determinación de la velocidad, la división del segundo ADN
hebra.

4.3 BIOSENSORES DE ONDA DE ADN ACÚSTICO

Se han empleado biosensores de onda acústica de ADN para estudiar el dúplex.

formación en la superficie del sensor y para controlar una amplia variedad de
Procesos que involucran la química del ácido nucleico en la interfaz sólido-líquido.
Sin necesidad de etiquetas como agentes radioquímicos o fluorescentes. los
Teoría y aplicaciones de la tecnología de ondas acústicas fueron revisadas por
 Thompson [50,51], Ziegler [52] y compañeros de trabajo.
Los fenómenos piezoeléctricos están relacionados con la polarización eléctrica reversible.
generado por la tensión mecánica en cristales que no muestran un centro de
simetría. La señal producida por los dispositivos de ondas acústicas se genera a granel.
o ondas acústicas de superficie lanzadas por transductores de metal en ultrasonidos
frecuencias Tales ondas se propagan a través de materiales piezoeléctricos,

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Biosensores basados ​en ADN

Generalmente cuarzo, donde propiedades tales como la orientación y el espesor de la

El cristal, así como la geometría del transductor, determinan los caracteres
Estadísticas del movimiento ondulatorio. Un sensor de onda acústica de modo de corte de espesor (TSM)
Consiste en una oblea de cuarzo de corte AT y electrodos metálicos en sus dos lados.
Para generar un campo eléctrico oscilante de rango de frecuencia operacional.
5-20 MHz [51,52]. El cambio medido en frecuencia está determinado por la masa.
Carga y por las condiciones de contorno particulares que existen en el sensor -
Interfaz líquida, como energía libre de interfases, estructura líquida y recubrimiento.
Propiedades de la película. La formación de una capa biomolecular adherente en el
interfaz produce cambios en la frecuencia a través de pérdidas viscosas junto con
Alteración de los procesos de energía y disipación. El sensor de onda acústica TSM
se ha utilizado ampliamente como un sensor de respuesta de masa, el cristal de cuarzo
Sensor de onda acústica de microbalanza (QCM), que utiliza un campo eléctrico oscilante de
Frecuencia operacional de 5–10 MHz.
La cinética de la hibridación interfacial fue estudiada por Thompson y
colaboradores [53] con un sensor TSM que usa una superficie PdO para inmovilizar el ARN. Eso
no estaba claro si las cadenas de ARN se fijaron en unos pocos puntos o si
Las porciones significativas de cada molécula se mantienen en posiciones fijas. los
El enredo de moléculas de ARN largas, formando bucles y bobinas, podría ser
responsable de la libre difusión restringida de hilos y una baja tasa para el
reacción de hibridación. Esta tasa también está influenciada por la cobertura de
La superficie por ARN y otros efectos interfaciales. La interpretación de la
Influencia de los agentes bloqueadores y la fuerza iónica en la cinética del nucleico.
hibridación ácida y el mecanismo de asociación de hebra con respecto a
Se consideró la hibridación de soporte sólido.
También se ha prestado atención a la detección por TSM de la interacción de
Ácidos nucleicos unidos a la superficie con moléculas pequeñas, como cis de unión específica.
y transplatinos contra el cáncer. Los resultados mostraron dos cinéticas distintas.
Procesos que fueron interpretados en términos de unión a ácido nucleico de la
productos de hidrólisis de los dos fármacos de Thompson y colaboradores [54].
La inmovilización de ADN en superficies de plata de TSM mediante modificación fue
reportado por Yao y colaboradores con ácido tioglicólico [55] y didodecil
ditiono-oxamida y albúmina de suero bovino [56]. El Langmuir – Blodgett
Se usó la técnica (LB) para depositar películas que contenían ADNss en cristales de QCM
por Nicolini et al. [57] y el ensayo de hibridación nanogravimétrica fue
Confirmado por mediciones fluorescentes.
El uso de microscopía de fuerza atómica (AFM) y de inyección de flujo QCM en
tándem proporcionó información importante sobre la cobertura de la superficie y
Orientación en oro de una sonda de ADN tiolada, según lo informado por Zhou y
compañeros de trabajo [58]. El efecto de usar un alcanotiol diferente para reorientar el
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Soy Oliveira Brett

La película preformada para una mayor extensión y eficiencia de la hibridación fue

examinado. Las imágenes de AFM indican claramente que la formación de ADN híbrido en el
sensor heterogéneo ocurrió preferentemente en los límites de grano de oro,
lo que sugiere que el obstáculo por las moléculas de la sonda de ADN adyacentes juega un
Papel importante en el gobierno de la cantidad de hibridación. Mientras que AFM
Permitió la visualización directa de la orientación de la sonda y el ADN objetivo.
moléculas, QCM proporcionó un medio para medir semicuantitativamente la cantidad
de la molécula de sonda inmovilizada y la de los dúplex hibridados, tanto
Estudios que indican baja eficiencia de hibridación.
Películas de poli (pirrol / pirrol-ODN) electrosintetizadas por Vieil y
los trabajadores [59] también se utilizaron para modificar los electrodos de QCM para monitorear el ADN
hibridación.
Las características de los sensores QCM que contienen ADN mono o multicapa.
sonda construida por enlace químico directo, interacción avidina-biotina o
La absorción electrostática en películas de polielectrolito fue comparada por Zhou et al.
[60]. El uso de la adhesión de polietilenimina, reticulación de glutaraldehído
(PEI-Glu) método para inmovilizar ADN del virus de la hepatitis B en cuarzo QCM dorado
Los cristales, que permiten que el sensor se regenere cinco veces, fueron reportados por Hu
y compañeros de trabajo [61].
El procedimiento de avidina-biotina se ha utilizado ampliamente en la hibridación
estudios. Dado que la concentración de todos los ADN analizados utilizados es idéntica, la
La concentración total de las muestras analizadas es alta. La amplificación de
El evento de reconocimiento de base de desajuste es necesario para mejorar la sensibilidad. los
Uso de liposomas funcionalizados con oligonucleótidos o liposomas marcados con biotina
como sondas para la amplificación dendrítica de procesos de detección de ADN fue
caracterizado por Willner y colaboradores [62] y mostró un mejor desempeño
utilizando QCM que las mediciones de espectroscopia de impedancia.
Tres métodos indirectos diferentes, Fig. 4.1, para detectar y amplificar una sola
los desajustes de bases fueron descritos por Willner et al. [63]. Todos los métodos fueron basados
en un tratamiento de superficie, que implica la inmovilización del ADN tiolado,
Hibridación y biotinilación en presencia de polimerasa I de la detección.
interfaz, que resulta en cristales de cuarzo au funcionalizados, realizados fuera
la celda QCM.
Los tres procedimientos de amplificación utilizados con este Au funcionalizado
La interfaz de cristal de cuarzo consistió en la detección primero usando avidina y biotina.
liposomas marcados, en segundo lugar utilizando el conjugado avidina-Au-nanopartícula y el
deposición electrolítica catalizada de oro, y en tercer lugar avidina-fosfato alcalino
interacción de tase con 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato que causa la
Precipitación biocatalizada del producto insoluble en el cristal piezoeléctrico.
La separación del tratamiento de superficie fuera de la célula QCM junto con

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 Biosensores basados ​en ADN

Fig. 4.1. Vías de detección amplificadas de una falta de coincidencia de una sola base en ácidos nucleicos: (a) utilizando
Avidina y liposomas marcados con biotina; (b) utilizando un conjugado de avidina y nanopartículas de Au
y la deposición catalizada de oro; (c) utilizando una avidina-fosfatasa alcalina
bioconjugado y la precipitación biocatalizada del producto insoluble 4. (Reproducido
de la ref. [63] con permiso de Elsevier.)

la detección amplificada condujo a una minimización de la adsorción no específica de avidina o la

Liposomas y mayor sensibilidad en la interfaz de detección funcionalizada.
Una visión general de los estudios que aplican dispositivos de modo TSM para monitoreo
Las interacciones de los ácidos nucleicos interfaciales de Cavic y Thompson [51] muestran la
Las ventajas de esta configuración biosensora y su idoneidad para ser
Integrado en el diseño de matrices de alta densidad de sondas de ADN.

4.4 BIOSENSORES ELECTROQUIMICOS DE ADN

El objetivo en el desarrollo de electrodos modificados con ADN fue estudiar la interacción.

de ADN inmovilizado en la superficie del electrodo con analitos en solución y para
utilizar el biosensor de ADN para evaluar y predecir las interacciones del ADN y
Daño por compuestos peligrosos para la salud en base a su unión al nucleico.
ácidos El ADN actuaría como un promotor entre el electrodo y el biológico.
Molécula en estudio. Las técnicas electroquímicas tienen la ventaja.
en el diseño del biosensor de ADN de ser rápido, sensible, rentable y permitir

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Soy Oliveira Brett

Generación in situ de intermedios reactivos y detección de daños en el ADN.

Descripciones completas de investigaciones sobre detección de ADN y ADN [64–73]
Mostrar las grandes posibilidades del uso de la transducción electroquímica en el ADN.
diagnóstico.
 LosLa investigación
mecanismos electroquímica
biológicos sobre eldeADN
y el biosensor ADNesesdeungran
muyrelevancia parapara
buen modelo explicar muchas
simulando la interacción de los ácidos nucleicos con las membranas celulares, el potencial
compuestos cancerígenos mentales y para aclarar los mecanismos de acción de
Medicamentos utilizados como agentes quimioterapéuticos.
Cuando se compara con transductores ópticos, piezoeléctricos u otros, el
La transducción electroquímica es dinámica porque el electrodo es en sí mismo un
reactivo cargado sintonizable, así como un detector de todos los fenómenos de la superficie,
lo que amplía enormemente las capacidades de biosensores de ADN electroquímico.
Sin embargo, es necesario que el analito sea electroactivo, es decir, capaz de
sometidos a reacciones de transferencia de electrones, con el fin de utilizar un electroquímico
transductor Para diseñar biosensores basados ​en ADN heterogéneos, es esencial
entender las estructuras superficiales de las superficies modificadas y por lo tanto es
Es importante saber qué grupos de ADN son electroactivos.
La doble estructura helicoidal del ADN deducida por Watson y Crick.
consistía en dos cadenas de polinucleótidos que se ejecutan en direcciones opuestas y
compuesto por un gran número de desoxirribonucleótidos, cada uno compuesto por una base, una
Azúcar y un grupo fosfato. Se sostienen las dos cadenas de la doble hélice.
unidos por enlaces de hidrógeno entre purina, adenina (A) y guanina (G), y
bases de pirimidina, citosina (C) y timina (T), y es posible identificar una
surco mayor y menor, este último con una carga de densidad negativa más alta.
Las bases siempre están emparejadas: adenina con timina y guanina con citosina.
y están en el interior de la hélice, mientras que el fosfato y la desoxirribosa
Las unidades están en el exterior.
El comportamiento electroquímico del ADN y la adsorción a diferentes tipos de
Los electrodos han sido investigados durante varios años usando una caída
Electrodo de mercurio y electrodos sólidos más recientes [64–80]. Electroquímica
Reducción de la cal de ácidos nucleicos naturales y biosintéticos en una caída de mercurio
El electrodo [64] mostró que los residuos de adenina y citosina, así como la guanina
Los residuos en una cadena de polinucleótido son reducibles. Oxidación electroquímica de
Los ácidos nucleicos naturales y sintéticos en los electrodos de carbono [74-80] mostraron que
todas las bases: guanina (G), adenina (A), citosina (C) y timina (T) pueden ser
Oxidado, Fig. 4.2, siguiendo un mecanismo dependiente del pH.
Esta figura, de Oliveira Brett y Matysik [80], se mostró por primera vez.
que las bases de pirimidina timina y citosina pueden sufrir oxidación en
electrodos de carbono vítreo, aunque para potenciales muy positivos y que la

190

Página 13

Biosensores basados ​en ADN

 Fig. 4.2. Determinación voltamétrica diferencial de pulso de bases de purina y pirimidina
guanina (2 £ 10 M), adenina (3 £ 10 M), timina (3 £ 10 M) y citosina
25 25 24

(3 £ 10 M) en tampón borato (pH 10.02), (a) con tratamiento previo ultrasónico (potencia
24

intensidad, 72 W cm ; Separación del electrodo de la punta de la bocina, 5 mm), (b) exploración sucesiva sin
22

Pretratamiento ultrasónico. Velocidad de barrido, 5 mV s ; amplitud, 50 mV. (Reproducido de

21

Árbitro. [80] con permiso de Elsevier.)

La concentración de las bases de pirimidina necesaria fue 10 veces mayor que la

Concentración de las bases de purina. Esto significa que, dado que las proporciones de adenina
a timina y de guanina a citosina están muy cerca de 1.0 en todas las especies, es
Difícil de detectar citosina y timina.
La oxidación electrocatalítica del ADN en la porción de azúcar y amina, a una
La superficie del electrodo de cobre, fue estudiada por Singhal y Kuhr [81] utilizando una
Procedimiento de detección diferente.
Como se mencionó, las bases electroactivas en dsDNA están en el interior de la
doble hélice y su distancia y accesibilidad a la superficie del electrodo son
Determinante para el comportamiento electroquímico de los ácidos nucleicos. En las Figs. 4.3 y 4.4
algunos voltamogramas de pulso diferencial obtenidos con dsDNA y ssDNA en una
Se presentan electrodos de carbono vítreo.
La señal electroquímica debida a ssDNA es siempre más alta que la de
dsADN, ver refs. [64,82]. Esto ilustra la mayor dificultad para el
Transición de electrones desde el interior de la forma rígida de doble cadena de
dsDNA a la superficie del electrodo que desde la forma flexible de una sola hebra

191

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Soy Oliveira Brett

 Fig. 4.3. Voltamogramas de impulsos diferenciales obtenidos con un GCE desnudo en pH 4.5 0.1 M
tampón de acetato de: (···) 15 mM 8-oxoguanina (8-oxoG); (···) 15 mM guanina (G); (···)
Guanosina 15 mM (Guo); (· · ·) 100 mM de adenina (A); y 60 mg ml dsDNA (- - -) 1º y
21

(-) 40 ° voltamograma. Amplitud de pulso, 50 mV; ancho de pulso, 70 ms; rango de escaneo,
5 mV s . (Reproducido de la Ref. [123] con permiso de Elsevier.)
21

donde los residuos de guanina y adenina están cerca del electrodo

superficie.
Esto ha sido justificado por la estereoquímica de la doble hélice de ADN en
comparación con la característica similar a una cinta de ssDNA que puede seguir el
El electrodo se contornea más fácilmente. La rugosidad de una superficie de electrodo sólido también
Significa que el ADN de doble hélice tiene alguna dificultad para seguir la superficie.
contornos, mientras que las moléculas de ADN desenrolladas monocatenarias encajan más fácilmente
en las ranuras en la superficie del electrodo debido a su mayor
flexibilidad.
La adsorción de dsDNA en superficies de electrodos de oro mostrada por STM y
Imágenes de AFM obtenidas por Lindsay et al. [83-86] demuestra que el ADN
Las moléculas se adsorben en la superficie de forma reversible y pueden sufrir conformación.
transiciones Adicionalmente, la deposición electroquímica y el potencial in situ.
El control durante la obtención de imágenes puede utilizarse para obtener imágenes reproducibles de STM de la
Estructura interna de ssDNA adsorbido y dsDNA. Tecnicas espectroscopicas

192

Página 15

Biosensores basados ​en ADN

Fig. 4.4. Voltamogramas de pulso diferencial sucesivos del carbono vítreo limpio.
electrodo, sumergido en la solución de ssDNA durante la modificación; se — apoyando
electrolito: 0.1 M de tampón de acetato pH 4.5. Amplitud de pulso, 50 mV; ancho de pulso, 70 ms;
Velocidad de barrido, 5 mV s . (Reproducido de la Ref. [70] con permiso de Elsevier.)
21

como la espectroelectroquímica infrarroja utilizada por Dong y colaboradores [87]

y espectroscopia Raman mejorada en la superficie (SERS) por Otto et al. [88] tiene
También se ha utilizado para investigar la adsorción de ADN en las superficies de los electrodos.
Las características de la superficie del electrodo representan un aspecto importante en el
Construcción de biosensores electroquímicos de ADN sensible para detección rápida.
 de la interacción del ADN y el daño. Una cuestión crítica en el desarrollo de un ADN-
El biosensor electroquímico es el material sensor y el grado de superficie.
Cobertura que influye directamente en la respuesta del sensor.
Usando AFM en modo MAC ex situ, Oliveira Brett et al. [89-91] han podido
Visualizar directamente las características superficiales de las películas de ADNb preparadas.
en un electrodo de grafito pirolítico altamente orientado (HOPG). Se encontró que
Las diferentes metodologías de inmovilización conducen a cambios estructurales en el
Superficie del ADN-biosensor y por consiguiente diferente respuesta del sensor. AFM
Imágenes de un sustrato de HOPG modificado por una capa gruesa y una capa delgada de dsDNA.
se muestran en la figura 4.5. La superficie HOPG es extremadamente suave, lo que permite
La identificación de la topografía cambia cuando se modifica la superficie con
dsADN. Dos diferentes procedimientos de inmovilización de ADN de doble cadena en
Se evaluó la superficie de un electrodo HOPG, una película delgada adsorbida con ADNd
Formando una estructura de red, con agujeros no cubiertos por la película molecular.
Exponer la superficie del electrodo, y una película dsDNA gruesa que cubre completamente

193

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Soy Oliveira Brett

Fig. 4.5. Imágenes topográficas AFM en modo MAC en aire de: (A1 y A2) limpian HOPG
superficie del electrodo; (B1 y B2) superficie de biosensor de dsADN de película delgada, preparada en
HOPG por 3 min. Adsorción libre de una solución de 60 mg ml dsDNA en pH 4.5 0.1 M
21

tampón de acetato electrolito; (C1 y C2) superficie de biosensor de dsADN de película gruesa, preparada
sobre HOPG por evaporación de una solución de 37.5 mg ml dsDNA en pH 4.5 0.1 M
21

tampón de acetato electrolito; (A1, B1 y C1) Vista bidimensional de 1 mm Tamaño de escaneo de £ 1 mm

y (A2, B2 y C2) vista tridimensional de 500 nm, tamaño de escaneo de £ 500 nm. (Reproducido
 de la ref. [91] con permiso de Elsevier.)
La superficie del electrodo con una película multicapa uniforme, presentando una gran
Estructura más rugosa.
Las redes de dsDNA se formaron en el electrodo HOPG durante la formación.
de capas delgadas de dsDNA definen diferentes áreas de superficie activa en el electro-
Biosensor químico. Las regiones descubiertas pueden actuar como un sistema de micro-
Electrodos con dimensiones nanométricas o micrométricas. El bidimensional

194

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Biosensores basados ​en ADN

Las redes de dsDNA forman una matriz de biomateriales para unir y estudiar otras
moléculas. El mayor problema encontrado con los electrodos HOPG.
modificado por una película delgada de dsDNA es el hecho de que el electrodo no está
Cubierto completamente permitiendo la difusión de moléculas desde la solución a granel.
A la superficie y su adsorción no específica. Esto lleva a dos
Contribuciones a la señal electroquímica, una de las simples adsorbidas.
compuesto y otro por el daño al dsDNA inmovilizado, y es difícil
Distinguir entre las dos señales [123].
La gran ventaja de la película gruesa de dsDNA es que la superficie HOPG es
completamente cubierto por dsDNA para que la unión no deseada de moléculas a
La superficie del electrodo es imposible. La respuesta del biosensor de ADN es, pues, única.
determinado por la interacción del compuesto con el dsDNA en la película,
Sin ningún aporte de la reacción electroquímica del compuesto.
en la superficie del sustrato HOPG.
Evidencia de que las moléculas de ADNb derivatizadas con tiol en las superficies de oro,
adsorbidos bajo control potencial, sufren un cambio morfológico en el que la
las hélices se paran derechas o se recuestan sobre la superficie metálica,
Dependiendo del potencial aplicado con relación al potencial de carga cero.
(pzc), ha sido descrito por Barton y colaboradores [92]. En positivo aplicado
los potenciales del eje helicoidal se vuelven paralelos a la superficie del electrodo, la base
pares orientados verticalmente contra la superficie del electrodo, lo que lleva a la
conclusión de que el espesor de una monocapa de dsDNA adsorbido en el
La superficie del electrodo es inferior a 2 nm. La posibilidad de controlar la cobertura.
de la superficie del electrodo y seleccionando la orientación del ADN utilizando pequeñas
Cambios en el potencial abre nuevas perspectivas para el desarrollo y
Aplicaciones de ADN biosensores electroquímicos. Un chip de silicona con una matriz.
Heller y colaboradores [93] utilizaron electrodos de platino para la biotina -
Inmovilización de oligonucleótidos mediada por estreptavidina e hibridación
Se controló mediante el ajuste de la intensidad del campo eléctrico.
La superficie del electrodo puede modificarse inmovilizando ssDNA o
dsADN. El biosensor ssDNA electroquímico utiliza oligonucleótido corto
secuencias para la capa de reconocimiento de superficie capaz de identificar un
secuencia de nucleótidos complementaria de un ADN diana a través de híbridos
ización. El biosensor dsDNA electroquímico puede predecir el mecanismo.
y detectar el daño causado al ADN por compuestos peligrosos para la salud que
causa roturas de la hebra y posibilita la detección electroquímica de la
Bases expuestas. Procedimientos de inmovilización y tratamiento químico de un
Electrodo por reacciones químicas o por quimisorción alterar su superficie que
Debe caracterizarse por técnicas de superficie. La puesta a punto del electrodo.
 El potencial permite la generación in situ de radicales a partir de electroactivos.

195

Página 18

Soy Oliveira Brett

Compuestos que interactúan con el ADN seguidos por los electroquímicos.

Detección del daño.
Biosensores electroquímicos de secuencias de ADN utilizando electroquímicos directos.
Detección de hibridación de ADN, análisis de trazado por adsorción, complejo metálico.
Indicadores de hibridación, hibridación electroactiva de compuestos orgánicos.
Se han considerado indicadores y sondas renovables de ADN [65,67,72,73].
Con complejos metálicos e hibridación electroactiva de compuestos orgánicos.
Indicadores, adsorción no específica puede influir en los resultados [68,94]. Crono
Se usó detección potenciométrica para monitorizar la hibridación en pantalla
Electrodos de carbono impresos siguiendo la oxidación del pico de guanina,
que disminuye en presencia de la cadena complementaria [64,68,73].
El ADN tiene cuatro sitios de coordinación potenciales diferentes para unirse al metal.
iones: los átomos de oxígeno fosfato cargados negativamente, los hidroxilos de ribosa,
Los nitrógenos del anillo de base y los grupos ceto de base exocíclicos. Iones metálicos como
Na þ , K þ , Mg 2Þ y Ca 2Þ existe en el cuerpo en concentraciones elevadas y la
Los ácidos nucleicos y los nucleótidos aparecen como complejos coordinados con estos iones.
Debido al gran potencial de los métodos electroquímicos para estudiar la
adsorción y reacciones de moléculas biológicas en interfaces electrificadas,
han sido utilizados por investigadores que han estado estudiando iones metálicos – ADN
interacciones
Estudios de agentes metalointercaladores redox activos en presencia de
dsDNA se ha hecho con soluciones que contienen los complejos redox de
Cobalto, hierro y osmio [64,68,72,95]. Complejos de tetróxido de osmio con
Las aminas terciarias (Os, L) se han utilizado como una sonda química de la estructura del ADN.
La determinación simultánea, basada en una separación de picos suficiente en el
La escala de potencial de (Os, L): aductos de ADN y libres (Os, L) se obtuvo de
Fojta et al. [96] utilizando un electrodo de grafito pirolítico.
La unión de ligando y ligando sustituyentes en complejos de
El rutenio (II) ha sido investigado por Barton y colaboradores [97,98] en
Una moda sistemática y los parámetros vinculantes para las series comparadas.
Con el fin de determinar las diferentes funcionalidades de ligando y tamaños en
Unión con ADN, es decir, intercalación y unión superficial. Fue encontrado
que si se comparan los diversos factores que contribuyen a estabilizar el
complejos metálicos de rutenio en la hélice del ADN, parece que lo más
Un factor significativo es el de la forma molecular.
Los complejos que más se ajustan a la estructura helicoidal del ADN, aquellos
en el que las interacciones de van der Waals entre complejo y ADN son
maximizado, muestra la mayor afinidad de unión. El enlace era
interpretado por Barton y colaboradores [99] en términos de la interacción de
Interacciones electrostáticas de los complejos de coordinación de metales con el

196
Página 19

Biosensores basados ​en ADN

esqueleto de azúcar-fosfato cargado y el intercalative, hidrofóbico

interacciones dentro de la hélice del ADN, es decir, los pares de bases apiladas p. Estas
Los agentes de metalointercalación se han utilizado a menudo como híbridos electroactivos.
Indicadores basados ​en su diferente interacción con dsDNA y
ssDNA.
Se han utilizado electrodos de oro modificados con sondas de ADN para detectar.
Hibridación utilizando indicadores electroquímicamente activos [100,101]. Un sándwich-
tipo ternario complejo con un ADN objetivo ha sido descrito por Maeda y
colaboradores [102] para la detección electroquímica de hibridación basada en un
conjugado ferroceno-oligonucleótido. Coloidal Au fue utilizada por Fang y co-
trabajadores [103] para mejorar la inmovilización de ssDNA en un electrodo de oro y
La hibridación se llevó a cabo mediante la exposición del ADNss que contenía
Electrodo de oro para ssDNA complementario marcado con ferrocencarboxaldehído.
Un inconveniente es que la oxidación de las bases de ADN se produce a mayor positivo
Potenciales y nunca se pueden observar con electrodos de oro.
Detección electroquímica de hibridación de ADN en nanopar de Au coloidal.
Los tics han sido combinados por Wang et al. [104] con un biomagnético avanzado.
tecnología de procesamiento que combina la eliminación magnética eficiente de
ADN hibridado con mezcla magnética de bajo volumen desarrollado por Limoges
y compañeros de trabajo [105]. La hibridación de un oligonucleótido diana a
oligonucleótidos unidos a perlas magnéticas fue seguido por la unión de la
Nanopartículas de metal recubiertas con estreptavidina para el ADN capturado, disolución de
La etiqueta de oro de tamaño nanométrico y las medidas de extracción potenciométrica.
de la etiqueta de metal disuelto en electrodos de carbón de película gruesa de un solo uso. Esta
Ensayo de hibridación genomagnética electroquímica también se aplicó a
estreptavidina-fosfatasa alcalina (AP) mediante un sándwich ligado a enzimas
Solución de hibridación por Wang et al. [106].
Los ensayos de hibridación de ADN enzimático con detección electroquímica pueden
Ofrecen mayor sensibilidad y menores costos de instrumentación en comparación.
Con sus homólogos ópticos. Los esfuerzos para prevenir la unión no específica de la
Enzima codisuelta y para evitar problemas de ensuciamiento seleccionando condiciones.
adecuados para amplificar la respuesta del electrodo han sido reportados por Heller y
compañeros de trabajo [107]. Un sensor electroquímico desechable basado en un
El electrodo impreso de pantalla recubierto con película de intercambio fue descrito por Limoges y
Compañeros de trabajo para un ensayo enzimático de hibridación de ácido nucleico usando alcalina
fosfatasa [108] o peroxidasa de rábano picante [109]. En otra metodología para
mejorar la sensibilidad, un electrodo de pasta de carbono con un nucleótido inmovilizado
en la superficie del electrodo y el azul de metileno como indicador de hibridación era
acoplado, por Mascini y colaboradores [110], con amplificación por PCR de ADN
Extraído de sangre humana para la detección electroquímica de virus.

197

Página 20

Soy Oliveira Brett

Originalmente desarrollado como un fármaco dirigido a los genes [15-17], PNA, como se mencionó
Anteriormente, demuestra propiedades de hibridación hacia complementarias.
Las secuencias de ADN y el comportamiento de adsorción se estudiaron mediante AC.
 mediciones de impedancia en un electrodo colgante de gota de mercurio (HMDE) por
Palecek y colaboradores [111]. La capacidad diferencial del electrodo doble.
La capa se midió en función del potencial. La adsorción de ANP, con una
espina dorsal neutral, fue considerablemente diferente de la del ADN, sin ANP
Desorción que ocurre incluso después de la aplicación al electrodo de un alto
Potencial negativo por un largo periodo de tiempo.
Las mediciones de impedancia electroquímica también se utilizaron para detectar la
La hibridación de ADN en chips de Si / SiO 2 y gran énfasis ha sido puesto por
Cloarec et al. [112] sobre la inmovilización de cadenas simples sobre los sustratos en
Para obtener sensores reproducibles. La adsorción de dsDNA y
Los nucleótidos en una superficie de carbono vítreo también han sido evaluados por
espectroscopia de impedancia química por Oliveira Brett et al. [113,114].
La utilización de una matriz de dsDNA para ayudar a la inmovilización de enzimas es también una
Alternativa prometedora para el desarrollo de biosensores de ADN y sus
Aplicación en sistemas de análisis de inyección de flujo (FIA). Un ADN tirosinasa de carbono.
El electrodo de pasta descrito por Serrano y colaboradores [115] mostró una excelente
rendimiento para la detección de catecol en un sistema FIA y sugiere que
Otros biosensores enzimáticos pueden beneficiarse de la presencia de ADN.
La actividad citostática de varios medicamentos de platino ha demostrado que el platino
complejos de coordinación causan una inhibición irreversible de la síntesis de ADN debido a
Unión covalente con el ADN. Esto hace que el tratamiento sea a menudo
Acompañado de reacciones adversas. Se utilizó voltamperometría diferencial de pulso.
Para investigar las interacciones de los complejos de coordinación de platino con fuertes
agentes anticancerígenos en solución con ADN por Oliveira Brett et al. [116,117]. los
Los fármacos que interactúan con el ADN previenen el crecimiento celular, pero no solo el crecimiento de células cancerosas;
El efecto citotóxico también bloquea el crecimiento de las células normales. La falta de
La selectividad de los medicamentos contra el cáncer es uno de los principales problemas en la quimioterapia contra el cáncer.
y los biosensores de ADN son una herramienta importante para la investigación de la
Mecanismo químico y biológico de los fármacos activos contra las células cancerosas.
Los nitroimidazoles se encuentran entre los fármacos nitroheterocíclicos más importantes de
Interés en la quimioterapia contra el cáncer. Se observó que la adenina y la guanina.
interactuar con intermedios generados durante la reducción de nitroimidazol,
causando daños irreversibles al ADN y sugiriendo propiedades mutagénicas de
estos compuestos. El mecanismo de reducción de un grupo de nitroimidazoles.
fue investigado por un nuevo enfoque de Oliveira Brett et al. [118-122] utilizando
El biosensor del ADN. El analito se concentró previamente en la superficie del electrodo.
que contiene ADN y ya sea la reducción o la oxidación de la reducción

198

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Biosensores basados ​en ADN

Se estudiaron productos retenidos en la superficie del electrodo. Era posible

Sigue su reducción, la oxidación reversible de la hidroxilamina.
derivado (RNHOH) al correspondiente derivado nitroso (RNO), el
Reacción de condensación entre los derivados de hidroxilamina y nitroso para
forman el compuesto azoxi (RNO: NR) y la interacción con el ADN.
Detección electrostática voltamétrica in situ de daño oxidativo dsDNA
causado por la reducción de adriamicina, un antibiótico de la familia de las antraciclinas,
intercalados en el ADN, se llevó a cabo utilizando un biosensor de ADN. Oxidación
y la reducción de las moléculas de adriamicina intercaladas en dsDNA se investigaron
 cerrada
Mecanismopor Oliveira
de acciónBrett et al. [123]
del ADN para
con este entender
fármaco lo in vivo. Sin embargo, no es
antineoplásico.
posible detectar el daño de adriamicina-ADN al monitorear solo los cambios
En el pico de oxidación adriamicina. El daño al dsDNA inmovilizado causa.
La aparición de picos de oxidación a partir de bases de ADN y esto siempre debe ser
Medido y tomado en cuenta, Fig. 4.5. Los resultados mostraron que la
La interacción de adriamycin con dsDNA es potencialmente dependiente y causa contacto.
entre las bases de ADN guanina y adenina y la superficie del electrodo de modo que
Su oxidación es fácilmente detectable, Fig. 4.6. Un mecanismo para la adriamicina.
reducción y oxidación in situ cuando se intercala en dsDNA inmovilizado en
Se propuso la superficie del electrodo de carbono vítreo. Este mecanismo conduce a la
Formación de la mutagénica 8-oxoguanina, cuyo comportamiento redox fue estudiado.
por Oliveira Brett et al. [124,125].
Esta información es muy relevante porque el mecanismo de interacción de
ADN-fármaco en las interfaces cargadas imita mejor el ADN-fármaco in vivo
situación compleja, donde se espera que el ADN esté en estrecho contacto con
membranas y proteínas de fosfolípidos cargados, en lugar de cuando el
La interacción está en solución. El daño oxidativo al ADN fue demostrado por
Barton y colaboradores [126] dependen del potencial de oxidación. Oxidativo
el daño puede ser promovido desde un sitio remoto como resultado del agujero de electrones
Migración a través de la pila p de ADN: el agujero migra hacia abajo de la doble hélice.
para dañar la guanina, un sitio sensible al daño del ácido nucleico oxidativo dentro de
la célula.
Del mismo modo, la detección de daños en el ADN que implican roturas de la cadena fue
observado por Palecek y colaboradores [127] utilizando un HMDE. Extenso
escisión de ADN confinado en electrodo por especies reactivas de oxígeno (ROS) fue
obtenido en ausencia de reductores químicos cuando el ciclo redox de la
El metal (complejo hierro / ADN) fue controlado. No solo los agentes de escisión eran
detectado, pero también se moduló la escisión del ADN, generando el
Especies que dañan el ADN electroquímicamente.

199

Página 22

Soy Oliveira Brett

 Fig. 4.6. Voltamogramas diferenciales de pulso de fondo restado en pH 4.5 0.1 M
tampón de acetato obtenido con una capa gruesa de GCD modificada con dsADN después de sumergirse
durante 10 minutos en una solución de adriamicina 1 mM y se enjuaga con agua antes de
experimento en búfer: (···) sin potencial aplicado; (-) escaneo posterior después de
Aplicando un potencial de 20.6 V durante 120 s. Amplitud de pulso, 50 mV; ancho de pulso,
70 ms; Velocidad de barrido, 5 mV s . (Reproducido de la Ref. [123] con permiso de Elsevier.)
21

El ADN adsorbido en un electrodo de carbono vítreo también se utilizó como

promotor de electrones efectivo que permite la transferencia de electrones a través de conductos de salto.
a través del electrodo / par de bases / citocromo c por Ikeda et al. [128]. Oro
Electrodos modificados con oligonucleótidos cortos inmovilizados a través de tiol.
La quimisorción fue descrita por Lisdat et al. [129] para estudiar la promoción.
de transferencia de electrones al citocromo c.
La detección de sustancias químicas que causan daños irreversibles al ADN es
Muy importante, ya que puede conducir a enfermedades hereditarias o carcinógenas. ADN
Los biosensores se han utilizado para medir trazas de aminas tóxicas.

200

Página 23

Biosensores basados ​en ADN

compuestos, compuestos de fenotiazina con neurolépticos y antidepresivos

Acción, así como la detección de daños en el ADN inducido por la radiación por Wang y
compañeros de trabajo [130]. Pruebas de cribado de carcinógenos basados ​en voltametría.
Se desarrollaron medidas para estudiar el daño in vitro al ADN causado por
La acción de los contaminantes por Oliveira Brett y Silva [131], patógenos por
Palecek y colaboradores [67] y la detección de la formación de aductos de ADN que
iniciar el proceso carcinogénico, como los aductos de benzo [a] pireno-ADN mediante
Ozsoz y colaboradores [132]. La aplicación del ADN electroquímico.
Biosensores para detección en alimentos de patógenos bacterianos y virales responsables.
para la enfermedad, debido a sus secuencias únicas de ácido nucleico, es atractivo pero
Todavía tiene algunos inconvenientes en comparación con las técnicas de inmunobiosensores.
por Limoges [133], Wilsins [134] y colaboradores.
Microprocesadores de electroforesis capilar (CE) microfabricados con integrado
La inyección y la detección electroquímica indirecta se utilizaron para
Fragmento de restricción de ADN de sensibilidad y tamaño de producto de PCR por Mathies
y compañeros de trabajo [135]. El acoplamiento de este y otros ADN electroquímicos.
Los esquemas de detección con dispositivos microfluídicos son muy prometedores para la genética.
pruebas según lo descrito por Wang [136].
El desarrollo de biosensores de ADN electroquímicos abrió un amplio
perspectiva utilizando un método particularmente sensible y selectivo para el
Detección de interacciones específicas. La posibilidad de prever el daño que
Estos compuestos causan que la integridad del ADN surja de la posibilidad de
Concentración de los materiales de partida o de los productos de reacción redox.
 en
La la superficie
presencia dedel biosensorde
intermedios decorta
ADN, permitiendo
duración asídaño
y de su el sondeo electroquímico de
al ADN.
Efectivamente, el biosensor electroquímico de ADN permite la concentración previa.
del fármaco investigado sobre la superficie del sensor del electrodo e in situ
Generación electroquímica de radicales que dañan el ADN.
inmovilizado en la superficie del electrodo de carbono vítreo y puede ser detectado
electroquímicamente. Sin embargo, la cobertura no uniforme de la superficie del electrodo por
El ADN y la adsorción del fármaco en el carbono vítreo desnudo, Fig. 4.5, pueden llevar a
Contribuciones tanto de analito adsorbido simple como de productos de daño
Al ADN inmovilizado, que necesita ser distinguido cuidadosamente. El daño a
El ADN inmovilizado siempre conduce a la aparición de picos de oxidación de
Bases de ADN o incluso 8-oxoguanina como muestran Oliveira Brett et al. [123–125],
El cual debe ser monitoreado y tomado en cuenta.
El uso de biosensores electroquímicos de ADN para la comprensión del ADN.
Las interacciones con moléculas o iones explotan el uso de voltamétrico.
Técnicas para la generación in situ de intermedios reactivos y es un
Herramienta complementaria para el estudio de los mecanismos de interacción biomolecular.

201

Página 24

Soy Oliveira Brett

Los métodos voltamétricos son un procedimiento de detección barato y rápido.

Adicionalmente, la interpretación de datos electroquímicos puede contribuir a
elucidación del mecanismo por el cual el ADN es dañado por oxidación por tales
sustancias, en una aproximación al escenario de acción real que se produce en el
celula viva.

4.5 CONCLUSIONES

Los biosensores de ADN descritos muestran claramente la relevancia e importancia de

Diferentes tipos de transductores para el estudio del mecanismo biológico del ADN.
Interacciones y de las relaciones estructura-actividad. La detección de ADN puede ser
llevado a cabo por varias estrategias de detección diferentes y, como se muestra, cada ADN
El biosensor tiene algunas ventajas claras y todos los enfoques son importantes para
lograr una respuesta correcta.
Los nuevos biosensores de ADN combinarán información de más de uno.
Transductor para caracterización y análisis de oligonucleótidos y
ADN trenzado en interfaces, utilizando nuevos procedimientos de inmovilización y mejores
Conocimiento de la cobertura superficial para evitar adsorciones no específicas.
afectando la eficiencia de hibridación. Un ensayo de hibridación para el directo.
la detección de una secuencia genómica específica de una enfermedad infecciosa necesitaría,
según Diamandis [137], una sensibilidad que permite la detección de 10 4 –10 5
copias de un ADN objetivo específico que está muy por debajo de las sensibilidades actuales
obtenible con la ayuda de sistemas de amplificación antes de la detección, tales como
PCR. Serán necesarias otras rutas para mejorar la detección de ADN, pero en el
En el futuro es casi seguro que los biosensores de ADN formarán parte de los kits de diagnóstico.
La comprensión del mecanismo de acción de las drogas que interactúan con
El ADN explicará las diferencias en la reactividad entre compuestos similares.
Este conocimiento puede ser usado como un parámetro importante para la evaluación cuantitativa.
relaciones estructura-actividad (QSAR) y / o estudios de modelado molecular,
como contribución al diseño de nuevos fármacos de unión al ADN específicos de la estructura,
 yintegridad.
por la posibilidad de preseleccionar el daño que pueden causar al ADN
Los biosensores de ADN tienen un gran potencial para numerosas aplicaciones que
Incluirá nuevas mejoras para la detección de un solo nucleótido.
Análisis de polimorfismos (SNP) en medicina personalizada, organismos patógenos.
ismos en el campo del control de alimentos, y contaminantes tóxicos en el medio ambiente
supervisión.
Los biosensores de ADN continuarán explotando la notable especificidad de
reconocimiento biomolecular para proporcionar herramientas analíticas que pueden medir la
Presencia de una sola especie molecular en una mezcla compleja, riesgo de preselección.

202

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Biosensores basados ​en ADN

Compuestos que causan daño al ADN y ayudan a explicar el ADN-proteína.

interacciones

Expresiones de gratitud

Apoyo financiero de Fundaça˜o para a Ciência e Tecnologia (FCT), proyectos

POCTI (cofinanciado por el fondo de la Comunidad Europea FEDER), ICEMS
(Unidad de Investigación 103), y Proyectos Europeos ERBICT15-CT98-0915, QLK3-
2000-01311, y HPRN-CT-2002-00186 son reconocidos con gratitud.

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