Manual Practicas IG 2019 PDF

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT
ÁREA DE CIENCIAS DE LA SALUD
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS
LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

ACADEMIA DE INMUNOBIOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE DE

INMUNOLOGÍA GENERAL
Responsables de la elaboración del manual Coordinador de la elaboración del manual
Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

Dr. Héctor Torres Larios
Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián
Ciudad de la Cultura “Amado Nervo”, Tepic Nayarit Octubre de 2016
Este documento cuenta con 78 páginas que contienen esquemas, dibujos y anexos
DIRECTORIO
Rector
M. en C. Ignacio Peña González
Secretaria de Docencia
M.T.A. Norma Liliana Galván Meza
Coordinador del Área de Ciencias de la Salud
M.O. Julio Cesar Rodríguez Arámbula
Directora de la Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y

Farmacéuticas
Q.F.B. Nadia Roxana Martínez Rubio
Coordinador de Programa
M en C Isaac Espinoza Santana
Subdirectora Académica
M. en C. Isabel Cristina Medina Carrillo
1
ÍNDICE
Página
INTRODUCCIÓN 4
COMPETENCIAS INTEGRADAS AL SISTEMA DE PRÁCTICAS 5
ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS DENTRO DE LA PROFESIÓN 5
CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL 6
NIVELES DE DESEMPEÑO 7
DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS 7
PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD 8
REGLAMENTO PARA USO DE LOS LABORATORIOS DE 8
PRÁCTICAS DE LA UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO
BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS DE LA UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA DE NAYARIT
DISPOSICIONES DE ORDEN GENERAL 12
REGLAMENTOS DE SEGURIDAD E HIGIENE 12
NORMAS BÁSICAS DE COMPORTAMIENTO Y PROTECCIÓN 14
PRÁCTICA No. 1 PIPETEO DE SOLUCIONES 16
Introducción 17
Competencia específica de la Práctica 18
Criterios de desempeño 19
Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica 19
Cuadro de disposición de desechos 19
Normas oficiales mexicanas específicas de la práctica 20
Desarrollo de la práctica 20
Resultados esperados en relación con los criterios de desempeño 24
Criterios de calificación de la práctica 25
PRÁCTICA No. 2 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN 26
Introducción 27
Competencia específica de la Práctica 28
PRÁCTICA No. 3 REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN 37
Introducción 38
Competencia de la Práctica 39
2
PRÁCTICA No. 4 WESTERN-BLOT 44
Introducción 45
PRÁCTICA No. 5 ELISA 57
Introducción 58
CALIFICIÓN DE LAS PRÁCTICAS 69
CRITERIOS DE ACREDITACIÓN 69
ACERVOS DE CONSULTA 70
GLOSARIO DE TÉRMINOS 71
ANEXO (SOLUCIONES) 73
3
INTRODUCCIÓN
La unidad de aprendizaje de Inmunología General incluye el desarrollo de métodos que

pongan de manifiesto los procesos inmunológicos involucrados en el estado de salud y
enfermedad de un individuo.
En esta parte del curso-laboratorio, se desarrollan capacidades prácticas para la

determinar células y moléculas del sistema inmune humano que tienen que ver con
estados de salud-enfermedad y que coadyuvan con el diagnóstico médico. Los métodos
que se utilizarán en el curso-Laboratorio son la base de aquellos utilizados en el
diagnóstico clínico. Asimismo, se ponen en práctica las normas oficiales mexicanas que
versan sobre el uso de disposición final de residuos peligrosos biológico-infecciosos
(NOM86), la seguridad laboral, así como el fortalecimiento del trabajo en equipo.
Esta unidad de aprendizaje utiliza los conocimientos adquiridos de Biología Celular,

Bioquímica, Bioquímica avanzada, Microbiología, análisis Instrumental, morfofisiología.
Asimismo, tiene relación con otras unidades de aprendizaje posteriores, sobre todo con
aquella que tienen que ver con el diagnóstico de enfermedades, búsqueda de principios
activos, y las relacionadas con la detección de metabolitos de interés clínico.
Este manual está constituido por cinco prácticas, que pueden ser completadas en un
tiempo de 3 horas semanales.
En cada práctica de presente una breve introducción a la temática, los reactivos y

métodos a utilizar, en forma de instrucciones numeradas que se complementan con
figuras y esquemas. Asimismo, un espacio para la construcción de un diagrama de
flujo, necesario para realizar la práctica.
4
COMPETENCIAS INTEGRADAS AL SISTEMA DE PRÁCTICAS
Al desarrollar las prácticas del Inmunología General serás competente para:
 Aplicar los métodos que pongan de manifiesto los diferentes procesos

inmunológicos en un individuo.
 Relacionar los datos obtenidos de la práctica con los fundamentos teóricos,
que permitan interpretar los procesos inmunológicos involucrados.
 Aplicar la normatividad involucrada en bioseguridad y buenas prácticas en el
Laboratorio (NOM062, NOM086, ZOO 1999, reglamento de Laboratorio).
 Desarrollar los aspectos éticos profesional-paciente
ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS DENTRO DE LA PROFESIÓN
Este manual te permitirá relacionar los aspectos teóricos de los procesos inmunológicos
que tienen que ver con la reacción antígeno-anticuerpo, que son base para aquellas
que se utilizan en el diagnóstico clínico. Asimismo, te permitirá interpretar resultados y
relacionarlos con el estado de salud de un individuo.
5
CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL
CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL
Necesidades de Competencia Perfil profesional Unidades de Unidad de competencia

formación integrada aprendizaje
profesional
Aplica técnicas de El Químico Farmacobiólogo es el profesional del

análisis clínicos a las área de la salud que reúne los conocimientos,
condiciones de cada destrezas y actitudes que le permiten el uso de la
ciencia básica y aplicada relacionada con sistemas
paciente en todas sus
químicos, biológicos y farmacéuticos desarrollando
fases métodos, ejecutando procedimientos y evaluando
El conocimiento de las resultados.
Recolección de fluidos y Durante el desarrollo de la unidad de
técnicas inmunológicas
excretas. permitirá que el aprendizaje el estudiante será
Las habilidades del Químico Farmacobiólogo
estudiante realice egresado de la Unidad Académica de Ciencias competente para conocer, identificar,
Ejecuta métodos de determinaciones de Químico Biológicas y Farmacéuticas le permiten Inmunología describir y clasificar los mecanismos
laboratorio para moléculas involucradas investigar, generar y mejorar recursos para aplicar, moleculares y celulares involucrados
General
análisis, en los procesos de desarrollar, evaluar, analizar así como prestar tanto en la respuesta inmunitaria, así como
salud-enfermedad de un servicio como asesoría sobre las ciencias aplicar métodos que pongan de
determinaciones,
sujeto, con apego a la relacionadas con la salud a todos los niveles, que
control de calidad en los manifiesto los diferentes procesos
reglamentación sanitaria permitan prevenir y diagnosticar enfermedades,
laboratorios implicados para la correcta inmunológicos para relacionar su
mantener y recuperar la salud en todas sus
en su ejercicio disposición de residuos condiciones, por medio de métodos o procesos participación con el estado de salud de
profesional peligrosos biológico químicos, fisicoquímicos y biológicos. un individuo, tomando en cuenta la
infeccioso y químicos. normatividad vigente y los aspectos
Separación y Su campo de acción es muy amplio, éticos profesional-paciente.
recolección de RPBI. concentrándose en el campo de la salud, ciencias
forenses, área farmacéutica y alimenticia, con gran
capacidad de trabajo interdisciplinario dentro de un
Aplicación de
marco de ética, responsabilidad y compromiso
legislación sanitaria hacia su entorno social, respondiendo de forma
efectiva ante las grandes necesidades presentes y
Anatomía y determinantes para su desarrollo. Respetando y
funcionamiento del aplicando en todo momento la normatividad vigente
cuerpo humano y aplicable.
6
NIVELES DE DESEMPEÑO
Con el sistema de prácticas que se aborda en este manual tú nivel de desempeño será
2, ya que se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo, variadas y
aplicadas en diversos contextos. Algunas actividades son complejas y no rutinarias.
Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonomía en las decisiones. A menudo
requiere colaboración con otros y trabajo en equipo.
DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS
COMPETENCIA TIPO DE
SEMANA PRÁCTICAS BIBLIOGRAFÍA
ABORDADA PRÁCTICA
Control de la
Pipeteo de
dispensación de 2-3 Laboratorio Básica
soluciones
líquidos
Identificación de
Reacciones de
Células del sistema 4-6 Laboratorio Básica
precipitación
inmunológico
Reacción de
7-8 Laboratorio Básica
Evidenciar la aglutinación
interacción antígeno-
9-13 Western-blot Laboratorio Básica
anticuerpo
14-17 ELISA Laboratorio Básica
PRÁCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD
REGLAMENTO PARA USO DE LOS LABORATORIOS DE PRÁCTICAS DE LA

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS
DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT
OBJETIVO GENERAL
Que toda persona que haga uso de los laboratorios de prácticas de las unidades de aprendizaje
de la unidad académica conozca y acate los lineamientos y normas a seguir en ellos, para
mantener su buen funcionamiento, así como los derechos y obligaciones que como usuario de
laboratorio tienen para salvaguardar la seguridad de todos los que en ellos trabajen.
DISPOSICIONES GENERALES
ARTÍCULO 1.- Las prácticas serán estrictamente supervisadas por el docente responsable. En
caso contrario, estas no podrán realizarse debiendo ser reprogramadas de acuerdo con la
disponibilidad del laboratorio. Excepcionalmente la dirección de la unidad académica podrá
nombrar un suplente.
ARTÍCULO 2.- Durante las sesiones, queda estrictamente prohibido hacer uso de juegos
electrónicos, celulares, computadoras portátiles, reproductores de música y todo equipo ajeno a
la práctica. El hacer caso omiso de esto, obligará a pedir la salida inmediata del laboratorio. En
este caso se considerará inasistencia a la práctica correspondiente.
ARTÍCULO 3.- Se prohíbe fumar y consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio.
ARTÍCULO 4.- Es obligatorio traer uñas recortadas y cabello recogido.
ARTÍCULO 5.- En caso de utilizar el microscopio queda estrictamente prohibido traer rímel en
las pestañas, de lo contrario no podrá realizar la práctica. En este caso se considerará
inasistencia a la práctica correspondiente.
8
ARTÍCULO 6.- Durante el desarrollo de las prácticas, es obligatorio el uso de bata blanca
debidamente cerrada, así como zapato cerrado y de piso. En caso de ser necesario, deberá
usarse guantes, cubre boca y/o mascarilla, cofia, lentes de seguridad.
ARTÍCULO 7.- Todas las sustancias, equipos y materiales deberán ser manejadas con el
máximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de procedimiento, de
seguridad y demás normas aplicables, según sea el caso.
ARTÍCULO 8.- En caso de cualquier accidente personal, de equipo o material de trabajo; debe
notificarse inmediatamente al maestro o al responsable.
ARTÍCULO 9.- La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes y los Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos deberán tratarse de acuerdo a lo establecido en la norma
NOM-087-ECOL-2002.
ARTÍCULO 10.- En caso de requerir que algún equipo trabaje de manera continua, deberá
dejarse en el interior del laboratorio correspondiente, la información acerca del tipo de reacción
o proceso en desarrollo, las posibles fuentes de problema, la manera de controlar los
eventuales accidentes y la forma de localizar al responsable de la unidad de aprendizaje.
ARTÍCULO 11.- Se prohíbe realizar cualquier tipo de actividades ajenas al desarrollo de

práctica.
DEL RESPONSABLE DEL LABORATORIO
ARTÍCULO 12.- El responsable del laboratorio tendrá las siguientes obligaciones:
a) Leer íntegramente el presente reglamento en la primera sesión de trabajo de cualquier curso

que se imparta en laboratorios.
b) Llevar la agenda de uso del laboratorio.
c) Atender a los diferentes grupos que tomen prácticas, independientemente del programa
educativo o unidad de aprendizaje de que trate.
d) Cuidar los equipos y materiales que en el laboratorio se encuentren.
e) Asegurar que los reactivos y materiales para cada práctica se encuentren listos para el día y
hora programada.
9
f) Asegurar que los reactivos que se preparen se encuentren perfectamente etiquetados con el
nombre de la sustancia a la que se refiere, fecha de preparación, caducidad, grupo y turno. Así
como también especificar condiciones de almacenamiento.
g) Al finalizar las actividades en el laboratorio, deberá verificar que queden cerradas las llaves
de gas, agua, según sea el caso, apagados los equipos utilizados, luces, etc.
h) Mantener actualizado el inventario de equipo, reactivos y material del laboratorio.
i) Elaborar y /o actualizar el manual de procedimientos del laboratorio.
j) Solicitar en tiempo los reactivos y consumibles que se requieren al responsable

administrativo.
k) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la
Salud o Consejo de Programa Académico.
DEL MAESTRO TITULAR DE LABORATORIO
ARTÍCULO 13.- El maestro titular de laboratorio tendrá las siguientes obligaciones:
a) Entregar con anterioridad el manual de práctica que se utilizará durante el curso al

responsable del laboratorio, para la organización de las prácticas a realizarse.
b) Presentarse de manera puntual, de preferencia 10 minutos antes del horario acordado.
c) Dar a conocer el programa de prácticas en la primera sesión, así como formar equipos, para
ser asignados el primer día del curso a una mesa de trabajo, para todo el semestre.
d) Supervisar las actividades que se realicen en los laboratorios.
e) Permanecer durante el desarrollo de la práctica y salir del laboratorio hasta que el último
alumno haya concluido.
f) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la
Salud o Consejo de Programa Académico.
DE LOS ALUMNOS
ARTÍCULO 14.- Los alumnos tendrán las siguientes obligaciones:
10
a) Ingresar al laboratorio a la hora indicada para la práctica y permanecer en el hasta el término
de ella.
b) Respetar la tolerancia máxima para entrar al laboratorio, que será de 10 minutos con
respecto a la hora programada. Si se excede de este tiempo se considerará como inasistencia
injustificada.
c) En caso de inasistencia justificada con escrito de la Dirección, el alumno reprogramará la

práctica con el maestro considerando la disponibilidad del laboratorio.
d) Colocar mochilas o cualquier otro material ajeno a la práctica en el lugar establecido para
ello.
e) Responsabilizarse del material y equipo que utilicen en las diferentes actividades

desarrolladas en los laboratorios.
f) Hacer buen uso del material y equipo de laboratorio. Si por descuido, negligencia o uso
indebido este es dañado por una persona, el importe de la reparación o sustitución del mismo
será cubierto por el alumno o equipo correspondiente.
g) El alumno que sustraiga material, sustancias y/o equipo de laboratorio se le prohibirá el

ingreso al Laboratorio y se aplicarán las sanciones correspondientes establecidas en la Ley
Orgánica Universitaria y el Estatuto de Gobierno.
h) Si se requiere material adicional para realizar la práctica, deberá solicitarse al responsable

del laboratorio.
i) Al terminar las actividades desarrolladas deberán entregar su material limpio y dejar aseada el
área de trabajo.
j) Por ningún motivo deben permanecer los alumnos en el laboratorio después de la salida del
maestro o responsable de laboratorio.
k) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la Salud o Consejo de

Programa Académico.
Transitorios
Primero. El presente reglamento entrará en vigor el día 06 del mes de agosto de 2007 y deroga
todas las disposiciones anteriores.
11
DISPOSICIONES DE ORDEN GENERAL
Es este apartado se establecen los reglamentos y recomendaciones que deberás observar

durante TODAS las prácticas y estancia en el laboratorio de Inmunología General. Es
importante que sepas que la aplicación de estos preceptos serán evaluados en cada una de las
prácticas y que es tu responsabilidad cumplirlos y dar evidencia de ello.
REGLAMENTOS DE SEGURIDAD E HIGIENE
NOMBRE, NÚMERO
Y PROCEDENCIA DE
CATEGORIA CRITERIO
LA NORMA
APLICABLE
MEDIO AMBIENTE
En las áreas de generación
de los establecimientos
generadores, se deberán
Manejo de residuos
separar y envasar todos los NOM-087-ECOL-
peligrosos biológico
residuos peligrosos biológico- SSA1-2002
infeccioso
infecciosos, de acuerdo con
sus características físicas y
biológicas infecciosas
Condiciones de
seguridad e higiene en
los centros de trabajo Cumplir con las instrucciones
para el manejo, de uso y mantenimiento del
NOM-005-STPS-1998
transporte y equipo de protección personal
almacenamiento de proporcionado por el patrón
sustancias químicas
peligrosas
Conocer el grado de
peligrosidad y los riesgos de
Sistema para la
las sustancias químicas
identificación y
peligrosas que se utilizan en
comunicación de
el centro de trabajo
peligros y riesgos por NOM-018-STPS-2000
Identificar los depósitos,
recipientes y áreas que
peligrosas en los centros
contengan sustancias
de trabajo.
químicas peligrosas o sus
residuos
12
SISTEMA CONTRA INCENDIOS
Contar con las instrucciones
de seguridad aplicables en
cada área del centro de
Condiciones de trabajo y difundirlas entre los
seguridad - prevención y trabajadores, contratistas y
protección contra visitantes, según corresponda NOM-002-STPS-2010
incendios en los centros Cumplir con las condiciones
de trabajo de prevención y protección
contra incendios en el centro
de trabajo
EQUIPO DE PROTECCIÓN
Condiciones de
seguridad e higiene en
los centros de trabajo Cumplir con las instrucciones
para el manejo, de uso y mantenimiento del
NOM-005-STPS-1998
transporte y equipo de protección personal
almacenamiento de proporcionado por el patrón
peligrosas
Determinar el equipo de
protección personal, que
deben utilizar los trabajadores
Equipo de protección
en función de los riegos de
personal-Selección, uso
trabajo a los que puedan estar NOM-017-STPS-2008
y manejo en los centros
expuestos por las actividades
de trabajo
que desarrollan o por las
áreas en donde se
encuentran
Sistema para la
administración del
Observar los procedimientos
trabajo-seguridad en los
relacionados con los procesos
procesos y equipo NOM-028-STPS-2012
y equipos críticos que difunda
críticos que manejen
el patrón
peligrosas
PLANTA FÍSICA
Condiciones de Contar con los niveles de
iluminación en los iluminación en las áreas de NOM-025-STPS-2008
centros de trabajo trabajo
13
NORMAS BÁSICAS DE COMPORTAMIENTO Y PROTECCIÓN
Deberás utilizar toalla o lienzo para limpieza en caso de requerirse, guantes y cubre
bocas como protección, durante el tiempo de permanencia en el laboratorio.
Pantalón y zapatos (no sandalias): Pantalón de mezclilla y zapatos cerrados.

Necesarios, en caso de derrame de solución, evita el contacto con la piel.
Debes conocer la ubicación exacta del botiquín de primeros auxilios, del extintor y
también de la regadera de seguridad.
En el laboratorio queda estrictamente prohibido comer, fumar y beber, así como jugar y
hacer bromas a los compañeros de prácticas.
Al entrar al laboratorio, debes hacerlo en forma ordenada.
Cuando se realicen las prácticas, se prohibirá el ingreso de personas ajenas y la salida

de alumnos.
En caso de dañar material y/o equipo, deberá ser reemplazado en un máximo de una
semana.
14
CONTENIDO DE CADA PRÁCTICA
15
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y
FARMACÉUTICAS
QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
PRÁCTICA NÚMERO 1
PIPETEO DE SOLUCIONES
Responsables
Q.F.B. Iris Celeste Tovar Ocampo
16
INTRODUCCIÓN
La técnica del pipeteo abarca diferentes herramientas y medios que se requieren para
pipetear. El empleo correcto de la técnica permite dosificar líquidos de forma rápida y
sobretodo precisa, que es de suma importancia para el correcto desarrollo de las
técnicas inmunológicas, que son altamente sensibles 1.
La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir

pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científica
Existen micropipetas de volumen fijo y volumen variable. Las de volumen variable a su
vez están divididas por rangos de volumen, las más comunes van de 0.5-10 µL, de 10-
100 µL, y de 100-100 µL2.
El pipeteo consiste en una práctica sencilla, ¿verdad?
Sólo se trata de aspirar y dosificar líquidos. Aun así, pueden producirse errores con
facilidad y repercutir directamente en la calidad de los resultados. A continuación se
describen algunos consejos para el pipeteo 3:
 Profundidad de inmersión de la punta errónea: la correcta profundidad de

inmersión de la punta puede mejorar la precisión en hasta un 5 %. La punta debe
estar sumergida entre 1 y 2 mm en las pipetas de microvolumen y hasta de 3 a 6
mm en las pipetas de gran volumen, en función del tamaño de la punta. Si la
punta se sumerge demasiado, el volumen de gas de la punta se comprime y
provoca que se aspire demasiado líquido.
 Ángulo de pipeteo erróneo: el ángulo de inmersión de la punta de la pipeta en la
muestra debe ser lo más vertical posible y no debe desviarse más de 20 grados
desde el ángulo vertical. Un ángulo más horizontal provoca que se introduzca
demasiado líquido en la punta, lo que conlleva aspiraciones imprecisas. Por
ejemplo, a un ángulo de 30 grados respecto al ángulo vertical, puede aspirarse
hasta un 0,7 % de líquido en exceso.
17
 Ritmo de pipeteo irregular: utilice un ritmo constante en el pipeteo entre
muestras. Evite ir deprisa o realizar operaciones rápidas, y mantenga el ritmo
para cada paso del ciclo de pipeteo.
 Dosificación irregular: para lograr una precisión y una reproducibilidad superior
entre muestras, asegúrese de dosificar hasta la última gota de la muestra, sin
que quede nada adherido en el extremo de la punta. Para la mayoría de las
aplicaciones, se recomienda la dosificación con el extremo de la punta apoyada
contra la pared del recipiente, ya que así se reduce o se elimina la cantidad de
muestra que queda en la punta. Esta técnica puede aumentar la precisión en un
1 % o más.
 Preenjuague inadecuado o inexistente: La dosificación del líquido de una pipeta
deja un recubrimiento del líquido en la punta, lo que provoca que el volumen
expulsado sea ligeramente inferior de lo que debería ser. Preenjuagar una nueva
punta dos veces, como mínimo, con el líquido que se va a utilizar acondicionará
su interior.
1
http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Manejo_Liquidos&opc=tecnicas&idap=48
2
http://www.pce-iberica.es/instrumentos-de-medida/instrumentos-laboratorios/tecnica-
pipeteo.htm
3
http://www.mt.com/mx/es/home/supportive_content/news/po/pipe/pipetting-techniques.html
COMPETENCIA ESPECÍFICA DE LA PRÁCTICA
El estudiante será competente para la Identificación de componentes, manejo adecuado

y uso de los componentes de ajuste de volumen, aspirado y expulsión de líquidos de
micropipetas de volumen variable
18
CRITERIOS DE DESEMPEÑO
Identifica los componentes de las micropipetas
Describe el funcionamiento de los componentes de ajuste de volumen, aspirado y

expulsión de líquidos
Maneja de manera adecuado las micropipetas de volumen variable
Realiza mediciones de volumen con una precisión ≤ 10%
Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos
Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica
COMO PROCEDER EN
TIPO DE RIESGO COMO EVITARLOS
CASO DE UN ACCIDENTE
Supervisar que los reactivos estén

colocados de acuerdo a su grado de Lavar inmediatamente con
toxicidad. agua abundante, es
Reactivos mal
conveniente retirar la ropa
cerrados (salpicadura
para evitar que el corrosivo
en la piel)
quede atrapado entre la ropa
Que los frascos permanezcan cerrados y y la piel.
ventilados.
Cuadro de disposición de desechos
TIPO DE DESECHOS COMO DESCARTARLOS TIPO DE CONTENEDOR
Depositarlos en contenedores marcado

Vidrios En depósitos de basura
como “Basura Común”.
Depositarlos en contenedores y en
Guantes, cubrebocas En depósitos de basura
bolsas negras, “Basura común”.
19
Normas Oficiales Mexicanas específicas de la práctica
NOMBRE, NÚMERO Y
CATEGORÍA CRITERIO PROCEDENCIA DE LA
NORMA
Equipo de protección Equipo de protección personal acorde con NOM-113-STPS-2009

personal sus características y dimensiones físicas,
así como con los agentes de riesgo.
Condiciones de seguridad e
higiene en los centros de
trabajo para el manejo, Cumplir con las instrucciones de uso y
transporte y mantenimiento del equipo de protección NOM-005-STPS-1998
almacenamiento de personal proporcionado por el patrón
peligrosas
Conocer el grado de peligrosidad y los

Sistema para la riesgos de las sustancias químicas
identificación y peligrosas que se utilizan en el centro de
comunicación de peligros y trabajo NOM-018-STPS-2000
riesgos por sustancias
químicas peligrosas en los Identificar los depósitos, recipientes y
centros de trabajo. áreas que contengan sustancias químicas
peligrosas o sus residuos
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
20
RECURSOS MATERIALES Y EQUIPO
Micropipeta 1-10 µL
Micropipeta 10-100 µL
Puntas blancas (0.5-10 µL)
Puntas amarillas (10-200 µL)
Tubos de ensaye de 13x100
Espectrofotómetro visible
Celda para espectrofotómetro
Agua destilada
Solución de azul de metileno al 0.1%
Solución de azul de metileno al 0.01%
Material que debe traer el alumno
Marcador indeleble
Franela
PAUTAS GENERALES
 Revisar la pipeta al inicio del día de trabajo para retirar suciedad y polvo
 Ajustar el volumen en el rango especificado para la pipeta
 Sujetar la pipeta de forma que el reposamanos de la pipeta descanse sobre el
dedo índice
 Para maximizar exactitud, la pipeta, la punta y el líquido deben estar a la misma
temperatura
 Comprobar que las puntas son las adecuadas para la pipeta
 Usar las puntas una sola vez
21
 Enjuagar la punta varias veces en el líquido a pipetear antes del pipeteo para
mejorar la exactitud, de acuerdo con la siguiente figura:
 No volver la pipeta del revés, de forma que el líquido de la punta afecte al interior
de la pipeta
 Evitar contaminaciones de las puntas usando el eyector y los guantes
DESCRIPCIÓN DEL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
A) USO MICROPIPETA 1-10 MICROLITROS
1. Preparar 10 tubos de ensaye de 13x100 con 3 mL de agua corriente cada

uno
2. Regular el volumen a 2 µL y presionar el émbolo hasta el primer tope
3. Introducir verticalmente la punta 1 mm en el líquido (solución de azul de
metileno al 0.1%)
4. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del
líquido tocando las paredes del recipiente para dejar los excesos de líquido
del exterior de la punta
5. Introducir verticalmente la punta 1 mm en el agua contenida en uno de los
tubos de ensaye de 13x100
6. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el embolo hasta el primer
tope y después hasta el segundo. De esta forma vaciamos totalmente la
punta
22
7. Sacar la punta del recipiente tocando las paredes y dejamos el émbolo en su
posición inicial
8. Repetir los pasos 2-7 para cada uno de los tubos preparados en el punto 1
9. Mezclar vigorosamente la solución de agua con colorante
10. Leer la absorbancia de cada tubo en un espectrofotómetro a una longitud de
onda de 650 nm
Repetir el proceso al menos 5 veces
B) USO MICROPIPETA 10-100 MICROLITROS
1. Preparar 10 tubos de ensaye de 13x100 con 3 mL de agua cada uno

2. Regular el volumen a 20 µL y presionar el émbolo hasta el primer tope
3. Introducir verticalmente la punta 2-3 mm en el líquido (solución de azul de
metileno al 0.01%)
4. Soltar lentamente el émbolo hasta su posición inicial. Sacar la punta del
líquido tocando las paredes del recipiente para dejar los excesos de líquido
del exterior de la punta
5. Introducir verticalmente la punta 2-3 mm en el agua contenida en uno de los
tubos de ensaye de 13x100
6. Dispensar el líquido en el recipiente presionando el embolo hasta el primer
tope y después hasta el segundo. De esta forma vaciamos totalmente la
punta
7. Sacar la punta del recipiente tocando las paredes y dejamos el émbolo en su
posición inicial
8. Repetir los pasos 2-7 para cada uno de los tubos preparados en el punto 1
9. Mezclar vigorosamente la solución de agua con colorante
10. Leer la absorbancia de cada tubo en un espectrofotómetro a una longitud de
onda de 650 nm
Repetir el proceso al menos 5 veces
23
ANÁLISIS DE DATOS
Obtener la media de las absorbancias ± la desviación estándar para los datos obtenidos
en el inciso A) y el B) para cada una de las repeticiones.
Cálculos:
Las lecturas de las absorbancias deben ser mayores a 0.1
Sacar el promedio de las lecturas, de este promedio se obtiene la desviación estar y se

aplica la fórmula para sacar el porcentaje.
Fórmula para porcentaje de desviación estándar.
% 𝐷𝑆 = 𝑥 100
24
RESULTADOS ESPERADOS EN RELACIÓN CON LOS CRITERIOS DE
DESEMPEÑO
EVIDENCIAS DE APRENDIZAJE CRITERIOS DE DESEMPEÑO

Lista de cotejo sobre los Debes conocer cada uno de los componentes
componentes de las micropipetas de las micropipetas
Lista de cotejo sobre la descripción Debes conocer la función de cada uno de los
del funcionamiento de los componentes de las micropipetas
componentes de ajuste de volumen,
aspirado y expulsión de líquidos de
la micropipeta
Tabla de resultados de 10 Debes tener una precisión ≤10%, determinado
mediciones de volumen, promedio y como la desviación estándar de las 10
desviación estándar mediciones con respecto al promedio de ellas.
Lista de cotejo sobre conocimiento Debes conocer las normas mexicanas

y aplicación de las normas de aplicables a la práctica (NOM-113-STPS-2009,
seguridad y reglamentos NOM-005-STPS-1998 y NOM-018-STPS-2000)
respectivos.
25
CRITERIOS DE CALIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA
Lista de cotejo sobre los componentes de las 10%

micropipetas
Lista de cotejo sobre la descripción del funcionamiento 20%
de los componentes de ajuste de volumen, aspirado y
expulsión de líquidos de la micropipeta
Lista de cotejo sobre el manejo de la micropipeta de 10%
volumen variable
Tabla de resultados de 10 mediciones de volumen, DS ≤10% -------- 50%
promedio y desviación estándar 20%≥DS>10%--30%
DS>20% -----------0%
Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las 10%
normas de seguridad y reglamentos respectivos.
DS= Desviación estándar
26
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO
BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS
PRÁCTICA NÚMERO 2
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
Responsables
27
INTRODUCCIÓN
Los antígenos y anticuerpos interactúan por complementariedad espacial y no por

uniones covalentes. La asociación específica del antígeno y el anticuerpo es
dependiente de los puentes de hidrógeno, fuerzas electrostáticas, fuerzas de Van der
Waals y el efecto hidrofóbico; todas ellas consideradas fuerzas débiles, aunque la suma
de estas interacciones entre antígeno y anticuerpo pueden ser bastante fuerte. Al igual
que los anticuerpos, los antígenos pueden ser multivalentes, es decir, contienen
múltiples copias del mismo epítope, o a través de la presencia de múltiples epítopes
que son reconocidos por múltiples anticuerpos. Las interacciones multivalentes pueden
producir mayor estabilidad en los complejos antígeno-anticuerpo, sin embargo la
multivalencia puede también resultar en dificultades estéricas, lo que podría reducir la
posibilidad de unión.
Los complejos antígeno–anticuerpo insolubles forman una red tridimensional que debe
ser voluminosa para que pueda observarse a simple vista, asimismo, los reactantes han
de estar en proporciones adecuadas, ya que el exceso de cualquiera de ellos conducen
a un cierto grado de solubilización del agregado molecular; debido a que la reacción
antígeno–anticuerpo está sujeta a la ley de acción de masas.
Es posible utilizar esta reacción In vitro para evidenciar la reacción antígeno-

anticuerpo, esta reacción se puede llevar a cabo en fase líquida o en soportes
semisólidos y es visible de mejor manera cuando los complejos formados son de gran
tamaño.
Cuando un antígeno en solución se agrega de manera progresiva a un antisuero

potente, se forman precipitados del complejo antígeno-anticuerpo. El entrecruzamiento
de antígenos y anticuerpos da origen a estructuras enrejadas tridimensionales para
formar grandes agregados que precipitan. A medida que se agregan más y más
antígeno se alcanza un óptimo (zona de equivalencia) después del cual, de modo
uniforme, se forma menos precipitado.
28
Tipos:
1. Inmunoprecipitación en medio líquido.

2. Inmunoprecipitación en medio sólido
3. Inmunodifusión Simple en tubo
4. Inmunodifusión Doble en placa
5. Inmunodifusión Simple en placa
El estudiante será competente para realizar reacciones de precipitación en medio

líquido y sólido, así como interpretar los resultados obtenidos.
 Realiza la reacción de precipitación en medio líquido

 Identifica las diferentes zonas de la curva de precipitación
 Realiza la cuantificación de un antígeno por Mancini
 Describe el funcionamiento de los gradientes de concentración para la prueba de
Mancini
 Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos
29
COMO PROCEDER EN
Detener el sangrado y hacer

Cortaduras Trabajar apegado al protocolo de la práctica curación en caso de no
requerir atención médica

Reactivos mal
en la piel)
ventilados.
Depositarlos en contenedores y/o

bolsas rojas con la leyenda
Materia orgánica En depósitos de basura
desechos biológicos según
corresponda.
Depositarlos en contenedores y
Basura común En depósitos de basura en bolsas negras, “Basura
común”.
30
NOMBRE, NÚMERO Y
NORMA
Equipo de protección Equipo de protección personal NOM-113-STPS-2009

personal acorde con sus características y
dimensiones físicas, así como con
los agentes de riesgo.
Se deberán separar y envasar

Manejo de residuos todos los residuos peligrosos
peligrosos biológico biológico-infecciosos, de acuerdo NOM-087-ECOL-SSA1-2002
infeccioso con sus características físicas y
Condiciones de seguridad e
higiene en los centros de
Cumplir con las instrucciones de
trabajo para el manejo,
uso y mantenimiento del equipo
transporte y NOM-005-STPS-1998
de protección personal
almacenamiento de
proporcionado por el patrón
peligrosas
Conocer el grado de peligrosidad

y los riesgos de las sustancias
Sistema para la
químicas peligrosas que se
identificación y
utilizan en el centro de trabajo
comunicación de peligros y
NOM-018-STPS-2000
Identificar los depósitos,
químicas peligrosas en los recipientes y áreas que contengan
centros de trabajo. sustancias químicas peligrosas o
sus residuos
31
A) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
B) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO (Mancini)
32
16 tubos capilares
14 copas de 1 mL
Gradilla
Micropipeta de 20 a 200 µL
Puntillas para micropipetas
Pipetas serológicas de 1 mL
Solución salina
Antígeno soluble 50 mg/mL
Antisuero de conejo anti-BSA
Plastilina
Papel absorbente o papel rollo
Regla graduada en milímetros
Marcador indeleble
Franela
B) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO (Mancini)
Portaobjetos limpios y desengrasados
Horadador de 3 mm de diámetro
Pipetas serológicas de 10 mL, de punta ancha
Pipetas serológicas de 1 mL
33
Pipetas Pasteur
Matraz Erlenmeyer y /o vasos de precipitado de 50 a 100 mL
Agarosa tipo II, medio EEO al 1% en SSF
Agarosa tipo II, medio EEO al 0.1% en SSF
Solución salina fisiológica
Solución de timerosal al 1%
Antisuero
Solución de antígeno a diferentes concentraciones (inicial 1 mg/mL)
Papel absorbente o papel rollo
Regla graduada en mm
Molde de plástico de 10 x 8 cm
Marcador indeleble
Franela

1. Haga 14 diluciones dobles seriadas del antígeno, en copas de 2 mL, con un
volumen final de 0.2 mL
2. Divida los tubos capilares en tres partes iguales, utilizando un marcador indeleble
3. Llene el tubo capilar con antisuero hasta la primera marca y limpie el exterior del
tubo con papel absorbente, para eliminar el antisuero adherido al exterior del
mismo.
4. Invierta el tubo capilar, y haga descender el antisuero hasta el borde de extremo
contrario.
5. Tome un volumen de antígeno, de tal manera que el líquido dentro del capilar
llegue hasta la segunda marca. No debe haber burbujas en la interfase entre el
antisuero y el antígeno. Limpie la parte externa del capilar con papel absorbente.
34
6. Mezcle el contenido por rotación y por inversión del capilar y centre. Tapar uno
de los extremos del capilar con el dedo índice e introduzca el extremo contrario
en plastilina.
7. Repita los pasos 3, 4, 5 y 6 para cada una de las diluciones del antígeno.
8. Utilice como controles un tubo capilar en el que reemplace el antígeno por
solución salina y otro en el que reemplace el antisuero por solución salina.
9. Mantenga los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.
10. Mida la cantidad de precipitado en cada uno de los tubos, con la ayuda de una
regla. Llene la tabla que se muestra a continuación y haga una gráfica con los
datos obtenidos, colocando en las abscisas la concentración de antígeno y en las
ordenadas la cantidad de precipitado en mm y localice las tres zonas de la curva
de precipitación.
Tubo Dilución BSA Concentración BSA Mm precipitado

1 ½
2 ¼
3 1/8
4 1/16
5 1/32
6 1/64
7 1/128
8 1/256
9 1/512
10 1/1024
11 1/2048
12 1/4096
13 1/8192
14 1/16384
B) REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO (MANCINI)
1. Prepare los portaobjetos barnizados con agarosa al 0.1%

2. Toma 4 mL de agarosa al 1% en un vaso de precipitado. Deje enfriar hasta una
temperatura aproximada de 45°C, y añadir 3% (V/V), del antisuero, mezclando
perfectamente. Adicione solución de timerosal hasta una concentración de
0.01%.
35
3. Coloque los portaobjetos barnizados, sobre una superficie completamente
horizontal y con una pipeta serológica de punta ancha, colocar 4 mL de la
solución de agarosa preparada en el punto anterior. Deje gelificar a temperatura
ambiente y coloque los portaobjetos en cámara húmeda hasta su uso.
4. Haga 5 perforaciones de 3 mm de diámetro. Remueva la agarosa del interior de
las perforaciones.
5. Llene 4 pozos con 10 µL de las soluciones de antígeno, a concentraciones
conocidas (1mg/mL, 0.75 mg/mL, 0.50mg/m, 0.25 mg/mL). Llene el quinto pozo
con la solución problema de antígeno.
6. Mantenga las placas en cámara húmeda a temperatura ambiente, durante 24-48
h.
7. Mida el diámetro de los halos de precipitación formados. Haga una gráfica en
Excel colocando la concentración de antígeno en el eje de las abscisas y el
cuadrado del halo de precipitación en el eje de las ordenadas. Interpole el valor
del diámetro encontrado con la solución problema para determinar su
concentración.

DESEMPEÑO

Lista de cotejo sobre la realización de Debes preparar correctamente los tubos
la reacción de precipitación en medio capilares para la determinación de la
líquido reacción de precipitación en medio líquido
Rúbrica sobre el gráfico sobre la curva Debes realizar el gráfico y entregarlo en hoja
de precipitación blanca, en el que se indiquen los nombres
de los ejes y las diferentes zonas de la curva
de precipitación. Deberás incluir una portada
para tu trabajo
Lista de cotejo sobre la realización de Debes preparar correctamente los
la reacción de precipitación en medio portaobjetos para la determinación de la
sólido reacción de precipitación en medio sólido
Rúbrica sobre el gráfico para la Debes realizar el gráfico y entregarlo en una

determinación de la concentración de hoja blanca, en el que se indiquen los
BSA de la muestra problema nombres de los ejes, la ecuación de la recta,
36
obtenida mediante el método de mínimos
cuadrados y reportar la concentración de la
solución problema de antígeno. Deberás
incluir una portada para tu trabajo.
Lista de cotejo sobre la función de los Debes explicar la función de cada uno de los
componentes de las reacciones de componentes de las reacciones de
precipitación realizadas. precipitación realizadas.
Lista de cotejo sobre conocimiento y Debes conocer las normas mexicanas

aplicación de las normas de seguridad aplicables a la práctica (NOM-113-STPS-
y reglamentos respectivos. 2009, NOM-087-ECOL-SSA1-2002, NOM-
005-STPS-1998 y NOM-018-STPS-2000)
Lista de cotejo sobre la preparación de diluciones dobles seriadas 10%

Lista de cotejo sobre la realización de la reacción de precipitación en 5%
medio líquido
Gráfico sobre la curva de precipitación 20%
Lista de cotejo sobre la realización de la reacción de precipitación en
10%
medio sólido
Gráfico para la determinación de la concentración de antígeno de la
30%
muestra problema
Lista de cotejo sobre la función de los componentes de las reacciones
15%
de precipitación realizadas.
Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de
10%
seguridad y reglamentos respectivos.
37
PRÁCTICA NÚMERO 3
REACCIÓN DE AGLUTINACIÓN
Responsables
38
INTRODUCCIÓN
La interacción antígeno-anticuerpo es una relación bimolecular parecida a la interacción

enzima-sustrato, con una diferencia importante: no conduce a una alteración química
irreversible en el anticuerpo ni en el antígeno. La relación entre un anticuerpo y un antígeno
incluye varias interacciones no covalentes entre el determinante antigénico, o epítopo, del
antígeno y el dominio de región variable de la molécula del anticuerpo, en particular las
regiones hipervariables, o regiones determinantes de complementariedad (Kuby et al, 2007).
La minuciosa especificidad de las interacciones antígeno-anticuerpo condujo al desarrollo de

una diversidad de pruebas inmunológicas, que pueden utilizarse para detectar la presencia de
anticuerpo o de antígeno. Los inmunoensayos han sido de vital importancia en el diagnóstico de
enfermedades, la vigilancia del grado de respuesta inmunitaria humoral y la identificación de
moléculas de interés biológico o médico. Estas valoraciones difieren en su rapidez y
sensibilidad; algunas son estrictamente cualitativas, otras son cuantitativas (Kuby et al, 2007).
La interacción entre el anticuerpo y un antígeno particulado resulta en un agrupamiento visible

llamado aglutinación. Los anticuerpos que producen estas reacciones se denominan
aglutininas. Del mismo modo en que un exceso de anticuerpo inhibe las reacciones de
precipitación, este exceso también puede inhibir las reacciones de aglutinación; tal inhibición se
denomina efecto prozona. Ya que los efectos prozona pueden encontrarse en muchos tipos de
inmunoensayos, comprender la base de este fenómeno tiene importancia general (Kuby et al,
2007).
La estimulación antigénica de linfocitos B, junto con las señales brindadas por los linfocitos T,
llevan a la activación y diferenciación en células plasmáticas, que son las que responsable de la
producción d anticuerpos que encontramos en el suero de un individuo.
Los anticuerpos producidos son específicos para el antígeno que indujo su producción, por lo
que evidenciar la presencia de anticuerpos contra un antígeno determinado en un individuo, nos
permite confirmar que dicho sujeto estuvo en contacto con el antígeno en cuestión.
39
El estudiante será competente para realizar e interpretar reacciones e aglutinación.
 Prepara diluciones dobles seriadas

 Realiza reacciones de aglutinación
 Interpreta las reacciones de aglutinación
 Describe los conceptos de título, dilución, prozona
 Respeta y aplica las normas de seguridad y reglamentos respectivos.
COMO PROCEDER EN


Reactivos mal
en la piel)
ventilados.
40
Depositarlos en contenedores
Vidrios, y jeringas En depósitos de basura
marcado como “Basura Común”.
En depósitos de basura Depositarlos en contenedor rojo,

Agujas
para RPBI marcado como “RPBI”.

corresponda.
Basura común En depósitos de basura
NOMBRE, NÚMERO Y
NORMA
Equipo de protección Equipo de protección personal acorde NOM-113-STPS-2009

personal con sus características y dimensiones
físicas, así como con los agentes de
riesgo.
Se deberán separar y envasar todos los

Manejo de residuos residuos peligrosos biológico-
NOM-087-ECOL-SSA1-
peligrosos biológico infecciosos, de acuerdo con sus
2002
infeccioso características físicas y biológicas
infecciosas
Condiciones de seguridad e Cumplir con las instrucciones de uso y NOM-005-STPS-1998

higiene en los centros de mantenimiento del equipo de protección
41
trabajo para el manejo, personal proporcionado por el patrón
transporte y almacenamiento
de sustancias químicas
peligrosas

riesgos de las sustancias químicas
Sistema para la identificación
y comunicación de peligros y peligrosas que se utilizan en el centro
de trabajo.
riesgos por sustancias NOM-018-STPS-2000
químicas peligrosas en los Identificar los depósitos, recipientes y
centros de trabajo.
áreas que contengan sustancias
químicas peligrosas o sus residuos
42
 Baño María ajustado a 37ºC

 Gradilla
 Tubos de ensaye de 13 x 100
 Pipetas serológicas de 1 mL
 TBS-Gelatina al 0.05% (TBS-G)
 Suero anti-glóbulos rojos descomplementado (calentado a 56°C durante 30 minutos).
 Glóbulos rojos de humanos en suspensión al 0.5% en TBS-G.
 Marcador indeleble
 Franela
AGLUTINACIÓN DIRECTA
Titulación de un suero anti-glóbulos rojos
1. Marque 11 tubos de 13x100 del 1 al 11

2. Prepare 10 diluciones dobles seriadas del suero anti-glóbulos rojos de carnero,
utilizando TBS-G como diluyente (Tubos 1 al 11). Considere un volumen final de 0.2 mL
de cada dilución.
3. En el tubo 11 adicione 0.2 mL de TBS-G
4. Adicione 0.2 mL de glóbulos rojos a cada uno de los 11 tubos preparados, mezcle
suavemente.
5. Incube en Baño María a 37 °C durante 1 h.
6. Centrifugue durante 1 minuto a 3000 rpm.
7. Mezcle suavemente los tubos a contraluz y observe la presencia de aglutinación
(grumos). Verificar que no exista aglutinación en el tubo 11 (control).
8. Reporte el título del suero, que es el inverso de la dilución máxima en la cual aún se
observa aglutinación de eritrocitos.
43
DESEMPEÑO

Lista de cotejo sobre la Debes preparar correctamente las diluciones
preparación de diluciones dobles requeridas para la determinación del título de la
seriadas reacción de aglutinación
Lista de cotejo sobre el Debes realizar correctamente la mezcla de
desarrollo de la técnica de reactivos para lleva a cabo la reacción de
aglutinación aglutinación
Lista de cotejo sobre conceptos Debes conocer los conceptos de título, dilución y
los de título, dilución, prozona prozona
Determinación del título de la Debes proporcionar el título de la reacción de
reacción de aglutinación aglutinación
Lista de cotejo sobre Debes conocer las normas mexicanas aplicables a
conocimiento y aplicación de las la práctica (NOM-113-STPS-2009, NOM-087-
normas de seguridad y ECOL-SSA1-2002, NOM-005-STPS-1998 y NOM-
reglamentos respectivos. 018-STPS-2000)
Lista de cotejo sobre el desarrollo de la técnica de aglutinación 40%

Lista de cotejo sobre conceptos de título, dilución, prozona 20%
Determinación del título de la reacción de aglutinación 30%
Lista de cotejo sobre conocimiento y aplicación de las normas de 10%
44
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y
FARMACÉUTICAS
PRÁCTICA NÚMERO 4
WESTERN-BLOT
Responsables
Q.F.B. Iris celeste Tovar Ocampo
45
INTRODUCCIÓN
Es posible la identificación de una proteína específica en una mezcla compleja de

proteínas mediante una técnica conocida como “Western blot”, así denominada por su
similitud con “Southern-blot”, que detecta fragmentos de DNA, y con “Northern-blot”,
que detecta mRNA. En el “Western-blot”, una mezcla de proteínas es separada en un
gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Las bandas de proteínas se transfieren
entonces a una membrana de nitrocelulosa, utilizando corriente eléctrica para ello, para
realizar posteriormente la inmunodetección.
Los complejos Ag-Ab que se forman en la banda que contiene la proteína reconocida
por el anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radiactivo se
unió a la proteína de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot)
exponiendo una placa de rayos X a la membrana, un procedimiento que se conoce
como autorradiografía. Sin embargo, en los procedimientos de detección que más se
usan suelen emplearse anticuerpos contra la proteína conjugados a una enzima. Tras la
unión del conjugado de enzima y anticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno que
produce un producto de color intenso e insoluble origina la aparición de una banda de
color en el sitio del antígeno blanco. Puede lograrse una sensibilidad mucho más alta si
se usa un compuesto quimioluminiscente aunado a agentes de realce adecuados para
producir luz en el sitio del antígeno. La aplicación más amplia de este procedimiento es
como prueba de confirmación de VIH, donde el Western blot se utiliza para determinar
si el paciente tiene anticuerpos que reaccionan con una o más proteínas víricas.
Tomado de: Kindt, T. J., Goldsby, R. A. O., Kuby, B. A., Kindt, J. T. J., Goldsby, R. A., & Osborne, B. A.
(2007). Inmunología de Kuby (No. Sirsi) i9789701064542).
46
El estudiante será competente para realizar la separación electroforética de proteínas y

poner de manifiesto la presencia de anticuerpos específicos, mediante la técnica de
western-blot.
 Realiza la separación electroforética de proteínas

 Realiza la transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa
 Realiza la inmunodetección de anticuerpos específicos
 Describe los conceptos de movilidad relativa (Rf), electroforesis, anticuerpo
primario, anticuerpo secundario, cromógeno
TIPO DE COMO PROCEDER EN CASO

COMO EVITARLOS
RIESGO DE UN ACCIDENTE

Cortaduras Trabajar apegado al protocolo de la práctica curación en caso de no requerir
atención médica
Supervisar que los reactivos estén colocados

de acuerdo a su grado de toxicidad. Lavar inmediatamente con agua
Reactivos mal
abundante, es conveniente retirar
cerrados
la ropa para evitar que el
(salpicadura en la
corrosivo quede atrapado entre
piel) Que los frascos permanezcan cerrados y la ropa y la piel.
ventilados.
47
TIPO DE
COMO DESCARTARLOS TIPO DE CONTENEDOR
DESECHOS
Depositarlos en contenedores marcado

como “Basura Común”.
En depósitos de basura Depositarlos en contenedor rojo, marcado

Agujas
para RPBI como “RPBI”.
Depositarlos en contenedores y/o bolsas

Materia orgánica En depósitos de basura rojas con la leyenda desechos biológicos
según corresponda.
Depositarlos en contenedores y en bolsas

negras, “Basura común”.
NOMBRE, NÚMERO Y
NORMA
Equipo de protección Equipo de protección personal acorde con sus NOM-113-STPS-2009

personal características y dimensiones físicas, así como
con los agentes de riesgo.

Manejo de residuos
residuos peligrosos biológico-infecciosos, de NOM-087-ECOL-SSA1-
acuerdo con sus características físicas y 2002
infeccioso
Condiciones de seguridad
e higiene en los centros de Cumplir con las instrucciones de uso y
trabajo para el manejo, mantenimiento del equipo de protección NOM-005-STPS-1998
transporte y personal proporcionado por el patrón
almacenamiento de
48
peligrosas
Sistema para la Conocer el grado de peligrosidad y los riesgos

de las sustancias químicas peligrosas que se
identificación y
utilizan en el centro de trabajo.
comunicación de peligros y
NOM-018-STPS-2000
Identificar los depósitos, recipientes y áreas
químicas peligrosas en los
que contengan sustancias químicas peligrosas
centros de trabajo.
o sus residuos
49
 Micropipetas
 Puntas para micropipetas
 Tubos cónicos de 50 mL
 Tubos cónicos de 2 mL
 Sistema de electroforesis Miniprotean III (Biorad)
 Fuente de poder EC250
 Centrífuga para tubos tipo Eppendorf ®
 Placa de calentamiento para tubos de 2 mL
 Papel filtro
 Marcador indeleble
 Franela
 Guantes
 Molde de plástico de 10 x 8 cm
 Molde de plástico de 10 x 2 cm
 Guantes de látex
Reactivos para electroforesis en gel de poliacrilamida

 Solución de Acrilamida-Bis-Acrilamida
 Solución de Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
 Solución de Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
 Agua destilada
 Solución de SDS al 10%
 Solución de Persulfato de amonio al 10%
 TEMED
 Regulador de muestra 2X
 Regulador de corrimiento
 Solución de trabajo para tinción de proteínas con azul de Coomassie
 Solución decolorante para geles de Poliacrilamida
50
 Solución de ácido acético al 10%
 Solución de BSA 1 mg/mL
 Marcadores de peso molecular preteñidos
Reactivos para transferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa

 Sistema de electrotransferencia (Mini Trans-Blot®Cell. BIORAD)
 Regulador de Transferencia
 Membrana de nitrocelulosa
Reactivos para Inmunodetección

 Contenedor plástico para incubación de tiras de nitrocelulosa.
 Solución PBS-Tween20 al 0.25% (TBS-T)
 Solución bloqueadora (PBS-G) (PBS-T 0.1% con gelatina al 0.3%)
 Suero de conejo inmunizado con BSA
 Anticuerpos anti-Ig’s totales de conejo producidos en cabra y conjugados a peroxidasa.
 Solución reveladora (western-blot)
 Colorante Rojo Poceau 0.2% en ácido acético al 1%
 Solución ácido acético al 1%
Tomar en cuenta la siguiente imagen para la realización de la práctica:
51
PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA
1. Limpie los cristales (2) con etanol al 70%.

2. Coloque los cristales en el receptáculo fijador (4) ajustándolos perfectamente.
3. Empotre el receptáculo fijador armado en el punto anterior, en el módulo de llenado (5).
4. Prepare la mezcla para el gel separador al 12 % en un tubo cónico de 50 mL, de acuerdo
con lo establecido en la tabla 1.
5. Con ayuda de una pipeta Pasteur, coloque, entre los cristales ensamblados anteriormente,
aproximadamente 3.7 mL de la mezcla preparada, cuidando de no formar burbujas.
6. Enseguida coloque aproximadamente un mL de agua sobre la mezcla, cuidando que no se
mezcle. Espere hasta que polimerice el gel.
7. Una vez formado el gel separador, retire el agua invirtiendo el módulo para que ésta
escurra. Retire el exceso de agua con ayuda de papel filtro o algodón.
8. Prepare a la mezcla para el gel concentrador de acuerdo con lo indicado en la tabla 1.
Viértala sobre el gel separador, hasta llenar completamente.
9. Coloque a un gel el peine de 10 pocillos y en el otro se coloca el peine ciego (1), cuidando
que no se formen burbujas y espere a que polimerice la mezcla. Enseguida retire los
peines.
10. Enjuague con agua destilada el carril para la muestra
Tabla 1. Reactivos para el gel separador y gel concentrador (2 geles)
REACTIVOS GEL SEPARADOR GEL CONCENTRADOR

(12%) (4%)
Acrilamida-Bisacrilamida (30-0.8%) 4 mL 670 µL
Tris 1.5 M pH 8.8 2.6 mL ----------
Tris 1.5 pH 6.8 ---------- 1.25 mL
SDS 10% 100 µL 50 µL
Agua destilada 3.2 mL 3 mL
Persulfato de amonio al 10% 100 µL 50 µL
TEMED 10 µL 6 µL
52
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. Prepare 4 diluciones dobles seriadas de la solución de BSA, utilizando PBS como

diluyente. El volumen final de cada dilución deberá ser de 100 μL.
2. En un tubo cónico de 1.7 mL coloque 100 μL de cada dilución de BSA y adicione 50 μL
del amortiguador de muestra.
3. Para preparar el gel para la inmunotransferencia coloque en un quinto tubo 100 μL de la
solución de BSA a 1 mg/mL y adicione 50 μL del amortiguador de muestra.
4. Caliente las mezclas anteriores 10 minutos a 100°C. Dejar enfriar hasta su uso.
ARMADO DE LA CÁMARA DE ELECTROFORESIS
1. Coloque los cristales que contienen el gel preparado en el módulo de corrimiento (7).
2. Introduzca el módulo de corrimiento en la tina de electroforesis (6) y llene ambos
compartimientos de amortiguador de corrimiento.
3. Con ayuda de una micropipeta y de las guías de plástico del equipo (3), coloque 10 μL
de cada una de las muestras preparadas, de acuerdo con la siguiente tabla:
Carril Muestra Carril Muestra

1 Marcadores de peso molecular 6 -
2 Dilución 1 7 Dilución 1
Peine Ciego
1 100 µL
4. Tape la tina de electroforesis y conéctela a la fuente de poder, ajustando a 100 el

voltaje.
5. Una vez que el frente de corrimiento llegue al gel separador, aumentar el voltaje a 200.
6. Cuando el frente de corrimiento llegue al final del gel, detenga el corrimiento. Apague y
desconecte la fuente d poder.
7. Desmonte el equipo y separe los cristales que contienen el gel, con ayuda de la espátula
proporcionada para tal efecto.
53
8. Corte el gel en dos porciones, de manera vertical, por el centro del carril 6.
9. Sumerja una mitad del gel en la solución de azul de Coomassie. Incube 2-3 horas a
37°C o18 horas a temperatura ambiente.
10. Retire el colorante y lave el gel con agua corriente.
11. Adicione solución decolorante y mantenga en agitación constante a temperatura
ambiente.
12. Cambie la solución decolorante las veces que sea necesario, hasta que las bandas
proteínicas sean visibles nítidamente.
13. Almacene el gel en ácido acético al 10%
TRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A MEMBRANA DE NITROCELULOSA
1. Humedezca la membrana de nitrocelulosa, papel filtro, esponjas, proporcionadas para la

trasferencia, en solución amortiguadora de transferencia.
2. Coloque los materiales en casete de transferencia en el siguiente orden: papel filtro, la
mitad no teñida del gel, membrana de nitrocelulosa y nuevamente un papel filtro. Evite la
formación de burbujas.
3. Coloque el casete de geles en la cámara (el gel hacia el ánodo) y llénela completamente
con amortiguador de transferencia.
4. Aplique una corriente de 240 miliamperes o 100 volts durante una hora.
5. Desmonte el equipo. Enjugue la membrana con agua destilada.
INMUNODETECCIÓN
1. Tiña la membrana de nitrocelulosa obtenida en el paso anterior, con solución de rojo

Ponceau durante 2 a 3 min. Posteriormente destiña PBS -T hasta que las bandas
proteínicas sean visibles. Documente fotográficamente la membrana teñida.
2. Lave exhaustivamente la membrana de nitrocelulosa con PBS-T hasta eliminar por
completo el rojo Ponceau.
3. Sumerja la membrana de nitrocelulosa en solución bloqueadora (PBS-G) e incube 30
minutos a temperatura ambiente.
54
4. Elimine la solución bloqueadora, y adicione 3 mL del suero de conejo inmunizado con
BSA diluido 1:100 en PBS-T. Incube durante 30 min a temperatura ambiente. Enseguida
decante la solución.
5. Lave 5 veces la membrana de nitrocelulosa adicionando de 3 a 1 mL de PBS-T en cada
lavado, durante 3 minutos cada lavado en agitación.
6. Adicione 3 mL de anticuerpo conjugado (anti-Ig’s totales de conejo producidos en cabra
y conjugados a peroxidasa) diluido 1:10,000 en PBS-G-T Incube 30 minutos a
temperatura ambiente. Enseguida decante la solución.
7. Repita el paso 5
8. Lave la membrana una vez con PBS 1X
9. Adicione 3 mL de solución reveladora (3,3’-Diaminobencidina al 0.02%, H2O2 al 0.01%
en PBS, preparada en el momento) e incube a temperatura ambiente 5 minutos. Revise
constantemente y detenga la reacción cuando aparezcan bandas nítidas, antes de que
la membrana de nitrocelulosa se torne completamente roja.
10. Detenga la reacción lavando la membrana con agua corriente.
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR.
Determine la movilidad electroforética (Rf) de BSA y de cada uno de los marcadores de

peso molecular, en el gel teñido con azul de Coomasie. Para ello, mida la distancia (en
mm) del origen del gel separador a cada una de las bandas proteínicas y la distancia
del origen del gel separador al frente de corrimiento. El Rf se calcula con la siguiente
fórmula:
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛 𝑎 𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑎

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
55
Complete la siguiente tabla:
MARCADOR DE PESO MOLECULAR (KDa) LOG PESO Rf

PESO MOLECULAR MOLECULAR
1
2
3
4
5
6
7
8
BSA ¿?
Grafique el Log de PM vs Rf. Realice la regresión lineal y obtenga la ecuación de la recta.
Con la ecuación obtenida, determine el peso molecular de BSA.
Repita el análisis, para las bandas detectadas en la inmunodetección.

DESEMPEÑO

Lista de cotejo de demostración de Debes conocer el nombre de cada uno de los
los componentes de la cámara de componentes del sistema de electroforesis y
electroforesis y transferencia transferencia
Lista de cotejo de descripción de los Debes conocer la función de cada uno de los
componentes de la cámara de componentes del sistema de electroforesis y
electroforesis y transferencia transferencia
Lista de cotejo de manejo y ensamble Debes demostrar que sabes ensamblar
de la cámara de electroforesis y correctamente el sistema de electroforesis y
transferencia transferencia
56
Lista de cotejo sobre el desarrollo de Debes demostrar que puedes realizar e interpretar
la inmunodetección una inmunodetección por western-blot
Deberás realizar un reporte de la práctica en que se
incluya: portada, título de la práctica, unidad de
Reporte de práctica
competencia de la práctica, resultados obtenidos,
conclusiones y cuestionario
Fundamentos sobre la función de la Debes conoce los conceptos de solución
solución bloqueadora, solución bloqueadora, solución reveladora, electroforesis de
reveladora, electroforesis de proteínas, transferencia de proteínas, anticuerpo
proteínas, transferencia de proteínas, conjugado, Rf.
anticuerpo conjugado, Rf,
Lista de cotejo sobre conocimiento y Debes conocer las normas mexicanas aplicables a la
aplicación de las normas de práctica (NOM-113-STPS-2009, NOM-087-ECOL-
seguridad y reglamentos respectivos. SSA1-2002, NOM-005-STPS-1998 y NOM-018-
STPS-2000)
Lista de cotejo de demostración de los componentes de la cámara de 10%

electroforesis y transferencia
Lista de cotejo de descripción de los componentes de la cámara de 10%
electroforesis y transferencia
Lista de cotejo de manejo y ensamble de la cámara de electroforesis 20%
y transferencia
Lista de cotejo sobre el desarrollo de la inmunodetección 20
Reporte de práctica 20%
Interrogación directa sobre la función de la solución bloqueadora, 10%
solución reveladora, electroforesis de proteínas, transferencia de
proteínas, anticuerpo conjugado, Rf,
57
PRÁCTICA NÚMERO 5
ELISA
Responsables
Q.F.B. Iris celeste Tovar Ocampo
58
INTRODUCCIÓN
El ensayo inmunoenzimático (EIA), también denominado ELISA por sus siglas en inglés
(“enzyme-linked immunosorbent assay”), es una técnica de análisis en placa diseñada
para detectar y cuantificar sustancias como proteínas, péptidos, hormonas y
anticuerpos. En un ELISA, un antígeno debe ser inmovilizado a una fase sólida y ahí
puede ser reconocido por un anticuerpo, que está conjugado a una enzima. La
detección se logra mediante la actividad de la enzima, que actúa sobre un sustrato y
producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro. El elemento más crucial de esta estrategia de detección es tener
una interacción antígeno-anticuerpo altamente específica 1.
Existes diferentes tipos de ELISA:
• ELISA directo
• ELISA Indirecto
• ELISA tipo sándwich
• ELISA tipo doble sándwich
• ELISA competitivo
El ELISA se realiza típicamente en placas de poliestireno de 96 pocillos, al que

pasivamente se adsorben los anticuerpos o las proteínas (antígenos). La inmovilización
de los reactivos en la superficie de los pocillos permite eliminar fácilmente todo el
material que es ajeno a la interacción antígeno-anticuerpo durante el ensayo 1
1
Traducido de https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-
learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html)
59
Las enzimas más utilizadas son peroxidasa de rábano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP).
Aunque otras enzimas como β-galactosidasa, la acetilcolinesterasa y la catalasa se han
utilizado también, pero no tienen gran aceptación debido a que las opciones de sustrato
son limitadas. La elección del sustrato depende de la sensibilidad requerida del ensayo
y de los equipos de medición disponible para detección de señales (espectrofotómetro,
Fluorímetro o luminómetro)1.
El ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la

especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con
enfermedades autoinmunes. Además, por su fácil estandarización, manejo y variedad
de antígenos disponibles, ha desplazado notablemente a otras técnicas como el
radioinmunoensayo para la detección de anticuerpos anti-DNAcd (conocido también
como prueba de Farr), ya que no utiliza radionucleótidos, lo que hace que sea una
técnica accesible y de bajo riesgo. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más
utilizado en el laboratorio de diagnóstico es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en
el reconocimiento de los anticuerpos específicos presentes en las muestras de los
pacientes, mediante un anticuerpo dirigido contra la región Fc humana de cualquier
isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1
o IgA2). Los anticuerpos anti-Fc están unidos a enzimas como la peroxidasa o la
fosfatasa alcalina. Los antígenos utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos,
recombinantes (antígeno completo o epítopo específico) o sintéticos (epítopo
específico)2.
1
2
Ramírez, D. F. H., & Cabiedes, J. (2010). Técnicas inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las
enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica,6(3), 173-177
60
Después de permitir la interacción de los anticuerpos de las muestras de los pacientes
con el antígeno adsorbido a la placa de ELISA, se realizan lavados para eliminar los
anticuerpos inespecíficos y se agrega el anticuerpo anti-inmunoglobulina humana
conjugado a una enzima, permitiendo la interacción por un tiempo determinado.
Posteriormente, se adiciona la solución que contiene el sustrato-cromogénico específico
de la enzima (por ejemplo -fenilendiamina, 3, 3′, 5, 5′-Tetrametilbenzidina [TMB] para
la peroxidasa o p-nitrofenilfosfato para la fosfatasa alcalina) el cual cambiará de color
en función de la cantidad de anticuerpos conjugados con la enzima y cuya cantidad
depende de la cantidad de anticuerpos del sujeto de estudio que reconocieron al
antígeno pegado a la placa. En otras palabras, la intensidad de color es directamente
proporcional a la cantidad de anticuerpo del sujeto unido al antígeno 2
Figura 1 La placa de 96 pozos se recubre con antígenos específico, los cuales son reconocidos por los
anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes. La unión se revela cuando se adiciona un
anticuerpo anti-Fc humana conjugado con una enzima. Al agregar el sustrato de la enzima cambia de
2
color el medio
2
Ramírez, D. F. H., & Cabiedes, J. (2010). Técnicas inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las
enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica,6(3), 173-177.
61
Ventajas y desventajas del ELISA indirecto1
• Se cuenta con una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados.

• Versatilidad, ya que muchos anticuerpos primarios se pueden hacer en una
especie y utilizar así un mismo anticuerpo secundario.
• La Máxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene porque no
está conjugado.
• La sensibilidad aumenta ya que cada anticuerpo primario contiene varios
epítopos que pueden ser reconocidos por el anticuerpo secundario
(conjugado), lo que permite la amplificación de la señal.
La principal desventaja es que puede haber reacción cruzada con el anticuerpo

secundario, dando por resultado la señal inespecífica, lo que puede ser eliminado con
los controles adecuados1.
1
El estudiante será competente para determinar cuantitativamente (título) la presencia de

anticuerpos dirigidos contra un antígeno específico, utilizando la técnica de ELISA
indirecto
 Prepara las diluciones de antígeno necesarias para la determinación de

anticuerpos
 Realiza la detección de anticuerpos anti-BSA utilizando la técnica de ELISA
 Realiza los cálculos necesarios para determinar el título de anticuerpos
 Describe los conceptos de adsorción, cromógeno, sustrato
 Establece las diferencias entre ELISA y Western-blot
62
COMO PROCEDER EN


Reactivos mal
en la piel)
ventilados.
Depositarlos en contenedores
marcado como “Basura Común”.
En depósitos de basura Depositarlos en contenedor rojo,

Agujas
para RPBI marcado como “RPBI”.

corresponda.
63
NOMBRE, NÚMERO Y
NORMA
Equipo de protección Equipo de protección personal acorde con NOM-113-STPS-2009

personal sus características y dimensiones físicas,
así como con los agentes de riesgo.

Manejo de residuos
residuos peligrosos biológico-infecciosos, NOM-087-ECOL-SSA1-
de acuerdo con sus características físicas y 2002
infeccioso
Condiciones de seguridad
e higiene en los centros de
trabajo para el manejo, Cumplir con las instrucciones de uso y
transporte y mantenimiento del equipo de protección NOM-005-STPS-1998
almacenamiento de personal proporcionado por el patrón
peligrosas

Sistema para la riesgos de las sustancias químicas
identificación y peligrosas que se utilizan en el centro de
comunicación de peligros y trabajo.
NOM-018-STPS-2000
químicas peligrosas en los Identificar los depósitos, recipientes y áreas
centros de trabajo. que contengan sustancias químicas
peligrosas o sus residuos
64
 Micropipetas.
 Puntas para micropipetas.
 Microplaca de poliestireno de 96 pozos con fondo plano.
 Lector de microplacas marca Biorad Modelo 550.
 Solución de BSA en Solución de carbonatos a una concentración de 25 µL /mL.
 Suero de conejo inmunizado con BSA.
 Regulador carbonato/bicarbonato 0.1 M pH 9.6.
65
 Papel parafilm.
 Solución salina amortiguadora de fosfatos (PBS) con Tween al 0.05% (PBS-T)
 Solución de PBS-gelatina al 0.3% (PBS-G)
 Anticuerpos anti-Ig’s totales de conejo producidos en cabra y conjugados a peroxidasa.
 Solución reveladora (ELISA)
 Ácido sulfúrico 8 N.
1. Sensibilice la placa o tiras con 100 μL del antígeno de BSA en regulador de carbonatos
pH 9.6.
2. Tape la placa con cinta e incube durante 30 minutos 37°C o 18 a 24 horas en
refrigeración.
3. Deseche las soluciones de la placa, invirtiendo la placa. Golpee sobre papel absorbente
para eliminar el exceso de líquido.
4. Lave la placa 2 veces con 250 μL/ pozo de PBS-T.
5. Coloque en cada uno de los pozos 300 μL de PBS-G e incube 40 minutos a 37°C.
6. Realice las diluciones dobles seriadas del suero de conejo inmunizado con BSA,
comenzando con una dilución 1:5,000 utilizando PBS-G como diluyente. El volumen final
de cada dilución es de 1 mL. (varía según el esquema por sesión )
7. Incube 30 minutos a 37°C.
8. Deseche las soluciones de la placa, invirtiendo la placa. Golpee sobre papel absorbente
para eliminar el exceso de líquido y Lave la placa 5 veces con 250 μL/ pozo de PBS-T
9. Coloque en cada uno de los pozos 100 μL de anticuerpos anti-inmunoglobulinas de
conejo-conjugado a peroxidasa diluido 1:40,000 en PBS-G, excepto los marcados como
blanco, en los que deberá colocar 100 μL PBS-G.
10. Incube 40 minutos a 37° C.
11. Repita el paso 8
12. Adicione a cada uno de los pozos 100 µL de solución reveladora e incube 15 minutos a
temperatura ambiente y en oscuridad.
13. Detenga la reacción, adicionando una gota de H2SO4 8 N a cada pozo.
14. Lea la absorbancia, en el espectrofotómetro para microplacas, utilizando el filtro de 490
nm.
66
Esquema No. 1 Para una tira con 8 pozos:
Sensibilización Bloqueo 1er Ab 2do Ab Revelado

A Blanco -- -- -- -- Sln Reveladora
B Blanco -- -- -- -- Sln Reveladora
C C1 Ag Ag PBS - G PBS - G 1:40,000 Sln Reveladora
D C1 Ag Ag PBS - G PBS - G 1:40,000 Sln Reveladora
E C2 Ab s/Ag PBS - G Ac (1:5000) 1:40,000 Sln Reveladora
F C2 Ab s/Ag PBS - G Ac (1:5000) 1:40,000 Sln Reveladora
G Reacción Ag PBS - G Ac (1:5000) 1:40,000 Sln Reveladora
H Reacción Ag PBS - G Ac (1:5000) 1:40,000 Sln Reveladora
Incubación 30 min/ 37° C 40 min/37°C 30 min/ 37° C 40 min/37°C 15 min, T Ambiente
67
Esquema No. 2 Para tres tiras (24 pozos):
Sensibilización [Ag] Bloqueo

Tira No. Tira No.
F 1 2 3 1 2 3
A Blanco -- -- -- PBS-G PBS-G PBS-G
B Blanco -- -- -- PBS-G PBS-G PBS-G
C C1 Ag Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 PBS-G PBS-G PBS-G
D C1 Ag Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 PBS-G PBS-G PBS-G
E C2 Ab - Dil 1:2 Dil 1:4 PBS-G PBS-G PBS-G
F C2 Ab - Dil 1:2 Dil 1:4 PBS-G PBS-G PBS-G
G C3 Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 PBS-G PBS-G PBS-G
H C3 Sin diluir Dil 1:2 Dil 1:4 PBS-G PBS-G PBS-G
Incubación 30 min/ 37° C 40 min/37°C
Dilución 1er Ab Dilución 2do Ab Revelado

Tira No. Tira No.
Toda las
1 2 3 1 2 3
tiras
A -- Dil 1:2,500 Dil 1:2,500 -- 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
B -- 1:2 1:2 -- 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
C PBS-G 1:4 1:4 1:40,000 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
D PBS-G 1:8 1:8 1:40,000 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
E 1:5000 1:16 1:16 1:40,000 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
F 1:5000 1:32 1:32 1:40,000 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
G 1:2,500 1:64 1:64 1:40,000 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
H 1:2,500 1:128 1:128 1:40,000 1:40,000 1:40,000 Sln Rev
15 min, T
30 min/ 37° C 40 min/37°C
T/T Ambiente
68
Esquema No. Para la evaluación (48 pozos):
Sensibilización
Descripción 1 2 3 4 5 6
A Blanco
B Blanco
C C1 Ag
D C1 Ag
E C2 Ab
F C2 Ab
G C3
H C3
Bloqueo
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
E
F
G
H
1er Ab
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
E
F
G
H
69
2do Ab Revelado
1 2 3 4 5 6 Todo
A
B
C
D
E
F
G
H
70
ANÁLISIS DE DATOS
1. Determine la ecuación de la recta (mediante regresión lineal) para cada una de las
concentraciones de Ag utilizadas, utilizando los datos de absorbancia vs concentración
de BSA
2. Utilizando la ecuación de la recta, calcule la dilución del suero de conejo necesario para
obtener el 50% de la unión con el Ag, con respecto al control 3.
3. Determine el título del suero, definido como el promedio del inverso dela dilución del
suero de conejo necesario para obtener el 50% de la unión con el Ag. Nota: Deberá
utilizar los dos valores más cercanos entre sí obtenidos por interpolación.

DESEMPEÑO
EVIDENCIAS DE CRITERIOS DE DESEMPEÑO

APRENDIZAJE
Lista de cotejo de demostración Debes conocer el nombre de cada uno de los
de los reactivos del método de reactivos del método de ELISA indirecto
ELISA indirecto
Lista de cotejo de descripción de Debes conocer la función de cada uno de los
los componentes del método de reactivos del método de ELISA indirecto
ELISA indirecto
Lista de cotejo sobre el Debes realizar correctamente la determinación de
desarrollo de la técnica de ELISA anticuerpos de conejo anti-BSA por ELISA.
Deberás realizar un reporte de la práctica en que
se incluya: portada, título de la práctica, unidad de
Reporte de práctica
competencia de la práctica, resultados obtenidos,
conclusiones
Lista de cotejo sobre Debes conocer las normas mexicanas aplicables a
conocimiento y aplicación de las la práctica (NOM-113-STPS-2009, NOM-087-
normas de seguridad y ECOL-SSA1-2002, NOM-005-STPS-1998 y NOM-
reglamentos respectivos. 018-STPS-2000)
71
Lista de cotejo de demostración de los reactivos del método de ELISA 10%

indirecto
Lista de cotejo de descripción de los componentes del método de ELISA 30%
indirecto
Lista de cotejo sobre el desarrollo de la técnica de ELISA 30
Reporte de práctica. 20%
72
CALIFICACIÓN DE LAS PRÁCTICAS
Pipeteo de soluciones 10%
Reacciones de precipitación 15%
Reacción aglutinación 15%
Western-blot 30%
ELISA 30%
Total 100%
CITERIOS DE ACREDITACIÓN
 Obtener calificación mínima de 60 en cada una de las prácticas

 Asistencia al 100% de las prácticas
 Realizar de manera individual el 100% de las prácticas
 Entrega formal y oportuna del 100% de los productos de aprendizaje de las
prácticas
El valor de las prácticas es del 25% de la calificación de la Unidad de Aprendizaje.
73
ACERVOS DE CONSULTA
 Owen JA, Punt J, Stranford SA, Jones PP, Kuby J. (2013) Kuby Inmunología. 7ma.
edición. Editorial McGraw-Hill education. México.
 Abbas, K. A., Lichtman, H. A., & Pober, S. J. (2010). Inmunología celular y molecular ,
43–44Madrid.
 http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Manejo_Liquidos&opc=tecnicas&i
dap=48
 http://www.pce-iberica.es/instrumentos-de-medida/instrumentos-laboratorios/tecnica-
pipeteo.htm
 http://www.mt.com/mx/es/home/supportive_content/news/po/pipe/pipetting-
techniques.html
 https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-
learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-
elisa.html
 Ramírez, D. F. H., & Cabiedes, J. (2010). Técnicas inmunológicas que apoyan el
diagnóstico de las enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica,6(3), 173-177
 http://asinom.stps.gob.mx:8145/Centro/ConsultaNoms.aspx
 http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nomssa.html
74
GLOSARIO DE TÉRMINOS
75
76
ANEXO (SOLUCIONES)
I. Solución Salina Amortiguada con Fosfatos (PBS) 0.1 M pH 7.4. 10X
Cloruro de sodio 40 g
Fosfato dibásico de potasio 0.2 g
Cloruro de potasio 2.9 g
Agua destilada 900 mL
Ajustar el pH a 7.4 y aforar a un litro con agua destilada.
II. solución azul tripán al 0.4%

Azul tripan 0.4 g
PBS qsp 100 mL
III. TBS-Gelatina
a. Solución A
Trizma base 6.05 g
NaCl 8.76 g
Ajustar el pH a 7.6 con HCl 1M
b. Solución A
Gelatina 0.5 g
Calentar el agua y disolver la gelatina
Mezclar la solución A y B y aforar a un litro con agua destilada.
IV. Solución de Acrilamida-Bisacrilamida

Acrilamida 30 g
Bisacrilamida 0.8 g
77
H2O destilada hasta 100 mL
Filtrar en papel Whatman1 y guardar a la obscuridad a 4ºC.
V. Solución Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8

Trizma Base 18.15 g
H2O destilada 90 mL
Ajustar el pH 8.8 primero con HCl concentrado y posteriormente con HCl 1N.
Aforar a 100 mL con agua destilada.
Filtrar en papel Whatman1 y guardar a 4ºC.
VI. Solución Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8

Trizma Base 3g
H2O destilada 35 mL
Ajustar el pH 6.8 con HCl concentrado y posteriormente con HCl 1N
Aforar a 50 mL con agua destilada.
Filtrar en papel Whatman1 y guardar a 4ºC.
VII. Solución de persulfato de amonio al 10%

Persulfato de amonio 100 mg
H2O destilada 1 mL
Se prepara en el momento de usarse
VIII. Regulador de Muestra 2x

Tris 0.5M, pH 6.8 8 mL
SDS al 10% 10 mL
Glicerol 5 mL
2-Mercaptoetanol 2.5 mL
Azul de Bromofenol al 1% 1.0 mL
78
H2O destilada 32.5 mL
IX. Regulador de corrimiento (Tris 0.025 M, Glicina 0.192M, SDS al 0.1%, pH 8.3)
Trizma Base 3g
Glicina 14.4 g
SDS al 10% 10 mL
H2O destilada qbp 1000 mL
No se ajusta el pH
X. Solución Madre para Tinción de proteínas

Azul de Coomassie R250 2g
H2O destilada qbp 200 mL
XI. Solución de trabajo para tinción de proteínas con azul de Coomassie

Solución de Azul de Coomassie R250 62.5 mL
Metanol absoluto 250 mL
Ácido acético glacial 50 mL
H2O destilada 137.5 mL
Filtrar en papel Whatman 1
XII. Solución decolorante para geles de Poliacrilamida

Metanol absoluto 500 mL
H2O destilada 400 mL
XIII. Solución de ácido acético al 10%

79
XIV. Regulador de Transferencia (Tris 0.025 M, Glicina 0.192 M, pH 8.3 metanol 20%
v/v)
Trisma Base 9.07 g
Glicina 43.2 g
Metanol 600mL
XV. Regulador de Carbonato/bicarbonato pH 9.6

Carbonato de sodio 1.5 g
Bicarbonato de sodio 2.93 g
Agua destilada qbp 1000 mL
XVI. Regulador de Citrato/Fosfato, pH 5.0

Solución de ácido cítrico 0.1 M 24.3 mL
Solución de fosfato dibásico de sodio 0.2 M 25.7 mL
Agua destilada qbp 50 mL
XVII. PBS-Tween20 al 0.1%

PBS 10x 100mL
Tween 20 1 mL
H2O destilada qsp 1000 mL
XVIII. PBS-Tween20 al 0.05%

PBS 10x 100mL
Tween 20 0.5 mL
H2O destilada qsp 1000 mL
XIX. Solución reveladora (Western-blot)

3,3’ diaminobencidina 3 mg
PBS 1x 6 mL
80
H2O2 AL 30% 20 µl
XX. Solución reveladora (ELISA)

o-fenilendiamina 10 mg
Regulador citrato/fosfto pH 5.0 25 mL
H2O2 AL 30% 10 µl
XXI. Solución amortiguada Tris-Salina (TBS) 1x

Trisma base 6.05 g
NaCl 8.76 g
H2O qsp 1L
Disolver el 800 mL de H2O, ajustar el pH a 7.5 con HCl y aforar a 1 L.

Almacenar a 4°C
81

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT

ÁREA DE CIENCIAS DE LA SALUD

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE DE

Responsables de la elaboración del manual Coordinador de la elaboración del manual

Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

Ciudad de la Cultura “Amado Nervo”, Tepic Nayarit Octubre de 2016

M. en C. Ignacio Peña González

M.T.A. Norma Liliana Galván Meza

Coordinador del Área de Ciencias de la Salud

M.O. Julio Cesar Rodríguez Arámbula

Directora de la Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y

Q.F.B. Nadia Roxana Martínez Rubio

M en C Isaac Espinoza Santana

M. en C. Isabel Cristina Medina Carrillo

La unidad de aprendizaje de Inmunología General incluye el desarrollo de métodos que

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ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS DENTRO DE LA PROFESIÓN

CAMPO DE APLICACIÓN PROFESIONAL

Necesidades de Competencia Perfil profesional Unidades de Unidad de competencia

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DESCRIPCIÓN DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS

REGLAMENTO PARA USO DE LOS LABORATORIOS DE PRÁCTICAS DE LA

ARTÍCULO 4.- Es obligatorio traer uñas recortadas y cabello recogido.

ARTÍCULO 11.- Se prohíbe realizar cualquier tipo de actividades ajenas al desarrollo de

DEL RESPONSABLE DEL LABORATORIO

ARTÍCULO 12.- El responsable del laboratorio tendrá las siguientes obligaciones:

a) Leer íntegramente el presente reglamento en la primera sesión de trabajo de cualquier curso

b) Llevar la agenda de uso del laboratorio.

d) Cuidar los equipos y materiales que en el laboratorio se encuentren.

h) Mantener actualizado el inventario de equipo, reactivos y material del laboratorio.

i) Elaborar y /o actualizar el manual de procedimientos del laboratorio.

j) Solicitar en tiempo los reactivos y consumibles que se requieren al responsable

k) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la

Salud o Consejo de Programa Académico.

DEL MAESTRO TITULAR DE LABORATORIO

ARTÍCULO 13.- El maestro titular de laboratorio tendrá las siguientes obligaciones:

a) Entregar con anterioridad el manual de práctica que se utilizará durante el curso al

b) Presentarse de manera puntual, de preferencia 10 minutos antes del horario acordado.

d) Supervisar las actividades que se realicen en los laboratorios.

f) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la

Salud o Consejo de Programa Académico.

ARTÍCULO 14.- Los alumnos tendrán las siguientes obligaciones:

c) En caso de inasistencia justificada con escrito de la Dirección, el alumno reprogramará la

e) Responsabilizarse del material y equipo que utilicen en las diferentes actividades

g) El alumno que sustraiga material, sustancias y/o equipo de laboratorio se le prohibirá el

h) Si se requiere material adicional para realizar la práctica, deberá solicitarse al responsable

k) Las demás que se establezcan en el Consejo de área de Ciencias de la Salud o Consejo de

Es este apartado se establecen los reglamentos y recomendaciones que deberás observar

REGLAMENTOS DE SEGURIDAD E HIGIENE

Pantalón y zapatos (no sandalias): Pantalón de mezclilla y zapatos cerrados.

Al entrar al laboratorio, debes hacerlo en forma ordenada.

Cuando se realicen las prácticas, se prohibirá el ingreso de personas ajenas y la salida

Q.F.B. Iris Celeste Tovar Ocampo

Dr. Juan Manuel Agraz Cibrián

Dr. José Francisco Zambrano Zaragoza

La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir

El pipeteo consiste en una práctica sencilla, ¿verdad?

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