UNIVERSIDAD NACIONAL DE

INGENIERIA

Facultad de Ingeniería Química y Textil

LABORATORIO Nº2
TECNICAS DE ESTERILIZACION

CURSO : BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

CODIGO : PI-721/A

ALUMNOS : Rafael Castillo, Luis Miguel

Sicos Sicos, Roberto Carlos

PROFESORA : Ing. Janet Rojas

2010 – I
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

TECNICAS DE ESTERILIZACION

OBJETIVOS:

 Entender la esterilización como un procedimiento muy

importante en las pruebas microbiológicas, pues nos permitirán
eliminar casi en su totalidad los restos de microorganismos
vivos, cuando ya no queramos trabajar con ellas.

 Conocer los diferentes métodos de esterilización por agentes

físicos, para aplicarlos a los diferentes materiales de vidrio que
se van a usar en el laboratorio, como las placas petri, la botella
de cultivo, el matraz, etc.

 Conocer las diferentes técnicas de esterilización mediante el

uso de diferentes agentes (tanto los agentes físicos como
químicos), para poder saber en que casos aplicar cada una de
estas y cual seria la mas apropiada para determinados casos
específicos.

 Saber las condiciones de operación de una autoclave

(temperatura, tiempo, presión) y de una estufa (temperatura y
tiempo) para la correcta esterilización de materiales de vidrio.

FUNDAMENTO TEORICO:

ESTIRILIZACION:

La esterilización es el proceso de eliminación de toda forma de vida,

incluidas las esporas. Es un término absoluto que implica pérdida de
la viabilidad o eliminación de todos los microorganismos contenidos
en un objeto o sustancia, acondicionado de tal modo que impida su
posterior contaminación. Se trata de un término probabilístico, de
modo que tras un adecuado proceso de esterilización, se debe llegar
a una probabilidad de encontrar microorganismos igual o menor que
una unidad contaminada en un millón de unidades sometidas a un
proceso de esterilización.

METODOS DE ESTIRILIZACION:

METODOS FISICOS:

TECNICAS DE ESTERILIZACION 2
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

Los métodos físicos son aquellos que no involucran el empleo de

sustancias letales para los microorganismo, sino procedimientos
físicos como la radiación ionizante, el calor o la ultrafiltración de
soluciones con membranas que impiden el paso de microorganismos,
incluyendo virus.

MÉTODOS QUÍMICOS

Los métodos químicos de esterilización son aquellos que involucran el

empleo de sustancias letales para los microorganismos, tales como el
óxido de etileno y el etanol.

METODO FISICO DE ESTIRILIZACION (USANDO CALOR

HUMEDO):

AUTOCLAVE DE LABORATORIO:

Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar

material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y
temperatura, evitando con las altas presiones que el agua llegue a
ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento de la autoclave
es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la
presión y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber
de algunas formas acelulares, tal como los priones, que pueden
soportar las temperaturas de autoclave.

Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de

vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión
interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una
temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de
esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Las
autoclaves más modernas permiten realizar procesos a mayores
temperaturas y presiones, con ciclos estándares a 134 ºC a 200 kPa
durante 5 min para
esterilizar material
metálico; llegando
incluso a realizar ciclos de
vacío para acelerar el
secado del material
esterilizado.

Las autoclaves son

ampliamente utilizadas en
laboratorios, como una

TECNICAS DE ESTERILIZACION 3
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

medida elemental de esterilización de material. Aunque cabe notar

que debido a que el proceso involucra vapor de agua a alta
temperatura, ciertos materiales no pueden ser esterilizados en
autoclave, como el papel y muchos plásticos (a excepción del
polipropileno).

METODO FISICO DE ESTIRILIZACION (USANDO CALOR SECO):

ESTUFA DE ESTIRILIZACION:

El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por

niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de
membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde
los materiales a los microorganismos que están en contacto con
éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra
más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La
acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor
temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del
medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan
mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más
difíciles de romper por el calor seco.

La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios

para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y
tiempo de exposición que la autoclave. La temperatura varía entre
120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140°C
se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a
160°C se requieren al menos 2 horas de exposición.

Ventajas

 No es corrosivo para metales e instrumentos.

TECNICAS DE ESTERILIZACION 4
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

 Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y

de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas

 Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor

húmedo, debido a la baja penetración del calor.

PARTE
EXPERIMENTAL:
El trabajo realizado en el laboratorio consistió básicamente en
conocer los métodos mas adecuados para la esterilización de
materiales de laboratorio. Según sea el caso, estos materiales pueden
contener o no residuos sólidos, por lo tanto el método para esterilizar
es diferente dependiendo del tipo de material y del tipo de residuo
que contiene éste.

En el laboratorio se aprendió la esterilización de:

 Placa petri con/sin residuos sólidos

 Tubo con tapa rosca con/sin residuos sólidos

 Erlenmeyer con/sin residuos sólidos

 Probeta, pipeta, asa de siembra; y otros materiales en general

(gradillas, mesa, etc.)

 La esterilización, manejo, puesta en marcha y parada de la

autoclave.

TECNICAS DE ESTERILIZACION 5
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

Se pudo comprender la suma importancia que requiere la

esterilización de los materiales en los trabajos de investigación y en
cualquier trabajo de laboratorio, por lo tanto darle el énfasis requerido
ya que en los próximos laboratorios se harán esterilización de
materiales muy seguido y su correcto empleo influirá directamente en
los resultados de la práctica de laboratorio.

MATERIALES

Materiales de vidrio

 Placa Petri

 Tubo de ensayo con tapa rosca

 Erlenmeyer o Matraces

 Probeta

 Pipeta

Materiales de otra naturaleza

 Asa de siembra

 Mechero de alcohol

 Gradillas de tubos de ensayo

 Olla

 Calentador eléctrico

 Escobillas de lavado

 Pinzas

 Accesorios de jebe o plástico, algodón, gaza, papel Kraft, papel

aluminio

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA

Esterilización de Placa Petri

En caso la placa petri tenga residuos se puede esterilizar mediante un

método corto: Primero se coloca la placa petri en una bolsa, esta se
coloca en un baño maría por 15 minutos aproximadamente o también
se puede poner en la autoclave por el mismo tiempo, luego se retira y

TECNICAS DE ESTERILIZACION 6
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

se deja enfriar a temperatura ambiente; después que se enfrió, se

retiran del interior de la placa los sólidos de los líquidos, los líquidos
van al desagüe y los sólidos se vierten en la bolsa correspondiente.

A continuación se lava la placa con jabón líquido, para su posterior

enjuague con agua de caño y luego con agua destilada
posteriormente se seca (en la estufa a 170ºC por 30 minutos
aproximadamente).

Después que la placa esta totalmente seca se envuelve en papel

Kraft, este papel cuenta con 2 lados: 1 lado rugoso y otro lado liso. La
parte lisa va hacia dentro (en contacto con la placa), en este papel se
tiene que anotar: nombre, fecha, tipo de cepa a cultivar (en caso la
tuviese); la principal función del papel Kraft es aislar la caja petri del
entorno para evitar que se contamine la muestra, ésta puede estar
guardada por 2 semanas teniendo la plena seguridad de su
esterilización e inocuidad.

En el caso que la placa petri no contuviera residuos sólidos, se

emplea el mismo método anterior desde la parte en que se lava la
placa con jabón líquido, el resto del método es igual.

Como una alternativa en vez de esterilizar la placa petri puede ser el

empleo de placa petri descartable siempre y cuando sea posible
obtener este tipo de material.

Primero se procedió
a lavar con jabón las
placas petri. Luego
se les coloco en las
rejillas para que el
agua escurra. Luego
se paso algodón con
alcohol.

TECNICAS DE ESTERILIZACION 7
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

Una vez seco las

placas petri, se le
envolvió en papel
kraft, para el secado
en la estufa y a la
vez se realizo la
esterilización del
material.

Una vez finalizada el

tiempo adecuado
para el secado y
esterilizado, que fue
de 30 minutos
aproximadamente,
se procedió a
guardar la placa
petri con toda la
envoltura de papel
kraft, lista para
nuestro laboratorio
de cultivo.

Esterilización de tubos tapa rosca y matraces de vidrio

Se esterilizan en la autoclave (sin necesidad de estar dentro de una

bolsa) por un tiempo de 15 minutos con todo su contenido. Después
que se retiraron de la autoclave se dejan enfriar y se descartan los
residuos sólidos.

TECNICAS DE ESTERILIZACION 8
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

De manera similar que con la caja petri se lava con jabón líquido,
luego se enjuaga con agua de caño y agua destilada, para secar los
tubos de vidrio basta con ponerlos boca abajo en la gradilla.

Los tubos con tapa rosca sirven para realizar cultivos en ceparios.

Algunos matraces de vidrio tienen tapa de algodón y esto se debe a

que algunos cultivos necesitan oxígeno (aire) para desarrollarse.

Esterilización de la Probeta

Al ser la probeta un material donde no se va a desarrollar ningún

cultivo, la esterilización de este objeto basta con lavar con detergente
y enjuagar con agua de caño y finalmente con agua destilada.

Esterilización de Pipetas

Se sumergen en una probeta de 500ml que contiene una solución de

hipoclorito al 5 % durante 24 horas.

Esterilización del asa de siembra

Esta asa cuenta con un alambre de nicrón (el cual tiene la

particularidad de calentarse rápidamente y enfriarse rápidamente),
para la esterilización se calienta el alambre hasta que éste quede al
rojo vivo luego se deja enfriar a temperatura ambiente.

Esterilización de otros materiales (gradilla, mesa, etc.)

Generalmente se esterilizan con una solución de hipoclorito al 5%;

para asegurarse de la esterilización de una determinada parte del
laboratorio donde se va a llevar a cabo un cultivo, se recomienda
encender el mechero cerca del recinto de trabajo asegurando así un
ambiente libre de microorganismos.

RESULTADOS:
ESTERILIZACIÓN, MANEJO, PUESTO EN MARCHA Y PARADA DE
LA AUTOCLAVE

TECNICAS DE ESTERILIZACION 9
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

La autoclave usada en el laboratorio tiene una capacidad de 1galón

de agua, es un equipo pequeño. Las condiciones de operación del
equipo son: T=120ºC, P=10psia, por 30 minutos.

Para el uso del autoclave se echa 1 galón de agua, se colocan los

objetos a esterilizar dentro de la autoclave, luego se cierra
herméticamente y se enciende el calentador eléctrico (la llave se
colocará en la posición 4 -5).

Cuando el agua empieza a hervir el manómetro comenzará a subir, se

espera hasta que el manómetro marque 10 psia (no se recomienda
usar presiones mayores por motivos de seguridad del equipo y de las
personas que lo operen), una vez llegue a esta presión ésta se debe
mantener constante, lo cual se logra moviendo la llave de la
autoclave a la posición 3.5 – 4, después de que se logro controlar la
presión se controla 30 minutos.

Una vez pasado este tiempo se procede al apagado de la autoclave,

primero la llave de la autoclave se pone en la posición 0; se espera
que el manómetro marque 0 psia, se abre la llave de evacuación del
agua (la que esta en el fondo de la autoclave), se abre la autoclave y
se retiran los objetos que tiene dentro.

Como resultado de este procedimiento de esterilización de muestras

sin contenido, se obtuvieron los materiales (en nuestro caso fueron
las botellas), esterilizadas.

TECNICAS DE ESTERILIZACION 10
LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA

CONCLUSIONES:

 Existen diferentes técnicas para poder esterilizar materiales con

o sin contenido. La técnica de esterilización con agentes físicos,
es la más aplicada para materiales de vidrio, especialmente la
técnica que emplea calor seco y calor húmedo como agente
esterilizante.

 Las condiciones de operación de la autoclave, para la correcta

esterilización de materiales, deben ser controladas, para
mantener las condiciones óptimas de temperatura y presión así
como el tiempo necesario que debe estar sometida la muestra.

BIBLIOGRAFIA:

 http://www.engenderhealth.org/spanish/sip

 http://www.biologia.edu.ar/microind/esterilización.htm

 http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos

TECNICAS DE ESTERILIZACION 11