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ESTÁNDAR ISO
INTERNACIONAL 11290-1

Segunda edicion
2017-05

Microbiología de la cadena alimentaria - Método


horizontal para la detección y enumeración de Listeria
monocytogenes y de Listeria spp. -

Parte 1:
Método de detección

Microbiología de la Chaîne alimentaire - Méthode pour la recherche horizontale et le


denombrement de Listeria monocytogenes et de
Listeria spp. - Partie 1: Méthode de

recherche

Número de referencia ISO


11290-1: 2017 (E)

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ISO 11290-1: 2017 (E)

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Contenido Página

Prefacio .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................. v

Introducción .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ........................ vi 1

Alcance .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ......................... 1 2

Referencias normativas .................................................. .................................................. .................................................. ................................ 1 3

Términos y definiciones .................................................. .................................................. .................................................. ............................... 2 4

Principio .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ................ 2


4.1 General .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ... 2
4.2 enriquecimiento primario en un medio líquido de enriquecimiento selectivo con concentración reducida de agentes selectivos (media-Fraser
caldo) .................................................. ......................................... 2
4.3 enriquecimiento secundario con un medio de enriquecimiento líquido selectivo con plena concentración de agentes selectivos (caldo Fraser) ....................
.................................................. .. 3
4.4 Cultivo en placas y la identificación .................................................. .................................................. ................................................. 3
4.5 Confirmación .................................................. .................................................. .................................................. ....................................... 3

5 Los medios de cultivo y reactivos .................................................. .................................................. .................................................. ................ 3 6

Equipos y consumibles .................................................. .................................................. .................................................. ............ 3 7

Muestreo .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ................ 4 8

Preparación de la muestra de prueba .................................................. .................................................. .................................................. ................... 4 9

Procedimiento .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ............. 4


9.1 Porción de ensayo y la suspensión inicial .................................................. .................................................. ................................... 4
9.2 enriquecimiento primario .................................................. .................................................. .................................................. ..................... 4
9.3 enriquecimiento secundario .................................................. .................................................. .................................................. ............... 5
9.4 Cultivo en placas y la identificación .................................................. .................................................. ................................................. 5
9.4.1 general .................................................. .................................................. .................................................. .............................. 5
9.4.2 Agar Listeria de acuerdo con Ottaviani y Agosti .................................................. ................................. 5
9.4.3 Segunda medio selectivo .................................................. .................................................. ..................................... 6
9.5 Confirmación de Listeria monocytogenes o Listeria spp. .................................................. ................................. 6
9.5.1 Selección de colonias para la confirmación .................................................. .................................................. ...... 6
9.5.2 Confirmación de L. monocytogenes .... .................................................. .................................................. ......... 6
9.5.3 Confirmación de Listeria spp. .................................................. .................................................. ......................... 10
9.6 Interpretación de propiedades morfológicas y fisiológicas y de las reacciones bioquímicas ..................................................
.................................................. .................................................. .............. 11
9.7 caracterización adicional de las cepas aisladas (opcional) .................................................. ........................... 11

10 Expresión de los resultados .................................................. .................................................. .................................................. ............................... 11 11

Las características de rendimiento del método .................................................. .................................................. ...................... 11


11.1 Los estudios de validación de métodos .................................................. .................................................. .................................................. .... 11
11.2 Sensibilidad .................................................. .................................................. .................................................. ........................................... 11
11.3 Especificidad .................................................. .................................................. .................................................. ........................................... 11
11,4 nivel de detección (LOD 50) .................................................. .................................................. .................................................. ... 11

12 Informe de prueba .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ........ 12

13 La garantía de calidad .................................................. .................................................. .................................................. ....................................... 12 Anexo A ( normativo)

Diagrama del procedimiento .................................................. .................................................. ......................................... 13 Anexo B ( normativo) Composición y

preparación de medios de cultivo y reactivos ..................................... 14 Anexo C ( informativo) distinción de Listeria spp. de otros géneros ..................................................

......................... 27 Anexo D ( informativo) Reacciones para la identificación de Listeria especies .................................................. ............ 28 Anexo E ( informativo) Listeria

agares selectivos .................................................. .................................................. .................................... 30

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Anexo F ( informativo) Los resultados de los estudios entre laboratorios para la detección de
Listeria monocytogenes .................................................. .................................................. .................................................. ......................... 31 Bibliografía .......................................

.................................................. .................................................. .................................................. ..................... 35

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Prefacio

La ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales de normalización (organismos
miembros de ISO). El trabajo de preparación de Normas Internacionales se lleva a cabo normalmente a través de comités técnicos de ISO.
Cada organismo miembro interesado en una materia para la cual se ha establecido un comité técnico, tiene el derecho a estar representado
en dicho comité. Las organizaciones internacionales, gubernamentales y no gubernamentales, en coordinación con ISO, también participan
en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC) en todas las materias de normalización
electrotécnica.

Los procedimientos utilizados para desarrollar este documento y los destinados a su posterior mantenimiento se describen en las Directivas ISO
/ IEC, Parte 1. En particular, deben tenerse en cuenta los diferentes criterios de aprobación necesarios para los diferentes tipos de documentos
ISO. Este documento fue elaborado de acuerdo con las normas editoriales de las Directivas ISO / IEC, Parte 2 (véase www .iso .org / directivas ).

Se llama la atención a la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puede ser objeto de derechos de patente. ISO no se hace
responsable de la identificación de cualquiera o todos los derechos de patente. Los detalles de cualquier derecho de patente identificados durante el
desarrollo del documento estarán en la introducción y / o en la lista ISO de las declaraciones de patentes recibidas (véase www .iso .org / patentes ).

Cualquier nombre comercial utilizado en el presente documento se da información para la comodidad de los usuarios y no constituye un
endoso.

Para una explicación de la naturaleza voluntaria de las normas, el significado de los términos y expresiones específicas ISO relacionados con
evaluación de la conformidad, así como información sobre el cumplimiento de ISO de los principios de la Organización Mundial del Comercio
(OMC) en los obstáculos técnicos al comercio (OTC) ver el siguiente URL: www .iso .org / iso / html prólogo .

Este documento fue preparado por el Comité Europeo de Normalización (CEN) el Comité Técnico CEN / TC 275, Análisis de
alimentos - los métodos horizontales, en colaboración con el Comité Técnico ISO / TC 34, Productos alimenticios, Subcomité
SC 9, Microbiología, de conformidad con el acuerdo de cooperación técnica entre ISO y CEN (Acuerdo de Viena).

Esta segunda edición anula y sustituye a la primera edición (ISO 11290-1: 1996), que ha sido revisada técnicamente. También incorpora la

enmienda ISO 11290-1: 1996 / enm.1: 2004. Los principales cambios, en comparación con la norma ISO 11290-1: 1996, son los siguientes.

- La detección de Listeria monocytogenes ha sido modificado como se indica a continuación.

- enriquecimiento primario en caldo de medio-Fraser: la incubación durante 25 h ± 1 h.

- enriquecimiento secundario en caldo Fraser: la incubación durante 24 h ± 2 h [. 29 ]

- caldos Half-Fraser y Fraser se pueden refrigerar antes de la transferencia o el aislamiento en agar selectivo para un máximo de 72 h.

- Almacenamiento de placas de aislamiento: se incubaron placas pueden ser refrigeradas por un máximo de dos días antes de la lectura.

- aspecto microscópico para su confirmación es opcional si el agar de aislamiento permite distinguir entre patógenos y no
patógenos Listeria spp.

- prueba de CAMP y prueba de catalasa son opcionales.

- La inclusión de nuevas características de rendimiento.

- Además, la detección de Listeria spp. se ha incluido en el alcance y el título cambiado en consecuencia. Una lista de los integrantes de la serie

ISO 11290 se puede encontrar en el sitio web de ISO.

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ISO 11290-1: 2017 (E)

Introducción

Los principales cambios, que figuran en el prólogo, introducidos en este documento con respecto a la norma ISO 11290-1: 1996 se consideran
como importante (véase ISO 17468 [ 28 ]). Los cambios técnicos se evaluaron y se considera que tienen un efecto significativo sobre las
características de funcionamiento de métodos o resultados de las pruebas. Debido a la gran variedad de productos alimenticios y piensos, este
método horizontal puede no ser apropiado en todos los detalles para determinados productos para las que puede ser necesario el uso de métodos
diferentes o específicas. Sin embargo, en todos los casos, este método horizontal se pretende aplicar la medida de lo posible y desviaciones de
esto sólo se hizo por razones técnicas justificadas.

Cuando este documento se revisa siguiente, se tendrá en cuenta toda la información disponible entonces en relación con el grado en que se
ha seguido este método horizontal y las razones de las desviaciones de la misma en el caso de determinados productos.

La armonización de los métodos de prueba no puede ser inmediata, y para ciertos grupos de productos de las normas
internacionales y / o nacionales de normalización puede existir ya que no cumplen con este método horizontal. Se espera que
cuando se revisen estas normas, serán transformados para cumplir con este documento para que finalmente serán las que sean
necesarias por razones técnicas bien establecidas las salidas sólo restantes de este método horizontal.

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Microbiología de la cadena alimentaria - Método horizontal para la detección


y enumeración de Listeria monocytogenes
y de Listeria spp. -

Parte 1:
Método de detección

ADVERTENCIA - A fin de salvaguardar la salud del personal de laboratorio, es esencial que las pruebas para detectar L.
monocytogenes y Listeria spp. Sólo se llevó a cabo en laboratorios debidamente equipados, bajo el control de un microbiólogo
experto, y que tiene gran cuidado en la eliminación de todos los materiales incubadas. Las personas que utilicen este
documento deben estar familiarizados con la práctica normal de laboratorio. Este documento no pretende abordar todos los
aspectos de seguridad, si los hay, asociados con su uso. Es responsabilidad del usuario establecer las prácticas de
seguridad y salud. En particular, se recomienda encarecidamente que las pruebas para detectar

L. monocytogenes se llevan a cabo en laboratorios que prestan nivel de bioseguridad 2 condiciones. Se recomienda encarecidamente
que el personal de laboratorio mujeres se hacen conscientes del riesgo particular para el feto en desarrollo presentado por la infección
de la madre a través de la exposición a L. monocytogenes
y Listeria spp., y que el personal embarazadas y personas con condiciones subyacentes reconocidos o enfermedades que
deterioran la inmunidad mediada por células no manipular cultivos de
L. monocytogenes y Listeria spp.

1 Alcance

Este documento especifica un método horizontal para

- la detección de L. monocytogenes, y

- la detección de Listeria spp. (incluso L. monocytogenes).

Este documento es aplicable a

- productos destinados al consumo humano y para la alimentación de los animales, y

- muestras ambientales en el área de la producción alimentaria y manipulación de alimentos. Es posible que cierta adicionalmente descritos Listeria

especies que no se pueden detectar o confirmado por este método. [ 5 ], [10] , [12] , [ 14 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

2 Referencias normativas

Los siguientes documentos se hace referencia en el texto de tal manera que parte o la totalidad de su contenido constituye requisitos de este
documento. Para las referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición del
documento de referencia (incluyendo cualquier modificación). ISO 6887 (todas las partes), Microbiología de la cadena alimentaria - Preparación
de muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico

ISO 7218, Microbiología de los alimentos y piensos - Requisitos generales y guía para los análisis microbiológicos

ISO 11133, Microbiología de alimentos, piensos y agua - Preparación, producción, almacenamiento y pruebas de rendimiento de medios
de cultivo

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ISO 11290-1: 2017 (E)

3 Términos y definiciones

A los efectos de este documento, se aplican los siguientes términos y definiciones.

ISO e IEC mantienen bases de datos terminológicas para su uso en la normalización en las siguientes direcciones:

- IEC Electropedia: disponible en http: // www .electropedia .org /

- ISO plataforma de Navegación en línea: disponible en http: // www .iso .org / OBP

3.1
Listeria monocytogenes
microorganismos que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos y que exhiben las características morfológicas,
fisiológicas y bioquímicas descritas cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con este documento

3.2
detección de Listeria monocytogenes
determinación de la detección / no detección de Listeria monocytogenes ( 3.1 ), En una masa dada o volumen de producto o una superficie
especifica, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con este documento

3.3
Listeria spp.
microorganismos que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos y que exhiben las características morfológicas,
fisiológicas y bioquímicas descritas cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con este documento

3.4
detección de Listeria spp.
determinación de la detección / no detección de Listeria spp. ( 3.3 ), En una masa dada o volumen de producto o una superficie especifica,
cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con este documento

4 Principio

4.1 Generalidades

Listeria spp. pueden estar presentes en pequeñas cantidades y, a menudo van acompañadas de números considerablemente mayor de otros
microorganismos, por lo tanto el enriquecimiento selectivo es necesario. También es necesario detectar lesionada y subrayó Listeria spp. y el
medio de enriquecimiento selectivo primaria, con la concentración de inhibidor reducida, cumple al menos parte de esta función. NOTA

Presencia de L. monocytogenes puede ser enmascarado por la presencia de otro Listeria especies, en particular,
L. innocua o L.ivanovii.

Dentro de los límites de este documento, la detección de L. monocytogenes y de Listeria spp. hace necesario cuatro etapas sucesivas, como se
describe en el diagrama de flujo en Anexo A .

4,2 enriquecimiento primario en un medio líquido de enriquecimiento selectivo con concentración reducida de
agentes selectivos (media-Fraser caldo)

La inoculación de un medio de enriquecimiento primario selectivo que contiene la mitad de las concentraciones de acriflavina y ácido nalidíxico
(media-Fraser caldo, ver B.1 ), Que también se utiliza como un fluido de dilución para la muestra de ensayo ( 9.1 ).

La incubación de la suspensión inicial a 30 ° C durante 24 h a 26 h.

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4,3 enriquecimiento secundario con un medio de enriquecimiento líquido selectivo con plena concentración de
agentes selectivos (caldo Fraser)

Inoculación de fuerza completa medio de enriquecimiento líquido secundario (caldo Fraser) con un cultivo obtenido a partir de 4.2 .

La incubación del caldo Fraser a 37 ° C durante 24 h. [ 29 ]

4,4 cultivo en placas y la identificación

A partir de los cultivos obtenidos en 4.2 y 4.3 , Cultivo en placas en los dos medios sólidos selectivos:

- agar Listeria de acuerdo con Ottaviani y Agosti (ver Referencias [ dieciséis ] Y [ 17 ] y B.3 );

- cualquier otro medio selectivo sólido a la elección del laboratorio complementaria a Agar Listeria
de acuerdo con Ottaviani y Agosti, usando un sustrato diferente y / o principio que el utilizado en
Listeria agar según Ottaviani y Agosti (véase B.4 ). Ver anexo E para obtener información sobre los medios de comunicación. La
incubación del agar Listeria de acuerdo con Ottaviani y Agosti a 37 ° C durante un total de 48 h. Si colonias de presunta L. monocytogenes o Listeria
spp. son evidentes a las 24 h de la incubación puede ser detenido en esta etapa. La incubación del segundo medio selectivo a la temperatura
y el examen apropiado después de la hora apropiada.

4.5 Confirmación

Siembra de las colonias de presunta L. monocytogenes o Listeria spp., plateado cabo como se describe en 4.4 , Y la confirmación
por medio de morfológica y / o pruebas bioquímicas apropiado.

5 Los medios de cultivo y reactivos

Para las prácticas de laboratorio actuales, consulte la norma ISO 11133.

Composición y rendimiento de las pruebas de los medios y reactivos de cultivo y su preparación se describen en anexo B .

6 Equipos y consumibles

Material ordinario de microbiológica (como se especifica en la norma ISO 7218) y, en particular, los siguientes.

6.1 Aparato para la esterilización en seco ( horno) o esterilización en húmedo ( autoclave). Como se especifica en la norma

ISO 7218.

6.2 Armario secador o una incubadora, capaz de ser mantenida entre 25 ° C y 50 ° C.

6.3 Incubadoras, capaz de funcionar a 30 ° C ± 1 ° C, 37 ° C ± 1 ° C y a 25 ° C ± 1 ° C (opcional).

6.4 Baño de agua, capaz de funcionar a 47 ° C a 50 ° C.

6.5 bucles estériles aproximadamente 3 mm de diámetro o 10 l, e inoculando aguja o cable.

6,6 metros pH, capaz de ser leído al 0,01 unidades de pH a 25 ° C, lo que permite realizar mediciones que son una precisión de ± 0,1
unidades de pH.

6.7 Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de capacidades nominales de 1 ml y 10 ml.

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6.8 placas de Petri, por ejemplo, de diámetro 90 mm.

6.9 Microscopio, preferiblemente con contraste de fase, y con toboganes y cubreobjetos.

6,10 Frigorífico, capaz de funcionar a 5 ° C ± 3 ° C.

7 muestreo

El muestreo no es parte del método especificado en este documento. Si no hay una norma internacional específica en materia de toma
de muestras del producto en cuestión, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema. Para las
muestras de alimentos y piensos, consulte ISO / TS 17728 [ 3 ].
Para las muestras ambientales, utilice ISO 18593 [ 2 ] y véase la referencia [ 24 ].

Es importante que el laboratorio recibe una muestra que sea verdaderamente representativa y que no ha sido dañado o cambiado durante el
transporte o almacenamiento (véase ISO 7218).

8 Preparación de la muestra de prueba

Preparar la muestra de ensayo de acuerdo con la Norma Internacional específica que trata con el producto de que se trate [véase la norma
ISO 6887 (todas las partes) e ISO 18593 [ 2 ]]. Si no hay una norma internacional específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen
a un acuerdo sobre este tema.

9 Procedimiento

porción 9.1 Prueba y suspensión inicial

Consulte la ISO 6887 (todas las partes) y cualquier norma internacional específico apropiado para el producto en cuestión.

Para la preparación de la suspensión inicial, el uso como fluido de dilución del medio de enriquecimiento selectivo primario especificado en B.1 (Caldo de
medio-Fraser).

En general, para preparar la suspensión inicial, añadir una porción de prueba de 25 g o 25 ml a 225 g o 225 ml de medio selectivo enriquecimiento
primario ( B.1 ), Para obtener una dilución de diez veces, y homogeneizar. Pre-calentar el medio de enriquecimiento primaria selectiva a temperatura
ambiente antes de su uso.

Este documento ha sido validado para porciones de ensayo de 25 g o ml. Una porción de muestra más pequeño puede ser utilizado, sin la
necesidad de validación / verificación adicional, siempre que la misma relación entre caldo de enriquecimiento primario y la porción de ensayo se
mantiene. Una porción de ensayo mayor que el inicialmente validado puede ser utilizado, si un estudio de validación / verificación ha demostrado
que no hay efectos adversos sobre la detección de L. monocytogenes o Listeria spp.

NOTA 1 Validación puede llevarse a cabo de acuerdo con el documento apropiado de la norma ISO 16140 (todas las partes) [ 1 ].
Verificación para las muestras de la puesta en común puede llevar a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en la norma ISO 6887-1: 2017, Anexo D (protocolo de
verificación para la puesta en común de muestras para ensayos cualitativos). Ver Referencias [ 21 ] y [22] ya que proporcionan información sobre el caso particular de Listeria muestras
de fondo común.

NOTA 2 Para grandes cantidades, se recomienda para pre-calentar el medio de enriquecimiento primaria selectiva a 30 ° C ± 1 ° C antes de mezclarla
con la porción de ensayo.

9.2 enriquecimiento primario

Incubar el medio de enriquecimiento primario (media-Fraser caldo, ver B.1 ), Preparado de acuerdo con 9.1 , A 30 ° C ( 6.3 ) Durante 25 h ± 1
h.

NOTA 1 Una coloración negro puede desarrollar durante la incubación.

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ISO 11290-1: 2017 (E)

NOTA 2 Es posible almacenar a 5 ° C ( 6.10 ) La muestra pre-enriquecido después de la incubación antes de la transferencia a Fraser
caldo para un máximo de 72 h. (Ver

referencia [ 20 ].)

9.3 enriquecimiento secundario

9.3.1 Después de la incubación de la suspensión inicial (enriquecimiento primario) durante 25 h ± 1 h ( 9.2 ), Transferir 0,1 ml del cultivo obtenido en 9.2
(Independientemente de su color) a un tubo o frasco que contiene 10 ml de medio de enriquecimiento secundario (caldo Fraser) ( B.2 ).

9.3.2 Incubar el medio inoculado ( 9.3.1 ) Durante 24 h ± 2 h a 37 ° C ( 6.3 ). NOTA

En el caso de Listeria spp. otro que Listeria monocytogenes detección, adicional 24 h de incubación puede permitir la recuperación de más
especies.

9,4 cultivo en placas y la identificación

9.4.1 general

9.4.1.1 Desde el cultivo de enriquecimiento primario ( 9.2 ) Se incubaron durante 25 h ± 1 h a 30 ° C ( 6.3 ), Inocular, por medio de un bucle ( 6.5 ),
La superficie del primer medio de siembra en medio selectivo, Agar Listeria de acuerdo con Ottaviani y Agosti ( B.3 ), Para obtener colonias bien
separadas.

Proceder de la misma manera con el segundo medio en placa de salida selectiva de elección ( B.4 ). NOTA

La mitad-Fraser caldo y el caldo Fraser pueden ser refrigerados a 5 ° C ( 6.10 ) Antes del aislamiento en agar selectivo
para un máximo de 72 h. [ 20 ]

9.4.1.2 Desde el medio de enriquecimiento secundario se incubaron durante 24 h ± 2 h a 37 ° C ( 6.3 ) ( 9.3.2 ), Repita el procedimiento descrito en el
9.4.1.1 con los dos medios selectivos de chapado-out.

9.4.1.3 Invertir las placas de Petri obtenidos en 9.4.1.1 y 9.4.1.2 y colocarlos en una incubadora a 37 ° C ( 6.3 ) Para Agar Listeria de
acuerdo con Ottaviani y Agosti ( B.3 ). Para el segundo medio selectivo ( B.4 ), Siga las instrucciones del fabricante.

9.4.1.4 para Agar Listeria de acuerdo con Ottaviani y Agosti incubar durante un total de 48 h ± 2 h. Si colonias de presunta L. monocytogenes o
Listeria spp. son evidentes a las 24 h ± 2 h la incubación puede ser detenido en esta etapa. Para segundo agar selectivo se incuba durante el
tiempo apropiado. Examinar los recipientes ( 9.4.1.3 ) Para la presencia de colonias presuntivas de L. monocytogenes o Listeria spp. NOTA

Después de placas de incubación puede ser refrigerada a 5 ° C ( 6.10 ) Para un máximo de 48 h antes de leer.

9.4.2 Agar Listeria de acuerdo con Ottaviani y Agosti

Considerar como presunto L. monocytogenes las colonias de color azul-verde rodeadas de un halo opaco (colonias típicas). Las
colonias de L.ivanovii también son azul-verde y rodeado de un halo opaco. Considerar como presunto Listeria spp. las colonias de color
azul-verde con o sin halo de opaco. NOTA 1 Algunas cepas de L. monocytogenes expuesto a condiciones de estrés, el estrés en particular el
ácido, puede mostrar un halo muy débil (o incluso sin halo). NOTA 2 Algunos raros L. monocytogenes se caracterizan por un PIPLC lento (fosfatidil
inositol fosfolipasa C) la actividad. Tales bacterias se detectan cuando la duración total de incubación es más de, por ejemplo, cuatro días. Algunas
de estas cepas podrían ser patógenas. [ 13 ] No L. monocytogenes cepas se han descrito como PIPLC negativo.

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