Biologia Celular Reacção de Hill e a Fotossíntese

*Índice

*Índice...............................................................................................................................1
*Objectivos........................................................................................................................2
*Introdução........................................................................................................................2
*Material utilizado:...........................................................................................................3
*Procedimento...................................................................................................................4
*Apresentação de resultados.............................................................................................6
*Discussão de resultados.................................................................................................12
*Conclusão......................................................................................................................14
*Conclusão

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*Objectivos

* Determinação do conteúdo em clorofilina;

* Estudo da reacção de Hill.

*Introdução

A fotossíntese é um processo a partir do qual os organismos autotróficos

fotossintéticos convertem a matéria mineral (matéria-prima inorgânica) em matéria
orgânica, utilizando a energia luminosa. Este processo é realizado por plantas, algas,
algumas bactérias e cianobactérias. A fotossíntese inclui a fixação do dióxido de
carbono atmosférico, usado na síntese de hidratos de carbono, resultando na libertação
de oxigénio.
A fotossíntese pode ser compreendida como um processo físico-químico,
traduzido pela seguinte equação geral:
Energia
luminosa
6CO2 +12H2O C6H12O6+6O2+6H2O
clorofila
Dióxido Água Glicose Oxigénio Água
de carbono

Nas plantas, a fotossíntese ocorre ao nível dos cloroplastos: é na membrana dos

tilacóides destes organelos que se localizam as clorofilas. O processo fotossintético
compreende duas fases: a fase fotoquímica (luminosa), dependente da luz, e a fase
química, não dependente da luz. A fase fotoquímica ocorre nos tilacóides. Nesta etapa
têm lugar reacções fotoquímicas importantes:
 fotólise da água - dissociação da molécula de água em oxigénio e hidrogénio, na
presença da luz; a água funciona como o dador primário de electrões;
 oxidação da clorofila a - ao ser excitada pela luz, a clorofila a emite electrões,
ficando na forma reduzida;
 fluxo de electrões - percurso seguido pelos electrões ao longo de cadeias de
transportadores, onde ocorrem transferências energéticas que permitem a
fotofosforilação do ADP em ATP;.
 redução do NADP+ - os electrões reduzem o NADP+ (aceitador final de electrões) a
NAPH.
Para que a fase fotoquímica ocorra é necessária a presença de luz, água, ADP+Pi e
NADP+. Os produtos finais são O2, ATP, NADPH e H+.
A fase química, também denominada ciclo de Calvin ou ciclo fotossintético redutor
do carbono, ocorre no estroma e compreende um conjunto de reacções que não
dependem da luz. Ali, o dióxido de carbono é fixado, combinando-se com a ribulose
difosfato (RuDP). Os electrões do NADPH e o ATP, produzidos na fase fotoquímica,
são utilizados na produção do aldeído fosfoglicérido (PGAL), que pode seguir duas vias
- intervir na regeneração da ribulose difosfato ou ser usado na síntese da glicose. A fase
não dependente da luz requer a presença de ATP, NADPH e CO2. Os produtos finais
desta fase são glicose, ADP+Pi, NADP+ e RuDP.

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*Material utilizado:

* Folhas de espinafre (Spinacia oleracea),

* Almofariz,
* Gelo,
* Gaze,
* Tubo de eppendorf,
* Micropipetas,
* Centrifugadora,
* Tubo de centrifugação,
* Água (H2O),
* Acetona;
* Tampão R – solução tampão de ruptura:
0,33M Sorbitol,
10mM Pirofosfato de sódio,
4mM Cloreto de magnésio,
2mM Tris,
Acertar a pH 6,5 com HCl
* Tampão S – solução tampão de suspensão:
0,33M Sorbitol,
2mM EDTA,
1mM Cloreto de magnésio,
10mM Tris,
Acertar a pH 7,6 com HCl
* Vórtex,
* Cuvette,
* Espectrofotómetro,
* Hemocitómetro,
* Microscópio,
* Tampão fosfato 100 mM, pH 6,5
* DCFIF 0,1 mM (Diclorofenolindofenol)
* Atrazina 100 µm
* Tubos de ensaio,
* Papel de prata.

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*Procedimento

1ª Parte – Ruptura celular dos espinafres e purificação de cloroplastos por precipitação

diferencial:
1. Escolher as folhas de espinafres e remover as nervuras principais.
2. Cortar finamente 4g folhas sem nervuras.
3. Colocar as folhas num almofariz, previamente arrefecido e colocado sobre o
gelo. Adicionar 10 ml de solução tampão R e triturar até obter uma pasta fina.
4. Filtrar através de 4 camadas de gaze, espremendo a polpa para recuperar o
máximo possível.
5. Centrifugar 1 minuto a 200g (4ºC) – precipitação das células inteiras e dos
fragmentos não triturados. Decantar o sobrenadante para um novo de tubo de
centrifugação.
6. Centrifugar a 7 minutos a 1000g (4ºC).
7. Desprezar o restante.
8. Ressuspender o pellet em 2 ml de solução tampão S e recolher para 2 tubos de
eppendorf (fracção rica em cloroplastos).
9. Fazer a diluição da suspensão de cloroplastos de um dos tubos a 1/100 (1ml de
cloroplastos e 99ml de tampão s).

2ª Parte – Determinação do conteúdo em clorofila

1. Pipetar 0,2 ml da suspensão de cloroplastos para um tubo de eppendorf de 2 ml.
2. Adicionar 1,6 ml de acetona ao tubo. Agitar no vórtex.
3. Adicionar 0,2 ml de água destilada ao tubo. Agitar no vórtex.
4. Centrifugar a 1000g, 5 minutos.
5. Transferir o sobrenadante para uma cuvette e ler a absorvância a 652 nm.
Utilizar água como branco do espectrofotómetro.
6. Calcular a clorofila total/ml de suspensão utilizando a expressão:

Abs652nm = [clorofila (mg/ml)] ×l×ε

Em que: l é a largura da cuvette (1cm) e ε é o coeficiente de extinção (0,029 ml
mg-1 cm-1)
7. Com o auxílio de um hemocitómetro, calcular o número de cloroplastos/ml.

3ª Parte – Reacção de Hill

1. Com base, nos resultados obtidos para a concentração de clorofila, determine o
factor de diluição necessário para obter uma concentração de 10 ml de clorofila.
2. Preparar 4 tubos de acordo com a tabela:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Tampão fosfato 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml
Cloroplastos activos ----- 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Atrazina ----- ----- ----- 1,0 ml
Água 2,0 ml 1,0 ml 1,0 ml -----

3. Ligue o espectrofotómetro e seleccione o comprimento de onda de 600 nm.

4. Adicionar o 1 ml de DCFIF aos Tubos 3 e 4. Misturar e medir imediatamente a
absorvância a 600 nm.
5. Embrulhar o Tubo 2 em papel de alumínio e coloca-lo no escuro.
6. Expor os Tubos 3 e 4 a uma fonte luminosa forte.

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7. Medir a absorvância dos tubos expostos à luz ao fim de 10, 20 e 30 minutos.

Registar.
8. Medir a absorvância do tubo 2 ao fim de 10, 20 e 30 minutos, tendo o cuidado
de o recolocar no escuro. Registar.
9. Calcular a concentração de DCFIF reduzido ao fim de 10, 20 e 30 minutos,
utilizando a expressão:

Cr =Co(Ao-Ac)Ao

Em que: Cr concentração de DCFIF reduzido,

Co concentração de DCFIF inicial,
Ao absorvância inicial (tempo o),
Ac absorvância determinada ao fim de 10, 20 e 30 minutos.
10. Construir um gráfico de mmol DCFIF reduzido vs tempo.

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*Apresentação de resultados

Cálculo do número de cloroplastos/ml

Número de cloroplastos contados em cada quadrado do hemocitómetro

7 2 1 3
1 1 3 7
1 6 3 1
8 2 0 2
4 3 4 3
2 3 3 3
6 1 5 4
2 5 5 3
3 1 3 2
2 3 5 4
4 5 3 5
4 1 4 3
6 10 1 5
4 6 8 4
6 3 2 3
5 5 3 5
2 7 5 3
3 5 5 2
5 4 4 4
2 3 1 5

Nº de cloroplastos total no hemocitómetro =média de células×25×16×100

5×5 4×4 da diluição

1/100

Nº de cloroplastos total no hemocitómetro=59×16×25×100=2 360 000

Cálculo auxiliar:
Média de células num quadrado pequeno =48+59+52+76+605 =2955=59

Volume do hemocitómetro = 0,0025mm2 ×0,1mm = 2,5×10-4 mm3 =0,00025×10-3ml

Valores retirados do hemocitómetro

2 360 000 cloroplastos ________ 0,00025×10-3 ml

X _______ 1ml

X=9,44×1012 cloroplastos/ml

Cálculo da clorofila total/ml de suspensão

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* Valores obtidos quando se leu a absorvância do sobrenadante a 652 nm:

1ª Leitura = 1,177
2ª Leitura = 1,145
3ª Leitura = 1,164

* Cálculo da absorvância a 652nm:

Abs 652nm = 1,177+1,145+1,1643=1,162

* Cálculo da concentração inicial de clorofila:

Abs 652nm = [clorofila (mg/ml)] ×l×ε

1,162=clorofila×1×0,029
Clorofila=40,06 mg/ml (concentração inicial)

* Cálculo do factor de diluição necessário para obter uma concentração 1/10 mg/ml de
clorofila

Cinicial×Vinicial=Cfinal×Vfinal

* Cálculo do volume inicial para a concentração final de 1mg/ml de clorofila e volume

final 10 ml

40,06 mg/ml×Vinicial = 1mg/ml ×10ml

Vinicial = 0,2497ml=250 µl

250 µl de clorofila e 750 µl de água

Valores de absorvância dos tubos

Tempo 0 minutos 10 minutos 20 minutos

Tubos
1 - 0,018 0,012 0,006
2 -0,006 -0,006 0,006
3 -0,006 -0,006 0,003
4 -0,012 -0,010 -0,003

Cr =Co(Ao-Ac)Ao

Co=c1v2=c2v2
Co=0,1mM×1ml=6ml×X

Concentração Volume total

de DCFIF de cada tubo
Co=16,7 µm

Tabela de valores de concentração de DCFIF reduzido

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Tempo 10 minutos 20 minutos

Tubos
1 27,8 22,3
2 0 33,4
3 0 25,1 Gráficos
4 2,8 12,5 Actividade de clorofila = -
0,55 µm/min/mg

Actividade de clorofila= 3,34 µm/min/mg

Actividade de clorofila= 2,51 µm/min/mg

Actividade de clorofila= 0,97 µm/min/mg

Valores de absorvância dos tubos – valores dados pela professora

Tem 0 minutos 10 minutos 20 minutos 30 minutos 50 minutos

po Tubos
1 0,280 0,226 0,224 0,228 0,248
2 0,230 ----- 0,288 0,330 0,314
3 0,250 0,142 0,087 0,060 0,061
4 0,250 0,252 0,253 0,254 0,273

Tabela de valores de concentração de DCFIF reduzido – calculado pelos valores dados

pela professora

Tempo 10 minutos 20 minutos 30 minutos 50 minutos

Tubos
1 3,22 3,34 3,10 1,90
2 ------- -4,21 -7,26 -11,9
3 7,21 10,9 12,7 12,6
4 -0,14 -1,14 -0,267 -1,44

Gráficos com base nos valores fornecidos pela professora

Actividade de clorofila= -0,03531 µm/min/mg

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Actividade de clorofila= -0,25286 µm/min/mg

Actividade de clorofila=0,122657 µm/min/mg

Actividade de clorofila= -0,02522 µm/min/mg

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*Discussão de resultados

Na primeira parte da experiência em que realizámos a ruptura celular dos

espinafres utilizámos a solução tampão R que continha na sua constituição cloreto de
magnésio com objectivo de manter a integridade do núcleo. Esta solução também serve
para manter o pH constante. Já a utilização da solução tampão S também continha
cloreto de magnésio pela mesma razão e continha EDTA, de forma a remover os metais
pesados e inactivar as metaloproteínas potencialmente destruidoras das estruturas sub
celulares. As diferentes velocidades e tempos de centrifugação (passo 5 e 6 da primeira
parte do procedimento) servem para separar sequencialmente as várias partículas de
acordo com a sua velocidade de sedimentação. Para se purificar as fracções sub
celulares obtidas pela precipitação diferencial, ressuspendeu-se o pellet com a adição da
solução tampão S (passo 8 da primeira parte do procedimento), a fim de obter uma
fracção rica em cloroplastos.
Na segunda parte da experiência, realizámos a contagem do nº de cloroplastos na
suspensão que foi de 9,44×1012 cloroplastos/ml. Tivemos que observar os cloroplastos
ao microscópio e contar quantos se encontravam em cada quadrado dos pequenos.
Ainda na segunda parte da experiência chegámos ao valor de clorofila total/ml,
verificando a absorvância da suspensão a 652 nm. Com base no valor obtido
determinámos o factor de diluição necessário para obter uma concentração de 1/10
mg/ml de clorofila. E diluímos a suspensão de cloroplastos com este factor de diluição.
Esta diluição foi necessária para a terceira parte da experiência.
Na terceira parte da experiência, fomos testar a reacção de Hill. Robert Hill
verificou que cloroplastos isolados quando iluminados e na presença de um aceitador de
electrões artificial (A) são capazes de produzir O2:
2H2O+2A cloroplastos+luz 2AH2+O2
Esta reacção, conhecida por reacção de Hill, ocorre na ausência de CO2 e usa apenas
água como fornecedor do potencial redutor (demonstrando-se assim que a libertação de
O2 e a redução de CO2 não estão necessariamente interligadas). Esta reacção revela um
facto essencial da fotossíntese: a transferência de electrões, activada pela luz, desde uma
substância até à outra contra um gradiente de potencial químico, i.e., a transformação de
energia luminosa em energia química. A utilização do DCFIF como aceitador de
electrões nesta fotorredução permite medir por espectrofotometria a reacção de Hill
porque o corante é azul quando oxidado e incolor quando reduzido. A taxa de
decréscimo da cor azul é uma medida da taxa de reacção.
Ainda falando da terceira parte da experiência, analisemos os gráficos. No tubo
1, não ocorre reacção, ou seja actividade da clorofila ao, uma vez que não continha
cloroplastos activos na sua composição. Assim consideremos o nosso tubo 1, como tubo
de controlo. No tubo 2, também não deveria ter ocorrido alteração nos valores de
concentração, uma vez que o tubo se encontrava no escuro. Nos nossos resultados
houve apenas uma ligeira diferença de absorvância, assim como nos resultados dados
pela professora, não é muito relevante uma vez que actividade da clorofila deu negativa.
Quanto ao tubo 3, registou-se no gráfico actividade de clorofila positiva portanto o
DCFIF reduziu-se, a sua taxa de concentração aumentou, tal como se pode verificar
tanto nos resultados da professora como dos nossos, provando-se assim a reacção de
Hill. Já no tubo 4, contrariamente aos nossos resultados, mas apoiado pelos resultados
obtidos pelos valores dados pela professora o DCFIF, houve pouca actividade da
clorofila (o declive negativo do gráfico demonstra isso), o que deve acontecer, uma vez
que o tubo 4 contém atrazina que é um inibidor de transferência de electrões.

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*Conclusão

Em suma, a reacção de Hill ocorre quando os cloroplastos são iluminados e na

presença de um receptor artificial de electrões, neste caso o DCFIF.
A reacção de Hill não só corrobora o facto de que o O2 libertado na fotossíntese
provém da oxidação da H2O, como também indica a existência de dois conjuntos de
reacções independentes:
I) Reacções da fase luminosa – conjunto de reacções químicas directamente
dependentes da luz; ocorre a captação da energia da luz e são sintetizadas moléculas
com potencial redutor (NADPH) e energético de ATP.
II) Reacções da fase não luminosa ou ciclo de Calvin – a energia e potencial redutor das
moléculas sintetizadas na fase luminosa são utilizadas para fixar o CO2e sintetizar
açúcares com 3C (trioses fosfato).
É importante referir, que não obtivemos resultados muito correctos devido à
complexidade desta experiência.

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*Bibliografia

• “Biologia e Geologia – Preparação para o Exame Nacional”, Porto Editora, 2007

• FERREIRA, Ana Maria; QUINTAS, Célia; BRAZ, Nídia; PALMA, Sílvia
Cristina; No laboratório - Bloco I; 2ª edição, Areal Editores, 1996
• SILVA, Amparo Dias; GRAMAXO, Fernanda; SANTOS, M.ª Ermelinda;
MESQUITA, Almira Fernandes; Biologia e Geologia - 10º ano; Porto Editora,
2004

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