PEWARNAAN ALIZARIN RED

Nama : Dedi Teguh Prasetiyo

NIM : B1A017055
Rombongan : III
Kelompok :1
Asisten : Sharon Hillary

LAPORAN PRAKTIKUM PERKEMBANGAN HEWAN

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2018
 I. PENDAHULUAN

A. Tujuan

Tujuan praktikum pewarnaan Alizarin red adalah untuk melakukan

prosedur pewarnaan alizarin merah dan mengetahui kalsifikasi tulang.

B. Manfaat

Manfaat praktikum pewarnaan Alizarin red adalah memberikan informasi

mengenai proses kalsifikasi pada embrio hewan.
 II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum pewarnaan Alizarin red adalah

tempat specimen berupa botol jernih bermulut lebar, pipet tetes, gelas arloji, dan alat
bedah.
Bahan-bahan yang diperlukan dalam praktikum pewarnaan Alizarin red
adalah ikan nilem (Osteochilus vittatus), larutan alkohol 96 %, akuades, KOH 1 %,
pewarna Alizarin red, KOH 2%, larutan penjernih A, B dan C.

B. Metode

Metode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah:

1. Ikan nilem (Osteochilus vittatus) disiapkan, dimatikan dan dibekukan.
2. Ikan direndam ke aquades selama 10 menit.
3. Ikan dibersihkan menggunakan alkohol 96% selama 12 jam.
4. Ikan direndam ke akuades selama 10 menit.
5. Ikan direndam ke KOH 1% selama 7 jam.
6. Ikan direndam ke Alizarin red selama 10 jam.
7. Ikan direndam ke larutan A selama 30 menit.
8. Ikan direndam ke larutan B selama 30 menit.
9. Ikan direndam ke larutan C sampai pengamatan.
10. Ikan diamati dan tulang yang terwarnai dicatat.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3.

Ikan nilem segar Ikan nilem yang Ikan nilem yang
ditambahan akuades ditambahkan alkohol 96%

Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6.

Ikan nilem setelah Ikan nilem setelah Ikan nilem yang
ditambahakan akuades ditambahkan KOH 1% ditambahkan Alizarin
red

Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9.

Ikan nilem setelah Ikan nilem setelah Ikan nilem setelah

dimasukkan KOH 2% dimasukkan KOH 2% dimasukkan KOH 2%
ulangan 1 ulangan 2 ulangan 3

Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12.

Ikan nilem setelah Ikan nilem setelah Ikan nilem setelah
dimasukkan KOH 2% ditambahkan larutan A ditambahkan larutan B
ulangan 4

Gambar 13.
Ikan nilem yang
ditambahkan larutan C
Tabel 3.1. Data Tulang yang Terwarnai (Rombongan V)
Kelompok Tulang yang Terwarnai
a. Terwarnai : tengkorak, operculum
1.
b. Terlihat, tidak terwarnai : vertebrae
a. Terlihat, tidak terwarnai : rongga insang, tulang ekor, ribs,
2. operculum series
b. Terwarnai : verttebrae, tengkorak, neuronium, neural spines
a. Terlihat, tidak terwarnai : pin spine, maxxila, soft rays,
premaxsilla, hypyral
3.
b. Terwarnai : neucranium, pectoral brodle, ribs, vertebrae,
neural spines, operculum series
a. Terlihat, tidak terwarnai : tulang rusuk, sisrip punggung, sirip
ekor, sirip dada
4.
b. Terwarnai : operculum, rongga insang, tulang belakang
(sebagian)
a. Terlihat, tidak terwarnai : vertebrae, tulang rusuk, tulang
urostyle, Haemal spines, tulang plery giophores, premaxila, sirip
5.
dada, opercular series, suspen corium
b. Terwarna : neurocranium

Tabel 3.2 Prosedur Pewarisan Alizarin Red

Waktu Larutan Keterangan
07.35 - 07.45 Akuades Ikan masih terlihat segar
07.45 - 19. 45 Alkohol 96% Ikan sudah mulai lembek dan memutih
19.45 - 19.55 Akuades Ikan berwarna pucat
19.55 - 07.55 KOH 1% Ikan mulai terlihat transparan
07.55 - 14.55 Alizarin red Tulang ikan mulai terwarnai merah
14.55 - 15.25 KOH 2% Tubuh ikan bertambah transparan
15.25 - 15.55 KOH 2% Ikan bertambah transparan
15.55 - 16.25 KOH 2% Ikan bertambah trasnparan
16.25 - 16.55 KOH 2% Iakn bertambah transparan
16.55 - 17.10 Larutan A Tulang dan bagian dalam ikan terlihat
 semakin jelas
Tulang dan bagian dalam ikan terlihat
17.10 - 17.40 Larutan B
semakin jelas
Tulang dan bagian dalam ikan terlihat
17.40 - 17.55 Larutan C
semakin jelas
B. Pembahasan

Hasil pengamatan diperoleh terhadap pewarnaan alizarin pada ikan nilem

yaitu tulang yang terwarnai berupa operculum, rongga insang, tulang belakang
(sebagian) sedangkan tulang yang terlihat tetapi tidak terwarnai berupa tulang rusuk,
sirip punggung, sirip ekor, sirip dada. Hasil kelompok kami ini sesuai dengan
pendapat Kalthoff (1996) yang menyatakan bahwa tulang yang pertama terwarnai
adalah tulang tengkorak (tulang kepala). Tulang tengkorak merupakan tulang
dibentuk dengan cara osifikasi intramembran. Umumnya tulang yang
terbentuk secara intramembran (proses pembentukan tulang dari jaringan mesenkim
menjadi jaringan tulang) mengalami osifikasi lebih cepat dibandingkan dengan
tulang yang terbentuk secara endokondral (sel-sel) mesenkim berdiferensiasi lebih
dulu menjadi kartilago (jaringan rawan) lalu berubah menjadi jaringan tulang)
(Jasin, 1989). Menurut Sukra (2000) tulang-tulang yang mengalami pewarnaan
dengan zat warna alizarin red adalah tulang dahi (frontal), tulang rahang (mandibula
dan maxilla), radius, ulna, tulang ujung jari, scapula, tulang rusuk, femur, tibia, serta
fibula. Penulangan yang biasanya terbentuk pertama yaitu pada vertebrae caudalis
(Setiawan, 3013). Mesenchymal stem cell dapat berdiferensiasi menjadi beberapa
tipe sel mesenkim seperti fibroblast, kondroblast, osteoblast, mioblast,dan
adipoblast, kemudia berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi jaringan ikat seperti
tulang an kartilago (Ceriana et al., 2014). Proses ini berasal dari serat kolagen
dimasuki zat ossin (protein tulang), kemudian fibroblast pembentuk mengalami
transformasi menjadi osteoblast dan osteoblast. Osteoblast pembentuk tulang,
osteoblast peresap zat yang akan dirombak menjadi tulang. Warna ini muncul karena
zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang. Namun pada
bagian vertebratanya tidak terwarnai dengan sempurna. Hal ini dikarenakan
proses pengikatan zat warna tidak seimbang antara kalsium dan fosfor sehingga
mempengaruhi penyerapan warna alizarin red pada tulang (Lesson, 1990).
Hasil berbeda dengan pustaka kemungkinan karena ada faktor-faktor yang
mempengaruhi keberhasilan pewarnaan alizarin red antara lain kandungan mineral
terlarut, kepekatan larutan alizarin red, dan ketepatan perlakuan pemberian larutan
pendukung, tingkat ketelitian dalam penambahahan larutan, umur ikan yang berbeda
dan lamanya waktu perendaman pada tiap larutan. Selain itu kurang lamanya waktu
perendaman ikan dalam larutan KOH 1% dan pewarnaan oleh larutan Alizarin, yang
membuat jaringan ototnya tidak terlalu transparan sehingga menyulitkan larutan
pewarna Alizarin terserap pada tulang-tulang yang mengalami klasifikasi. Tulang-
tulang yang telah mengalami kalsifikasi akan berwarna merah tua. Menurut
Soeminto (2000) tulang yang tidak terwarnai akan berwarna transparan. Tulang yang
tidak terwarnai belum tentu tidak mengalami kalsifikasi, mungkin pada saat
diwarnai larutan belum terserap ke seluruh bagian, kandungan kalsium sedikit, serta
terlalu lama dalam perendaman larutan KOH 1% yang menyebabkan ikan menjadi
hancur (Soeminto 2000).
Specimen hancur kemungkinan terlalu lama dalam perendaman larutan KOH
1%. KOH mentransparansi lipid dan protein yang berada pada otot ikan sehingga
ikan menjadi transparan. Namun terlalu lama direndam KOH 1% menyebabkan
tidak hanya bagian otot saja yang ditransparansi namun jaringan yang membungkus
tulang rangka (skeleton) pun menjadi ikut tertransparansi sehingga menyebabkan
specimen hancur (Soeminto 2000). Tulang specimen yang belum terwarnai belum
tentu tidak mengalami kalsifikasi mungkin pada saat diwarnai larutan belum terserap
ke seluruh bagian karena kurang lamanya waktu perendaman ikan dalam larutan
KOH 1% dan pewarnaan oleh larutan Alizarin yang membuat jaringan ototnya tidak
terlalu transparan sehingga menyulitkan larutan pewarna Alizarin terserap pada
tulang-tulang yang mengalami klasifikasi. Faktor lain yaitu kandungan garam
kalsium yang sedikit. Kalsium merupakan bahan utama dalam proses penulangan
(osifikasi) (Christiani et al 2016). Konsentrasi kalsium dapat mempengaruhi
morfologi sel punca menjadi osteoblasts melalui interaksi sel ke sel atau antar sel
(Imanuel et al., 2017). Pewarnaan Alizarin red hanya untuk pewarnaan tulang keras
sehingga yang terwarnai hanya tulang keras saja yang ditunjukkan berwarna merah
sedangkan tulang rawan tidak terwarnai sehingga tidak dapat mengamati tulang
rawan yang terbentuk. Biasanya tulang rawan menggunakan Alizarin blue sehingga
kartilagonya terwarna biru sedangkan otot yang meneglilingi tulang terlihat
transparan (Susanto, et al., 2016). Mekanisme KOH mentrasparasikan otot yaitu
KOH mentransparansi lipid dan protein yang berada pada otot ikan, lipid dan protein
terdegradasi sehingga ikatan antar molekulnya melemah dan ikan terlihat transparan
(Yatim, 1983).
 IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas maka dapat diambil kesimpulan

sebagai berikut:
1. Prosedur pewarnaan Alizarin red yaitu ikan dilumpuhkan menggunakan es,
kemudian rendam pada akuades selama 10 menit untuk membersihkan ikan.
Ikan selanjutnya direndam ke alkohol 96% selama 12 jam untuk fiksasi setelah
itu rendam pada akuades selama 10 menit. Larutan dibuang kemudia
ditambahakan 1% KOH selama 12 jam untuk mentransparasikan otot, kemudian
larutan diganti dengan Alizarin red selama 7 jam untuk mewarnai tulang yang
terkalsifikasi. Larutan Alizarin red jangan dibuang kemudian ditambahkan 1mL
KOH 2% selama 30 menit maksimal 5 ulangan, kemudian ditambahkan larutan
A, B, dan C masing-masing larutan secara bergantian selama 30 menit.
2. Kalsifikasi tulang pada ikan nilem (Osteochilus vittatus) ditandai dengan tulang
yang terwarnai merah sudah terjadi pada operculum, rongga insang, tulang
belakang (sebagian).

B. Saran

Saran untuk praktikum ini adalah praktikan diharapkan melakukan pewarnaan

Alizarin red sesuai dengan prosedur yang sudah ada agar hasil sesuai dengan yang
diharapkan.
 DAFTAR REFERENSI

Ceriana, R., Djuwita, I. & Wresdiyati, T., 2014. Ekstrak Batang Sipatah-Patah
Meningkatkan Proliferasi dan Diferensiasi Sel Punca Mesenkimal Sumsum
Tulang. Jurnal Veteriner, 15(4), pp. 436-445.

Christiani, R. E., Setyawati, I. & Yulihastuti, D. R., 2016. Morfologi dan

Perkembangan Skeleton Fetus Tikus (Rattus norvegicus) Yang Diberi
Ransum Mengandung Daun Kaliandra (Calliandra calothyrsus) Selama
Kebuntingan. Jurnal Biologi, 20(2), pp. 69-74.

Imanuel, T.M., Herdiman, H. & Wargasetia, T.L., 2017. Suplementasi Vitamin D,

Dosis Tinggi Menurunkan Kalsifikasi Tulang Femur dan Janin Mencit.
Jurnal Kedokteran Hewan Brawijaya, 29(3), pp. 185-189.

Jasin, M., 1989. Sistematika Hewan Invertebrata dan Vertebrata. Surabaya: Sinar
Wijaya.

Kalthoff, K., 2001. Analysis of Biological Developmental. 2nd Edition. New

York: McGraw-Hill Inc.

Lesson., 1990. Atlas of Histology. London: W.B Saunders Company.

Setiawan, A., Pertumbuhan Skeleton Fetus Mencit (Mus musculus L.) Setelah
PemberianMorfin Selama Masa Organogenesis. Jurnal Penelitian Sains,
(13), pp. 79-89.

Soeminto., 2000. Embriologi Vertebrata. Purwokerto: Universitas Jenderal

Soedirman.

Storer, T. 1989. General Zoology. New York: McGraw-Hill Inc.

Susanto, G. N. & Utari, F. R., Struktur Skeleton Sirip Kaudal Kompleks

Periophthalmus gracilis. Jurnal Biogenesis, 4(1), pp. 29-33.

Yatim, W., 1983. Embryologi.Bandung: Tarsito.