Introducción A La Cromatografía Líquida de Alta Re... - (PG 16 - 46) PDF

c.
cd
ccddccdd
d  c c.   d c    
Introducción
cddcc. 15
+ + - -
+ SO3- N (CH3)3+ -
 
Figura 6. Esquema del proceso de cromatografía de intercambio iónico.
.dcdcdcc.
d. Cromatografía de exclusión molecular: en este tipo de separación croma-
d.   
tográfica, también llamada de
filtración o
de   denc
permeación gel, la fase
estacionaria está constituida por un polímero entrecruzado de tamaño
ccddcdc
de poro definido. Las moléculas grandes, no compatibles con el tamaño
ccdcdd
de poro, siguen su avance, mientras que las más pequeñas quedan rete-
ddd.cdccd
nidas en los intersticios del gel. Esta modalidad cromatográfica es útil
para especies
  neutras
cde alto peso
 molecular realizándose
   la separación
d d
en función de su tamaño.
  c d .  ddd cc   
c  d   c d  c 
Copyright © 2012. Editorial Universidad Autónoma de Madrid. All rights reserved.
cd.

   
    
ira.eaderoceodecroaoraadeecinoecar.
Figura 7. Esquema del proceso de cromatografía de exclusión molecular.
ira.eaderoceodecroaoraadeecinoecar.
e.    erie a earacin de eca or 
e. Cromatografía de afinidad: permite la separación de mezclas por su in-

e. teracción
ineraccin  
eecica
específica concon erie a earacin
unndeterminado
deerinado dede
iandode
ligando ecaenzima-
acividad
actividad: or 
enia
sustrato, antígeno-anticuerpo.
ineraccin eecica con n deerinado iando de acividad enia
raoanenoanicero.
raoanenoanicero.

 
 
Figura 8. Esquema del proceso de cromatografía de afinidad.
ira.eaderoceodecroaoraadeainidad.


3. 
enadioicinoconiracindeaaeeacionaria.
3. enadioicinoconiracindeaaeeacionaria.
Gismera, García, María Jesús, et al. Introducción a la cromatografía líquida de alta resolución, Editorial Universidad Autónoma de Madrid,
a. aaeeacionariaeencenraeaeada
2012. ProQuest Ebook Central, http://ebookcentral.proquest.com/lib/remingtonsp/detail.action?docID=3226641.
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

3. 16 Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución

enadioicinoconiracindeaaeeacionaria.
a. aaeeacionariaeencenraeaeada
3. Según la disposición o configuración de la fase estacionaria.
eneineriordenaconaeneraenearicadaenacerooeroo
a. Cromatografía en columna: la fase estacionaria se encuentra empaquetada en el
interior
vidrio.  de una columna generalmente fabricada en acero, polímero o vidrio.

ira.eaderoceodecroaoraaencona.
Figura 9. Esquema del proceso de cromatografía en columna.
b. 

b. Cromatografía plana   :     
• 

• Cromatografía
b en capa
 fina: la fase estacionaria esta extendida sobre
     . 
un soporte sólido inerte de vidrio, plástico o aluminio. La muestra
bb
para análisis se aplica
  por
  medio de un tubo
 b capilar
  sobre la superficie
 b
de una capa fina
. adsorbente en forma de banda o punto.

Figura..
10. Cromatografía en capa fina.
•   :       

.

..
Introducción 17
•   :       

• Cromatografía en papel: se denomina de esta forma a la cromatografía
plana que emplea celulosa como fase estacionaria.
.


Figura 11. Cromatografía en papel.
 aeassbesasaesaeeasesssasa
..
Una de las posibles clasificaciones, atendiendo a los criterios vistos hasta
aaseesaeaaba.
ahora, se muestra en la Tabla I.
 
aba.ssseaaas.
Tabla I. Distintos tipos de cromatografías.

FASE FASE TÉCNICA PROCESO
ESTACIONARIA MÓVIL CROMATOGRÁFICA CROMATOGRÁFICO
C.de Líquidos Adsorción

Sólida Líquida Capa fina Intercambio Iónico
Columna Exclusión Molecular
C.de Gases
 Gas Capa fina Adsorción
Columna
C. de Fluidos
Fluido
 Supercríticos Adsorción / Reparto
supercrítico
Columna
C.de Líquidos
Líquida Líquida Capa fina Reparto
Columna
C. de Gases
 Gas Reparto
Columna

  bsae ese s es e  e s aes se ee
asaasasaas:
4. seaasaaeseaaseassases:
18 Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución
No obstante, existen otros criterios en función de los cuales se pueden cla-

sificar las técnicas cromatográficas:
4. Considerando las polaridades relativas de las dos fases:

a. Cromatografía en fase normal. En esta modalidad la fase estacionaria es
más polar que la fase móvil. Normalmente la columna esta rellena con
una sílice enlazada a un resto orgánico que posee un grupo polar (cia-
nos, dioles, aminos). La polaridad de este grupo controla la selectividad
de la fase estacionaria. La elución se lleva a cabo con disolventes o mez-
cla de disolventes de polaridad inferior a la fase estacionaria (dietiléter,
cloroformo o n-hexano).
b. Cromatografía en fase inversa. En este caso la fase estacionaria es menos
polar que la fase móvil. Debido a su versatilidad, la cromatografía en
fase inversa es la habitualmente utilizada en la mayoría de aplicaciones.
Como relleno para la fase estacionaria se emplean cadenas hidrocarbo-
nadas de distinta longitud, tal como C8 o C18, químicamente unidas a
una base de sílice. La fase móvil suele estar constituida por un disol-
vente o mezcla de disolventes de elevada polaridad. El papel de la fase
móvil en este tipo de cromatografía es de gran importancia, ya que con
sólo uno o dos tipos de fases estacionarias y modificando la naturaleza

y composición de la fase móvil, pueden obtenerse separaciones que van
desde hidrocarburos alifáticos hasta separaciones de enantiómeros.
5. Considerando el procedimiento de desarrollo cromatográfico:

a. Cromatografía de elución. Esta técnica cromatográfica consiste en poner
una única porción de muestra en contacto con la fase estacionaria una
vez que la fase móvil se encuentra impregnando de manera continua di-
cha fase estacionaria, después de lo cual, la mezcla se distribuye entre
ambas fases. Cuantas más veces tenga lugar la distribución de moléculas
entre la fase móvil y la estacionaria, más eficaz será la separación. La
fase móvil utilizada es comúnmente llamada eluente o eluyente, mien-
tras que una vez recogida la fracción eluida que contiene los analitos de
interés, recibe el nombre de eluato.
Introducción 19
  d d  c cc     
Figura 12. Proceso de cromatografía de elución.
ccFigura
d 12.
Proceso de cromatografía
 de elución.
 d  . 

Si durante todo  c
el proceso    c
cromatográfico se trabaja sin dc
variar d 
la composi-
ción de lacccd
fase móvil, se denomina elución isocrática. Sin embargo, hay ocasio-
dcdc
nes en quec
para separaciones difíciles puede no conseguirse una
dd.   c      composición
 
de fase móvil adecuada que proporcione la resolución deseada. En esos
c  c  cc d  d  c d
casos
se utiliza la elución en gradiente que consiste en cambiar la composición del

c.
eluente durante el proceso de separación.

MUESTRA FASE MÓVIL
S B
A+B+C
C
C
B
C A
A
C
B
ELUCIÓN A B
Tiempo o Volumen


Figura 13. Esquema del proceso de elución.
.dcdc.

 cdddcd
 d c   cd d d
cc c      c 
Si bien la cromatografía de líquidos de alta resolución se desarrolla siempre

mediante elución, existen otros procedimientos de desarrollo cromatográfico
como el análisis frontal y la cromatografía por desplazamiento.
b. Cromatografía de análisis frontal. La muestra se pasa por la fase estacio-
naria de forma continua constituyendo ella misma la fase móvil. Todos
los componentes permanecen en la fase estacionaria hasta que ésta se sa-
tura en un componente y empieza a eluirse. El componente con menos
afinidad por la fase estacionaria eluirá el primero.
c. Cromatografía por desplazamiento. La muestra se introduce en un deter-
minado momento disuelta en fase móvil. Junto a la fase móvil se añade
un compuesto denominado desplazador que se fija más fuertemente a
la fase estacionaria que los solutos desplazándoles de ésta. Depediendo
de la fuerza de interacción relativa soluto/desplazador, los solutos de la
muestra eluirán con un determinado orden.
I.C. Cromatografía de líquidos en columna
Dentro de las técnicas cromatográficas que emplean como fase móvil un

líquido (cromatografía líquida, CL) se incluye tanto la cromatografía en papel
y capa fina como la cromatografía en columna.

En los comienzos de la cromatografía líquida en columna se trabajaba con
columnas relativamente grandes haciendo pasar la fase móvil a través del lecho
cromatográfico mediante gravedad. Este lecho estaba constituido por partícu-
las de gran tamaño (150-250 µm). Como desventajas de este diseño se puede
señalar:
• Los tediosos procedimientos de empaquetado de las columnas.
• La columna generalmente sólo se usa una vez, por lo que resulta una
técnica cara.
• La baja eficacia obtenida al trabajar con partículas grandes.
• Los tiempos de análisis son excesivamente largos incluso para mezclas
simples.
• El diseño es fuertemente dependiente de la forma en que el operador
aplique la muestra.
• La detección de los solutos manual no permite la automatización.
Introducción 21
          
Por estos motivos, la cromatografía líquida en columna se fue relegando en
          
su uso frente al avance de la cromatografía de gases (CG, 1952) que presentaba

como  
grandes ventajas 
frente  la
a las anteriores alta
  
eficacia columnas
de las yel
que pueda
 usarse tanto
 a escala analítica
  como
   preparativa.
 El
factor limitante
 
de la eficacia en cromatografía líquida clásica en columna abierta clásica era la
             
baja velocidad de difusión de las moléculas de soluto entre las fases estacionaria
y 
móvil. La para
única opción   
aumentar  
la eficacia de las   
columnas 
consistiría en
aumentar la velocidad
  de la transferencia
  de masa
   y equilibración
  de las molécu-
   
las de soluto entre ambas fases. Los tratados teóricos clásicos de Van Deemter y
    omatoaa  o  ata o 
Giddings sugerían que ese objetivo sólo podía conseguirse utilizando rellenos de
taataaaaaaoaao
tamaños de partícula muy pequeños. La reducción del tamaño de partícula hasta
valores
a adel orden
m a de 5 µmconlleva
ta la necesidad
a oma de utilizar
 ot sistemas
ata deño
propul-
sión de las fases móviles capaces de impulsarlas a través de estos nuevos lechos,
estamaño
decir que sean capaces de trabajar a altas presiones (500-5000 psi, 34-340
atm). Por  este motivo, tanto las bombas como las columnas y conexiones han de
soportar unas condiciones de trabajo de alta presión. Así, surge la cromatografía
• 
de líquidos de alta resolución (HPLC /CLAR), técnica en la que se utiliza una presión
elevada • para

forzar el paso de la fase móvil a través de una columna que contiene par-
tículas•de 
pequeño tamaño.
De
 esta manera
 se
consigue:     
• Aumentar la eficacia de la separación al disminuir el tamaño de partícula.


• Reducir la duración del proceso de separación entre 5 y 50 veces.
• •Permitir

realizar la detección en continuo del eluato y por tanto la auto-
 matización.
• Trabajar a escala preparativa.




 Figura 14. Cromatografía en columna y cromatógrafo de líquidos de alta resolución




II. Parámetros Cromatográficos
  cromatograma       

Se denomina cromatograma al registro de las señales de respuesta produci-

das en el detector ante la presencia de los analitos a la salida de la columna cro-

matográfica. Corresponde al registro del perfil de concentración, o masa, de

los componentes de la muestra como función del movimiento de la fase móvil
o
como volumen eluido desde la introducción d e la muestra. Al trabajar a cau-
dal constante
 de fase
  móvil,
  se registra
  la 
  señal analítica
 del detector
  frente al
 
tiempo transcurrido desde el momento en que la mezcla se puso en contacto
            
con ambas fases (Figura 15). De esa manera, esos tiempos representan el vo-

lumen de fase móvil necesario para la elución del analito.

S B
Tiempo o Volumen

 Figura 15. Cromatograma típico.


    
23   
          
           

El número de señales registradas (picos cromatográficos) representa el nú-

mero de compuestos separados y suministra información acerca del grado de
complejidad de la muestra. A partir del cromatograma se obtienen los datos
necesarios para llevar a cabo los análisis cualitativo y cuantitativo. La identi-
ficación cualitativa de los componentes de la muestra está basada en la eva-
luación de la posición de los picos. Por otra parte, el área bajo el pico croma-
tográfico permite la valoración cuantitativa de la cantidad relativa de cada
sustancia. Además, de la observación del cromatograma registrado se puede
extraer información sobre el comportamiento de la columna.


II.A. Parámetros cromatográficos de retención
 
Un cromatograma se obtiene a partir de la señal generada por las par-

tículas individuales de cada sustancia de la mezcla a la
salida de la columna. A
partir
 de él se pueden definir los parámetros cromatográficos de retención.

~
Senal

 


Tiempo 



Figura 16. Cromatograma: parámetros de retención.

El conjunto de moléculas
  idénticas
  que
constituye un
  soluto
entraenel sis-
tema cromatográfico
 enunmomento
 determinado.
  Cuando
 una molécula
   de
              


            
Parámetros Cromatográficos 25
soluto está en la fase móvil avanza con la misma velocidad lineal de esta. Al
penetrar en la fase estacionaria permanece retenida, según su afinidad por la
misma, siendo su velocidad lineal nula hasta que vuelve a la fase móvil. Si se
deja eluir el conjunto de moléculas idénticas, cada una de ellas habrá tarda-
do un tiempo en recorrer el sistema que debería ser el mismo si no existieran
fenómenos de dispersión. Este tiempo se denomina tiempo de retención (tR) y
coincide con el tiempo medio que todas las moléculas idénticas tardan en re-
correr el sistema. A efectos prácticos sería el tiempo que transcurre desde la
o  t VR)           
inyección de la mezcla hasta que un determinado soluto alcanza el detector.
Por otra
 parte,
 se define
  el
volumen
de
retención (V R) como 
  el volumen de fase 

móvil que debe fluir por la columna para llevar a cabo la elución de un com-
       F      
ponente dado. Conociendo el caudal al cual fluye la fase móvil, F (ml/min), se

pueden relacionar volumen y tiempo de retención:
VR
tR = 
F
Se denomina tiempo muerto, tiempo básico (tM), o tiempo inerte (to) al que
transcurre entre la inyección y la salida de una sustancia que no interacciona
  to to to o tM)  to t to)  
nunca con la fase estacionaria, es decir, aquella sustancia cuya velocidad a lo
largo de la columna cromatográfica coincide con la velocidad de la fase móvil.


Paralelamente, el volumen muerto (V M) será el volumen de fase móvil que que-

da retenido en la columna cromatográfica.

La diferencia entre el tiempo de retención de una sustancia y el tiempo muer-
to, es el to
 o tiempo que permanece
VM) dicha sustancia
    en
la fase
estacionaria, se deno-
   
mina tiempo de retención corregido (tS) y depende de la velocidad de la fase móvil.


 Parámetros cromatográficos de districión
II.B.

            
 Se define la constante de distribución (K DD) )
ostteestK como el reparto de un soluto entre
 estacionaria
la fase           
y móvil:

 to  t oo tS)        
C
 KD = s 
Cm


 toeoe
etek)

 
toeoe

C
etek)
Cs
K
K DD =
= C s 

Cm m
 26 Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución

 toeoe
 C V
toeoe
moles A
Un parámetro más ≡ A,s s  es el factor de capacidad o de
k´=utilizado en scromatografía
etek)
retención (k´) que tambiénmoles C A,mVm del soluto y que hace refe-
etek)
describeAmla distribución


rencia a la cantidad total de éste en cada fase involucrada en el sistema croma-
 
tográfico: 
 C V
moles
moles A Ass ≡ C AA,,ssVss 
kk´´=
K AV ≡ C V 
= moles
´= D , AAmms  C AA,,mmVmm
kmoles
 Vm

que también puede expresarse como:


K
K DD ,, AAV
KD,AA.
Vss 
kk´=
´= V
 Vs Vm  m
 
Vm
dónde:

 K D,AK esA.
la constante de distribución para la especie A.
KD,A
D,AA.
V el
 volumen de la fase estacionaria.
s Vs
  ,  ,  
Vs
Vm el volumen de la fase móvil.
 Vm

 Vm
 factor de capacidad, definido anteriormente, puede calcularse directa-
 El
           
mentedel
cromatograma como la
 , relación ,
entre el tiempo
que permanece
el
   ,  ,  

analito en la fase estacionaria y el que permanece en la fase móvil siendo inde-


pendiente de la velocidad de ésta.
             
             
 t −t
 k´= R M 
 tM

• Si k’ < 1, la elución es demasiado rápida
tt R − tM para la determinación de t
kk´´= R − tM  R.
=
• Si k’ > 10, la elución es demasiado lenta. ttM 
 • Los valores más adecuados
para la separación
M
están comprendidos entre

1 y 5. 

 El factor de selectividad o de separación
 (a) permite relacionar las constantes

de distribución de dos solutos de una mezcla por tanto, es una propiedad ter-
modinámica del sistema se define como:
K D,2
 t  t  α
2,1 =     
K D ,1
,


Parámetros Cromatográficos
 27

 KD,2
K D,2
α 2,1 =
KD,1

K D ,1

dónde

,
K es la constante de distribución de la especie más fuertemente retenida.
D,2
 K D,1
es la
constante dedistribución de la
especie menos retenida.
    1      , 
 KD,2
11
Según la definición el factor de selectividad siempre es mayor que la uni-
Kdad,
D,1
 pero si su valor se aproxima a 1 la separación se hace imposible. En
 general, se considera que la selectividad es aceptable a partir de valores de
           
a ≥ 1.14.
,

El factor de selectividad puede ser definido también en función de los fac-
  tores
     1       , 
 y tiempos de retención:
11
k´2 (t R )2 − t M
 α 2,1 = = 
k´1 (t R )1 − t M
           
 La selectividad de un sistema depende de la naturaleza de las fases involu-

 cradas, de la naturaleza
  de
  los solutos y de la
 temperatura, pero
  no 
de las ca-

 racterísticas cromatográficas del sistema (relación de fases, eficacia, caudal de
,          ,    
la fase móvil, etc.) k´ (t ) −t
α 2,1 = 2 = R 2 M 
,,
k´1 (t R )1 − t M
,
II.C. Parámetros cromatográficos de eficacia

  El tiempo de
 retención de un 
  soluto representa el promedio
   de
los
tiempos
 2 que forman parte de la “zona” ocupada
de retención de las moléculas de soluto
,          ,    
por dichas moléculas. En una primera aproximación, puede considerarse que
,,
en dicha zona existe una distribución gaussiana y, por tanto, el tiempo de re-
tención que se mide es el del centro de la zona que coincide con su centro de
,
gravedad (máximo de concentración). La eficacia de un sistema cromatográfi-
co está relacionada con la anchura de las señales obtenidas.
 Una de las magnitudes más2utilizadas para cuantificar la eficacia es el nú-
mero de platos teóricos (N). Este parámetro indica el número de veces que en una
columna cromatográfica existe una altura equivalente a un plato teórico (H).
            
 ttN
  
  
 
 t  
t  
 t t (H   

ttN
L
    t
N = t
   t t (H 
H
 Se define como:

 L
N=

 H
L
  dónde:
 L es la
longitud de la
  columna
 cromatográfica.
        


 L
El cálculo
  del número
 de platos
  ( teóricos se lleva
1   a cabo
  sobre el 
  cromato-
 grama a partir de la altura y del ancho de pico cromatográfico trazando dos
        (w       
tangentes a la curva de Gauss (Figura 17).b El punto de corte con la línea base
             
(h
proporciona el valor de la anchura del pico (wb) y la perpendicular al máximo

de pico la altura (h).
2
      ( 1
 t R        
N = 16  
 wb(w
         b      
N
 Otra expresión para calcular N, siempre que sea posible calcular la anchura
(h
w1/2
a la mitad de la altura del pico (w1/2 ) es:
 
22
 t 
54 t RR  
 NN==516
.2
w  
 w
 1b/ 2


 
~
Senal
 2

Figura 17. Representación de l a función de Gauss
1.

               
.

Created from remingtonsp on 2019-03-31 19:59:12. L
H= 

1.

A  
partir  
del valor del  
número de teóricos
platos  yde
la
longitud
 
dela co-
lumna cromatográfica, se puede calcular la altura equivalente a un plato teó-
.
rico.

L
H= 
N
 Estas magnitudes (N, H) dependen de la naturaleza de la fase móvil, del
soluto
 y
de las
variables N
operatorias.
H    

    
 t  
2
. 41.7 R  
w0.1 teóricos
 de platos 
 La expresión para calcular el número cuando el pico cro-
N
matográfico presenta “cola” al recuperar
sys = la línea base (picos asimétricos) es:
  A
          
 B  2+ 1.25
  t   

41.7 R  
   w0.1  
N sys =
  A   
 B  + 1.25
  
A/B1.

dónde:w0.1         10     
  25
A/B es el factor de asimetría calculado como se observa en la Figura 18.
.
w 0.1 es A/B1.
la anchura del pico cromatográfico a un 10% de la altura desde la

línea base.
w0.1         10     
.

Respuesta del detector
Tiempo

Figura 18. Elementos para la definición de la asimetría de los picos.
1..
1..


  
  
   
  
  A/B
A/B   
    
0.1.5.
2012. ProQuest Ebook
0.1.5.
Central, http://ebookcentral.proquest.com/lib/remingtonsp/detail.action?docID=3226641.

Se recomienda que es factor de asimetría A/B esté comprendido en el

intervalo 0.9-1.5 para que la separación sea adecuada.
La cromatografía es una técnica de separación y, por tanto, la resolución es la
magnitud más importante desde el punto de vista práctico, puesto que puede
considerarse como el objetivo primordial a conseguir. La resolución cromatográ-
Señal
fica de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para Resolución = 0.50
separar
dos
 analitos. Se mide entre dos picos contiguos y se calcula:
t R , 2 − t R ,1
Rs = 
 wb ,1 + wb , 2  
  Tiempo
 2 
Señal
Resolución = 0.50
Cuando los componentes de una mezcla avanzan por un sistema cromato-
Señal
gráfico
 a distintas
 s velocidades,
s cada uno 
  ocupa una zona de
 anchura 4s es-= 0.75
 Resolución
ss
tando sus centros de gravedad separados
 una distancia
∆z.
Si
las
velocidades
Señal
  ss s,

Resolución = 0.50   
de las zonas son constantes, la magnitud ∆z aumenta linealmente al alejarse
sssssssss
de la entrada de la columna. La separación completa de los analitos tiene lugar
s s
cuando ∆zs ss,
> 6s,  
lo que equivale  
a valores de Rs ≥  19).
1.5 (Figura s Tiempo

     s   s s   
Tiempo
Tiempo
∆,ss11
Señal
Señal
Resolución = 0.50
Resolución = 0.75
Señal
Resolución = 0.50 Resolución = 1.00

 Resolución = 0.75
Señal
Resolución = 0.75
Tiempo
Tiempo Tiempo
Tiempo Tiempo
Tiempo
Resolución = 1.50
Resolución = 1.00
Señal
Señal
SeñalSeñal
Resolución = 1.00 Resolución = 1.00

Resolución = 1.00
Resolución = 0.75
Tiempo
Tiempo Tiempo
Tiempo
Figura 19. Diferentes casos de resolución cromatográfica. Tiempo
Señal
Tiempo
Figura 19. Diferentes casos de resolución cromatográfica.
Resolución = 1.00
Señal
Señal
Resolución = 1.00
 Resolución = 1.00
1ssss
-2-
 Tiempo
Para una fase estacionaria determinada, la resolución puede mejorarse

aumentando la longitud de la columna. Así, se incrementa el número de platos
teóricos
 si bien, de esta forma, se requiere mayor tiempo para llevar a cabo la
separación.
 
La resolución también puede calcularse en función de las propiedades de la

columna como son la selectividad y el factor de capacidad:

1 α − 1 k´
Rs = N
4 α k´+1

Los
 factores que aumentan la resolución se pueden enumerar en:

• Aumento de la longitud de la columna cromatográfica, que conlleva ma-

yores tiempos de análisis y ensanchamiento de las señales cromatográficas.
• del
• Disminución diámetro
 
de
la     
columna.
• Disminución
del caudal 
 de la
fase móvil.
    
• Uso de
empaquetamientos regulares en la fase estacionaria.
• Disminución del tamaño de muestra inyectado.
• 
• Elección adecuada de las fases móviles y estacionarias.
• 
• Uso de gradientes de concentración de la fase móvil.
• 
La selección de las fases involucradas en la separación cromatográfica se
• 
ha de realizar con el objetivo de conseguir valores adecuados de los siguientes
• 
parámetros: • 
• Valores grandes de N (pequeños de H) para lo cual hay que tener en cuenta:

- Las dimensiones de la columna (longitud y diámetro).

- La fase estacionaria (a menor tamaño de partícula de relleno mayor efi-
cacia de 
 la columna).
        
- El caudal de la fase móvil (la velocidad óptima de flujo es aquella a la

 que H es mínima).
• Valores de k´ entre 2 y 5. La variación de k´ se consigue modificando la
• NH
composición de la fase móvil bien usando diferentes fases móviles (elución
 
isocrática) bien llevando a cabo una elución en gradiente.
• Valores  de a >
1. La mejora en la selectividad se puede conseguir mediante
cambios en la
composición de la fase móvil o en el valor de pH (en caso de
 
H

 
•• α1
α1


α
α
1
1

sustancias ionizables). Si a pesar de estos cambios a sigue siendo próximo

•• a 
1 es recomendable cambiar la fase estacionaria y optimizar de nuevo las

condiciones de separación.
 • Tiempos de retención tan bajos como sea posible.
 
 
 
 
 
 
 
 
 

La Tabla II resume los principales parámetros cromatográficos definidos


anteriormente.

Tabla II. Principales parámetros cromatográficos.


RELACIÓN
RELACIÓN CON
CON OTROS
OTROS
NOMBRE
NOMBRE ECUACIÓN
ECUACIÓN PARÁMETROS
PARÁMETROS
Volumen
Volumen de
de fase V
móvil
fase VMM == ttMM F
F
móvil
t −t K V
Factor kk´´== tRR − tMM kk´´== KDDVSS
Factor de
de retención
retención ttM V
VMM
M
Constante kk''V
VM
Constante dede K
KDD == V M
distribución
distribución VSS
t −t k´
Factor tR , 2 − tM k´2
Factor de
de α
α == t R , 2 − t M α
α == k´ 2
selectividad
selectividad tRR,,11 − tMM k´11
22((ttR , 2 −− ttR ,1 ))
R NN α
α −−11 kk´´ 
Resolución RSS == (w R , 2+ w R ,1 ) R
RSS == 4  α 1 + k´ 
Resolución
(wbb,,11 + wbb,,22 ) 4  α  1 + k´ 
2 2 2
Número  ttR  2 2 α  2 11++ kk´´ 2
Número de
de platos
platos N
N == 16
16  R  N 16R
N == 16
2 α
RSS α − 1   k´ 
teóricos
teóricos  w
wbb   α − 1   k´ 
Altura LL
Altura equivalente
equivalente de
de H
H == N
plato
plato teórico
teórico N

 2
2
II.D. Mecanismos de ensanchamiento de banda
Los picos cromatográficos que se obtienen en condiciones reales, raramente

responden al modelo de campana de Gauss, pudiéndose cometer grandes
errores al calcular parámetros cromatográficos que se basan en esa suposición.
El modelo gaussiano sólo es válido cuando el grado de asimetría es pequeño,
como es el caso de las señales cromatográficas que se obtienen para sustancias
poco retenidas (picos estrechos y bien definidos). Sin embargo, al aumentar la
retención aumenta el grado de asimetría debido a procesos de ensanchamiento
extracolumna y efectos isotérmicos. Otras causas de asimetría son, la incompleta
separación de los componentes, la formación de huecos en la columna, así
como reacciones químicas o procesos de transferencia de masas (difusión de
los analitos) muy lentos entre las fases.
Según la teoría de los platos teóricos, aunque la cromatografía es un pro-
ceso continuo, es posible imaginar que la columna se divide en N segmentos,
en cada uno de los cuales se establece un equilibrio. Cada uno de estos seg-
mentos imaginarios correspondería a lo que se ha definido como plato teórico.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que el equilibrio de distribución de los
solutos no se produce de forma infinitamente rápida sino que la velocidad de
transferencia de masa es finita. Además, la forma del pico cromatográfico de-

pende tanto de la velocidad de elución como de las diferentes trayectorias que
las moléculas pueden seguir a su paso por la fase estacionaria así como de la
difusión molecular de los solutos en la dirección del eje de la columna.
La influencia de cada uno de los factores anteriores queda recogida en la
ecuación de Van Deemter, según la cuál, existe una velocidad óptima de fase
móvil, v, para cualquier columna que proporciona la mínima altura equivalen-
te de plato teórico.
B
H = A+ + Cv 
v
El primero de los parámetros de la ecuación  de Van Deemter, A, representa
las
 múltiples trayectorias aleatorias que el soluto puede seguir por la fase es-
A,
tacionaria (difusión
  Eddy).
 Esta diferencia
 en las
   velocidades de flujo
  de las
 
moléculas de soluto provoca el ensanchamiento de banda (Figura 20).
           


  
2012. ProQuest Ebook Central, http://ebookcentral.proquest.com/lib/remingtonsp/detail.action?docID=3226641. 1

Created from remingtonsp on 2019-03-31 19:59:12. 1

           

  
          
1

 34 Introducción
1
a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución

 2  2
  
1
 1


 
2  2

            
Figura 20. Esquema representativo de la contribución de la difusión Eddy al ensanchamiento de banda.

           B/v 

La
influencia de la
  difusión longitudinal del
  soluto
  cuando el transporte
 se
  
 realiza en un sistema tubular (difusión longitudinal en la dirección axial), B/v,

se representa en la Figura 21. Su contribución al ensanchamiento de banda se
 incrementa
al  
aumentar 
el tiempo que el soluto
 
reside en la    
fase estacionaria.
           B/v 

           


 


 
Figura 21. Esquema representativo de la contribución de la difusión longitudinal al ensanchamiento de banda.


La resistencia a la transferencia de masa entre la fase estacionaria y la

fase móvil se representa con el parámetro C. Este factor es el que más contri-
buye al ensanchamiento de banda (Figura 22).
 
 



Figura 22. Esquema representativo de la contribución de la veloci-

Figuradad
Figura 22.deEsquema
22. Esquema representativo
representativo
transferencia de la
de la contribución
contribución
de masa al ensanchamiento de la
de
de banda. la velocidad
velocidad
de transferencia
de transferencia dede masa
masa alal ensanchamiento
ensanchamiento de de banda.
banda.
-- 33 --
III. Instrumentación básica
Básicamente, un cromatógrafo consiste en un sistema compuesto de un re-

servorio de fase móvil, una bomba de alta presión, un sistema de introducción
de muestra, la columna cromatográfica y, a continuación, el acoplamiento de
un sistema de detección y de un sistema de adquisición y tratamiento de datos
que permita “visualizar” la separación.
Figura 23. Componentes básicos de la instrumentación para cromatografía de líquidos de alta resolución.
37
Los cromatógrafos se comercializan con una disposición integrada o una

disposición modular, la cual ofrece una mayor flexibilidad instrumental. En
general, están fabricados en acero inoxidable por la resistencia mecánica que
presenta este material. Sin embargo, pueden existir problemas de corrosión
(disolventes acuosos que contienen haluros y disolventes halogenados), de con-
taminación (eluentes oxidantes o complejantes cuando se utilizan en cambio
iónico) y de degradación (desnaturalización de algunas proteínas en contacto
con el acero). Para estos casos se han desarrollado instrumentos resistentes a la
corrosión y biocompatibles, incluyendo mecanizados de titanio y/o fluoropolí-
meros en los componentes clave.
En los últimos años existe una tendencia hacia la miniaturización de estos
instrumentos para su uso con columnas de calibre pequeño, lo que conlleva un
menor consumo de disolvente, mayor sensibilidad de masa y fácil conexión a
otras técnicas de separación y detección.
III.A. Depósitos de fase móvil
Los depósitos que van a contener la fase móvil que se va a utilizar en el sis-
tema cromatográfico deben estar fabricados en un material inerte a la posible

reacción con la fase móvil. Habitualmente, consisten en una simple botella de
vidrio, material plástico o un erlenmeyer equipado con un tapón perforado y
un tubo flexible para la adecuada conexión al sistema de bombeo. Por el otro
extremo, el tubo de conexión sumergido en el recipiente de fase móvil, acaba
en un filtro de 2μm de tamaño de poro con el fin de prevenir la entrada en la
bomba de partículas en suspensión.
Para que la fase móvil pueda transportar la mezcla de sustancias a separar
a través del sistema cromatográfico es necesario que ésta sea soluble en la fase
móvil. Las fases móviles habitualmente utilizadas para llevar a cabo la separa-
ción cromatográfica suelen ser, en el caso de la cromatografía en fase inversa,
combinaciones de agua ultrapura con disolventes orgánicos polares como me-
tanol o acetonitrilo, pudiendo contener además sales inorgánicas, tampones,
ligandos de coordinación y agentes formadores de pares iónicos para contri-
buir a la separación adecuada de los analitos. En la modalidad en fase normal,
Instrumentación básica 39
las fases móviles empleadas suelen ser combinaciones de disolventes orgánicos

apolares.
Los disolventes usados en cromatografía líquida deben ser espectroscópica-
mente puros, estar exentos de partículas sólidas y libres de gases disueltos. La
disponibilidad de disolventes espectroscópicamente puros está garantizada ya
que existen una gran variedad de disolventes orgánicos idóneos para cromato-
grafía. Sin embargo, es posible la utilización de disolventes de otras caracterís-
ticas dependiendo de las condiciones de detección a las que se vaya a trabajar.
Los disolventes grado HPLC aseguran la no existencia de partículas en
suspensión, con lo que podrían ser utilizados directamente sin necesidad de
filtrar. Sin embargo, es aconsejable su filtración. Para ello se usan filtros de
membrana de porosidad controlada de 0.45-0.47μm ó 0.22μm fabricados en
diferentes materiales como Nylon, ésteres de celulosa, PVDF, PTFE, etc.
(Figura 24) elegidos en función de su compatibilidad con la fase móvil a utili-
zar. Esta compatibilidad abarca compatibilidad química, biológica, problemas
de adsorción así como estabilidad térmica.
Figura 24. Filtros de membrana de disco para disolventes usados en HPLC.
Para poder llevar a cabo la filtración a través de dichas membranas es nece-

sario el uso de sistemas de filtración forzada. Normalmente se utilizan equi-
pos de filtración, como el de la Figura 25, que constan de un depósito de
disolvente y un soporte de fibra de vidrio sobre el que se coloca el filtro de
membrana elegido. El sistema de filtración dispone de una entrada para aco-
plar un sistema de vacío.
Figura 25. Sistema de desgasificación a vacío para fases móviles en HPLC.
Los disolventes han de estar desgasificados con el fin de evitar la retención

de burbujas de gas en las diferentes partes que componen el sistema cromato-
gráfico y que podrían dar lugar a problemas de retención y separación e inclu-
so de detección si llegasen a alcanzar el sistema detector. Este es un problema
importante sobretodo para sistemas que trabajan en gradiente. Así por ejem-
plo, la presencia de oxígeno disuelto en la fase móvil puede dar lugar a una
disminución de la sensibilidad y a una línea base no estable cuando se usan
detectores UV-visible (el oxígeno absorbe en la región UV entre 190-260 nm),

de fluorescencia (produce disminución de la intensidad relativa de fluorescen-
cia) y electroquímicos (puede dar lugar a oxidaciones no deseadas).
Existen diferentes procedimientos de distinta eficacia para desgasificar fa-
ses móviles:
• Aplicación de vacío en la fase móvil.
• Uso de energía ultrasónica (baños de ultrasonido o sondas ultrasónicas).
• Mediante agitación y vacío.
• Burbujeo de gases químicamente inertes (He, N2).
• Uso de membranas permeables a gases.
Estos dos últimos procedimientos son los más adecuados para el uso en
rutina. Uno de los tratamientos más eficaces es el burbujeo con helio el cual
elimina un 80-90% de aire disuelto en 10 minutos. Para conseguir que no se
produzca la disolución de aire en la fase móvil durante el tiempo de trabajo es
necesario realizar el tratamiento periódicamente o bien mantener la fase móvil

en atmósfera de helio.
Una alternativa cuando la presencia de oxígeno es problemática es la utiliza-
ción de y catalizador de platino sobre alúmina colocado en una pequeña pre-co-
lumna entre el sistema de bombeo y el inyector con el fin de reducir el oxígeno
presente. En algunos sistemas cromatográficos más sofisticados, el recipiente
que contiene la fase móvil va equipado con un sistema de desgasificación.
Al igual que las fases móviles, las muestras que van a ser introducidas en
el sistema cromatográfico deben cumplir los mismos requisitos. En este caso
se utilizan filtros de jeringa (Figura 26), fabricados también con diferentes
materiales poliméricos y de porosidad variable, que se acoplan a un cuerpo de
jeringa mediante una conexión tipo “luer-lock”.
Figura 26. Unidades de micro filtración de muestras para jeringa.
III.B. Sistemas de bombeo
El sistema de bombeo es un componente crítico del sistema cromatográfico

cuya misión es la de hacer pasar un caudal constante de fase móvil a través de la
columna cromatográfica. El desarrollo de adecuados sistemas de bombeo ha sido
uno de los principales factores en el avance de la cromatografía líquida moderna.
Se podría pensar que para obtener un caudal constante es suficiente con
mantener la presión constante en cabeza de columna, pero en la práctica no
ocurre así. La relación entre el caudal de la fase móvil, F, en la columna y la
caída de presión, ∆P, viene dada por la ecuación de Darcy:
            


42      
Introducción a 
la   F Líquida
Cromatografía    Resolución
de Alta  
∆P
S ⋅ ε dp 2 ∆P
F=
η Φ L 

Dónde:

• S es la sección de la columna.
• S
• ε su porosidad total.
• ε
• η la viscosidad de la fase móvil.
• η
• dp el diámetro de partícula del relleno.
• dp
• Ф es el término de resistencia al flujo presentado por la columna.
• Ф
• L su longitud.
• L
 Por tanto, la calidad de una bomba en HPLC se mide atendiendo a la re-
producibilidad
  y
constancia del 
  caudal suministrado. Un caudal
    variable
 da
 
origen a ruido en el detector, lo que conllevaría a una mayor imprecisión en la

detección de las señales más débiles. En general, los sistemas de bombeo de-

ben cumplir los siguientes requisitos:
• Estar
   fabricados
 de materiales
 químicamente
  inertes
  a la
 fase móvil

• Generar presiones por encima de 6000pSi (≈400 atm)

• Suministrar un caudal libre de pulsaciones o llevar un sistema
• 
amortiguador de las mismas. (las pulsaciones no afectan a la
separación en sí pero contribuyen al ruido del detector y, por tanto,
• 
disminuyen la sensibilidad)
• Proporcionar caudales adecuados para diferentes tipos de columnas.
Normalmente se exigen caudales de 10 µl/min a 100 ml/min.
• Suministrar caudales reproducibles a lo largo del tiempo ya que de
 
ello depende la reproducibilidad de los tiempos de retención.
• Los cabezales de la bomba deben tener pequeño volumen para facilitar
y llevar a cabo cambios rápidos en la composición de la fase móvil.
En la Figura 27 se muestran diferentes diseños de bombas de alta presión

para HPLC:
Figura 27. Sistemas de bombeo de alta presión para cromatografía líquida.
Actualmente, los tipos de bombas que se usan en cromatografía líquida se

dividen en bombas de presión constante y de volumen constante en función del me-
canismo de bombeo de la fase móvil.
III.B.1. Bombas de presión constante
Las bombas de presión constante, presurizan la fase móvil mediante un gas

inerte, proporcionan un caudal libre de pulsos estable y tienen la ventaja de un
bajo coste y simplicidad. Sin embargo, son poco precisas y proporcionan baja
reproducibilidad ya que el caudal que suministran es muy sensible a cambios
en la permeabilidad de la columna y en la viscosidad de los disolventes. Esto
hace que no sean adecuadas para trabajar en la modalidad de gradiente.
Como ejemplos de este tipo de sistemas de bombeo son:
• las bombas neumáticas de desplazamiento directo capaces de trabajar a
presiones hasta 200 atm.
• las bombas amplificadoras de aire que trabajan a elevadas presiones y
proporcionan grandes caudales.
III.B.2. Bombas de volumen constante
Las bombas de volumen constante compensan las variaciones de permeabilidad

del sistema y de viscosidad de la fase móvil mediante variaciones de presión, por lo
que el caudal de la fase móvil permanece constante. Proporcionan análisis más pre-
cisos y por eso constituyen los sistemas de bombeo más adecuados y utilizados.
Hay dos tipos principales de bombas de volumen constante: bombas de tipo
jeringa y bombas recíprocas de pistón y de membrana.
III.B.2.1. Bombas de tipo jeringa
El impulso de la fase móvil se genera por el desplazamiento de un pistón

controlado mecánicamente que se mueve a una velocidad constante dentro de
una cámara de volumen fijo que puede contener de 200 a 500 ml de fase mó-
vil. El caudal de fase móvil que se obtiene está prácticamente libre de pulsos.
Este tipo de bombas permite programación de caudales y trabajo en gradiente
de concentración, su único inconveniente es la necesidad de un tiempo previo
de estabilización para proporcionar caudales constantes a elevadas presiones
debido a la compresibilidad de los disolventes.
Su uso suele estar limitado al acoplamiento con columnas de pequeño cali-

bre y a columnas capilares cuyos caudales habituales de trabajo son inferiores
a 200 μl/min. También se utilizan bombas de jeringa en sistemas cromato-
gráficos para trabajar con fluidos supercríticos en los que se utilizan columnas
tubulares abiertas.
Figura 28. Esquema de una bomba de jeringa.
 


 Instrumentación básica 45

III.B.2.2. Bombas recíprocas de pistón

           
Son los sistemas de impulsión más habitualmente utilizados hoy en día.

Pueden ser de único pistón o de doble pistón. Cada movimiento del pistón
desplaza un pequeño volumen (10-400 μl) de fase móvil desde una cámara que

contiene fase móvil y que incorpora una válvula de entrada y otra de salida.

 

Figura 29. Esquema y funcionamiento de una bomba de pistón.
Durante la etapa de llenado, el pistón se desplaza dentro de la cámara, la

 
válvula de entrada se abre y la fase móvil entra dentro de la cámara. Durante
esa etapa la válvula de salida se cierra, ya que la presión del sistema es mayor
que la presión de la cámara. En el movimiento de suministro de fase móvil,
el pistón se mueve dentro del cilindro, la válvula de entrada se cierra, la de
salida se abre y la fase móvil fluye hacia la columna cromatográfica. Un se-
llo de silicona colocado en el pistón impide las pérdidas de fase móvil fuera
de la cámara durante el movimiento del pistón. Los pistones y las bolas que
actúan de válvulas suelen ser de zafiro o de rubí, y los cabezales de la bomba
de acero inoxidable. Para permitir su utilización en condiciones extremas de
pH y a elevadas concentraciones de sales en la fase móvil muchas de las partes
metálicas de las bombas han sido sustituidas por PEEK (polietilenétercetona,
polímero inerte fácilmente moldeable, como los metales, y capaz de soportar
presiones de hasta 5000 pSi). Si se va a trabajar a presiones de alrededor de
2000 pSi es posible la utilización de Teflón.

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c.

3. 16 Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución

•   :       

•   :       

C.de Líquidos Adsorción

No obstante, existen otros criterios en función de los cuales se pueden cla-

4. Considerando las polaridades relativas de las dos fases:

sólo uno o dos tipos de fases estacionarias y modificando la naturaleza

5. Considerando el procedimiento de desarrollo cromatográfico:

se utiliza la elución en gradiente que consiste en cambiar la composición del

Si bien la cromatografía de líquidos de alta resolución se desarrolla siempre

I.C. Cromatografía de líquidos en columna

Dentro de las técnicas cromatográficas que emplean como fase móvil un

y capa fina como la cromatografía en columna.

• Aumentar la eficacia de la separación al disminuir el tamaño de partícula.

El número de señales registradas (picos cromatográficos) representa el nú-

largo de la columna cromatográfica coincide con la velocidad de la fase móvil.

Se recomienda que es factor de asimetría A/B esté comprendido en el

  ss s,

Resolución = 0.50 Resolución = 1.00

Resolución = 1.00 Resolución = 1.00

Para una fase estacionaria determinada, la resolución puede mejorarse

II.D. Mecanismos de ensanchamiento de banda

Los picos cromatográficos que se obtienen en condiciones reales, raramente

transferencia de masa es finita. Además, la forma del pico cromatográfico de-

Figura 22. Esquema representativo de la contribución de la veloci-

Básicamente, un cromatógrafo consiste en un sistema compuesto de un re-

Los cromatógrafos se comercializan con una disposición integrada o una

III.A. Depósitos de fase móvil

tema cromatográfico deben estar fabricados en un material inerte a la posible

las fases móviles empleadas suelen ser combinaciones de disolventes orgánicos

Figura 24. Filtros de membrana de disco para disolventes usados en HPLC.

Para poder llevar a cabo la filtración a través de dichas membranas es nece-

Figura 25. Sistema de desgasificación a vacío para fases móviles en HPLC.

Los disolventes han de estar desgasificados con el fin de evitar la retención

detectores UV-visible (el oxígeno absorbe en la región UV entre 190-260 nm),

necesario realizar el tratamiento periódicamente o bien mantener la fase móvil

Figura 26. Unidades de micro filtración de muestras para jeringa.

III.B. Sistemas de bombeo

El sistema de bombeo es un componente crítico del sistema cromatográfico

En la Figura 27 se muestran diferentes diseños de bombas de alta presión

Figura 27. Sistemas de bombeo de alta presión para cromatografía líquida.

Actualmente, los tipos de bombas que se usan en cromatografía líquida se

III.B.1. Bombas de presión constante

Las bombas de presión constante, presurizan la fase móvil mediante un gas

III.B.2. Bombas de volumen constante

Las bombas de volumen constante compensan las variaciones de permeabilidad

III.B.2.1. Bombas de tipo jeringa

El impulso de la fase móvil se genera por el desplazamiento de un pistón

Su uso suele estar limitado al acoplamiento con columnas de pequeño cali-

Figura 28. Esquema de una bomba de jeringa.

Durante la etapa de llenado, el pistón se desplaza dentro de la cámara, la

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