HOSPITAL REGIONAL DOCENTE CLINICO QUIRURGICO

CODIGO: DPCYAP-AI / MTI-001

“DANIEL ALCIDES CARRION”
DEPARTAMENTO PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA
AREA DE INMUNOLOGIA
VERSIÓN: 001
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PÁGINA: 1 de 145

ELISA (Ensayo de por inmunoabsorción ligado a enzimas)

Anti-Helicobacter pylori CagA (IgG)

1. MARCADORES:

Anti-Helicobacter pylori CagA (IgG)

2. MÉTODO:

ELISA (Ensayo de fluorescencia ligado a enzima)

3. PRINCIPIO:

El equipo ELISA proporciona un ensayo semicuantitativo o cuantitativo in vitro para

autoanticuerpos humanos del tipo IgG contra Helicobacter pylori CagA en suero o plasma.
Este equipo contiene tiras cada una con 8 pocillos recubiertos con Helicobacter pylori
CagA. En el primer paso de la reacción, las muestras diluidas de los pacientes son
incubadas en los pocillos. En el caso de muestras positivas, los anticuerpos IgG
específicos (también IgA e IgM) se unirán al correspondiente sitio antigénico. Para detectar
los anticuerpos unidos, se realiza una segunda incubación usando un anticuerpo anti-IgG
humano marcado con una enzima (conjugado enzimático). Que promoverá una reacción
coloreada.

4. MUESTRA:

Suero o plasma humano (recogidos con heparina de litio)

5. EQUIPO y MATERIALES:

 Microplacas multipocillo, con revestimiento antigénico: 12 tiras de microplacas cada

una con 8 pocillos individuales dispuestas en un armazón, listo para usar.
 Calibrador 1: 200 UR/ml (IgG, humana), listo para usar.
 Calibrador 2: 20 UR/ml (IgG, humana), listo para usar.
 Calibrador 3: 2 R/ml (IgG, humana), listo para usar.
 Control positivo: (IgG, humano) listo para usar.
 Control negativo: (IgG, humano) listo para usar.
 Conjugado enzimático: Anti IgG humano de conejo marcado con peroxidasa, listo
para usar
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 Tampón de muestra: listo para usar.
 Tampón de lavado: concentrado 10x.
 Solución cromógeno / sustrato: TMB/H2O2, listo para usar.
 Solución de parada: Ácido sulfúrico 0.5 M, listo para usar.
 Instrucciones del ensayo.
 Protocolo con valores guía.

6. PROCEDIMIENTO

1. Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la

prueba.
2. Dilución: 1:101 en tampón de muestra. Por ejemplo: diluir 10ul de suero en 1.0 ml
tampón de muestra y mezclar bien con vortex (pipetas de la muestra no son
convenientes para mezclar)
3. Preparar el volumen necesario de buffer de lavado (1 parte de reactivo más 9 partes de
agua destilada, es decir una dilución 1:10)
Incubación de la muestra:
4. Colocar 100 ul del calibrador, los controles o de muestras de pacientes diluidas en los pocillos de la
microplaca de acuerdo al protocolo de pipeteo. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente entre
+18ºC y +25 ºC)
Lavado:
5. Lavado Manual: Vaciar los pocillos y seguidamente lavar 3 veces usando 300 ul del
tampón de lavado de trabajo.
6. Lavado Automático: Lavar los pocillos 3 veces con 400 ul de tampón de lavado de
trabajo (ajustar programa: p. ej. TECAN Columbus Washer “Overflow Modus”).
Dejar el tampón de lavado en cada pocillo durante 30 – 60 segundos por ciclo de
lavado, entonces vaciar los pocillos. Después del lavado (manual y automatico),
eliminar minuciosamente todo el líquido de la microplaca golpeándola suavemente
sobre un papel absorbente con las aberturas hacia abajo.
Nota: El líquido residual (> 10 ul) remanente en los pocillos después del lavado puede
interferir con el sustrato y producir valores de extinción falsamente bajos. Un lavado
insuficiente (p.ej., menos de 3 ciclos de lavado, volúmenes de tampón de lavado muy
pequeños, o tiempos de reacción muy cortos) pueden generar valores de extinción
falsamente altos.
Incubación del conjugado (2do paso):
7. Agregar n100 ul de conjugado enzimático (anti IgG humano marcado con peroxidasa)
en cada pocillo. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente (entre +18ºC y 25ºC).
Lavado:
8. Vaciar los pocillos, lavar según lo anteriormente descrito.
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Incubación del sustrato (3cer paso):
9. Agregar 100 ul de la solución de cromógeno/sustrato en cada pocillo. Incubar por 15
minutos a temperatura ambiente (entre +18ºC y 25ºC) (proteger de la exposición
directa a la luz solar).
Parada de la reacción:
10. Agregar 100 ul de la solución stop en cada pocillo en el mismo orden y a la misma
velocidad que se ha agregado la solución de cromógeno/sustrato.
Medición:
11. La medición fotométrica de la intensidad de color debe realizarse a una longitud de
onda de 450 nm durante los 30 primeros minutos después de añadir la solución de
stop. Antes de realizar la medición, agitar ligeramente la microplaca para asegurar la
distribución homogénea de la solución

7. RESULTADOS:
Semicuantitativa:
Los resultados pueden ser evaluados semicuantitativamente mediante el cálculo del ratio del
valor de la extinción del control o la muestra del paciente entre el valor de la extinción del
calibrador 2. El resultado se obtiene calculando una relación (ratio) de acuerdo a la siguiente
formula:
Extinción de controles o muestras de pacientes = Ratio
Extinción del calibrador 2

Interpretación:
Ratio < 0.8 : Negativo
Ratio >0.8 o < 1.1 : Dudoso
Ratio > 1.1| : Positivo

Cuantitativo:
La concentración de anticuerpos en las muestras de suero puede obtenerse mediante el punto de
corte de la curva estándar del valor de extinción de los 3 sueros calibradores con las
correspondientes unidades (línea/línea). Usar la representación “punto por punto” para calcular la
curva estándar por ordenador. La siguiente representación es un ejemplo de una típica curva de
calibración. Por favor, no usar esta curva para la determinación de las concentraciones de
anticuerpo en las muestras de pacientes.
Si la densidad óptica de una muestra es superior al del valor obtenido con el calibrador 1 (200
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UR/ml), el resultado debe ser dado como “mayor de 200 UR/ml. Se recomienda repetir esas
muestras a una dilución de 1:400. El resultado en UR/ml así obtenido para esas muestras habrá
de ser multiplicado posteriormente por una factor 4.
El límite superior del rango de referencia para personas sanas (punto de corte) recomendado por
EUPROIMMUN es de 20 unidades relativas (UR)/ml.

Interpretación:
< 20 UR/ml : Negativo
> 20 UR/ml : Positivo

8. CONTROL DE CALIDAD:

Control Interno: en cada corrida se procesan controles negativos y positivos para luego poder
validar la corrida de acuerdo a los criterios de validación ya antes menciona dos.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Inserto del producto

ELISA (Ensayo de por inmunoabsorción ligado a enzimas)

Anti-HSV-1 (gC1) (IgM)

7. MARCADORES:

Anti-HSV-1 (gC1) (IgM)

8. MÉTODO:

ELISA (Ensayo de fluorescencia ligado a enzima)

9. PRINCIPIO:

El equipo ELISA proporciona un ensayo semicuantitativo o cuantitativo in vitro para

autoanticuerpos humanos de clase IgM contra la glicoproteína C1 específica de HSV-1 en
suero o plasma. Este equipo contiene tiras de microplaca, cada una con 8 pocillos
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recubiertos con Glicoproteina C1 purificada. En el primer paso de la reacción, las muestras
de las pacientes diluidas son incubadas en los pocillos. En el caso de muestras positivas,
los anticuerpos IgM específicos (también IgA e IgM) se unirán a los antígenos. Para
detectar los anticuerpos unidos, se realiza una segunda incubación usando un anticuerpo
anti-IgM humano marcado con una enzima (conjugado enzimático). Que puede catalizar
una reacción coloreada.

10. MUESTRA:

Suero o plasma humano (recogidos con heparina de litio)

11. EQUIPO y MATERIALES:

 Pocillos de microplaca, con revestimiento antigénico: 12 tiras de microplacas cada

una con 8 pocillos individuales desprendible en un marco, listo para usar.
 Calibrador: (IgM, humana) listo para usar.
 Control positivo: (IgM, humano) listo para usar.
 Control negativo: (IgM, humano) listo para usar.
 Conjugado enzimático: Anti IgM humano de conejo marcado con peroxidasa, listo
para usar
 Tampón de muestra: Conteniendo absorbente-IgG/RF (preparación de anticuerpos
anti-IgG humana obtenidos en cabra) listo para usar.
 Tampón de lavado: Concentrado 10x.
 Solución cromógeno / sustrato: TMB/H2O2, listo para usar.
 Solución de parada: Ácido sulfúrico 0.5 M, listo para usar.
 Instrucciones del ensayo.
 Protocolo con valores de referencia.

12. PROCEDIMIENTO

1. Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la

prueba.
2. Dilución: 1:101 en tampón de muestra de color verde. Por ejemplo: diluir 10ul de suero
en 1.0 ml tampón de muestra y mezclar bien. Incubar la muestra durante 10 minutos a
temperatura ambiente. A continuación añada las muestras a los pocillos de las placas
según el protocolo.
3. Preparar el volumen necesario de buffer de lavado (1 parte de reactivo más 9 partes de
agua destilada, es decir una dilución 1:10)
Incubación de la muestra:
4. Colocar 100 ul del calibrador, los controles o de muestras de pacientes diluidas en los pocillos de la
microplaca de acuerdo al protocolo de pipeteo. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente entre
+18ºC y +25 ºC)
 HOSPITAL REGIONAL DOCENTE CLINICO QUIRURGICO
CODIGO: DPCYAP-AI / MTI-001
“DANIEL ALCIDES CARRION”
DEPARTAMENTO PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA
AREA DE INMUNOLOGIA
VERSIÓN: 001
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PÁGINA: 6 de 145
Lavado:
5. Lavado Manual: Vaciar los pocillos y seguidamente lavar 3 veces usando 300 ul del
tampón de lavado de trabajo.
6. Lavado Automático: Lavar los pocillos 3 veces con 400 ul de tampón de lavado de
trabajo (ajustar programa: p. ej. TECAN Columbus Washer “Overflow Modus”).
Dejar el tampón de lavado en cada pocillo durante 30 – 60 segundos por ciclo de
lavado, entonces vaciar los pocillos. Después del lavado (manual y automatico),
eliminar minuciosamente todo el líquido de la microplaca golpeándola suavemente
sobre un papel absorbente con las aberturas hacia abajo.
Nota: El líquido residual (> 10 ul) remanente en los pocillos después del lavado puede
interferir con el sustrato y producir valores de extinción falsamente bajos. Un lavado
insuficiente (p.ej., menos de 3 ciclos de lavado, volúmenes de tampón de lavado muy
pequeños, o tiempos de reacción muy cortos) pueden generar valores de extinción
falsamente altos.
Incubación del conjugado (2do paso):
7. Agregar n100 ul de conjugado enzimático (anti IgM humano marcado con peroxidasa)
en cada pocillo. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente (entre +18ºC y 25ºC).
Lavado:
8. Vaciar los pocillos, lavar según lo anteriormente descrito.
Incubación del sustrato (3cer paso):
9. Agregar 100 ul de la solución de cromógeno/sustrato en cada pocillo. Incubar por 15
minutos a temperatura ambiente (entre +18ºC y 25ºC) (proteger de la exposición
directa a la luz solar).
Parada de la reacción:
10.Agregar 100 ul de la solución stop en cada pocillo en el mismo orden y a la misma
velocidad que se ha agregado la solución de cromógeno/sustrato.
Medición:
11.La medición fotométrica de la intensidad de color debe realizarse a una longitud de
onda de 450 nm durante los 30 primeros minutos después de añadir la solución de
stop. Antes de realizar la medición, agitar ligeramente la microplaca para asegurar la
distribución homogénea de la solución

12. RESULTADOS:
Semicuantitativa:
Los resultados pueden ser evaluados semicuantitativamente mediante el cálculo del ratio del
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valor de la extinción del control o la muestra del paciente entre el valor de la extinción del
calibrador 2. El resultado se obtiene calculando una relación (ratio) de acuerdo a la siguiente
formula:
Extinción de controles o muestras de pacientes = Ratio
Extinción del calibrador

Interpretación:
Ratio < 0.8 : Negativo
Ratio >0.8 o < 1.1 : Dudoso
Ratio > 1.1 : Positivo

En caso de que el resultado del ensayo sea dudoso, deberá tomarse una muestra adicional
del paciente 7 dias después y reanalizarse en paralelo a la primera muestra. Los resultados
de ambas muestras permitirán realizar la evaluación apropiada de los cambios de
titulación.
Para determinaciones duplicadas se usara la media de los dos valores. Si los dos valores
se desvían considerablemente uno del otro, la muestra deberá ser reanalizada.
Para el diagnostico, los síntomas clínicos del paciente y los resultados serológicos siempre
deberán ser tenidos en cuenta de forma conjunta.

13. CONTROL DE CALIDAD:

Control Interno: en cada corrida se procesan controles negativos y positivos para luego poder
validar la corrida de acuerdo a los criterios de validación ya antes menciona dos.

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Inserto del producto