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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE

BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

 CURSO : ANALISIS INSTRUMENTAL

 PROFESOR(A) : ING. LEONARDO ESPILLICO CORMILLUNI

 ALUMNA : PATRICIA ROCÍO QUISPE BOTELLO

 CÓDIGO : 2014- 111006

 ESPECIALIDAD : ESIA

 AÑO : 3

TACNA, 07 DE DICIEMBRE DEL 2016

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PRACTICA DE LABORATORIO N° 05
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE LOWRY

I. INTRODUCCIÓN:

La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas

que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica.
Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de
nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa
aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y
laborioso y con poca sensibilidad.
La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos
inconvenientes. Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de
Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie.
En esta práctica nos ocuparemos únicamente del segundo de ellos. Tiene la ventaja
de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10
microgramos de proteína; su inconveniente principal es que al evaluar, como
veremos, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina),
la intensidad del color resultante varía entre las distintas proteínas. Pero cuando
tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el
método con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina. La
reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todo
conocida.

II. FUNDAMENTO TEORICO:

Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas.
A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de
proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

1. Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+ , en

presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente
idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación
entre el cobre y el nitrógeno peptídico.
2. Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido
fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y
en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo
de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente.
El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos
máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La
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elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra

estudiada.

Dado que este método da resultados variables se requiere una curva de

calibración que se hace a partir de seroalbúmina bovina. En la presente
práctica haremos esta curva de calibración, practicando la reacción de
Lowry y aprendiendo el uso del espectrofotómetro.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL
 Solución Standard de seroalbumina bovina (1 mg/ml).

 Muestra problema, de concentración desconocida.

 Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en el

momento de su utilización, y que son las siguientes:

A. Carbonato sódico al 2% en NaOH 0.1 M

B. Sulfato cúprico al 1%
C. Tartrato sódico-potásico al 2% En el momento de su uso se
mezclan 50ml de A con 0.5 ml de B y 0.5 ml de C.

 Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado

comercialmente y se debe mantener en refrigeración. Para su uso se diluye
inmediatamente antes en la relación de 1 parte de reactivo por 2 de agua
destilada.
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USO DEL ESPECTROFOTOMETRO:

1. Seleccionar la longitud de onda adecuada y comprobar si la fuente de

iluminación y el fototubo corresponden a la misma.
2. Encender el aparato al menos 30 minutos antes de su uso para obtener una
perfecta estabilización de su línea de base.
3. Ajustar el aparato a transmitancia cero: con el receptáculo de muestras vacío y
la tapa del mismo cerrada, girar el botón izquierdo del aparato hasta hacer
coincidir la aguja con el punto cero de la escala de transmitancia.
4. Ajustar el aparato a transmitancia 100%: Se introduce el blanco (en su tubo
adecuado) en el receptáculo de muestras, habiendo cuidado de la limpieza y de
la transparencia del tubo. Se baja la tapa del receptáculo y mediante el botón
derecho se lleva la aguja hasta coincidir con el 100% de transmitancia. A
continuación se saca este tubo y se comprueba que la aguja se coloca
exactamente frente al cero.
5. Medir cada una de las muestras: (a) medir en la escala de absorbancia, ya que
según la ley de Beer-Lambert la concentración es proporcional a la absorbancia,
pero como esta escala es logarítmica, para valores altos de absorbancia, las
mediciones se hacen imprecisas; (b) o bien medir las transmitancias, cuya escala
es lineal, y convertirlas después a absorbancia mediante la relación.

A = log (100/T)

ESPECIFICACIONES TÉCNICAS DEL EQUIPO:

Interfaz estándar de interfaz serial: RS-232-C

Rango de medición: 0 a 2500 A
Exactitud fotométrica: < ± 0.005 A 0 a 0.500 A
< ±1 % 0.501 a 2500 A
Precisión fotométrica < ± 0.003 A 0 a 0.600 A
< ±0.5 % 0.601 a 2500 A
Deriva: 0.003 A en 30 en 30 min
 Rango de longitud de onda: precisión alta en los 7 filtros 340, 405, 500, 5046,
578,620, 670 nm
Paso de banda:
 Rango UV (340 nm) = 10 nm
 Rango visible (405-670 nm) < 6 nm
Compartimiento de cubeta: para la celda de flujo y cubetas desechables,
temperatura controlada.
Control de temperatura: usa regulador de temperatura 25 °C 30°C o 37 °C ;
estabilidad < ± 0.1 °C hasta 20 °C.
Temperatura ambiente, estabilidad < ± 0.2 °C hasta 15 °C – 32 °C
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III. OBJETIVO:

 Determinar de forma espectrofotométrica la concentración de proteínas de

una muestra de maca aplicando el método de Lowry.

IV. MATERIAL Y METODOS:

4.1. Equipos:

 Espectrofotómetro.
 Balanza analítica.
 Centrifugadora.
 Agitador.

4.2. Materiales:

 Tubos de ensayo.
 Pipetas.
 Fiolas.
 Probeta.
 Vasos precipitados.

4.3. Reactivos:

 NaCl 0.15 M.
 Agua destilada.
 Carbonato de sodio anhidro.
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 NaOH.
 Sulfato de cobre.
 Tartrato de sodio y potasio.
 Reactivo de Folín.
 Albumina de suero bovina.

V. PROCEDIMIENTO:

1.1 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:

- Solución Alcalina:

 Pesar 20 g de carbonato de Sodio anhidro y 4 g de NaOH.

 Mezclar con 1000 mL (1L) de agua destilada.

- Solución de Sulfato de cobre:

 Pesar 2 g de CuSO4.
 Mezclar con 100 ml de agua destilada.

- Solución de tartrato de sodio y potasio:

 Pesar 4 g de tartrato de sodio y potasio.

 Mezclar con 100 ml de agua destilada.
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- Mixtura reactiva:

 Medir 2 ml de la Solución de Sulfato de cobre.

 Agregar 2 ml de la solución de tartrato de sodio y potasio.
 Completar para 100 ml con la solución alcalina, seguir el orden de la
secuencia para evitar pp.

- Solución estoque de Folin – Ciocalteau:

 En un balón de 2000 ml, disolver 100 g de tungstato de sodio y 25 g

de molibdato de sodio (NaMoO4.2H2O), adicionar 700 ml de agua
destilada.
 Adicionar 100 ml de HCl concentrado y 50 ml de H3PO4 (85%).
 Adaptar a un condensador de reflujo y hervir levemente durante 10
horas.
 Enfriar.
 Adicionar 150 g de LiSO4, 50 ml de agua destilada y algunas gotas de
bromo empleando la campana extractora.
 Enfriar.
 Completar a 1000 ml con agua destilada, el color de este reactivo debe
ser amarillo – dorado. La regeneración puede ser hecha por la adición
de gotas de bromo y se debe dar un hervor por 15 minutos cuando se
presente verdosa.
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- Reactivo de Folin – Cicocalteau diluido:

 Diluir un volumen de reactivo estoque con la solución de sulfato de

cobre y agua destilada.
 Es recomendable titular con NaOH 1N, de tal forma que corresponda
a un ácido 1N.

- Solución de NaOH 1N:

 Pesar 4g de NaOH.
 Mezclar con 100 ml de agua destilada.

1.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

- Tomar 10 g de maca molida.

- Preparar una suspensión de 10% en soluciones de NaCl 0.15M y agitar por 1

hora, la cual diluimos en un mortero.
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- Centrifugar la muestra a 3000 revoluciones por minuto.

- Determinar el contenido de proteínas por el método de Lowry.

- La muestra debe de ser preparada a partir del extracto haciendo una primera
dilución de 10/100, una segunda dilución de 1/100 y tomando una alícuota de
1ml.

1.3 PREPARACIÓN DEL PADRÓN SUERO ALBÚMINA BOVINA:

- Pesar 50 mg de suero albúmina bovina y 0.1 ml de NaOH 1N.

- Disolver con agua destilada y completar para 100 ml.
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- Realizar la curva padrón por el método de Lowry.

1.4 PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO DE LOWRY:

- Realizar el procedimiento indicado en la siguiente tabla:

N° DE PADRÓN H2 O () MEZCLA FOLIN

TUBOS SAB (mL) (mL) POR REACTIVA (mL)
TUBO (mL)
2 0.2 0.8 0.2 5.0 0.6
4 0.4 0.6 0.4 5.0 0.6
6 0.6 0.4 0.6 5.0 0.6
8 0.8 0.2 0.8 5.0 0.6
10 1.0 - 1.0 5.0 0.6
B - 1.0 5.0 0.6

- Al momento de agregar la mezcla reactiva esperar 10 min.

- Luego de agregar el reactivo de Folín y esperar 30 minutos para despúes leer

la absorbancia a 660 nm.
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VI. RESULTADOS:

Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro a 660 nm para

la curva padrón de suero albúmina bovina se muestra a continuación.
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TABLA N°01: Valores de absorbancia del suero albúmina bovina (50

mg/100mL).

N° DE CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA Absorbancia

TUBO (mg) (660 nm) 660 nm:
2 0.1 0.1306 Muestra 2
4 0.2 0.2062 (0.5ml+0.5ml
6 0.3 0.2657 H2O): 1.0250
8 0.4 0.3554 Muestra 3
10 0.5 0.4176 (1ml):
Blanco - 0.000 0.1963

 No consideramos la muestra n°1 por sobrepasar la unidad.

CONCENTRACIONES:

- Tubo 2: - Tubo 4:
50 mg 100ml 50 mg 100ml
X 0.2ml X 0.4ml
X = 0.1 mg X=0.2 mg

- Tubo 6: - Tubo 8:
50 mg 100ml 50 mg 100ml
X 0.6ml X 0.8ml
X= 0.3 mg X=0.4 mg

- Tubo 10:
50mg 100ml
X 1.0ml
X= 0.5 mg

Con los valores de la tabla anterior de los tubos 2, 4, 6, 8 y 10, se realizó la

gráfica N° 01 de la curva padrón de suero albúmina bovina.
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GRÁFICO N° 01: Concentración versus Absorbancia

0.45
y = 0.7232x + 0.0581
0.4 R² = 0.9968
ABSORBANCIA (660 nm)

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
CONCENTRACIÓN (mg)

Una vez obtenidos los valores a y b de la curva padrón, se halla la

concentración de proteínas de las muestras:

Y = a + bx
A = 0.0581
B = 0.7232

MUESTRA 2:
1.3369mg 0.5ml
Y= 0.0581 + 0.7232 x X 100ml
1.0250 = 0.0581 + 0.7232 x
X= 267.38mg
0.9669 = 0.7232 x
X = 1.3369 mg 0.26738g 10g
X 100g
X = 2.6%

MUESTRA 3:
0.1911mg 1ml 1.911 1ml
Y= 0.0581 + 0.7232 x
0.1963 = 0.0581 + 0.7232 x X 10ml x 100ml
0.1382 = 0.7232 x X= 1.911mg x = 191.1mg
X = 0.1911 mg
1.911g 10g
X 100%
X = 19.11%
 “AÑO DE LA CONSOLIDACIÓN DEL MAR DE GRAU”

VII. DISCUCIONES:
 Con los resultados obtenidos, según la página web de maca peruana
https://macaperuana.wordpress.com/valor-nutricional/ indica que la maca,
tiene un aproximado de 10g-17g por cada 100 g de proteína.

 T

VIII. CONCLUSIONES:

 Se comprobó que efectivamente aplicando el método lowry se puede

determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema,
que resultan al interpolar los valores de absorbancia en una curva patrón
originada a partir de concentración de proteína conocida como lo es el suero
albúmina bovina.
 El contenido de proteínas de nuestra muestra de maca más adicionados fue
del 19%, resultado que es mayor al que nos dicen las referencias, y puede ser
que la muestra no es pura.

 Debemos tomar en cuenta que la muestra de maca utilizada no era totalmente

pura ya que contenía otros adicionados que pueden haber hecho que la
cantidad de proteínas varié y sea más de lo esperado.

IX. RECOMENDACIONES:

 Al momento de realizar nuestra curva padrón con el espectrofotómetro, es

recomendable limpiar las cubetas en caso estén mojadas o suceda algún
rebalse, con un papel que no deje ningún residuo en la cubeta que pueda
interferir al momento de hallar las absorbancias.
 “AÑO DE LA CONSOLIDACIÓN DEL MAR DE GRAU”

X. REFERECIAS BIBLIOGRAFICAS

 https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf
 https://es.scribd.com/doc/95768010/Determinacion-de-Proteinas-Por-El-
Metodo-de-Lowry-Y-Bradford
 http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI
%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf
 http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf
 https://macaperuana.wordpress.com/valor-nutricional/
 http://www.inkanat.com/es/maca/propiedades.html