Sistema de Mutaci�n Refractario a la Amplificaci�n por PCR

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El Sistema de Mutaci�n Refractario a la Amplificaci�n por PCR o ARMS-PCR por sus
siglas en ingl�s (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain
Reaction) es una t�cnica para detectar mutaciones puntuales conocidas, que se cree
que fue descrita por primera vez por el equipo de Newton en 1989.1? Se ha
desarrollado para el diagn�stico de todas las mutaciones �-talasemia comunes que se
encuentran en diferentes grupos �tnicos alrededor del mundo y sobre todo en los
pa�ses asi�ticos.2? La t�cnica se basa en que un cebador espec�fico s�lo permita
que la amplificaci�n tenga lugar cuando su extremo 3' coincida con su secuencia
diana. Por ejemplo, para detectar la mutaci�n �-talasemia (G / C), el nucle�tido en
el extremo 3' del cebador es una guanina con el fin de que si se encuentra con una
citocina, el nucle�tido sustituido en el ADN mutante, si no se lleva a cabo la
amplificaci�n ser�a debido a que el cebador formar�a un desajuste o "mismatch" G-G
con el ADN normal. Esta falta de correspondencia es d�bil, entonces para que se
pueda reducir la eficiencia de hibridaci�n de los cebadores con la cadena molde de
ADN entre un 0 y 5% para as� evitar la amplificaci�n, una mayor falta de
correspondencia con la secuencia diana u objetivo tendr�a que ser introducida en el
segundo, tercero o cuarto de los nucle�tidos antes del extremo 3' del cebador
utilizado.3?

�ndice
1 Antecedentes hist�ricos
2 Principio
2.1 Dise�o de cebadores
2.2 Condiciones
3 M�todo
4 Materiales
5 Optimizaciones
5.1 ARMS-PCR m�ltiple
5.2 T-ARMS-PCR
5.3 q-ARMS-PCR
5.4 RT-ARMS-q-PCR
5.5 ARMS-Scorpion
5.6 ARMS-PCR con hexa-cebadores
6 Aplicaciones
6.1 Inmunizaci�n
6.2 Genotipificaci�n
6.3 Haplotipado
6.4 PCR-ARMS e hibridaci�n reversa en la detecci�n de mutaciones en beta-
thalassemia
6.5 Identificaci�n de SNPs comparando PCR-ARMS con PCR-RFLP
6.6 Biopsias cl�nicas
6.7 An�lisis de mutaciones puntuales
6.7.1 Detecci�n de mutaciones comunes en el gen G6PD
6.7.2 Detecci�n de mutaciones en MUTYH
6.8 Diagn�stico molecular
6.8.1 Sarampi�n
7 Ventajas
8 Desventajas
9 Kits comerciales
10 Referencias
Antecedentes hist�ricos
En 1989, algunos grupos independientes describieron un tipo de PCR que podr�a ser
utilizada para el an�lisis de mutaciones puntuales conocidas en el ADN y que as� se
pudiera distinguir entre el alelo normal, el genotipo heterocigoto y los genotipos
mutantes o normales homocigotos; estos grupos independientes fueron los de Newton,
Nichols, Okayama, Sommer y Wu. El m�todo se conoce como PCR-ARMS o �nicamente ARMS
(Sistema de Mutaci�n Refractario a la Amplificaci�n por PCR) nombrado as� en el
texto publicado por Newton en 1989, como PASA (PCR para la amplificaci�n de alelos
espec�ficos) por Sommer y como ASPCR (PCR alelo-espec�fico) por Wu. La
aplicabilidad es la de analizar mutaciones asociadas a enfermedades conocidas como
la fenilcetonuria y anemia de c�lulas falciformes; posteriormente, en 1992, el
equipo de investigaci�n liderado por Sommer realiz� estudios de validaci�n que
establecieron que esta nueva estrategia de Reacci�n en Cadena de la Polimerasa es
aplicable al an�lisis de cualquier mutaci�n puntual conocida o Polimorfismo de un
solo nucle�tido.4?

En su art�culo Analysis of any point mutation in DNA. ARMS., Newton y su equipo

dijeron: "Hemos mejorado la "Reacci�n en Cadena de la Polimerasa" (PCR) para
permitir el an�lisis r�pido de cualquier mutaci�n conocida en el ADN gen�mico.
Demostramos un sistema, ARMS (Sistema de Mutaci�n Refractario a la Amplificaci�n
por PCR) que permite el genotipado �nicamente por la inspecci�n de las mezclas de
reacci�n despu�s de la electroforesis en gel de agarosa. El sistema es simple y
fiable, permite distinguir claramente alelos heterocigotos u homocigotos en un
locus para cualquiera de los dos alelos. El sistema no requiere ni la digesti�n con
enzimas de restricci�n o de oligonucle�tidos espec�ficos de alelos como son
aplicados convencionalmente, ni el an�lisis de la secuencia de los productos de
PCR. La base de la invenci�n son los oligonucle�tidos que no se unan a la cadena
molde en el extremo 3' , as� no funcionar�an como cebadores en la PCR en
condiciones apropiadas. Hemos analizado el ADN de pacientes con calantitripsina
(AAT), de portadores de la enfermedad y de individuos normales. Nuestros resultados
est�n en completo acuerdo con las asignaciones de los alelos derivados de la
secuenciaci�n directa de los productos de la PCR ... La viabilidad de la PCR-ARMS
descrita por Newton se demostr� por la amplificaci�n del ex�n III y parte del
intr�n III en el gen de AAT humano. La aplicaci�n directa de la PCR-ARMS a los
alelos cl�nicamente significativos se realiz� y los diagn�sticos estaban de acuerdo
con los resultados del an�lisis de la secuencia de los productos de PCR".1?

Los grupos independientes antes mencionados demostraron una t�cnica general que
permite la verificaci�n de cualquier polimorfismo o mutaci�n puntual conocidos. La
t�cnica requiere que el extremo terminal 3' de los cebadores de PCR sea espec�fico
para los alelos conocidos, tanto mutante como normal. As�, el cebador inicia la
s�ntesis en dos formas. Si el alelo es de la forma "normal", entonces es
refractario a la amplificaci�n por PCR sobre la cadena de ADN "mutante", mientras
que si la forma es "mutante" es refractario a la PCR sobre el ADN "normal". En
algunos casos una sola base que no concuerde s� permite la amplificaci�n, de manera
que demostraron que la introducci�n de algunos otros desajustes adicionales cerca
del extremo 3 ' de los cebadores apropiados aminora este problema.1?

ARMS es un m�todo simple, r�pido y confiable que proporciona precisi�n a la hora de

hacer un diagn�stico pre- y post-natal y un medio para la detecci�n de
heterocigotos. ARMS sigue siendo de beneficio a�n si las mutaciones asociadas a la
enfermedad, hasta ahora no caracterizada, est�n vinculados a los polimorfismos
caracterizados. En tales casos, la t�cnica permitir� analizar el haplotipo de
manera detallada con una cantidad m�nima de ADN. Los diagn�sticos prenatales
precisos son alcanzables en unas pocas horas si se evita la contaminaci�n materna a
partir de material fetal, aunque hoy en d�a las tecnolog�as y m�todos de
diagn�stico con ADN fetal circulante parecen prometedoras. Una consideraci�n
pr�ctica importante con este enfoque (como con otras estrategias basadas en la
Reacci�n en Cadena de la Polimerasa) es que es innecesario preparar ADN de alta
calidad, adecuado para la digesti�n con enzimas de restricci�n.4?

Un requisito previo de la PCR-ARMS es la ausencia de una actividad correctora 3'-

exonucleol�tica asociada con la ADN polimerasa, igual que el extremo 3'-OH de los
cebadores coincidentes sean refractarios a la extensi�n por la polimerasa de ADN
elegida. En los casos en que la falta de coincidencia no es refractaria a la
extensi�n (como se demostr� en los resultados de la experimentaci�n de Newton en
1989), son requeridos algunos desajustes m�s desestabilizadores. Emp�ricamente, el
grado de especificidad observada con los cebadores no coincidentes (y por tanto el
requisito de que la desestabilizaci�n adicional se lleve a cabo), se correlaciona
con el tipo de desajuste. C / T, A / A y desajustes de T / T (que son todos o bien
purina / purina o desajustes pirimidina / pirimidina) son considerablemente m�s
refractarios a la extensi�n por la Taq Polimerasa que los desajustes G / T, T / G,
A / C o C / A (donde todos son desajustes purina / pirimidina).1?

Es probable que cualquiera de estos enfoques para desestabilizar deliberadamente

los cebadores de la PCR-ARMS y, por lo tanto, mejorar la especificidad puede ser
mediante la reducci�n de dNTPs, magnesio y concentraciones de cebador o el simple
aumento de las temperaturas de amplificaci�n / extensi�n y de hibridaci�n. Por el
contrario, un aumento en la concentraci�n de estos reactivos o una disminuci�n de
la temperatura de amplificaci�n podr�a suponer que tenga un efecto adverso sobre
las especificidades de los cebadores de manera que no generen previamente ning�n
producto deseado.1?4?

La optimizaci�n de las concentraciones de magnesio, Taq polimerasa, dNTP y / o de

la temperatura exacta a trav�s de los ciclos de la PCR-ARMS, el control cuidadoso
de la variable debe ser alcanzable con la instrumentaci�n totalmente automatizada
de la PCR-ARMS. De hecho, la adici�n de Taq polimerasa para mezclas de reacci�n a
60 � C y asegurar que la temperatura de reacci�n nunca cae por debajo de �sta,
puede aumentar significativamente la especificidad de reacci�n y evitar la
generaci�n de productos en plantillas no coincidentes.1?

Hemos elegido utilizar grandes cebadores (30-meros) en este ensayo ya que esto
permite el uso de altas temperaturas de amplificaci�n para mejorar la especificidad
y reduce la posibilidad de un mal acoplamiento de los cebadores en otros lugares
del ADN gen�mico. Un enfoque alternativo podr�a ser el uso de cebadores m�s cortos
que abarquen una mutaci�n puntual tal que la discriminaci�n entre loci "normal" y
"mutante" se logre mediante la hibridaci�n de los cebadores de una manera
espec�fica con ciertos alelos en condiciones apropiadas, naturalmente. Es
importante tener en cuenta, sin embargo, que en este an�lisis de la especificidad
de los cebadores no se habla de algo absoluto, la ausencia de controles internos
podr�a concebiblemente dar lugar a diagn�sticos err�neos y la hibridaci�n de los
mismos cebadores. Otras desventajas ser�an que las diferentes condiciones tendr�an
que ser determinadas para cada locus de inter�s lo que complicar�a el an�lisis
simult�neo de m�ltiples loci.1?

"No se nos escapa que la PCR-ARMS puede tener muchas otras aplicaciones en la
medicina y la biolog�a molecular. La t�cnica ser� �til para la tipificaci�n precisa
de los pat�genos infecciosos con base en los cambios espec�ficos de la cepa,
caracter�sticos para cada una, de manera que pueden ser identificados. El an�lisis
de activaci�n de oncogenes es as� sencillo al igual que la detecci�n de deleciones
en el ADN. Muchas aplicaciones adicionales tambi�n se pueden considerar en el
contexto de la investigaci�n."1?

-Newton et al., 1989

Principio
La PCR-ARMS se basa en la observaci�n de que la amplificaci�n por PCR es
ineficiente o completamente refractaria si hay un desajuste entre el nucle�tido
terminal de un cebador en su extremo 3' y la plantilla correspondiente.1? La Taq
ADN polimerasa carece de una actividad de exonucleasa y por lo tanto no se pueden
corregir desajustes en los extremos 3' del cebador. Como tal, se requiere la
hibridaci�n de bases complementarias en el extremo 3' del cebador para la
amplificaci�n eficiente de Taq DNA polimerasa; la amplificaci�n del alelo normal, y
no el de la mutante, se lleva a cabo utilizando un cebador que es complementaria al
alelo normal y tiene un desajuste entre el residuo 3' y el alelo mutante. Por el
contrario, s�lo el mutante se amplificar� si el residuo 3' del cebador es
complementario al alelo mutante y no el alelo normal. La especificidad o poder de
discriminaci�n del nucle�tido terminal en el extremo 3' se puede mejorar a�n m�s si
se incorpora una asimetr�a adicional posicionado cerca del nucle�tido 3'.1? 4?

Varios estudios han intentado cuantificar el efecto inhibidor de diferentes

desajustes en la amplificaci�n por PCR, como aquellos de los �ltimos a�os de la
d�cada de 1990. Aunque han surgido algunas tendencias, los resultados han sido
notablemente discordantes. Sarkar y sus colegas, en 1990, concluyeron que la PCR es
inhibida por desajustes entre la plantilla y el nucle�tido en el extremo 3' del
cebador. Por otra parte, Kwok y su equipo en 1990 demostraron una reducci�n de 20
veces en la eficiencia de la amplificaci�n con desajustes A : A (cebador : molde),
la reducci�n de 100 veces con desajustes A : G, G : A, y C : C, y poca o ninguna
reducci�n con otros desajustes. En 1992, Huang y sus colaboradores demostraron
alg�n grado de inhibici�n con cada combinaci�n de desajustes. La inhibici�n m�s
d�bil, la reducci�n de aproximadamente 100 veces, se asoci� con desajustes C : T .
Hab�a aproximadamente 10 veces una reducci�n con desajustes A : C, C : A, G : T, y
desajustes; G: 34T 10 a 10 veces de reducci�n con desajustes T : C y T 6: T ; y al
menos 10 veces la tasa de reducci�n con desajustes A : A, G : A, A : G, G : G, y
C : C. Ayyadevara y colegas, que realizaron ciertos experimentos en el a�o 2000
variaron sistem�ticamente tanto el extremo terminal 3' y los nucle�tidos de los
pen�ltimos cebadores, todo ello bajo condiciones de relativamente alta rigurosidad.
Su estudio indica que los cebadores que terminan Adenina son moderadamente
inferiores a los que terminan en otros nucle�tidos.4?

La PCR-ARMS est� basada en el mismo principio que ASO (Allele Specific

Oligonucleotide): la utilizaci�n de oligonucle�tidos espec�ficos para la secuencia
normal y para la secuencia mutada; en la PCR-ARMS estos oligonucle�tidos son
cebadores de PCR. Se dise�an, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un
mismo cebador com�n pero se diferencian en que un cebador amplificar� s�lo el alelo
normal, mientras que el otro cebador amplificar� s�lo el mutado. Dada la rapidez y
sencillez de la PCR, esta t�cnica est� desplazando cada vez m�s a la t�cnica de
ASO.5?

Dicho de otra forma, una PCR ARMS est�ndar consiste en dos reacciones
complementarias (dos tubos) y utiliza 3 cebadores. Un cebador es constante y
complementarios a la plantilla en ambas reacciones, los otros cebadores difieren en
sus extremos 3' y son espec�ficos para la secuencia de ADN de tipo normal o la
secuencia mutada en una base dada. Los productos de PCR se separan por
electroforesis a trav�s de un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio. Si la
muestra es homocig�tica para el alelo normal u homocig�tico para el alelo mutante,
s�lo se producir� s�lo en uno de los tubos, si la muestra es heterocig�tica se ver�
en ambos tubos.6?

ARMS es un m�todo basado en la Reacci�n en Cadena de la Polimerasa, que utiliza

cebadores espec�ficos para el alelo normal o el alelo mutante. En este m�todo, un
cebador de oligonucle�tido con un extremo de triple complementaria a la secuencia
de una mutaci�n espec�fica, junto con un cebador com�n se utiliza en una reacci�n
de PCR. En paralelo, un cebador normal correspondiente, junto con un cebador com�n
se utiliza en otra reacci�n PCR. La presencia de un producto amplificado en la
primera reacci�n indica la presencia de la mutaci�n mientras que su ausencia indica
la presencia de la secuencia de ADN normal en ese sitio espec�fico. En la segunda
reacci�n, la presencia de un producto amplificado indica la presencia de una
secuencia de ADN normal en ese sitio espec�fico, mientras que su ausencia indica
presencia de la mutaci�n. Se pueden separar los resultados de una PCR-ARMS en un
gel de agarosa al 2 o 3%.7?

Dise�o de cebadores
Como regla general para el dise�o de cebadores de una PCR-ARMS, se debe tratar de
implementar el desajuste en el segundo nucle�tido en la primera instancia y probar
la cartilla de la especificidad y la generaci�n de producto. La posici�n de la
desigualdad puede ser alterado si el primario no funciona, o la fuerza de la falta
de coincidencia aumenta si se observan bandas inespec�ficas. Seg�n Little, S. en
Current Protocols in Human Genetics,8? y como se ha mencionado anteriormente, los
desajustes pueden ser: m�ximos, GA, CT, TT; fuerte, CC; medio, AA, GG; D�bil, CA,
GT; ninguno, AT, GC.9?

Una prueba de ARMS t�pica para una sola mutaci�n se compone de dos amplificaciones
de la misma mezcla de reacci�n utilizando el mismo ADN gen�mico como sustrato. Los
resultados de los productos de amplificaci�n a partir del cebador espec�fico y su
par de cebadores (cuando la mutaci�n est� presente en el ADN gen�mico) y los otros
resultados de la amplificaci�n de dos cebadores que generan un fragmento de control
en todos los casos. La generaci�n de un producto de control indica la mezcla de
reacci�n y que el termociclador est� funcionando de manera �ptima. La estrategia
consiste en la detecci�n de las mutaciones comunes en el pa�s de origen �tnico del
paciente en primer lugar y luego para la detecci�n de las mutaciones m�s raras.
Despu�s de lo cual, las mutaciones no caracterizadas son identificadas por
secuenciaci�n gen�mica.9?

Los cebadores para el diagn�stico de los alelos normales para muchas mutaciones se
enumeran en diversos art�culos publicados en revistas cient�ficas. En los �ltimos
a�os se ha visto un aumento exponencial en la generaci�n de bibliograf�a de este
tipo.9?

Condiciones
Generalmente se utilizan 20 �l de volumen final de reacci�n de PCR. El volumen de
reacci�n se compone de 0,5 microgramos de la plantilla de ADN, 0,01 g de cada uno
de los cuatro cebadores (2 cebadores de control, 1 cebador com�n, y 1 mutante /
cebadores para la reacci�n normal / mutante), 0,5 unidad de Taq ADN polimerasa y
0,2 mM de cada dNTP en una soluci�n de tris-C1 10 mM, MgCl2 50 mM y espermidina 1
mM. El r�gimen de ciclo t�rmico consisti� en 30 ciclos de: precalentamiento a 94 �C
durante 2 minutos, desnaturalizaci�n a 94 �C durante 1 minuto, se permite la
hibridaci�n variable y la extensi�n a 72 �C durante 1 minuto.7?

M�todo
El m�todo descrito por los grupos de investigadores que en 1989 describieron la
PCR-ARMS, involucra los siguientes pasos: la preparaci�n de ADN, ADN gen�mico
aislado a partir de c�lulas de sangre perif�rica; amplificaci�n de
oligonucle�tidos, la amplificaci�n y la secuenciaci�n refractarios; los cebadores
comunes cuyas secuencias fueron D (CCCACCTTCCCCT CTCTCCAGGCAAATGGG), d
(GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTG), d (TGTCCA CGTGAGCCTTGCTCGAGGCCTGGG) y D
(GAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAG); as� como los cebadores para el control interno, un
fragmento de 510 pares de bases de un ex�n del gen de la apolipoprote�na B humana
se utiliz� sin purificaci�n adicional. Los cebadores de secuenciaci�n para la
caracterizaci�n inicial de los alelos fueron los descritos anteriormente;
caracterizaci�n de los alelos por PCR y secuenciaci�n directa, donde los alelos
mutantes y normales de la AAT S y Z fueron confirmados mediante amplificaci�n por
PCR, las secuencias diana se amplificaron en un volumen de reacci�n que conten�a
ADN gen�mico, desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxicitidina trifosfato (dCTP),
trifosfato de desoxiguanosina (dGTP) y trifosfato de timidina (TTP), cada uno a 1,5
mM, as� como 67 mM de Tris-HCl (pH 8,8), sulfato de amonio 16.6mM, cloruro de
magnesio a una concentraci�n de 6,7 mM, 2-mercaptoetanol, EDTA y cada cebador de
amplificaci�n. Las muestras fueron calentadas a 100 � C durante 5 minutos para
desnaturalizar el ADN. Dos unidades de Thermus aquaticus de ADN polimerasa (Taq) se
a�adieron a cada muestra. Las muestras se cubrieron con aceite mineral ligero,
despu�s se calent� a 600 �C durante 4 minutos para la primera ronda de la s�ntesis
de ADN. Los ciclos posteriores consistieron en una etapa de desnaturalizaci�n de 2
minutos a 92 � C y una etapa de s�ntesis de la hibridaci�n del cebador y el ADN
combinado a 60 � C durante 4 minutos. La secuenciaci�n directa de los productos de
PCR fue como se describi� anteriormente.1?

En el 2001, se propuso por un grupo de investigadores que para la identificaci�n de

beta-talasemia, las muestras de sangre fueran conservadas en EDTA, as� como la toma
de muestras de vellosidades cori�nicas o de fluido (CVS) se obtuviera de
seleccionados al azar de pacientes diagnosticados cl�nicamente con beta-talasemia
menor. Que se extrajera el ADN de las muestras con el fin de llevar a cabo una PCR-
ARMS. Despu�s de la extracci�n del ADN, las reacciones de PCR se establecieron en
dos tubos separados para cada muestra. Un tubo de ensayo para la amplificaci�n del
cebador de ARMS normal y el segundo para la amplificaci�n del cebador de ARMS
mutante.7?

Actualmente, el m�todo propuesto para preparar y realizar un Sistema de Mutaci�n

Refractario a la Amplificaci�n por PCR es el siguiente:9?

Preparar una mezcla de reacci�n (4 ml) que comprende de: 0,5 ml de 10x de la
soluci�n amortiguadora de PCR ARMS, 1,25 ml de 1,35 mM de la mezcla de dNTPs y 2,65
ml de agua destilada est�ril
Poner 20 �l de la mezcla de reacci�n en un tubo de PCR de 0.5 mL.
A�adir 1 �l de cada cebador (1 unidad de DO / ml).
A�adir 0,05 ml de Taq ADN polimerasa (5U / l).
Cuando se realiza m�s de una prueba, el cebador y la enzima se pueden mezclar
juntos en un tubo separado antes de la adici�n a la mezcla de reacci�n. Esto
disminuye los errores de pipeteado cuando se utilizan grandes cantidades.
A�adir 1 �l de ADN gen�mico (100 ng / l).
Superposici�n con 25 �l de aceite mineral.
Mix, centr�fuga y poner en el termociclador.
Amplificar durante 25 ciclos como sigue: 1 min a 94 �C / 1 min a 65 �C / 1,5 min a
72 �C con un periodo de extensi�n final de 3 minutos a 72 �C despu�s del ciclo
n�mero 25.
Retirar los tubos del termociclador y a�adir 5 �l de colorante azul. Mezclar y
centrifugar.
Cargar una al�cuota de 20 �l en un gel de agarosa al 3% y correr a 100 V durante
aproximadamente 45 min en TBE.
Te�ir el gel en una soluci�n de bromuro de etidio (0,5 mg / ml) durante 15-30
minutos
Visualizar bandas en una caja de luz UV (312 nm)
Fotografiar con un sistema de c�mara electr�nica o una c�mara Polaroid CU-5
equipado con un filtro naranja ( por ejemplo Wratten 22A).
Para la T-ARMS-PCR se hizo lo siguiente: ADN gen�mico fue extra�do de 0,2 ml de
muestras de sangre perif�rica frescas mediante el uso de la WizardH Genomic DNA
Purification Kit (Promega) seg�n las instrucciones del fabricante. muestras de ADN
extra�das ten�an una concentraci�n final que oscila desde 55 hasta 365 ng / mL.10?

Para superar las limitaciones de los m�todos est�ndar multiplex PCR Arms- T, el
m�todo propuesto se ha optimizado en t�rminos de dise�o de la cartilla, las
condiciones de los ciclos de PCR y en la utilizaci�n de cebadores quim�ricos y
estrategia de TSP, tal como se describe en nuestros informes anteriores en la
detecci�n del virus de la gripe de pies y manos y la boca humana asociada agentes
pat�genos.11? Se utilizaron un total de 24 cebadores quim�ricos cada uno consiste
en una secuencia espec�fica de gen con una secuencia de etiqueta universal en el
extremo 59. Las porciones de genes espec�ficos de los primers fueron dise�ados de
acuerdo con los requisitos de la T-ARMS-PCR. La especificidad de los cebadores
espec�ficos de alelo es conferido por la identidad del terminal 39 nucle�tidos ya
sea con el de tipo salvaje o el alelo mutante, la especificidad se incrementa por
la introducci�n de una falta de coincidencia deliberada en la posici�n -1 de la 39-
terminal. Un par de cebadores universales y seis juegos de T-Arms- PCR cebadores
quim�ricos fueron utilizados para la amplificaci�n. Las secuencias de cebadores
detalladas y las concentraciones de trabajo para cada SNP fueron enumerados.10?

El genotipado de los polimorfismos ensayados se realiz� mediante amplificaci�n por

PCR multiplex y an�lisis de fragmentos. Seis juegos de cebadores T- ARMS-PCR para
la amplificaci�n de doce fragmentos de diferentes tama�os se combinaron en un solo
20 ml de volumen de reacci�n, que tambi�n conten�an 10 ml de mezcla maestra kit
Qiagen Multiplex PCR, 50-100 ng de ADN gen�mico, y las concentraciones de cada
cebador optimizado. Multiplex PCR se realiz� utilizando Bioer LifePro
termociclador. Una PCR (TSP) protocolo interruptor de temperatura optimizada, que
utiliza cuatro temperatura de hibridaci�n diferente se realiz� como sigue: etapa de
desnaturalizaci�n inicial de 95�C de 10 min, 3 ciclos de 95�C durante 30 s, 60�C
durante 30 s, y72�C durante 45 s, 10 ciclos de 95�C durante 30 s, 58�C durante 30
s, y 72�C durante 45 s, 20 ciclos de 95�C durante 30 s, 68�C durante 30 s, y 72�C
para 45 s, 15 ciclos de 95�C for 30 s, 55�C por 30 s, 72� C por 45 s, seguidos por
un ciclo final de extensi�n a 72�C durante 10 min, y despu�s se deja enfriar a
4�C.10? Los productos de PCR m�ltiplex se separaron por ADN QIAxcelH cartucho de
gel de alta resoluci�n (Qiagen) en el sistema de QIAxcel (Qia- gen). ADN Tama�o de
marcador de 25 a 450 pb (Qiagen) y alineaci�n de marcador 15 pb / 500 pb (Qiagen)
se utilizaron en cada QIAxcel se ejecuta y se determin� el tama�o de los productos
mediante el software ScreenGel (Qiagen). Debido a que cada uno de los amplicones
era de una longitud diferente, se detectaron los alelos sobre la base de los
patrones de tama�os de pico. Un total de 186 muestras tambi�n fueron secuenciados
en paralelo con un ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EE.UU.) de
acuerdo con el protocolo BigDye versi�n 3.1 Terminaci�n de Invitrogen Corporation
(Shanghai, China) para confirmar los resultados T- m�ltiplex ARMS-PCR utilizando el
cebadores externos que figuran para cada SNP. Un total de 186 muestras se
tipificaron con un ensayo T-Arms- PCR multiplex y tambi�n escribe en paralelo con
la secuenciaci�n directa para evaluar la exactitud y la eficiencia del ensayo.
Todos los productos de PCR fueron bien resueltos y dimensionadas por CE y
ScreenGel, permitiendo la f�cil identificaci�n de los diferentes genotipos. Dos de
las 186 muestras ten�an once amplicones �nicos, es decir, aquellos pacientes que
tienen un solo SNP homog�nea entre los seis loci analizados. imagen gel de estas
dos muestras electroferograma y muestran que CE en QIAXEL puede separar claramente
un m�ximo de 11 fragmentos en una muestra. La precisi�n de m�ltiples an�lisis de
PCR de una muestra se confirm� por secuenciaci�n directa. tama�os de los fragmentos
determinados por la CE basada QIAXEL se enumeran. Leer las longitudes eran de 2 a
10 pb m�s grande que los esperados, pero esto no interfiri� con la determinaci�n de
los alelos. Heterocigotos y homocigotos fueron asignados de forma inequ�voca a
partir de los perfiles de CE. No se observ� reacci�n cruzada. Los genotipos
obtenidos a partir del ensayo multiplex eran en 100% de acuerdo con la
secuenciaci�n directa.10?

Materiales
dNTP

"Sume 50 �l de una soluci�n 100 mM de cada dNTP y 3,8 ml de agua destilada. El dNTP
de la soluci�n madre a 1,25 mM se debe almacenar en al�cuotas congeladas".9?

Cebadores

"50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), MgCl2 1,5 mM, 100 mg
/ ml. Un amortiguador a 10x puede ser preparado mediante la suma de 0,5 ml de 1 M
Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), 1,25 ml de 2 M KCl, 75 l de 1 M de MgCl2,
5 mg y 3.275 ml de agua destilada . La reserva de estabilizaci�n se calienta a 37
�C hasta que se disuelve y luego se congela en al�cuotas".9?

Taq polimerasas
"Las sugeridos son las siguientes, AmpliTaq Gold (PE Biosystems) que funciona mejor
para pruebas de digesti�n ARMS-PCR / RE y Platinum Taq (Gibco Life Technologies)
para Gap-PCR. (EDTA Tris-borato (TBE) tamp�n: 89 mM Tris-borato, 89 mM �cido
b�rico, 10 mM EDTA pH 8,0)".9?

Optimizaciones
El dise�o y la optimizaci�n de los protocolos de ARMS-PCR es hecha en funci�n de la
secuencia diana y las diferencias de nucle�tidos que definen los alelos. Adem�s de
los desajustes entre el nucle�tido del extremo 3� del cebador y la diana, solo los
desajustes deber�an incorporarse en varias posiciones del extremo 3�. Aparte de las
consideraciones te�ricas relativas a la posici�n terminal 3� de los cebadores
espec�ficos para alelos, el dise�o y optimizaci�n de los cebadores para ARMS-PCR
sigue las mismas consideraciones utilizadas para cualquier otro tipo de PCR. Los
cebadores se eligen para tener temperaturas de fusi�n te�ricas (Tm) comparables;
las longitudes de los cebadores son generalmente de 20 nucle�tidos o m�s, aunque la
longitud es menos importante que la Tm; los cebadores no deben tener secuencias
auto-complementarias de 4 nucle�tidos o m�s, ni deben tener m�s de 4 nucle�tidos de
complementariedad entre sus extremos 3�. Como con cualquier estrategia basada en
PCR, los resultados falsos negativos pueden ser el resultado de la presencia de
polimorfismos que han tenido un impacto negativo en la hibridaci�n del cebador y /
o en la amplificaci�n. Este problema potencial puede ser superado por la
orientaci�n de la cadena opuesta para la amplificaci�n, o mediante la incorporaci�n
de un nucle�tido degenerado en el cebador. Para identificar mutaciones individuales
con ARMS-PCR, las condiciones de la PCR se pueden establecer mediante la titulaci�n
de la concentraci�n de MgCl2 y / o cambiar las concentraciones del cebador a la
temperatura de amplificaci�n constante. Para ARMS multiplex, el primer paso es
optimizar las condiciones de PCR para la detecci�n sensible y espec�fica de cada
alelo. El objetivo es definir los par�metros de los ciclos de PCR y la
concentraci�n de MgCl2 en las que todos los alelos se amplifican de una manera
eficiente y espec�fica. Puede ser necesario volver a dise�ar uno o m�s pares de
cebadores para lograr la amplificaci�n espec�fica de alelo bajo un conjunto de
condiciones de PCR. Una vez se han establecido los par�metros de la PCR, los pares
de cebadores se pueden combinar para evaluar el rendimiento del ensayo ARMS-PCR
m�ltiple. Las concentraciones del cebador deben ajustarse de tal manera que cada
uno de los alelos se amplifique en un grado comparable. La especificidad del ensayo
de ARMS-PCR debe ser evaluada utilizando muestras de los controles normales y de
los portadores conocidos de las mutaciones. La especificidad tambi�n se puede
probar utilizando diluciones seriadas de ADN mutante mezclado con ADN normal (por
ejemplo, mutante: normal = 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8, etc.); la amplificaci�n uniforme
y espec�fica de cada alelo puede requerir manipulaci�n adicional de los par�metros
de ciclaci�n o la concentraci�n de uno o m�s reactivos (cebadores, Taq polimerasa,
MgCl2).4?

ARMS-PCR m�ltiple
Muchos trastornos gen�ticos se caracterizan por un peque�o n�mero de mutaciones
comunes que representan una proporci�n significativa y, en algunos casos, la
mayor�a de los alelos mutantes representadas en una poblaci�n dada. Una vez que se
ha establecido el espectro de mutaciones y las frecuencias de los alelos
individuales, la PCR-ARMS se puede utilizar para la detecci�n de manera simult�nea
de las mutaciones m�s comunes. En la pr�ctica, los ensayos multiplex pueden ser
desarrollados para la detecci�n de cuatro a seis mutaciones diferentes un solo tubo
de PCR.4?

T-ARMS-PCR
El sistema de mutaci�n refractario a la amplificaci�n por PCR con tetra-cebadores
(T-ARMS-PCR) es un m�todo r�pido y econ�mico para el an�lisis de polimorfismos de
un solo nucle�tido (SNP), requiriendo s�lo la amplificaci�n por PCR y la posterior
electroforesis para la determinaci�n de genotipos. Para mejorar el rendimiento y la
eficiencia de la T-ARMS-PCR, se puede combinar la T-ARMS-PCR con una estrategia
quim�rica de interrupci�n de temperatura basada en los iniciadores o cebadores de
PCR (TSP) y asimismo se puede utilizar la electroforesis capilar (CE por sus siglas
en ingl�s) para la separaci�n e identificaci�n de los resultados de la
amplificaci�n o �amplicones� como com�nmente se denominan. En el 2013, algunos
investigadores evaluaron este proceso en el genotipado simult�neo de cuatro tipos
de c�ncer de mama y dos relacionados con el riesgo de c�ncer de cuello uterino,
todos relacionados con algunos SNPs.10?

Un total de 24 cebadores T-ARMS-PCR, cada uno etiquetado con una secuencia

universal en el extremo 5� y un par de cebadores universales, fueron agrupados para
amplificar los 12 alelos de 6 SNPs en 186 muestras de sangre de mujeres que
fungir�an como controles. Tambi�n se realiz� una secuenciaci�n directa de todas las
muestras para evaluar la exactitud de este m�todo.10?

De las 186 muestras se pudieron producir hasta 11 amplicones en una sola PCR y ser
separados por Electroforesis Capilar. Los resultados de genotipado con la T-ARMS-
PCR m�ltiple estaban en completa concordancia con la secuenciaci�n directa de todas
las muestras. Este nuevo m�todo de T-ARMS-PCR m�ltiple es el primer m�todo
reportado que permite determinar el genotipo de seis SNPs en una sola reacci�n sin
ning�n tratamiento post-PCR distinta de la electroforesis; este m�todo es fiable,
r�pido y f�cil de realizar.10?

El papel de los polimorfismos de un solo nucle�tido (SNP) es el de contribuir a la

variabilidad entre individuos, a veces haci�ndolos susceptibles al c�ncer,12? el
crecimiento del tumor y la tasa de met�stasis,13?14?15? as� como en la eficacia del
tratamiento y las respuestas secundarias a los medicamentos.16?17? Entre los muchos
m�todos que se han desarrollado para determinar el genotipo de los SNPs; el sistema
de mutaci�n refractario a la amplificaci�n por PCR con tetra-cebadores (T-ARMS-PCR)
ha demostrado ser r�pido, simple y econ�mico.18?19?20?21?22? A trav�s de la
combinaci�n de dos cebadores externos y los dos cebadores internos espec�ficos para
alg�n alelo, la genotipificaci�n requiere s�lo una PCR seguida de una separaci�n
por electroforesis.19? La incorporaci�n de una T-Arms- PCR m�ltiple, con ocho
cebadores en una PCR hace capaz la detecci�n de manera simult�nea de dos
mutaciones.22?

Por otro lado, la hibridaci�n quim�rica m�ltiple por PCR a�ade una etiqueta
universal de 59 nucle�tidos a la secuencia de cebadores espec�ficos para varios
objetivos, se ha utilizado para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la
reacci�n en cadena de la polimerasa.23? dando buenos resultados. Con su alta
eficiencia en la detecci�n de decenas de diferentes productos de PCR en una
reacci�n, el uso de un cebador quim�rico para PCR con frecuencia se ha utilizado en
la cuantificaci�n de ARNm24?25?26? y la detecci�n de pat�genos.27?28?

El c�ncer de mama y el c�ncer c�rvico-uterino se han convertido en los c�nceres m�s

frecuentemente diagnosticados y las principales causas de muerte por c�ncer entre
las mujeres.29? Estudios recientes demuestran que las variantes som�ticas en
regiones de susceptibilidad est�n asociados con la probabilidad de ocurrencia de
c�ncer de mama y c�nceres ginecol�gicos.30?31?32?33?34?

Algunos SNPs fueron escogidos para un estudio que se hizo sobre las asociaciones
gen�ticas reportadas con estos tipos de c�ncer y que tiene una alta prevalencia en
las poblaciones asi�ticas. Se seleccionaron cuatro variantes de baja penetrancia
para la predicci�n del riesgo de c�ncer de mama: rs4784227 SNP35? y rs380366236? se
encuentran en el TOX3 un factor de transcripci�n; rs1219648 se encuentra dentro de
FGFR2, que contribuye al crecimiento celular, la invasi�n, la motilidad y la
angiog�nesis;37? rs88931238? est� dentro de MAP3K1, que est� vinculada a la
respuesta celular a los mit�genos. Se seleccionaron dos variantes asociadas con el
riesgo de c�ncer c�rvicouterino o de ovario. rs750749 SNP32? es un polimorfismos en
CD83, que est� implicado en el reconocimiento inmune y la presentaci�n de
ant�genos; rs749292 en CYP19A1, que desempe�a un papel clave en la bios�ntesis de
estr�genos.33?34?

En este trabajo, se describe un nuevo m�ltiplex T-ARMS-PCR que permite el

genotipado simult�neo de 6 SNPs (rs4784227, rs3803662, rs1219648, rs889312,
rs750749 y rs749292) asociado con c�nceres de mama y ginecol�gicos en un solo tubo
utilizando 24 quim�rico cebadores y un par de cebadores universales el uso de
cebadores quim�ricos y una estrategia de interruptor de temperatura PCR (TSP) se
combinaron con T-ARMS-PCR para optimizar los par�metros de amplificaci�n y mejorar
el rendimiento de SNP genotipado. La combinaci�n de estas diferentes t�cnicas de
genotipificaci�n de- muestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR
para detectar de forma fiable y eficiente seis SNPs en una sola reacci�n. Desde
hace m�s de 10 productos de PCR con longitudes diferentes deben ser identificados,
electroforesis capilar (CE) se utiliza en lugar de la electroforesis en gel de
agarosa.10? El estudio hecho sobre la prevalencia de ciertos tipos de c�nceren la
poblaci�n asi�tica, habla de que de acuerdo con los monitoreos recogidos en los
centros de salud comunitarios en Wuhan, China en 2011 un gran porcentaje de la
poblaci�n presenta polimorfismos de un solo nucle�tido asociados a estos.10?

M�todos que permitan el bajo costo de la determinaci�n r�pida y fiable de los SNPs
est�n generando un creciente inter�s ahora que vamos encaminados a la era de la
medicina personalizada. Es ampliamente reconocido que el uso de la informaci�n de
m�ltiples genotipos de SNPs proporciona una evaluaci�n del riesgo m�s precisa que
la predicha por el riesgo de un alelo �nico,39? por lo tanto, algunos m�todos
capaces de identificar m�ltiples genotipos, tales como MALDI-TOF (espectrometr�a de
masas)40?41? y basado en la hibridaci�n42?43?44? o a base de enzimas se han
utilizado45? m�todos. Sin embargo, estos m�todos requieren equipo especial costoso,
como los espectr�metros de masas o tardan mucho tiempo despu�s de la operaci�n. El
m�todo de ARMS-PCR con tetra-cebadores se ha convertido en uno de los m�todos m�s
com�nmente utilizados para el genotipado de SNP. S�lo se requiere equipo de
biolog�a molecular regular y elimina la necesidad de hibridaci�n o reacciones
enzim�ticas adicionales. Aunque se han reportado m�todos tr�plex y cu�druplex de
PCR, se hace un uso limitado de m�ltiplex T-ARMS-PCR en la determinaci�n del
genotipo debido a dos limitaciones clave. En primer lugar, la probabilidad de
encontrar cebadores con temperaturas de fusi�n emparejados cae dr�sticamente cuando
se trata de combinar la detecci�n de varios SNPs en una sola reacci�n. En segundo
lugar, la piscina que resulta de los amplificados requiere suficientes intervalos
de longitud entre bandas vecinas en la electroforesis para facilitar la separaci�n.
Mediante la combinaci�n de T-ARMS-PCR con una estrategia quim�rica basada en los
iniciadores de temperatura de activaci�n PCR eludimos en gran medida estas
limitaciones. Nuestro m�todo demuestra por primera vez la capacidad de tetra-primer
ARMS-PCR para detectar f�cilmente seis SNPs en una sola reacci�n.10?

Es notable que la intensidad de la banda pueden ser objeto de varios factores,

incluyendo la calidad del ADN gen�mico y PCR calidad de los reactivos; se ha
encontrado que 50 a 100 ng / ml de ADN es �ptima para proporcionar bandas
suficientemente clara y brillante con el fondo m�nima (datos no mostrados). Adem�s,
a diferencia de la mayor�a de otros m�todos inform� T-ARMS-PCR, una falta de
coincidencia deliberado en la posici�n -1 de la 39 terminal se incorpor� en ambos
cebadores internos y era suficientemente espec�fico para la detecci�n diferencial
de dos alelos para cada SNP. Debido a la limitaci�n de tama�o de la discriminaci�n
entre los productos de PCR, dise�o de cebadores de PCR puede ser restringido en
cierta medida, hacer m�ltiples T-ARMS-PCR dif�cil de escribir los SNPs que se
encuentran m�s cerca que 20 pb de la otra. Dos claras ventajas del m�todo ARMS-PCR
m�ltiple son el corto tiempo de ensayo y los bajos costos, incluso para ensayar un
gran n�mero de muestras. El m�todo propuesto, solo que incluya la PCR convencional
con un CE, puede llevarse a cabo antes de 3,5 horas con un m�nimo esfuerzo
pr�ctico. Despu�s de la extracci�n de ADN gen�mico, los pasos posteriores se pueden
completar en un solo tubo de reacci�n, lo que permite el an�lisis de m�ltiples
muestras listo en una �nica prueba para cribado de alto rendimiento. Este ensayo
consume solamente reactivos de PCR est�ndar y cartuchos de electroforesis; los
costos en este estudio fueron s�lo 2 US $ para la detecci�n simult�nea de seis SNPs
por muestra. Para nuestro conocimiento, el m�todo propuesto es el primero en
detectar seis SNPs en una �nica reacci�n usando tetra-primer ARMS-PCR. El nuevo
m�todo multiplex tetra-primer ARMS-PCR desarrollada en este estudio tiene un
potencial significativo para ser ampliamente aplicable tanto en entornos
comerciales y cl�nicas para la detecci�n de m�ltiples SNPs.10?

q-ARMS-PCR
La leu A3243G ARNmt mitocondrial (UUR) es un punto de mutaci�n que puede causar
miopat�a mitocondrial, encefalopat�a, s�ndrome de acidosis l�ctica y episodios de
ictus (MELAS), el trastorno de ADN mitocondrial m�s com�n, y tambi�n se encuentra
en los pacientes con diabetes de herencia materna y s�ndrome de sordera (EDIM).
Para correlacionar la manifestaci�n de la enfermedad con las cargas de mutaci�n, es
necesario medir el porcentaje de la mutaci�n A3243G en el ADNmt. Para cuantificar
de manera fiable las bajas proporciones del ADNmt mutante, hemos desarrollado un
sistema de mutaci�n refractario a amplificaci�n por PCR cuantitativo en tiempo real
(ARMS-qPCR). Hemos validado el m�todo con muestras experimentales que contienen
proporciones conocidas de A3243G mutante ADNmt generados mediante la mezcla de
cantidades conocidas de ADN de pl�smido clonado que contiene ya sea el de tipo
salvaje o las secuencias mutantes. Se encontr� un coeficiente de correlaci�n de
0,9995 entre los valores esperados y observados para las proporciones de A3243G
mutante en las muestras experimentales. Evaluaci�n de un total de 36 muestras de
ADN de pacientes demostr� resultados consistentes entre la PCR de restricci�n
polimorfismo de longitud de fragmento de an�lisis (RFLP) y en ARMS-qPCR. Sin
embargo, el �ltimo m�todo fue mucho m�s sensible para la detecci�n de bajos
porcentajes de heteroplasmia mutante. Tres muestras conten�an mutaciones de
oligonucle�tidos-detectable pero RFLP-indetectable espec�ficos de alelo. El m�todo
en tiempo real ARMS-PCR cuantitativa proporciona un r�pido, de un solo paso de
detecci�n cuantitativa y fiable de mutante heteroplasmic ADNmt. En los ARMS-PCR de
PCR, el cebador inverso (5'-TGGCCATGGGTATGTTGTTA-3 ') era en las posiciones de
nucle�tidos 3319-3300 para la amplificaci�n de ambos de tipo salvaje ADNmt y la
mutaci�n A3243G. Los cebadores directos para el an�lisis de RT ARMS-PCR de la
mutaci�n A3243G se enumeran. Los n�meros corresponden a las posiciones de
nucle�tidos en GenBank adhesi�n no. NC001807 y la base de datos MITOMAP (2).
Originalmente, una falta de coincidencia en la posici�n de nucle�tido pen�ltima del
sitio de mutaci�n se introdujo en los cebadores directos para aumentar la
especificidad de la reacci�n ARMS basado en los principios descritos por Newton.
Sin embargo, la especificidad no era suficiente, y no hab�a se�ales de fondo en 0%
mutante. Dos desajustes en los dos nucle�tidos inmediatamente 5 'al sitio de la
mutaci�n A continuaci�n, se introducen, que mejora en gran medida la especificidad.
Por lo tanto, se utilizaron cebadores modificados hacia adelante desde el conjunto
B de este estudio. En el sitio de la mutaci�n, la imprimaci�n de tipo salvaje que
contiene una "A" ser�a conjuntar con la secuencia diana de tipo salvaje, pero ser�a
una falta de coincidencia d�bil "AC" con la secuencia diana mutante. Del mismo
modo, el cebador mutante que contiene una "G" ser�a una combinaci�n perfecta con la
secuencia diana mutante, pero ser�a una falta de coincidencia d�bil "GT" con la
secuencia diana de tipo salvaje. Por lo tanto, se espera que la introducci�n de un
fuerte desajuste CC en la pen�ltima de nucle�tidos para aumentar la especificidad
de imprimaci�n.

RT-ARMS-q-PCR
El ensayo RT-qPCR ARMS se realiz� por triplicado para cada tipo salvaje y la
secuencia diana mutante. La mezcla de 20-l de reacci�n de PCR conten�a 1 � Platinum
SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen), 500 nM de cada cebador, tinte Rox, y ~ 4
ng de extracto de ADN gen�mico total, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. En tiempo real las condiciones de PCR fueron 2 min a 50 � C y 10 min a
95 � C, seguido por 45 ciclos de desnaturalizaci�n durante 15 s a 95 � C y el
recocido / extensi�n durante 60 s a 63 � C. colorante SYBR Green se une al surco
menor del ADN de doble cadena y aumenta la intensidad de las emisiones
fluorescentes, mientras que los amplicones se producen en cada ciclo de
amplificaci�n. Las intensidades de la se�al fluorescente se registraron y
analizaron durante la PCR en un sistema 7700 detector de secuencias ABI Prism
(Applied Biosystems) utilizando el software SDS (Ver. 1.91). curvas de disociaci�n
para los amplicones se generaron despu�s de cada carrera para confirmar que el
aumento de la intensidad de fluorescencia no eran atribuibles a las se�ales no
espec�ficas (d�meros de cebadores). El aumento de la se�al fluorescente est�
asociado con un crecimiento exponencial de producto de PCR durante la fase lineal-
log. El ciclo umbral (C ^ sub T ^) es el ciclo en el cual se detecta primero un
aumento significativo en el producto de reacci�n. Cuanto mayor sea la cantidad
inicial de ADN, se detecta el producto en menos tiempo acumulado en el proceso de
la PCR y la parte baja de la C ^ sub t ^ valor. Por lo tanto, el C ^ sub T ^
valores dentro de la fase de aumento exponencial lineal se utilizan para medir los
n�meros originales de copia de la plantilla de ADN y para construir la curva de
calibraci�n. Si una muestra conten�a> 100 000 o <100 copias sobre la base de la C ^
sub T ^, el ensayo se repiti� a una diluci�n mayor o menor del extracto de ADN de
manera que la medici�n caer�a dentro de un rango de n�meros de copias de ADN
lineal.

ARMS-Scorpion
El objetivo de un estudio fue el de comparar el test de KRAS sensibles y con
control de calidad con la secuenciaci�n directa y para evaluar el impacto en la
toma de decisiones de tratamiento. Se analiz� el ADN gen�mico aislado de las
muestras incluidas en parafina fijado en formol por secuenciaci�n directa y un
sistema de ensayo de ARMS-Scorpion (ARMS / S). El cetuximab se administr� a los
pacientes identificados como de tipo salvaje (WT) KRAS mediante secuenciaci�n
directa. Los efectos terap�uticos se evaluaron en funci�n de su estado de KRAS como
se determina por ARMS / S. Entre los 159 pacientes, la tasa de mutaci�n general se
determin� que era 37,0% por secuenciaci�n directa y 44,0% en los ARMS-PCR / S. Para
los pacientes diagnosticados como WT por secuenciaci�n directa y tratados con
cetuximab (n = 47), se observ� una tasa de respuesta del 16,0% para 38 pacientes
ARMS-PCR / S WT, mientras que 9 ARMS-PCR / S mutante (MUT) pacientes no
respondieron. Los ARMS-PCR / pacientes S WT mostraron una mejor�a significativa en
la supervivencia libre de progresi�n (SLP) y la supervivencia global (SG) en
comparaci�n con los ARMS-PCR / pacientes S MUT (PFS mediana de 5,0 vs 1,7 meses,
promedio de riesgo (HR) = 0,29, p = 0,001; La mediana de SG 12,1 vs 3,8 meses, HR =
0,26, p = 0,001). El test de KRAS sensibles y con control de calidad puede
proporcionar una mejor capacidad de predicci�n para determinar la eficacia de los
anticuerpos del factor de crecimiento anti-epid�rmicos .46?

ARMS-PCR con hexa-cebadores

El sistema de mutaci�n refractario a la amplificaci�n por PCR con tetra-cebadores
(TARMS-PCR) es un m�todo de genotipificaci�n sencillo y barato para la
diferenciaci�n de los dos alelos de un polimorfismo / mutaci�n (polimorfismos y
peque�as inserciones / deleciones) con un �nico tubo de PCR. En T-ARMS-PCR, un par
de cebadores comunes (exteriores) produce un amplic�n de control inespec�fico de
alelo y en combinaci�n con los cebadores 2 alelo-espec�ficos (interior) (dise�ado
para hibridarse en la orientaci�n opuesta) produce 2 amplicones espec�ficos de
alelo. Por lo tanto, los amplicones se pueden separar por electroforesis en gel
est�ndar. T-ARMS-PCR tambi�n ha sido dise�ado de un modo multiplex para el genotipo
m�s de un polimorfismo / mutaci�n por un �nico tubo de PCR. Se describe una T-ARMS-
PCR m�ltiplex modificada, el hexaprimer ARMS-PCR (H-ARMS-PCR), que es para cuando
est�n cerca de 2 polimorfismos en la secuencia. H-ARMSPCR utiliza s�lo 6 cebadores
y proporciona informaci�n directa sobre la estructura de haplotipos. El gen CTLA4
(citot�xico prote�na asociada a Linfocitos T 4, tambi�n conocida como CD152) es un
regulador negativo de la funci�n de las c�lulas T. Los polimorfismos CTLA4 -318 C>
T (rs5742909) y 49 A> G (rs231775) est�n asociados con la susceptibilidad a
enfermedades autoinmunes y c�ncer. Para determinar el genotipo de estos 2
polimorfismos, que s�lo son 365 pb de separaci�n, en la regi�n 5 'del gen de CTLA4,
se dise�� un H-ARMS-PCR que combina un �nico par de cebadores comunes y 2 pares de
cebadores alelo-especificos en el mismo tubo. La reacci�n de PCR (25 �l) conten�a
200 desoxinucle�sidos trifosfato mol / l, 100 ng de ADN gen�mico, 1,25 U de
HotStarTaq ADN polimerasa con su buffer y los siguientes cebadores a las
concentraciones indicadas: - 318fo, 5'CAATGAAATGAATTGGACTGGA TG-3 '(0,5 mol / L); +
49ro, 5'-TA CAGAGCCAGCCAAGCCAGATT3 '(0,8 mol / L); -318fi (C), 5'-CTC
CACTTAGTTATCCAGATCGTC-3 '(2,5 mol / L); -318ri (T), 5'-AC TGAAGCTTCATGTTCACTCrA-3
'(0,5 mol / L); + 49fi (a), 5'-GCACA AGGCTCAGCTGAACCTGGATA3 '(0,1 mol / L); y +
49ri (g), 5'-ACAGGAGAGTGCAGGGCCAG GTCCTAGC-3 '(0,5 mmol / L). Las condiciones de
ciclaci�n fueron 12 min a 95 � C, seguido de 5 ciclos de 94 � C durante 30 s, 62 �
C durante 30 s, y 72 � C durante 45 s; 30 ciclos de 94 � C durante 30 s, 57 � C
durante 30 s, y 72 � C durante 45 s; y un ciclo final a 72 � C durante 10 min.
Estamos genotipo tanto el -318 C> T y 49 A> G polimorfismos CTLA4 con este nuevo
dise�o de H-ARMS-PCR para muestras de 80 individuos que hab�an sido previamente
caracterizado con 3 m�todos establecidos: RFLP, PCR, secuenciaci�n directa del ADN,
y T-ARMS-PCR y se observaron discrepancias. Por otra parte, H-ARMS-PCR proporciona
un control interno adicional y la informaci�n directa sobre la estructura de
haplotipos mediante la generaci�n de un amplic�n que es espec�fico para 1 de los 4
haplotipos que 2 polimorfismos pueden tener te�ricamente. En este caso, el
amplic�n-haplotipo espec�fico se observa cuando los alelos - 318C y + 49G est�n en
el mismo cromosoma. Adem�s, la prueba de este enfoque mediante la aplicaci�n de H-
ARMS-PCR en la determinaci�n del genotipo de 2 polimorfismos que son 142 pb de
separaci�n, en la regi�n no traducida 3 '(UTR) del gen CYP19A1 (citocromo P450,
familia 19, subfamilia A, polip�ptido 1): rs10046 (C> T) y rs4646 (G> T). CYP19A1
codifica la aromatasa, la enzima responsable de la etapa final de la bios�ntesis de
estr�genos. polimorfismos CYP19A1 se han asociado con las concentraciones de
estr�genos en la mujer y con la susceptibilidad al c�ncer de mama y de pr�stata. Se
utiliz� la PCR para analizar estos 2 polimorfismos CYP19A1 en el 3 'UTR en 100
individuos ya que se caracterizan por RFLP PCR y / o secuenciaci�n de ADN directa y
observamos no hay discrepancias. Un amplic�n-haplotipo espec�fico est� presente
cuando alelos rs10046C y rs4646T est�n en el mismo cromosoma. Este H-ARMSPCR se
est� utilizando actualmente en un ensayo cl�nico multic�ntrico italiano (GIM5) para
poner a prueba la posible asociaci�n de polimorfismos CYP19A1 con la eficacia de la
terapia adyuvante con un inhibidor de la aromatasa (letrozol) despu�s del
tratamiento con tamoxifeno en pacientes posmenop�usicas con c�ncer de mama
temprano. Adem�s, genotipo una serie de 40 individuos de ambos polimorfismos CTLA4
y CYP19A1 por an�lisis de H-ARMS-PCR con diferentes termocicladores (iCyder� por
Bio-Rad, Px2� por Hybaid, y PTC0 -100� por MJ Research) y en diferentes
laboratorios, y se obtuvieron resultados completamente concordantes, lo que
demuestra la robustez y reproducibilidad de este enfoque. Todas las muestras
humanas fueron recolectados despu�s se obtuvo el consentimiento informado de
acuerdo con el procedimiento institucional. Hemos demostrado que H-ARMSPCR es una
t�cnica eficaz y robusto para el genotipado de 2 polimorfismos (en un intervalo de
aproximadamente 100 a 400 pb) con s�lo 6 cebadores. Las H-ARMS-PCR pueden trabajar
para el genotipado de polimorfismos incluso m�s alejados o separadas, probablemente
dentro de una distancia de aproximadamente 5 kb. Adem�s, al proporcionar
informaci�n directa sobre un haplotipo definido, H-ARMS-PCR, pueden ser �tiles para
la identificaci�n de haplotipos potencialmente ambiguos en individuos que son
heterocigotos dobles .47?

Aplicaciones
Inmunizaci�n
De acuerdo a las noticias procedentes de Kaohsiung, Taiw�n, los corresponsales
VerticalNews, la investigaci�n indic�, "Un sistema de mutaci�n refractaria a la
amplificaci�n m�ltiple inversa de la reacci�n en cadena de la polimerasa (RT- ARMS-
PCR) fue desarrollado para el diagn�stico diferencial del virus de la leucemia
felina vacuna y salvaje (FeLV) de tipo cepas sobre la base de una mutaci�n puntual
entre la cepa de la vacuna (S) y la cepa de tipo salvaje (T) situado en el gen p27.
Este sistema fue actualizado adicionalmente para obtener un tiempo real de RT-PCR
ARMS-PCR (ARMS QRT-PCR ) con un an�lisis de alta resoluci�n de fusi�n (HRMA)
plataforma ".

Sun Yat: "El genotipado de varias cepas de FeLV se determin� mediante la

comparaci�n de las curvas HRMA con la de tipo salvaje definido FeLV (cepa TW1), y
los resultados se expresaron como una la confianza porcentual. Los l�mites de
detecci�n de ARMS-PCR de RT-PCR y los ARMS-PCR QRT-PCR combinados con HRMA eran 100
y 1 copias de RNA de FeLV transcrito por 0,5 ml de muestra, respectivamente. No hay
resultados falsos positivos se obtuvieron con 6 pat�genos no relacionados y 1
felina l�nea celular. cepas Doce FeLV Taiw�n fueron identificados correctamente
utilizando ARMS-PCR QRT-PCR combinada con HRMA. los genotipos de las cepas se
correspond�a con el FeLV genotipo de tipo salvaje cepa definida con la confianza de
al menos el 91,17%. Un mayor grado de polimorfismo de secuencia se encuentra en
todo el gen p27 en comparaci�n con la larga repetici�n terminal regi�n ".

"El estudio actual describe la relaci�n filogen�tica de las cepas FeLV Taiw�n y
demuestra que el ensayo de ARMS RT-PCR desarrollado es capaz de ser utilizado para
detectar la replicaci�n de una cepa de vacuna que no ha sido adecuadamente
inactivado, actuando as� como un control de seguridad para la calidad de las
vacunas de FeLV " .48?

Genotipificaci�n
Las PCR-ARMS se pueden utilizar para determinar el genotipo de las muestras para la
mutaci�n m�s com�n asociada con la hemocromatosis hereditaria (HFE C282Y). Las PCR-
ARMS se pueden utilizar para determinar los genotipos para las mutaciones
individuales o SNP; es decir, distinguir heterocigotos de los homocigotos. Esto se
puede lograr mediante dos ARMS-PCR ensayos separados: uno espec�fico para el alelo
mutante y el otro espec�ficas para el alelo normal. Alternativamente, los sistemas
de ARMS-PCR de PCR se han desarrollado para el genotipado de un solo tubo de
mutaciones o SNPs. El sistema m�s simple implica la amplificaci�n bidireccional,
con el alelo normal amplifica usando una hebra como molde y el alelo mutante
amplificado de la cadena complementaria. Los cebadores est�n dise�ados de tal
manera que las longitudes de los amplicones pueden ser f�cilmente resueltos por
electroforesis en gel convencional. Esta estrategia tiene un control positivo
incorporado que resulta de la amplificaci�n entre los cebadores m�s exteriores de
los amplicones normales y mutantes. 4?

Haplotipado
PCR-ARMS-PCR pueden ser utilizados para establecer los haplotipos de los individuos
en la ausencia de muestras de los familiares. Esto es particularmente �til para
determinar el haplotipo de SNP que se encuentran dentro de las distancias que son
susceptibles de amplificaci�n por PCR. Considere el caso de SNPs bi-al�lica
adyacentes, donde los alelos se designan Aa y Bb. PCR-ARMS-PCR con las cuatro
combinaciones posibles de ARMS-PCR de cebadores espec�ficos para los alelos SNP A y
B SNP (AB, Ab, aB, ab) pueden ser utilizados. 4?

PCR-ARMS e hibridaci�n reversa en la detecci�n de mutaciones en beta-thalassemia

La beta-talasemia es la enfermedad hereditaria m�s com�n en Ir�n y durante los
�ltimos 10 a�os, el sistema de amplificaci�n refractario a las mutaciones (ARMS) y
el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricci�n (RFLP) fueron la �nica
t�cnica molecular utilizada para el diagn�stico de la enfermedad. Aunque existen
muchas mutaciones del gen beta-globina en la poblaci�n multi�tnica de Ir�n, estas
t�cnicas parecen mucho trabajo, mucho tiempo y es caro. Esto nos ha instado a
utilizar nuevas t�cnicas como la hibridaci�n inversa y secuenciaci�n directa de
este problema.7 En este estudio, hibridaci�n inversa en paralelo con los ARMS-PCR
para la detecci�n de las 10 mutaciones beta-talasemia m�s comunes y la hemoglobina
S en 82 pacientes con diagn�stico cl�nico de menor importancia beta-talasemia y la
mayor.7 A partir de los resultados, de los 82 casos detectables por ambos m�todos,
80 tuvieron resultados similares. En comparaci�n a las ARMS-PCR, la hibridaci�n
inversa parece ser m�s fiable, rentable, r�pido y aplicable.7 Teniendo en cuenta el
amplio espectro de mutaciones beta-talasemia en Ir�n, una t�cnica r�pida y fiable,
como hibridaci�n inversa representa ventajas vitales en comparaci�n con los m�todos
de diagn�stico tradicionales. De hecho, se recomienda como la t�cnica de elecci�n
que puede ser empleada por el Proyecto Nacional de Talasemia para la detecci�n y el
diagn�stico prenatal de la talasemia en Ir�n.7?

Identificaci�n de SNPs comparando PCR-ARMS con PCR-RFLP

La identificaci�n de polimorfismos de nucle�tido �nico (SNP) es ahora posible
mediante muchas t�cnicas, pero la elecci�n de uno de estos m�todos para un caso
particular representa todo un reto, debido a que el investigador debe tener en
cuenta muchos factores. En este art�culo los autores est�n tratando de presentar un
estudio comparativo de dos m�todos, que se utiliza actualmente en nuestro
laboratorio, para la identificaci�n de polimorfismos SNP: ARMS - PCR (sistema de
mutaci�n refractaria a la amplificaci�n) y. Los dos SNPs en el que nos centramos
pertenecen al gen VDR humano (gen del receptor de la vitamina D) y son ApaI (un
cambio de base G por T en el intr�n 8) y Taq I (T por el cambio de base C
silenciosa en el cod�n 352), el nombre de la enzimas de restricci�n que reconocen
estas variaciones. 49 Dado que los resultados obtenidos por los dos m�todos se
confirmaron por secuenciaci�n directa, concluimos que el m�todo ARMS-PCR es el m�s
adecuado para la detecci�n de los genotipos alternativos determinados por
mutaciones de una sola base. La simplicidad de este m�todo lo hace adecuado para el
an�lisis de gran n�mero de muestras, situaci�n que por lo general se cumple en
casos y controles y estudios gen�ticos de poblaci�n, porque esta prueba es f�cil de
usar, costo - efectiva y tener una precisi�n de 99,9%. 49?

Biopsias cl�nicas
Se han comparado el an�lisis de mutaci�n mediante secuenciaci�n de ADN y
amplificaci�n refractaria mutaci�n System � (ARMS �) por su capacidad para detectar
mutaciones en muestras de biopsia cl�nicos. Se han evaluado cinco en tiempo real
ARMAS ensayos: BRAF 1799T> A, [esto incluye V600E y V600K] y las ANR 182A> G [Q61R]
y 181c> A [Q61K] en el melanoma, el EGFR 2573T> G [L858R], 2235- 2249del15 [E746-
A750del] en el c�ncer de pulm�n no de c�lulas peque�as, y compararon los resultados
con la secuenciaci�n del ADN de la mutaci�n 'puntos calientes' de estos genes en el
tumor incluido en parafina y fijado en formalina ADN (FF-PET). Los ensayos ARMS
maximizan el n�mero de muestras que podr�an analizarse cuando tanto la calidad y
cantidad de ADN fue baja, y mejoraron tanto la sensibilidad y la velocidad de
an�lisis en comparaci�n con la secuenciaci�n. Armas fue m�s robusta con menos
fallos de reacci�n en comparaci�n con la secuencia y fue m�s sensible, ya que fue
capaz de detectar mutaciones funcionales que no fueron detectados por secuenciaci�n
del ADN. La secuenciaci�n del ADN fue capaz de detectar un peque�o n�mero de baja
frecuencia mutaciones recurrentes a trav�s de los exones seleccionados que no
fueron interrogados usando los ensayos ARMS espec�ficos en estos estudios. La PCR-
ARMS fue m�s sensible y robusto en la detecci�n de mutaciones som�ticas definidos
que la secuenciaci�n de ADN en muestras cl�nicas en las que el tipo de muestra
predominante fue FF-PET.50?

An�lisis de mutaciones puntuales

Una aplicaci�n com�n de PCR-ARMS es la detecci�n de mutaciones puntuales
individuales en el ADN. Se dise�an cebadores que preferentemente amplificar� el
alelo mutante, mientras que ser refractario a la amplificaci�n del alelo normal.
Incluido en la mezcla de reacci�n es un segundo conjunto de cebadores que son
espec�ficos para un locus heter�logo que sirve como control positivo para la
amplificaci�n PCR. sistemas de agarosa o en gel de poliacrilamida de electroforesis
convencionales se utilizan para resolver el amplic�n de control desde el amplic�n
mutante. Dado que la eficiencia de la amplificaci�n es inversamente proporcional a
la longitud del amplic�n, el amplic�n de control debe ser mayor o cerca en tama�o
con el amplic�n mutante.4 Este ensayo distingue entre las muestras que son
positivas para la mutaci�n IVS 8-1 GAEC (homocigotos o heterocigotos) y los que son
negativos para la mutaci�n. Esto es suficiente para aplicaciones donde no es
necesario distinguir entre los heterocigotos y homocigotos. Para otras
aplicaciones, tales como el an�lisis de mutaci�n para los individuos afectados con
un trastorno recesivo, puede ser deseable determinar el genotipo de los individuos
que son positivos para la mutaci�n. Esto se puede lograr mediante el cribado de
todas las muestras positivas con un segundo ensayo de ARMS-PCR que es espec�fico
para el alelo normal y refractario para el alelo mutante. heterocigotos ser�n
positivos para ambos ensayos ARMS-PCR, mientras que los homocigotos ser�n positivos
para el ensayo s�lo se ARMS-PCR mutante.4 La especificidad de la PCR-ARMS es tal
que las piscinas de las muestras pueden ser examinados para identificar a los
portadores de mutaciones raras espec�ficas. Este enfoque es capaz de detectar una
muestra positiva solo en piscinas de 30 o m�s muestras.; as� como la necesidad de
probar un gran n�mero de muestras individualmente para establecer las frecuencias
de poblaci�n para los alelos mutantes individuales. El sistema de amplificaci�n de
mutaci�n refractaria (ARMS) es un m�todo sencillo para detectar cualquier mutaci�n
que implica cambios de bases individuales o peque�as deleciones. ARMS se basa en el
uso de cebadores de PCR espec�ficos de secuencia que permiten la amplificaci�n de
ADN de prueba s�lo cuando el alelo diana est� contenida dentro de la muestra.
Despu�s de una reacci�n ARMS la presencia o ausencia de un producto PCR es
diagn�stico para la presencia o ausencia del alelo diana. Los protocolos detallados
aqu� describen m�todos que se pueden utilizar para analizar el ADN gen�mico humano
para una o m�s mutaciones. El protocolo b�sico se describe el desarrollo y la
aplicaci�n de una prueba de ARMS-PCR por una sola mutaci�n; Protocolo alternativo
extiende esta multiplexar ARMS para el an�lisis de dos o m�s mutaciones. El
Protocolo de Soporte describe un m�todo de extracci�n r�pida de ADN de muestras de
sangre o de enjuague bucal que produce ADN compatible con el tipo de pruebas que se
describen. ARMS es un m�todo simple para detectar cualquier mutaci�n que implica el
cambio de una sola base.51 El polimorfismo de nucle�tido �nico (SNP) puede
secuanciarse o genotipificarse, se consideran actualmente como unas herramientas
particularmente valiosas para el diagn�stico de diferentes patolog�as. Por esta
raz�n, en los �ltimos a�os una gran cantidad de esfuerzo se ha dedicado al
desarrollo de tecnolog�as precisas, r�pidas y rentables para el an�lisis de SNP. A
pesar de que un gran n�mero de enfoques distintos se ha informado cada laboratorio
utilice uno de los m�todos publicados en funci�n de su capacidad t�cnica y
econ�mica. En este art�culo se presenta una aplicaci�n de un ensayo en el local,
ARMS-PCR tetra-cabadores, y su aplicaci�n en la genotipificaci�n de SNP. Hemos
demostrado que este ensayo podr�a ser m�s ventajoso en comparaci�n con la PCR-RFLP,
PCR en tiempo real, y la secuenciaci�n del ADN. Hemos demostrado que el ensayo
tiene �xito en el genotipado usando tejidos embebidos en parafina archivados,
muestras heparinated y l�quido amni�tico con meconio. Estos ensayos de baja
presupuestado (3 $ / reacci�n) podr�an completarse tras 3-4 horas despu�s de la
recepci�n de muestras que permite un tiempo razonable vuelco en el laboratorio.
Desde ARMS-PCR tetra-primer ensayo de PCR no requiere ning�n equipo especial, el
ensayo se podr�a establecer en la mayor�a de los laboratorios de diagn�stico
cl�nico.,51?52?

Detecci�n de mutaciones comunes en el gen G6PD

La deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (G6PD) es la enzimopat�a humano m�s com�n.
Hasta la fecha, m�s de 122 mutaciones en el gen de la G6PD se han descubierto,
entre los cuales 12 mutaciones puntuales se encuentran en los chinos. Las 2
mutaciones m�s comunes, G1388A y G1376T, representan m�s del 50% de las mutaciones
que representan diversas regiones y grupos �tnicos en China. Configuraci�n de un
m�todo simple y preciso para detectar estas mutaciones no s�lo es �til para el
estudio de la frecuencia de los genotipos de G6PD, sino tambi�n para la b�squeda de
nuevas mutaciones. El prop�sito de este estudio fue encontrar un m�todo simple,
barato y exacto para detectar estas mutaciones comunes. El m�todo de amplificaci�n
de sistema de mutaci�n refractaria (ARMS) se utiliz� en este estudio. Se
investigaron muestras de machos 28 con deficiencia de G6PD. El m�todo de
amplificaci�n y la digesti�n con enzimas de restricci�n natural y no coincidente se
utiliza como un m�todo est�ndar para evaluar la naturaleza de las mutaciones
puntuales. Se encontraron diecis�is casos que llevan la mutaci�n G1388A y 12 de la
mutaci�n G1376T. Catorce casos de G1388A y 10 casos de G1376T fueron confirmados
por las armas. Cuatro casos no estaban en concordancia con los resultados obtenidos
por la digesti�n con enzimas de amplificaci�n restricci�n no coinciden. Estos 4
casos fueron luego juzgados por secuenciaci�n directa por PCR en el ex�n 12. Los
datos de secuenciaci�n de ADN apoyaron los resultados obtenidos por las armas. De
esta manera llegamos a la conclusi�n de que las armas es un m�todo r�pido,
sencillo, econ�mico y preciso para la detecci�n de las mutaciones del gen G6PD m�s
comunes entre los chinos.53?

Detecci�n de mutaciones en MUTYH

Se describe un T-ARMS-PCR para la detecci�n de mutaciones MUTYH, que se asocian con
adenomas colorrectales y c�ncer colorrectal. Mediante el dise�o de cebadores para
la T-ARMS-PCR espec�ficos para los ensayos de mutaciones (6 Y165C, G382D,
1395_7delGGA, Y90X, 1103delC, y R231H) seleccionados sobre la base de la frecuencia
de su aparici�n. Tambi�n hemos dise�ado un conjunto de 3 ensayos multiplex de T-
ARMS-PCR, cada uno para la detecci�n de 2 mutaciones . Se han probado muestras de
ADN de pacientes con poliposis adenomatosa coli atenuado o cl�sico y no hay
mutaciones en la l�nea germinal APC detectables. Todas las mutaciones se han
detectado f�cilmente tanto con los ensayos de T-ARMS-PCR m�ltiples y espec�ficos.
Los resultados se confirmaron por an�lisis de ADN HPLC en los 54 pacientes, y cada
mutaci�n se confirm� mediante secuenciaci�n directa del ADN. La T-ARMS-PCR no
requiere ning�n equipo especial, y proporciona una detecci�n r�pida, reproducible y
rentable de mutaciones MUTYH comunes. Multiplex T-ARMS-PCR permite la detecci�n de
mutaciones 6 MUTYH com�n con el uso de tan s�lo 3 tubos reacciones de PCR. Podr�a
ser �til para llevar a cabo grandes estudios epidemiol�gicos poblacionales.

En contraste, T-ARMS-PCR amplifica tanto de tipo salvaje y los alelos mutantes,

junto con un fragmento de control, en una reacci�n de PCR en un solo tubo. La
regi�n flanqueante de la mutaci�n es amplificado por 2 cebadores comunes
(exteriores), produciendo un amplic�n de control no alelo-espec�fica. Dos alelo-
espec�fica (interior) se dise�an cebadores en orientaci�n opuesta y, en combinaci�n
con los cebadores comunes, puede amplificar simult�neamente tanto la de tipo
salvaje y los amplicones mutantes. Los 2 amplicones espec�ficos de alelo tienen
longitudes diferentes y se pueden separar f�cilmente por electroforesis en gel
est�ndar, ya que la mutaci�n se encuentra de forma asim�trica con respecto a los
cebadores comunes (exteriores). Debido a que el amplic�n de control y al menos 1 de
los 2 amplicones espec�ficos de alelo son siempre presente, T-ARMS-PCR proporciona
un control interno con respecto a falsos negativos, as� como la falta de
amplificaci�n. Adem�s, la presencia de tipo salvaje y mutantes amplicones al�licas
permite la f�cil interpretaci�n de los resultados de PCR. Se dise�� un T-ARMS-PCR
para cada uno de los 6 mutaciones siguientes seleccionados sobre la base de su
frecuencia en la literatura y en una serie de pacientes: Y165C, G382D ,
1395_7delGGA, Y90X, 1103delC, y R231H. Seg�n los informes sobre el an�lisis de
mutaci�n sistem�tica de todo el gen, la detecci�n de estos 6 mutaciones
identificar�a al menos 85% de los pacientes con mutaciones MUTYH bial�licos. Para
llevar a cabo incluso genotipificaci�n r�pida, se hab�a dise�ado un conjunto de 3
T-ARMS-PCR m�ltiples para la detecci�n de estas mutaciones 6 MUTYH frecuentes:
mutaciones Y165C relativamente frecuente y G382D; las mutaciones 1103delC y
1395_7delGGA; y las mutaciones R231H y Y90X.20?

Diagn�stico molecular
Una funci�n principal de los diagn�sticos moleculares es la detecci�n de mutaciones
y polimorfismos de nucle�tido �nico (SNPs) que se asocian con fenotipos
particulares. Una variedad de estrategias se han desarrollado utilizando cebadores
que son complementarios y permitir la amplificaci�n espec�fica de alelos
individuales. PCR-ARMS y PCR-ASO han sido ampliamente utilizados en la
investigaci�n y el diagn�stico molecular desde su desarrollo inicial a finales de
1980. La atracci�n de estos m�todos radica en su simplicidad y la aplicabilidad al
an�lisis de pr�cticamente cualquier punto de mutaci�n conocido o SNP. Adem�s, estos
m�todos no requieren costos muy altos e instrumentaci�n sofisticada.4?

Sarampi�n
Wakukouomou y sus colegas publicaron su estudio en la revista Journal of Clinical
Microbiology (virus del sarampi�n Genotipado por el sistema de amplificaci�n
refractario a las mutaciones-PCR en tiempo real representa una aproximaci�n r�pida
para las investigaciones de brotes de sarampi�n J Clin Microbiol 2006; 44 (2):.
487-494).

"La PCR en tiempo real se ha desarrollado para determinar el genotipo del virus del
sarampi�n (MV) de cultivos. Cepas circulantes en epidemias en Gab�n en 1984, en
Camer�n en 2001, en Marruecos en 2003 y en Francia en 2004 fueron investigados"

D. Wakukouomou y sus colegas en el INSERM, U404 en Lyon,

"Desarrollamos un sistema de amplificaci�n refractario a las mutaciones-PCR en

tiempo real (RT-PCR AMRS) utilizando SYBR GREEN una fluor�foro verde.

"Seis pares de cebadores para la RT-PCR ARMS fueron dise�ados para amplificar
espec�ficamente los genotipos A, B2, B3.1, B3.2, C2, y D7. Genotipos podr�a
diferenciarse por fusi�n de an�lisis de la curva. Todas las cepas tambi�n se
confirmaron por secuenciaci�n directa ".

"La utilizaci�n del resultado obtenido por secuenciaci�n directa y el an�lisis

filogen�tico como la referencia, la exactitud de MV por RT-ARMS PCR y an�lisis de
la curva de fusi�n fue de 97%. Sin embargo, el �ltimo m�todo es m�s r�pido y
sensible que el primero."

"Este m�todo podr�a ser una herramienta �til para estudios epidemiol�gicos
moleculares de MV, proporcionando una alternativa eficiente para estudios a gran
escala." 54?55?

Ventajas
La PCR-ARMS es ideal para muchas aplicaciones de diagn�stico molecular,
particularmente aquellos que requieren la detecci�n de un n�mero relativamente
peque�o de mutaciones puntuales y tener rendimientos bajos a moderados. La
principal ventaja de la PCR-ARMS es la facilidad con que se pueden desarrollar
ensayos m�ltiples, validados e implementados. Por otra parte, las pruebas son no
radiactivas y no requieren sistemas de detecci�n caras y sofisticadas. Es r�pido,
fiable y no isot�pico. La multiplexaci�n en un solo tubo es posible con los
fluor�foros m�s recientes.,4? 6?

Desventajas
La limitaci�n m�s importante de PCR-ARMS es que puede ser utilizada para detectar
solamente mutaciones conocidas y polimorfismos. Como tal es necesario combinar ARMS
PCR con otras estrategias de diagn�stico molecular (por ejemplo, de secuenciaci�n)
para proporcionar una detecci�n completa de la mutaci�n. En sus formatos m�s
simples, tales como los descritos en este cap�tulo, PCR-ARMS puede ser poco
pr�ctica para aplicaciones que implican un gran n�mero de mutaciones o de alto
rendimiento. Para tales aplicaciones, considere el uso de ensayos de ARMS-PCR con
las estrategias de detecci�n de alelos que son m�s susceptibles a la
automatizaci�n. El formato original no distingu�a entre homocigotos y
heterocigotos, sin embargo, ahora con la tecnolog�a de indicadores fluorescentes s�
se puede distinguir entre los homocigotos y heterocigotos.,4? 6?
Kits comerciales
CF29v2, CF30, CF-polyT = ARMS m�ltiple (cuatro tubos, el n�mero de cebadores en una
�nica reacci�n); CF4v2 y CF-EU2 = ARMS fluorescentes m�ltiple (1 metro). Los dos
ejemplos son kits que comercializa Gen-Probe Life Sciences.6?

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