Guia 2019.microbiología General Farmacia 1 PDF

Guía de Prácticas – Microbiología General 2019-I
EP. Farmacia y Bioquímica
Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú. Decana de América
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
BÁSICA Y APLICADA
MICROBIOLOGÍA GENERAL
- GUÍA DE PRÁCTICAS -
ELABORADO POR:
 DRA. MARIA ELENA SALAZAR SALVATIERRA

 DR. VICTOR CRISPIN PEREZ
 DRA. MIRTHA ROQUE ALCARRAZ
 MG. JULIO REYNALDO RUIZ QUIROZ
 MSc. NELSON BAUTISTA CRUZ
 Q.F. ROBERT ALMONACID ROMÁN
2019
Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 1

INDICE
4 PRESENTACIÓN
6 NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
8 PRACTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

 Reconocimiento de equipos, aparatos y materiales de laboratorio, horno, autoclave, estufa
de incubación.
 Preparación de medios de cultivo.
 Proceso de esterilización por calor seco y calor húmedo.
13 PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

 Siembra en medio líquido, sólido y semisólido.
 Lectura de colonias, estudio de crecimiento microbiano.
 Caracterización de las colonias de los microorganismos.
18 PRÁCTICA III: TINCIONES MICROBIANAS

 Preparación del frotis bacteriano.
 Coloración por tinción simple y tinción diferencial Gram.
 Coloración de bacterias ácido resistentes.
 Tinción de estructuras microbianas: cápsula, pared celular y esporas.
25 PRÁCTICA IV: RECUENTO MICROBIANO

 Preparación de las muestras. Diluciones.
 Métodos de siembra para recuento.
28 PRÁCTICA V: GENÉTICA MICROBIANA

 Obtención de mutantes resistentes a antibióticos.
 Obtención de mutantes resistentes a la luz ultravioleta.
32 ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS

 Enfrentar microorganismos a la acción de desinfectantes
 Enfrentar microorganismos a la acción de antisépticos.
37 PRÁCTICA VI: NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

 Requerimientos nutricionales mínimos para el crecimiento microbiano (nutrientes, pH,
temperatura, y demanda de oxigeno.
42 PRÁCTICA VII: METABOLISMO MICROBIANO

 Metabolismo de carbohidratos (oxidación y fermentación) en bacterias y levaduras.
 Metabolismo de proteínas: Hidrólisis de caseína y Gelatina.
 Metabolismo de lípidos: Hidrólisis de lecitina.
ENZIMAS MICROBIANAS
 Catalasa, ureasa,
48 PRÁCTICA VIII: BACILOS GRAM NEGATIVOS 1

Enterobacterias patógenas
Cultivo e identificación bioquímica de:
 Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Yersinia.
52 PRÁCTICA IX: BACILOS GRAM NEGATIVOS 2

Enterobacterias oportunistas
 Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia

55 PRÁCTICA X: BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

 Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter, Aeromonas y
Vibrio cholerae
58 PRÁCTICA XI: BACILOS GRAM POSITIVOS

Bacilos Gram positivos no esporulados aerobios
Cultivo e identificación bioquímica de :
 Lactobacillus,
 Corynebacterium
Bacilos Gram. Positivos esporulados: aerobios
Cultivo e identificación bioquímica
 Bacillus subtilis
 Bacillus cereus
61 PRÁCTICA XII: ANAEROBIOS ESTRICTOS

 Clostridium perfringens
 Clostridium sporogenes
65 PRÁCTICA XIII: COCOS GRAM POSITIVOS

Cultivo e identificación bioquímica de :
 Staphylococcus aureus
 Staphylococcus epidermidis
 Streptococcus pyogenes
 Streptococcus viridans
 Streptococcus pneumoniae
70 PRÁCTICA XIV: MICOLOGÍA

 Cultivo de mohos y levaduras. Ambientales.
 Cultivo de dermatofitos
74 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75 ANEXO: BIOSEGURIDAD

PRESENTACIÓN
La Microbiología, es una ciencia relativamente nueva con respecto a otras ramas de la
Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie Van
Leewenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis
Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos
como actores de una gran diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de

enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad
algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de
alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se
ha reconocido su importancia en diversas áreas de investigación básica, en la industria
alimentaria, ambiental y farmacéutica.
El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se

inicie en el conocimiento de la Biología básica de los microorganismos, en sus
características morfológicas, fisiología, metabolismo, condiciones de crecimiento,
ecología, control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación en el
laboratorio.
Esta guía está dirigida a estudiantes que iniciarán sus experiencia en el manejo de los
microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio de la
misma una serie de recomendaciones necesarias con las reglas generales del laboratorio
y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule
en forma adecuada a los microorganismos y garantizar su seguridad como la de sus
compañeros.
Esta guía contiene 14 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice

gradualmente con los procedimientos de cultivo, observación e identificación de
bacterias y hongos. El orden de presentación corresponde al curso de Microbiología
General, semestre 2019 – I, de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.

En cada práctica se presenta una introducción teórica para facilitar la comprensión del
tema, seguida de los objetivos, materiales necesarios y procedimientos en forma de
instrucciones que se complementan con algunas figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados.

Esperamos queridos estudiantes que ésta Guía les sirva no sólo durante el desarrollo de
la asignatura sino también sea de importante ayuda en su vida profesional si el caso lo
requiere.
Los Autores

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
INSTRUCCIONES GENERALES
El alumno deberá presentarse a las clases prácticas:
 Puntualmente.
 Con mandil blanco y limpio
 Con malla y mascarilla si así lo requiere la práctica
 Si desea usar guantes, deberá luego descartarlos apropiadamente o de lo contrario deberán lavarse
cuando aún están en las manos y luego desinfectarlos antes del re-uso.
INSTRUCCIONES ESPECÍFICAS PARA EL TRABAJO EN EL

LABORATORIO
 No ingresar al laboratorio con: mochilas, portafolios, carteras, etc.
 Está prohibido recibir visitas así como salir del laboratorio una vez iniciada la práctica.
 Evitar abrir las ventanas y los movimientos innecesarios que favorezcan que el aire disperse
partículas y promueva la contaminación del ambiente.
 No participar directamente en los trabajos si se está resfriado o si se tiene heridas en las manos.
 Lavarse las manos antes y después de cada sesión de trabajo.
 Evitar el contacto de las manos y lapiceros con la boca, nariz y ojos.
 El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las prácticas.
 Comunicar inmediatamente al responsable cualquier incidente en el laboratorio por pequeño que sea.
 Conservar su mesa de trabajo limpia y ordenada todo el tiempo.
NORMAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO

 Cada alumno debe llevar a todas las prácticas: guía de prácticas, marcador de vidrio, encendedor y
lapicero. Cuando use el microscopio traer además papel lente y portaobjetos.
 Cada subgrupo constatará si el material de prácticas está conforme, caso contrario se solicitará lo
faltante.
 Si un alumno rompe algún material de vidrio, deberá reponerlo a la brevedad posible.
 Limpiar la superficie de la mesa de trabajo con una solución desinfectante al principio y al final de
cada sesión de laboratorio.
 Rotular las muestras y material empleado con el código que se le asigne a la mesa de trabajo.
 Manipular las muestras con instrumentos estériles, nunca directamente con las manos.
 Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando
el posible contacto con cabello y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el
experimento y al abandonar el laboratorio.
 Las operaciones de manipulación de muestra (siembra, repicado, diluciones, etc.), se realizarán
siempre en condiciones que eviten contaminación, es decir, cerca del mechero.
 Las placas serán entreabiertas o abiertas por un tiempo mínimo cerca de la llama del mechero.

 Colocar las pipetas y portaobjetos usados en un recipiente con desinfectante. destinado para tal fin.
 El material ya utilizado se debe colocar en recipientes especiales rotulados para evitar confusión.
 Si se derrama o quiebra un recipiente con material contaminado no tocar nada y avisarle al
responsable del laboratorio.
 Está prohibido pipetear con la boca, aún así sea agua.
 Cada estudiante antes de abandonar el aula de prácticas está obligado a despejar su mesa de trabajo
de todo material usado y sucio y lavarse las manos. Asegurarse de que todas las llaves de agua y de
gas así como los aparatos eléctricos estén apagados y/o desconectados.
 Antes de guardar el microscopio, en las prácticas que requieran su uso, asegurarse que los lentes estén
limpios de aceite de inmersión.
MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

Reportar todo incidente al profesor.
Derrame de material biológico sobre el cuerpo
 Remover la ropa inmediatamente.
 Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto.
 Buscar atención médica si es necesario.
 La ropa contaminada debe ser colocada en una solución desinfectante antes de ser lavada.
Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos
 Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado con abundante agua
durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado,
comenzando por los párpados.
 Buscar atención médica inmediatamente.
Cortes menores y heridas por pinchazo
 Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos.
 Buscar atención médica inmediatamente.
En el caso de derrames
 Vaciar el desinfectante sobre el papel toalla y dejar que esté en contacto con la muestra por lo menos
15 minutos.
 La persona que realice la operación debe llevar puesto guantes. Para limpiar la porción del derrame,
los trozos de vidrio rotos y/o cultivo también deben cubrirse con toallas de papel impregnadas en
solución desinfectante. Al cabo de diez minutos debe limpiarse empleando nuevas toallas de papel y
desinfectante.
 El material contaminado debe ser colocado en un recipiente para material contaminado o bolsa de
desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados.
ES PRECISO SER RESPONSABLE, ORDENADO Y RÁPIDO PARA LA

EJECUCIÓN DE LAS OPERACIONES ANALÍTICAS

PRÁCTICA: I
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

 Reconocimiento de equipos, aparatos y materiales de laboratorio, horno,
autoclave, estufa de incubación.
 Preparación de medios de cultivo.
 Proceso de esterilización por calor seco y calor húmedo.
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS, APARATOS Y MATERIALES DE

LABORATORIO
Autoclave: Aparato en el que se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullición del agua
por medio de un aumento de presión, funciona a 1,18 kg/cm2 por encima de la presión atmosférica. Al
mantener una temperatura de 121ºC por 15 minutos, se logra la destrucción de toda forma de vida, es
decir se logra la esterilización mediante el vapor de agua.
Fundamento: coagulación de proteínas estructurales y enzimas bacterianas cesando así su función
biológica.
Horno: Es utilizado en operaciones que requieren calor muy intenso, como la desecación y esterilización
de materiales mediante el calor seco, se realiza a una temperatura no menor de 170ºC por dos horas. Se
pueden esterilizar placas Petri; recipientes vacíos de vidrio, porcelana y metal, los recipientes salen secos
a diferencia de la autoclave. Fundamento: Oxidación de proteínas.
Estufa de Incubación: Es utilizada para lograr el crecimiento de los microorganismos en un tiempo más
corto, gracias a que la temperatura es de 37 ºC (temperatura óptima de crecimiento de bacterias).
También se tiene estufas a 42 ºC, 28 ºC, etc.; dependiendo de la temperatura óptima del microorganismo
que estemos utilizando.
Asa de Siembra: Un asa de siembra o asa bacteriológica es un instrumento de laboratorio tipo pinza que
consta de una base de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o
platino que termina en aro o en punta. Se emplea para arrastrar o transportar microorganismos de un
medio a otro para su adecuado desarrollo, así como para la realización del frotis bacteriano.
Placas Petri: La placa de Petri, es un recipiente circular de vidrio o de plástico, de diferentes tamaños (de
acuerdo a su uso). En microbiología, esta placa se utiliza principalmente para incorporar la muestra y/o
cepa objeto de estudio en algún medio de cultivo sólido apropiado. Después de la incubación se observará
si existe crecimiento buscando la presencia de “colonias” aisladas.
Autoclave Placas Petri

Asa de siembra

ESTERILIZACIÓN
Proceso por el cual se elimina todo agente microbiano en su forma vegetativa o esporulada.
La esterilización se puede conseguir por agentes físicos, químicos o mecánicos.
Agente Sistema de Esterilización Método

Calor húmedo Autoclave
Calor seco Incineración y flameado
Estufa Pasteur
FISICO Horno Poupinell
Radiaciones Ionizantes (rayos γ, x)
No ionizantes (rayos UV, IR)
Frío Congelación
Gases Oxido de etileno (OE)
Formaldehído
QUÍMICO
Alternativos del OE
Líquidos Glutaraldehído, etc.
Ondas Sónicas
MECÁNICO
Supersónicas
ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DE MATERIAL CONTAMINADO

En Microbiología es necesaria una limpieza muy detallada del material. Asimismo es importante la
recuperación del material reciclable y la eliminación del material desechable.
Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados. Debido a que los
objetos contaminados tienen una cantidad importante de materia orgánica, se recomienda usar mayores
concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento que para la desinfección o
esterilización de material limpio.
Generalmente para la eliminación y limpieza de material contaminado se usa la autoclave a 121ºC por 30
minutos. Una vez efectuado el tratamiento, se procede a su lavado, sumergiendo el material en agua
caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crómica u otros.
PROCESO DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Y CALOR

HÚMEDO
La susceptibilidad de los microorganismos al tratamiento térmico está en función de la especie, su estado
vegetativo o esporulado, temperatura-tiempo, naturaleza del medio, duración del tratamiento así como
naturaleza y número de microorganismos. El calor seco oxida a las proteínas y otras moléculas mientras
que el calor húmedo produce la coagulación de proteínas.
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

El material que va esterilizarse debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez
esterilizado.
En el caso de materiales de vidrio (tubos, matraces, etc.) se tapan con algodón, con tapones metálicos o
de plástico especial. Además cuando se usa algodón, ha de cubrirse éste con papel kraft.
En el caso de las pipetas, se le coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro. Una
vez preparado el material se introduce en estuches o cajas metálicas o se envuelven individualmente con
papel kraft.
Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces, frascos o tubos y se esterilizan,
generalmente, en autoclave.
Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización. La elección de un método
determinado viene condicionada por el tipo de material que se quiere esterilizar.

OBJETIVO
Conocer la importancia de la esterilización y familiarizarse con el manejo de los procedimientos más
frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.
EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

Horno
Autoclave
Materiales a tratar (Placas Petri, pipetas, tubos, viales,
☺Sabías que…
El calor húmedo elimina los microorganismos a
matraces) temperaturas menores, ya que la presencia de agua
Papel Kraft acelera la rotura de los puentes de hidrógeno
Algodón responsables de la estructura terciaria de las proteínas,
haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto
su funcionalidad.
PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento del material para esterilizar
Acondicionar el material para la esterilización, en el caso de pipetas, viales y matraces, hacer sus
respectivos tapones de algodón y luego proceder a envolverlas con papel Kraft.
En el caso de las Placas Petri, agruparlas en grupos de 2 o 4, de manera invertida y luego envolverlas con
papel kraft.
Esterilización por calor seco
Colocar en el horno el material debidamente acondicionado (pipetas, matraces, tubos y placas Petri) y
encender el horno. Se utiliza para este proceso una temperatura de 160 ºC – 180 ºC por 2 horas.
Esterilización por calor húmedo
Colocar el material debidamente acondicionado, por ejemplo tubos con medio de cultivo, en la autoclave.
Proceder a realizar el autoclavado, teniendo en cuenta los parámetros de esterilización para material
limpio que son:
 Presión: 15 lb/pulg2
 Tiempo: 15 minutos
 Temperatura: 121 ºC
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Realice el dibujo de la manera de envolver pipetas de vidrio.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son soluciones acuosas de sustancias nutritivas orgánicas e inorgánicas y de
principios activos, que en condiciones adecuadas de temperatura, humedad, tensión de oxígeno, CO 2, pH,
potencial redox, favorecen el crecimiento de microorganismos para el estudio de sus propiedades
morfológicas y bioquímicas. Los medios de cultivo pueden contener sustratos nutritivos como fuente de
carbono, nitrógeno, y energía, factores de crecimiento, agente gelificante (agar), sustancias inhibidoras e
indicadores de pH.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias
necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios
desarrollados hasta ahora.
Todos los medios de cultivo deben cumplir los siguientes requisitos:
 Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se
siembra.
 Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayoría
de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua o la esterilización.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
A) Por su estado físico:

1.-Medios líquidos o caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios
para el crecimiento de los microorganismos.
2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente solidificante, como
el agar-agar. Éste es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de origen marino cuyas
propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos. Tiene la ventaja que no
es degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos microorganismos de
ambientes marinos), funde aproximadamente a 100ºC y permanece en estado líquido mientras la
temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC.
Generalmente el agar se añade, para solidificar un medio líquido, en una concentración de 15 g/L. Los
medios con agar se utilizan en tubos o en placas de Petri.
3.-Medios semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente solidificante
es menor, generalmente del 2,5 g/L con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia
gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos.
B) Por su composición:
1.-Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de
microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las
concentraciones exactas de cada uno de ellos. Por ejemplo medios que tienen extracto de carne o
levadura.
2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos químicos
puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio definido que permita el
desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. coli, debería contener sales
inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl.
C) Por su utilización:
1.- Medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con
distintos requerimientos nutricionales.
2.- Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un agente
selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc.
3.- Medios diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir
de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen
de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, el Agar
Sangre es un medio nutritivo enriquecido y es a la vez un medio diferencial, ya que permite reconocer
aquellos microorganismos capaces de producir hemólisis.

OBJETIVO
Conocer y aprender la preparación de los diferentes medios de cultivo.
EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

 Agar nutritivo  Frascos de vidrio
 Agar-agar  Infusión cerebro corazón.
 Caldo nutritivo  Papel Kraft
 Agua destilada  Placas petri
 Algodón  Tubos de ensayo
 Autoclave  HCl 0,1N
 Cocinilla  NaCl 0,1N
PROCEDIMIENTO
Medio sólido:
La preparación de un medio sólido se puede hacer de dos maneras: Preparar el caldo y añadir agar-agar al
15 g/L o bien utilizar un medio de cultivo sólido comercial.
Una vez pesado el medio de cultivo deshidratado para un volumen determinado de agua, se reconstituye
con agua destilada, dejamos hidratar el polvo y agitamos hasta disolver los componentes, calentando la
mezcla hasta ebullición. No olvidar regular el pH, de acuerdo a lo indicado en la fórmula o en el frasco de
medio de cultivo. El medio preparado se distribuye en tubos de vidrio o en frascos, luego se taponan estos
y se cubren con papel Kraft para llevar a esterilizar. La esterilización de los medios de cultivo se realiza
en autoclave a 121ºC, 15 libras de presión/pulg2 por 15 minutos.
Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser
inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición adopte la
forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra.
Si se desea preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz
o frasco y, una vez atemperado (45 – 50 °C), se verterá en placas vacías estériles en un ambiente aséptico,
como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar.
Medio semisólido:
Pesar el medio Infusión Cerebro-Corazón (BHI) y agar-agar a la concentración de 2,5 g/L, en cantidad
suficiente para el volumen deseado. Adicionar agua destilada, mezclar y calentar hasta disolver (a 100
ºC), medir el pH y repartir en tubos, acondicionar y autoclavar. Opcionalmente se puede usar el medio
MIO (Movilidad Indol Ornitina)
Caldo:
Pesar la cantidad suficiente del medio Caldo Tripticasa de Soya (TSB) para el volumen deseado,
adicionar agua destilada y disolver completamente, verificar el pH, repartir en tubos y autoclavar.
Para balancear el pH, se utiliza NaOH 0,1 N ó HCl 0,1 N.
☺Sabías que…
Si se han de incorporar al medio compuestos
termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se
esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio
de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una
vez que este se haya atemperado. En todos los casos se
han de seguir las instrucciones del fabricante.

PRÁCTICA: II
TÉCNICAS DE CULTIVO
 Siembra en medio líquido, sólido y semisólido.
 Lectura de colonias, estudio de crecimiento microbiano.
 Caracterización de las colonias de los microorganismos.
La siembra de microorganismos consiste en poner en contacto los microorganismos (en cantidades muy
pequeñas) o la muestra conteniendo los microorganismos problemas, con un medio de cultivo estéril
fresco, para que en las condiciones de laboratorio (temperatura, humedad, etc.) se desarrollen y se
multipliquen “in-vitro” y se pueda aislar el microorganismo en cultivo puro para su estudio e
identificación; o cuando se tratan de microorganismos aislados, ponerlos en contacto con medio de
cultivo “fresco” y estéril para su conservación (“repicar un cultivo”).
Condiciones para la siembra de los microorganismos:

Considerar que sólo una persona procede a la siembra, por lo tanto, debe:
a) Identificar los microorganismos y muestras a sembrar.
b) Rotular los materiales con lápiz marcador de vidrio o plumón de tinta indeleble (nombre, tipo de
muestra, fecha, especie, etc.)
c) Mantener una asepsia rigurosa y estricta. Para ello:
 Sembrar cerca a la llama del mechero Bunsen, evitar las corrientes de aire.
 Esterilizar el asa de siembra en llama directa, enfriar cerca del mechero.
Esterilización del Asa Bacteriológica:
- Prender el mechero
- Tomar el asa bacteriológica por el mango y colocarla en posición vertical, sobre la llama del
mechero, hasta que el alambre quede al rojo vivo.
- Dejar enfriar al costado del mechero, antes de tomar las colonias.
Manejo del asa de siembra durante una inoculación

☺Sabías que…
Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un mango que permite
manipularlas. El alambre puede ser de diferente material, (fierro níquel, nicromo,
platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,) depende de la necesidad.
Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo
1. Siembra en Medio Líquido o Caldo (Fig. 1)

- Obtener la muestra con asa bacteriológica en aro.
- Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotación.
2. Siembra en Medio Sólido Inclinado (pico de flauta, Fig. 2)
- Obtener la muestra con asa en aro.
- Hacer estrías en la superficie del medio
3. Siembra en Medio semisólido (Fig. 3)
- Obtener la muestra con asa recta
- Introducir en el medio semisólido, a una profundidad aproximada de 2/3 del medio.
- Tener la precaución de retirar el asa recta, por el mismo sitio donde se introdujo.
Fig. 2: Siembra en agar inclinado
Fig. 1: Siembra en medio líquido Fig. 3: Siembra

en medio
semisólido

Sembrado en placas de agar
Para la siembra por “agotamiento” (en Medio sólido en placa de Petri), se comprueba previamente la
esterilidad del medio de cultivo, y la ausencia de pequeñas gotas de agua sobre la superficie del medio, si
lo hubiera, eliminar esas gotas de agua (“desecar”) colocando las placas en la estufa durante 20 ó 30
minutos (la base sobre la tapa, ambas en posición invertida). Sembrar las placas “agotando” el contenido
del asa mediante estrías sobre la superficie del medio.
Para la siembra por aislamiento seguir los pasos del gráfico.
Siembra por Siembra por aislamiento

“agotamiento”
Después de la siembra incubar los medios de cultivo en la estufa a la temperatura de 37 ºC para las
bacterias durante 18 – 24 horas y a 25 – 28 ºC para los hongos y levaduras durante 48 horas o más.
LECTURA DE COLONIAS, ESTUDIO DE CRECIMIENTO MICROBIANO

En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto se examinará la existencia de
enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición
de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención
de una población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados
posteriormente.
En medio sólido (agar inclinado) se observará el aspecto general del medio y la aparición de crecimiento
sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios
facultativos. Además, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a temperaturas
de 4ºC.
En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se

observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose
turbidez. Por eso es tan importante que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se distorsione el agar y
se vuelva a sacar el asa de siembra por el mismo sitio de inoculación. Los microorganismos inmóviles
crecerán únicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra en picadura sirve también, como otro
método de conservación de microorganismos anaerobios facultativos.
CARACTERIZACIÓN DE LAS COLONIAS DE LOS

MICROORGANISMOS
En el medio líquido (sin agitar) observar si hay:

a) Presencia de una “película” superficial que por la agitación suave caen al fondo del tubo o
permanecer en la superficie.
b) Presencia de un crecimiento superficial impregnado al tubo tomando el aspecto de un anillo
superficial.
c) Crecimiento con un sedimento en el fondo del tubo y que puede ser fino, grumoso o mucoso, al
agitar el tubo puede suspenderse con facilidad o permanecer sin cambios.
En el medio sólido, si es necesario con ayuda de una lupa, observar en la placa de Petri, las características
de las “colonias” aisladas:
Tamaño: Pequeña, regular, grande

Forma: Circular, irregular, elíptica, puntiforme, filamentosa.
Elevación: Plana, elevada, convexa, pulvinada o monticular, umbeliforme, umbilicada
Borde: Entero, ondulado, lobulado, crenado o dentado, filamentoso, rizado.
Superficie: Lisa, rugosa, granular.
Consistencia: Cremosa, membranosa, mucosa.
Densidad: Opaca, transparente, translucida
Cromogénesis: Pigmento verde, amarillo, rojo, blanquecino. Pigmento difusible o confinado a la colonia.
Medio de cultivo: Observar posibles cambios del medio de cultivo alrededor de la colonia.
OBJETIVO
Emplear las diferentes técnicas de cultivo de microorganismos, para favorecer su crecimiento.
MATERIALES
 Asa de siembra
 Mechero de Bunsen
 Tubos de 13 x 100
 Placa Petri.
 Solución salina fisiológica (SSF)
MEDIOS
 Caldo tripticasa de soya (TSB)
 Agar tripticasa de soya (TSA)
 Medio semisólido
CEPAS
 Pseudomonas aeruginosa
 Escherichia coli
 Bacillus cereus

PROCEDIMIENTO
 Siembra en medio liquido
 Siembra en medio semisólido
 Siembra en medio sólido
Nombre de cepa Mesa 1:

Medio Descripción del crecimiento bacteriano
TSB
Semisólido
TSA

TSB
Semisólido
TSA

TSB
Semisólido
TSA

TSB
Semisólido
TSA

PRÁCTICA: III
TINCIONES MICROBIANAS
 Preparación del frotis bacteriano.
 Coloración por tinción simple y tinción diferencial Gram.
 Coloración de bacterias ácido resistentes.
 Tinción de estructuras microbianas: cápsula, pared celular y esporas.
La mayoría de las bacterias son transparentes, por lo que resulta difícil su observación con el microscopio
óptico. El uso de colorantes nos permite aumentar artificialmente el contraste entre las células bacterianas
y el medio circundante.
Los colorantes nos permiten observar la morfología de los microorganismos, permitiendo distinguir los
diferentes tipos de célula, además de revelar la presencia de ciertas estructuras celulares como flagelos,
cápsulas, esporas, pared celular e inclusiones.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los
materiales celulares. Los colorantes pueden dividirse en tres grupos:
 Ácidos o aniónicos: Colorantes de moléculas cargadas negativamente y por lo tanto se combina con
estructuras celulares cargadas positivamente, como las proteínas. Estos colorantes no tiñen a la célula
y se usan sobre todo para teñir el fondo de la lámina o para contraste. Dentro de estos colorantes
tenemos a la eosina, fucsina ácida, rojo congo, ácido pícrico y verde malaquita
 Básicos o catiónicos: Son moléculas cargadas positivamente y se combinan con intensidad con los
constituyentes cargados negativamente, como los ácidos nucleicos, polisacáridos ácidos. Dentro de
estas sustancias tenemos al azul de metileno, safranina, fucsina básica, violeta de metilo, rojo neutro
y tionina.
 Neutros: Como Giemsa, Wright y Leishman
☺Sabias que ….
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un
colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; él cual se combina con un constituyente celular y lo altera
de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Un mordiente habitual es el ácido tánìco.
Las tinciones simples son las que usan un solo colorante. Mientras que las tinciones diferenciales son
capaces de diferenciar estructuras o incluso microorganismos que poseen características distintas. En este
tipo de tinciones se requieren el empleo de más de un colorante. Las tinciones estructurales sirven para
identificar determinadas estructuras que pueden estar presentes en ciertos microorganismos. Con esta
técnica se evidencian cápsulas, endosporas, flagelos y pared celular.
1. PREPARACION DEL FROTIS BACTERIANO
Es un paso que precede a la técnica de tinción. Se realiza a

partir de muestras (clínica, alimento, etc.) o de un cultivo.
El frotis bacteriano asegura una adecuada separación entre
las células y facilita que la tinción posterior se distribuya de
manera homogénea.
Con la ayuda de un asa de siembra, previamente llevada a

flama, se coloca en el portaobjeto una gota de solución
salina fisiológica (SSF). Luego son 3 los pasos a seguir:
a) Extensión: con el asa de siembra la muestra se suspende
en la SSF, luego se procede a extender la muestra con el
asa.
b) Secado: se deja secar la lámina a temperatura ambiente o
cerca del mechero.

c) Fijación: La lámina se pasa 3 veces por la llama del mechero de forma rápida. Este paso tiene
como finalidad evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración y lavado así como
también preservar la forma original de los microorganismos.
En algunos casos en los cuales se necesitan procedimientos suaves en la fijación, en lugar de usar el
calor, se emplean agentes fijadores como el etanol, metanol, etc.
2. COLORACIÓN POR TINCIÓN SIMPLE
En este tipo de coloración se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
tiñen con la misma tonalidad. Nos permite observar la morfología y tamaño de la célula bacteriana y
el tipo de agrupamiento.
Entre los colorantes usados están: fucsina básica, azul de metileno, safranina y cristal violeta, todas
en soluciones acuosas.
3. COLORACIÓN POR TINCIÓN DIFERENCIAL GRAM
Esta coloración permite diferenciar los microorganismos Gram (+) y Gram (-). Consiste que el
preparado fijado por calor se trate en primer lugar con el cristal violeta, luego se agrega la solución
de lugol como solución mordiente, se decolora con alcohol-acetona y finalmente se agrega un
colorante de contraste que puede ser fucsina o safranina.
Fundamento
La técnica se fundamenta en el uso de un primer

colorante, que debe ser de naturaleza básica y por lo
tanto posea afinidad por las estructuras cargadas
negativamente como la pared celular de las bacterias, el
más usado es el cristal de violeta. Una solución
mordiente que se combina con el primer colorante
formando un complejo, el cual no altera la coloración
que adquirieron las bacterias. Los mordientes mas
empleados son las sales metálicas, ácidos o bases. Un
agente decolorante, él cual es un disolvente orgánico o
una mezcla de solventes, el cual no tiene la capacidad
de disolver el complejo formado entre el primer
colorante y la solución mordiente. Por último el uso de
un colorante de contraste, de carácter básico, de distinto color que el primer colorante, y solo teñirá
a las bacterias que han perdido el primer colorante debido al agente decolorante
☺Sabias que…
El paso crítico de esta técnica es la decoloración, ya que si se prolonga demasiado
resultarán decoloradas las bacterias incluso las Gram (+).
Además que las bacterias Gram (+) en fase estacionaria pueden aparecer como Gram (-)
debido a procesos de degradación y autólisis de su capa de peptidoglicano.

4. COLORACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO – ALCOHOL RESISTENTES
La mayoría de las células procariotas del dominio Bacteria se pueden clasificar en función del
resultado de la tinción Gram, como Gram(+) o Gram(-). Pero determinadas bacterias como las
Corineformes, Nocardia y en especial Mycobacterium, presentan una pared celular muy compleja,
con abundancia de lípidos. Estas bacterias no se tiñen con los colorantes normales, pero una vez que
se han teñido con fucsina (forzando mediante calentamiento de la preparación), tienen resistencia a
decolorarse por una mezcla de ácido clorhídrico al 3% en etanol de 96º. Por ello se denominan
bacterias ácido – alcohol resistentes.
Fundamento
La ácido-alcohol resistencia se correlaciona con el alto contenido en lípidos de la pared celular y con
la presencia de un tipo específico de ácidos grasos llamados ácidos micólicos. Los cuales confieren a
la célula una alta hidrofobicidad y la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después
de la tinción con colorantes básicos.
Para poner de manifiesto la acido-alcohol resistencia, la tinción de Ziehl Neelsen requiere el empleo
sucesivo de 3 soluciones:
1. Mezcla de fucsina-fenol (carbofucsina),

que cuando se aplica en caliente es capaz de
teñir todo tipo de células bacterianas. El
fenol cumple la función de facilitar la
penetración de la fucsina en la pared celular.
2. El agente decolorante, él cual consiste en
una solución de HCl 0.36 N en etanol. Que
posee un elevado poder decolorante pero es
insuficiente para arrastrar la fucsina
asociada a la pared celular de
Mycobacterium.
3. Colorante de contraste. El azul de
metileno
Tras el tratamiento con fucsina y fenol las bacterias se tiñen de rosa-rojo. Pero al agregar el
decolorante, las bacterias ácido-alcohol resistentes no cambian de color mientras que el resto de
bacterias se decoloran y podrán tomar posteriormente el colorante de contraste. En consecuencia las
células de Mycobacterium quedarán teñidas y las bacterias ácido alcohol sensibles aparecerán de
color azul.
Procedimiento
 El frotis se tiñe con Carbofucsina fecnicada aplicando calor suave hasta emitir vapores (evitando
que el frotis se seque por la evaporación del colorante) y luego lavar el exceso de colorante con
agua.
 Decolorar con la solución acido - alcohol y lavar con agua.
 Teñir durante 30-60 segundos con Azul de Metileno (otra alternativa es el verde de malaquita),
lavar y proceder a secar
 Proceder a observar con el microscopio óptico con el objetivo de inmersión.
5. TINCIÓN DE ESTRUCTURAS MICROBIANAS:
 CÁPSULA
Algunas especies bacterianas patógenas (Streptococcus, Bacillus anthracis, Klebsiella pneumoniae,

etc.) y de uso industrial, además de hongos y levaduras patógenas (Cryptococcus neomorfans, etc),
están rodeadas de una capa generalmente gruesa denominada cápsula, la cual esta constituida por
exopolímeros casi siempre de naturaleza polisacárida que la propia bacteria excreta a través de su
pared celular.

TINCIONES NEGATIVAS:
Los colorantes que se emplean en tinciones negativas se
caracterizan porque no son capaces de fijarse ni penetrar en las
células.
Las cápsulas por sus características químicas no se tiñen por lo
general con colorantes básicos como el cristal violeta. Sin
embargo, se pueden observar indirectamente mediante la tinción
negativa con la tinta china, nigrosina o eosina
Los polisacáridos capsulares rechazan el colorante entonces las
células se observaran sin teñir sobre un fondo de color oscuro
mientras que la cápsula aparece como un halo claro alrededor de
los microorganismos.
☺Sabias que…
a. La exposición previa a los anticuerpos específicos (reacción de Quellung) aumenta la refractividad e impide su retracción
lo cual favorece la tinción
b. El tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real por lo tanto no se debe utilizar para la
medición de microorganismos
c. Para distinguir bien la cápsula del resto de la célula se debe aumentar el contraste cerrando el diafragma del condensador.
En estas condiciones, la cápsula aparecerá como un halo transparente alrededor de la célula, que se verá de color
grisáceo.
 PARED CELULAR
El espesor de la pared celular en las bacterias Gram positivas oscila entre 0.150um y 0.50um y hasta
0.8um en algunas cepas de Lactobacillus acidophilus. En las bacterias Gram negativas la pared
celular (membrana externa de la envoltura celular) mide aprox 0.015.um de espesor. La pared celular
se colorea con colorantes derivados del trifenilmetano en solución de pH 7.0 y por lo general se
utilizan mordientes (ácido tánico, ácido fosfomolíbdico). La pared celular se tiñe de color azul sobre
un fondo amarillento.
 ESPORAS
Las bacterias que forman esporas pertenecen principalmente a los géneros Streptomyces, Clostridium
y Bacillus. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma
vegetativa. Algunas de las bacterias productoras de esporas son patógenas para el hombre, por lo que
su estudio y observación son de enorme interés.
Tinción de esporas (Wirtz-Conklin)

Fundamento
Las endosporas poseen unas cubiertas
exclusivas que las hacen resistentes a
los factores ambientales adversos.
Además, estas cubiertas hacen que las
esporas aparezcan en el microscopio
óptico como estructuras refringentes
y de difícil tinción.
La tinción específica de esporas
requiere dos colorantes:
 Verde malaquita: colorante que
es capaz de teñir las esporas en
caliente.
 Safranina: colorante de
contraste que tiñe las formas
vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, mientras que
las formas vegetativas si lo harán, y quedarán teñidas con el segundo colorante.

Procedimiento
 Sobre el frotis bacteriano agregar unas gotas de Verde de Malaquita
 Calentar por 5 min. hasta que se emitan vapores.
 Proceder a lavar el exceso de colorante con agua.
 Teñir con safranina por 1 min. y luego lavar el exceso de colorante.
 Secar la muestra a temperatura ambiente y proceder a observar con el microscopio.
TÉCNICA DE DORNER: Se sensibiliza y colorea la espora con fucsina fenicada en caliente y

luego se extiende sobre nigrosina, la cual extraerá el colorante de todas las estructuras celulares
excepto de las esporas y por consiguiente, se verán las espora de color rojo, y el resto de la bacteria
se observa incolora con el fondo oscuro.
Procedimiento
 Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 ml de SSF
 Añadir 1 ml de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la
mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
 Con la ayuda del asa de siembra colocar la muestra en un portaobjetos. Añadir una solución
acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de
óvalo.
 Dejar secar y observar con objetivo de inmersión
TÉCNICA DE MOELLER, Utiliza el ácido crómico y la fucsina fenicada en caliente para

sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con
azul de metileno. Se observan las esporas rojas y el resto de la bacteria azul.
Procedimiento
 Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol, encendiendo y
dejando apagar.
 Cubrir el preparado con solución de ácido crómico al 5% durante 5 minutos para sensibilizar.
 Lavar y cubrir luego con solución de fucsina fenicada en caliente durante 10 minutos (calentar
pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisión de vapores y volver a calentar
ocasionalmente para mantener la temperatura).
 Lavar con agua corriente.
 Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la decoloración
con alcohol.
 Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.
 Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
PARTE EXPERIMENTAL
1. TINCIÓN SIMPLE
Objetivos:
 Observar microorganismos al microscopio.
 Estudiar su morfología (coco, bacilo) y agrupación (racimos, cadenas, etc).
Materiales:
 Cultivos bacterianos en medios líquidos y sólidos.
 Asa de siembra.
 Láminas portaobjetos limpias y sin grasa.
 Microscopio óptico con lente de inmersión.
 Colorantes: azul de metileno o safranina

Procedimiento:
1. Se coloca el frotis bacteriano sobre un puente de coloración, y agregamos una gota de azul de
metileno o safranina.
2. Se deja por un minuto y luego se procede a lavar el exceso de colorante con la piceta o con agua
de caño (chorro fino).
3. Se seca la lámina cerca (no directa) de la llama del mechero o a temperatura ambiente.
4. Agregar aceite de inmersión y proceder a observar en el microscopio con el objetivo 100X.
2. TINCION DIFERENCIAL GRAM

Objetivos:
 Clasificar y diferenciar a las bacterias según la tinción Gram
 Estudiar la morfología (coco, bacilo) y agrupación de las bacterias (racimos, cadenas, etc.).
Materiales:
 Cultivos bacterianos en medios líquidos y sólidos.
 Asa de siembra
 Colorantes:
 Solución de Cristal violeta.
 Solución de Lugol.
 Solución de Alcohol – acetona.
 Solución de Safranina
 Láminas portaobjetos limpios y sin grasa.
 Microscopio óptico con lente de inmersión
Procedimiento
1. Sobre el frotis bacteriano se agrega la solución de cristal violeta, y se deja fijar a temperatura
ambiente por 1min o con ayuda de calor, luego se lleva a un puente de coloración y se lava el
exceso de colorante con agua destilada.
2. Agregar la solución de lugol. Dejar por 1min y proceder a lavar el exceso.
3. Luego se procede a decolorar con I-II gotas de alcohol-acetona, e inmediatamente se lava.
4. Agregar I o II gotas de safranina por 30 segundos, y luego lavar
5. Se seca la lámina cerca de la llama del mechero o a temperatura ambiente.
6. Agregar aceite de inmersión y proceder a observar en el microscopio con el objetivo 100X..
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Anotar y dibujar las estructuras que observe en microscopio óptico tanto en la tinción simple como la
tinción Gram.
Tipo de tinción: __________________________________________________________

Microorganismo observado:_________________________________________________
Observación (dibujar y colorear) Descripción Microscópica

Tipo de tinción: __________________________________________________________
Tipo de tinción: __________________________________________________________

Microorganismo observado: ________________________________________________
Tipo de tinción: __________________________________________________________


PRÁCTICA: IV
RECUENTO MICROBIANO
 Preparación y dilución de las muestras.
 Recuento por métodos de incorporación y superficie.
Los métodos utilizados para el aislamiento y recuento de los microorganismos presentes en diferentes
muestras como alimentos, requieren el tratamiento previo de la muestra para liberar en un medio fluido
aquellos microorganismos que pueden estar aprisionados en el interior de la muestra o e las superficies
secas o gelatinosas. El procedimiento muchas veces requiere de ciertos aparatos electrónicos, con la
precaución de la formación de aerosoles, sobre todo cuando se sospecha la presencia de gérmenes
patógenos, pero otras veces, para una adecuada homogenización, basta con una agitación enérgica. De
esta forma, se prepara una suspensión homogénea de muestra y microorganismos que permite la
preparación de las oportunas diluciones que posteriormente podrán ser utilizadas en diversos métodos de
recuento o enumeración.
ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
El número de microorganismos aerobios mesófilos (Recuento en placa) encontrados en una muestra,

como un alimento, ha sido uno de los indicadores microbiológicos de calidad, más comúnmente utilizado.
El recuento de flora aerobia mesófila tiene un valor limitado a la hora de juzgar la seguridad de un
alimento. Resulta útil no obstante, en muchos alimentos por diversos motivos ya que, por ejemplo, indica
si la limpieza y la desinfección y el control de la temperatura durante los procesos de tratamiento
industrial, transporte y almacenamiento se han realizado en forma adecuada.
Los dos métodos más utilizados para el recuento de la flora aerobia mesófila son:
a) El método de recuento estándar en placa, también denominado método de recuento en placa de
microorganismos aerobios o método de recuento en placa por incorporación o recuento en placa
por siembra en todo el medio.
b) El método de recuento en placa de siembra por extensión en superficie.
Ó 1 ml de
muestra en 9ml
de diluyente
ml de

OBJETIVO
Preparar la muestra con el diluyente apropiado y proceder por cualquiera de los dos métodos para el
respectivo recuento.
MATERIALES:
 Tubos con 9ml de diluyente
 Frasco con 90 ml de diluyente
 Pipetas de 1ml estériles
 Balanza
 Placas petri estériles
 Placas con agar plate count
 Agar Plate Count fundido a 45ºC
 Espátula de drigalski
 Estufa de incubación
PROCEDIMIENTOS
PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES:
1. Recuerde que todo el trabajo siempre se realiza cerca al mechero. Si la muestra es sólida, disgregarla
en un mortero estéril o con ayuda de una espátula. Luego pesar 10g de muestra e incorporarlo en los
90 ml del diluyente. Si la muestra es líquida, medir 10 ml directamente sobre el diluyente. Esta es la
dilución 10-1.
2. Agitar vigorosamente hasta una adecuada homogenización.
3. Proceder a realizar las sucesivas diluciones de la siguiente manera: pasar 1 ml del frasco a un tubo
conteniendo 9ml de diluyente. De este modo se obtiene la dilución 10 -2.
4. Agitar vigorosamente o con ayuda de vórtex.
5. La siguiente dilución se realizará tomando 1 ml de la dilución 10 -2 a un tubo conteniendo 9ml de
diluyente, de esta manera se obtiene la dilución 10-3.
6. Repetir esta operación para preparar las diluciones siguientes.
MÉTODOS DE SIEMBRA Nº1 (POR INCORPORACIÓN):

1. Pipetear por duplicado en placas petri vacías y estériles, alícuotas de 1 ml de las diluciones escogidas.
Recuerde que el rango de diluciones preparadas y sembradas puede modificarse en función de la cifra
de microorganismos esperada. De todos modos, se recomienda sembrar tres diluciones distintas.
2. Fundir el agar para recuento en placa utilizando el baño maría. Temperar el medio a 44-46ºC y
controlar cuidadosamente su temperatura para que al mezclarlo con la dilución de la muestra no sean
inactivadas las bacterias.
3. Verter inmediatamente en las placas petri 10-15ml de medio fundido y temperado.
4. Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de
llevar a cabo esta operación es: a) dar a la placa movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, b)
hacerla girar 5 veces en sentido de las agujas del reloj, c) volver a dar movimientos de vaivén en una
dirección que forme ángulo recto con la primera y d) hacerla girar 5 veces en sentido contrario a las
agujas del reloj.
5. Dejar solidificar. Luego invertir las placas e incubarlas a 37ºC por 24-48 horas.
MÉTODOS DE SIEMBRA Nº2 (POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE):

1. Tomar alícuotas de 0.1ml de la dilución más elevada y depositarlas en la superficie del medio
contenido en dos placas petri (dos placas por dilución, sembrando en cada una 0.1ml).
2. Repetir esta operación con cada dilución hasta llegar a la más concentrada utilizando siempre la
misma pipeta que se vaciará y llenará tres veces antes de transferir a cada placa los 0.1ml.
3. Deben sembrarse por lo menos tres diluciones aun en el caso de que se desconozca el número
aproximado de microorganismos presentes en la muestra de alimento.
4. Extender las alícuotas de 0.1ml sobre la superficie del medio tan pronto como sea posible, utilizando
las espátulas de drigalski.
5. Dejar secar las superficies de las placas durante 15 minutos.
6. Incubar las placas invertidas a 37ºC por 24-48 horas.

CÁLCULO DEL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA:
1. Elegir las dos placas correspondientes a una dilución que presenten entre 30-300 colonias.
2. Contar todas las colonias de cada placa.
3. Hallar la media aritmética de los dos valores.
4. Multiplicar dicho resultado por el factor de dilución (la inversa de la dilución cuyas placas han sido
seleccionadas).
5. Dar el valor obtenido como el recuento estándar en placa.
RESULTADOS:
PROMEDIO FACTOR DE
DILUCIÓN PLACA 1 PLACA 2 RESULTADO
ARITMÉTICO DILUCIÓN

PRÁCTICA: V
GENÉTICA MICROBIANA
 Obtención de mutantes resistentes a antibióticos.
 Obtención de mutantes resistentes a la luz ultravioleta.
ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS
 Enfrentar microorganismos a la acción de desinfectantes
 Enfrentar microorganismos a la acción de antisépticos.
ALTERACIÓN DEL ADN DE LA BACTERIA POR UN AGENTE FÍSICO Y

QUÍMICO
La luz UV así como otras radiaciones y algunas sustancias químicas alteran la estructura del ADN
bacteriano y si los cambios no son reparados, el efecto puede ser letal o producir una mutación
superviviente.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas
absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente fotoproductos. Éstos
fotoproductos originan la inactivación de macromoléculas, aunque el ADN dispone de mecanismos para
paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. La inactivación del único cromosoma de la
bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de
acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).
El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene poco poder
penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada por el cristal y penetra poco en los
líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de
desinfección en salas de hospitales y de laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz
UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantes
correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases genéticas).
LUZ UV vs. CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO
Observar el efecto de la luz UV sobre el crecimiento bacteriano
MATERIALES
 Cultivos en caldo nutritivo de E. coli,

Klebsiella, Staphylococcus aureus
 Placas de TSA
 Lámpara de luz UV
 Espátulas de vidrio (Drigalski)

PROCEDIMIENTO
 Aplicar 0,1 mL de la suspensión bacteriana en la placa de TSA y hacer una extensión con una
espátula de vidrio.
 Dividir las placas en cuadrantes con ayuda del marcador.
 Exponer las placas destapadas a la luz UV; manteniendo constante la distancia de 50 cm a los
tiempos de 0, 5, 10 y 15 minutos.
 Hacer el experimento por duplicado y a una de las placas envolverla con papel Kraft antes de
incubar.
 Llevar a incubar las placas a 37 ºC por 24 horas.
Comparar el número de colonias sobrevivientes en los diferentes tiempos de exposición; así como en la
placa cubierta con papel Kraft y en la placa normal.
LUZ UV vs. CRECIMIENTO BACTERIANO
UFC (INCUBACIÓN
UFC (INCUBACIÓN SIN
TIEMPO DE EXPOSICIÓN ENVOLVIENDO LA
ENVOLVER)
PLACA)
5 MINUTOS
10 MINUTOS
15 MINUTOS
COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:

CRECIMIENTO BACTERIANO vs. ANTIBIÓTICO
Las bacterias presentan algunas características biológicas que les facilita la adquisición de resistencia a
antibióticos. En primer lugar tienen una alta velocidad de duplicación: muchas de las bacterias patógenas
de humanos pueden duplicar su población en apenas 30 minutos en medios de cultivo adecuados. Sin
embargo, su sistema de reparación de ADN no está tan desarrollado como en eucariotas superiores y,
como consecuencia, presentan una alta tasa de mutaciones espontáneas. Si debido al azar, una de esas
mutaciones les permite sobrevivir en presencia de un antibiótico, la misma presión selectiva de éste (mata
a todas las sensibles) va a favorecer la aparición de una población bacteriana resistente.
Los mecanismos mediante los cuales las bacterias resisten la acción de un antibiótico son complejos, pero
se pueden clasificar en dos grandes grupos:
 Los generados como consecuencia de mutaciones espontáneas

de genes constitutivos de las bacterias.
 Los que se derivan de la adquisición de material genético extraño
a la bacteria y que le confiere alguna capacidad que le permite
sobrevivir a la acción del antibiótico.
OBJETIVO
Observar la acción de los antibióticos sobre las bacterias
MATERIALES Y MEDIOS
Cultivo de E, coli de 24 h en caldo nutritivo.

Placa Petri con Agar tripticasa de soya o agar Muller Hinton
Discos de antibióticos.
Hisopos y pinzas estériles
PROCEDIMIENTO
 Sembrar en toda la superficie de la placa el cultivo de E. coli con ayuda del hisopo estéril
 Con ayuda de las pinzas colocar separadamente cuatro discos de diferentes antibióticos.
 Llevar a incubar a 37 ºC por 24 h.
Leer las placas después de la incubación e interpretar los resultados.

MÉTODO ALTERNATIVO
MATERIALES
 Tubo con caldo tripticasa soya (TSB)
 Tubos patrón de turbidez de SO4Ba estándar (Mc Farland)
 Placas Petri con 25 mL de Agar Mueller Hinton para placa de 90 mm
 Torundas estériles
 Pinzas estériles
 Viales con alcohol
 Viales con discos de antimicrobianos
 Tubos con solución salina
PROCEDIMIENTO
1. Usar solamente cultivos identificados y puros
2. Seleccionar 4 o 5 colonias de similares características y suspender en 5 ml de TSB
3. Incubar el cultivo a 35 ºC x 2 a 8 h. Verificar turbidez.
4. Comparar la turbidez con el del patrón de SO4Ba. Este estándar debe colocarse en un tubo del
mismo calibre del medio del cultivo reemplazado cada mes.
5. Diluir la turbidez del cultivo con solución salina estéril hasta igualar la densidad del patrón.
6. Secar las placas Petri conteniendo el Agar Mueller Hinton 30 minutos antes de inocular.
7. Sumergir la torunda en el cultivo y eliminar el exceso de humedad escurriendo por las paredes del
tubo previamente para la siembra.
8. Con la torunda estriar la placa en 3 direcciones con el objeto de obtener un crecimiento uniforme y
confluente.
9. Después esperar 3 a 15 minutos a temperatura ambiente.
10. Seleccionar apropiadamente los discos de acuerdo a la bacteria
11. Colocar los discos con pinza estéril, apretar el centro suavemente para asegurar un buen contacto
con la superficie del Agar Mueller Hinton. Tener cuidado de guardar cierta distancia entre disco y
disco y del borde de la placa. Solamente se debe colocar 7 discos para la placa de 90 mm
12. Las placas deben incubarse a 37 ºC, enseguida o dentro de los 30 minutos después de la aplicación
de los discos.
13. La lectura de las placas se hace entre las 18 y 24 h., con regla milimetrada.
14. Medir solamente las zonas que muestren completa inhibición.

ACCION DE LOS AGENTES FISICOS Y QUÍMICOS SOBRE LOS
MICROORGANISMOS
Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, las células procarióticas sufren los cambios
ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los organismos pluricelulares.
A lo largo de miles de millones de años, los procariotas han venido estando sometidos a diversas
presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptación.
Actualmente, las únicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son
exclusivamente procarióticas (bacterias extremófilas)
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así,
determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o
beneficiosas para otra.
Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los efectos que
determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al
crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de reproducción.
AGENTES FÍSICOS
Entre los cuales tenemos:
 Temperatura
 Desecación
 Radiaciones (ionizantes y no ionizantes)
 Luz visible
 Ondas sonoras
 Presión osmótica
 pH.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Fundamento
Los microorganismos tienen una temperatura mínima, una óptima y una máxima para su
crecimiento. Temperaturas por debajo de la mínima usualmente tienen acciones paralizantes en los
microorganismos. Éstas inhiben el crecimiento microbiano por un enlentecimiento del metabolismo, sin
embargo no es necesaria para matarlos. Las temperaturas por encima de la máxima tienen acción letal o
subletal, dado que desnaturalizan enzimas microbianas y otras proteínas. Si el tratamiento es corto en
duración y se efectúa a una temperatura no excesivamente alta, los daños que la bacteria sufre son
reparables y, por eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es más fuerte, en temperatura
o en duración, los daños se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad de
formar colonias, se habla entonces de efecto letal.
La temperatura es una manera muy común y efectiva de controlar a los microorganismos.
ALTAS TEMPERATURAS
CALOR HÚMEDO
1. Autoclavado
2. Agua hirviendo
CALOR SECO
1. Esterilización con aire caliente

2. Incineración
PASTEURIZACIÓN

BAJAS TEMPERATURAS
Las bajas temperaturas inhiben el crecimiento microbiano por disminución del metabolismo microbiano.
Los ejemplos incluyen refrigeración y congelamiento. Refrigeración a 5ºC disminuye el crecimiento de
microorganismos y mantiene los alimentos frescos por unos pocos días. El congelamiento a -10ºC detiene
el crecimiento microbiano, pero generalmente no los destruye y mantiene los alimento frescos por varias
semanas.
OBJETIVO
Observar el comportamiento de las cepas de estudio, bajo los efectos de la ebullición.
MATERIALES
 Asa de Kohle
 Mechero de Bunsen
 Tubos con suspensión de Bacillus subtilis, Escherichia coli
 Placa Petri con Agar Tripticasa de Soya (TSA)
PROCEDIMIENTO
Se dispondrá de un tubo con un cultivo Bacillus subtilis, Escherichia coli y de una placa Petri con TSA:
1. Separar la placa en cuatro partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con el
tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 10, 20, y 30 minutos.
2. Tomar, con una asada del cultivo y extenderlos sobre la parte de la superficie de la placa
correspondiente al tiempo t = 0.
3. Luego, colocar el tubo en el baño de agua que este en ebullición. Repetir el paso 2 a t = 5, 10, y 30
minutos (el tiempo es acumulativo).
4. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.
5. Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos.

AGENTES QUIMICOS
Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos
tipos de efectos diferentes:
 Bacteriostáticos: Cuando impiden el crecimiento bacteriano.
 Bactericidas: Cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, cuando nos referimos no sólo a las bacterias sino a cualquier tipo de microorganismos,
hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma
sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro microbicida depende
muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa.
¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”?
El único criterio válido es la pérdida irreversible de la capacidad de división celular, es decir, de la

pérdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando técnicas con placas de Petri, es decir, confirmando
que no crecen en medios sólidos adecuados.
Antes de proceder al estudio de las diversas moléculas que pueden afectar el crecimiento o la viabilidad
de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas.
AGENTES ESTERILIZANTES
Son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana, es decir, su
“muerte” o la pérdida irreversible de su viabilidad. (También existen agentes físicos esterilizantes,
como ya se vio en capítulos anteriores).
AGENTES DESINFECTANTES (O GERMICIDAS)

Son agentes (sobre todo químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos
(infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre
tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes.
AGENTES ANTISÉPTICOS
Son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales
vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican.
QUIMIOTERÁPICOS
Son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad
suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos fluidos
corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hacen
eficaces como antimicrobianos dentro del organismo.
Todos los días usamos agentes químicos para controlar el crecimiento microbiano: detergentes y jabones
para el cuerpo y la ropa, cloración de las aguas potables, antisépticos para la piel y el tratamiento de
heridas, desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios, etc.
Tanto en los laboratorios como en industrias alimentarias es necesario a menudo tratar superficies inertes
(mesas, suelos, paredes, maquinaria) con desinfectantes (sanitizantes), de ser posible con efecto
microbicida. Por ejemplo se pueden usar sales cuaternarias de amonio como el cloruro de benzalconio. El
formaldehido es un agente alquilante que en solución al 3-8% sirve bien para tratar superficies.

OBJETIVO
Comprobar la acción de los agentes químicos (antisépticos y desinfectantes) frente a las cepas de trabajo.
MATERIALES Y REACTIVOS
 Antisépticos: Alcohol yodado, peróxido de hidrógeno, yodopovidona al 10%, timerosal o similar.

 Desinfectantes: Fenol, hipoclorito de sodio al 5,25%, etc.
 Placas Petri con agar tripticasa de soya
 Espátulas de Drigalsky
 Discos de papel filtro estériles
 Mechero Bunsen
 Tubos con suspensión de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y
Bacillus subtilis.
 Pinzas metálicas
PROCEDIMIENTO
1. Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con el
antiséptico o desinfectante a estudiar
2. Tomar 0,1 mL de una suspensión bacteriana, y colocarla en el centro de la placa con TSA.
3. Luego proceder a esparcirla en toda la superficie de la placa con la ayuda de una espátula de
Drigalsky, y sembrar en 3 direcciones; horizontal, vertical y oblicua
4. Luego con la ayuda de una pinza previamente flameada se toma un “disco” y se embebe (cada
disco) con cada uno de los desinfectantes o antisépticos escogidos. Eliminar el exceso del líquido
en la pared del frasco.
5. Se coloca el disco en el área designada para tal fin.
6. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.
7. Interpretar el efecto de cada una de las sustancias utilizadas según el diámetro del halo de
inhibición.

RESULTADOS
BACTERIA:
DESINFECTANTE HALO (mm) ANTISÉPTICO HALO (mm)
INTERPRETACIÓN

PRÁCTICA: VI
NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
 Requerimientos nutricionales mínimos para el crecimiento microbiano
(Nutrientes, pH, temperatura, y demanda de oxígeno)
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias
químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos
objetivos:
Fines energéticos (reacciones de mantenimiento)

Fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Los requerimientos nutricionales de los microorganismos se relacionan con la fuente de energía y con la
fuente de carbono. De acuerdo a ello las bacterias pueden clasificarse como:
 Bacterias Autótrofas: Son aquellas bacterias que

sintetizan todos sus elementos celulares a partir del CO 2
como fuente de carbono que toman del medio ambiente y
sales inorgánicas para su crecimiento. Ejemplos:
Bacterias Acidithiobacillus thioxidans, nitrosomas-
hidrogenomonas.
 Bacterias Heterotróficas: Son aquellas que requieren para
su crecimiento una fuente de carbono y energía a partir de
compuestos orgánicos. Ejemplo: Salmonella,
Staphylococcus, Escherichia coli.
OBJETIVO
Determinar en que medio de cultivo se encuentra mayor crecimiento microbiano.
MATERIALES
Cepas
 Pseudomonas aeruginosa
 Escherichia coli.
 Bacillus subtilis
 Staphylococcus aureus

Medios de cultivo Agar Base para 1 L:
 M1 = Agar Base (AB) • Agar-agar 20,0 G
 M2 = AB + Glucosa al 5%. • ClNH4 1G
 M3 = AB + Glucosa al 5% + extracto de levadura • K2HPO4 1G
• SO4Mg 0,2 G
 M4 = AB + Glucosa al % + extracto de levadura + Ác. Nicotínico • SO4Fe 0,01 G
• Cl2Ca 0,01 G
PROCEDIMIENTO • Agua c.s.p.1L
 Sembrar cada microorganismo en los medios anteriores.

 Incubar a 37° C por 24 horas.
 Observar el crecimiento y anotar los resultados
RESULTADOS E INTERPRETACION
Bacteria/Medios M1 M2 M3 M4
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
+ = Poco crecimiento
++ = Regular crecimiento
+++ = Mayor crecimiento
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS IONES HIDROGENION

Los iones H+ y OHˉ tienen importancia decisiva en el crecimiento microbiano, pequeñas alteraciones en
la concentración tienen efectos considerables en el crecimiento. Cada microorganismo tiene un pH
óptimo. Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, éstas se pueden clasificar en:
 Neutrófilas: Si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8).

 Acidófilas: Si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
 Alcalófilas: Si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
OBJETIVO
Determinar el pH óptimo para cada una de las bacterias de experimentación.
MATERIALES
Cepas:
 Bacillus subtilis
 Escherichi coli
 Staphylococcus aureus
 Pseudomonas aeruginosa
Medios de cultivo:
Caldo nutritivo en tubos de 10 ml cada uno a diferentes pH (4, 7, 9).
PROCEDIMIENTO
 Sembrar los microorganismos en los tubos con caldo nutritivo a diferentes pH
 Incubar a 37°C por 24 horas.
 Observar el crecimiento y calificar por cruces.

Bacteria pH 4 pH 7 pH 9
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
++ = Regular Crecimiento
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Psicrófilas
Su temperatura óptima de crecimiento está entre 5ºC - 15 ºC. Suelen encontrarse en regiones árticas,
antárticas y en los glaciares
.
Mesófilas
Son microorganismos que crecen a temperaturas moderadas. Su temperatura óptima de crecimiento
está entre 25ºC y 45ºC. La mayoría de las bacterias pertenecen a este grupo, incluyendo las bacterias
comunes del suelo y las que infectan al organismo humano.
Termófilas
La temperatura óptima de estos microorganismos está entre 45 ºC – 70ºC y son comúnmente
encontradas en las aguas termales.
Hipertermófilas
Estas bacterias crecen a muy altas temperaturas. Su temperatura óptima de crecimiento está entre
70ºC - 110ºC. Generalmente éstos pertenecen al Dominio Archaea y se encuentran cerca de
hidrotermas en las grandes profundidades del océano.
OBJETIVO
Observar cual es la temperatura adecuada de cada bacteria y cual es su clasificación.
MATERIALES
Cepas
 Bacillus subtilis ☺Sabias que …..
 Bacillus cereus Los microorganismos
pertenecientes al dominio
 Escherichia coli Arquea pueden sobrevivir a
 Pseudomonas aeruginosa temperaturas de ebullición, en
ácidos, cerca de fuentes
Medio de Cultivo: Caldo nutritivo en tubos sulfurosas de ventilación en
los océanos o en otros
ambientes extremos.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar cada microorganismo en tres tubos de caldo nutritivo

 Incubar los tubos a diferente temperatura (25° C, 37° C, 45° C)
 Observar el crecimiento y calificar mediante cruces

Bacteria/Temperatura 25° C 37° C 45° C

Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Escherichia coli
++ = Regular crecimiento
EFECTO DE LA TENSIÓN DE OXÍGENO.

Los microorganismos presentan variación considerable en relación al oxígeno del medio de cultivo:
 Anaerobios estrictos u obligados:

Son aquellos que no necesitan del oxígeno del aire, inclusive es letal para ellas.
 Aerobios estrictos u obligados:
Cuando el microorganismo utiliza el oxígeno molecular.
 Anaerobio facultativos:
Son indiferentes a la presencia o ausencia de oxígeno.
 Microaerófilos:
Necesitan cantidades moderadas de oxígeno molecular.
 Anaerobio aerotolerante:
Al igual que los anaerobios obligatorios, no usan el oxígeno para su crecimiento, pero son tolerados
moderadamente. Éstos obtienen energía a partir de la fermentación.
OBJETIVO
Observar si existe crecimiento de microorganismos en cada uno de los medios utilizados después de
la incubación.
MATERIALES ☺Sabias que …..

Cepas: El potencial Redox es crítico para el
 Lactobacillus sp. desarrollo de los microorganismos. Es
la capacidad del medio a la
 Streptococcus mutans transferencia de electrones y depende
 Staphylococcus aureus en gran medida del oxígeno disuelto en
 Clostridium sporogenes el medio. Los anaerobios estrictos
necesitan un medio carente de oxígeno
ya que se desarrollan en medios
Medio de cultivo: reductores y son inhibidos a
 Medio semisólido o medio tioglicolato potenciales mayores de -0,100mV.
 Frascos con parafina estéril

PROCEDIMIENTO
 Calentar los tubos en B.M. por 30 minutos.

 Enfriar con chorro de agua fría para bajar la temperatura hasta 38°C – 40 ªC
 Sembrar los microorganismos en cada tubo.
 Incubar a 37°C por 24 horas.
 Observar el crecimiento.

PRÁCTICA: VII
METABOLISMO MICROBIANO
 Metabolismo de carbohidratos (oxidación y fermentación) en bacterias.
 Metabolismo de proteínas: hidrólisis de caseína y gelatina.
 Metabolismo de lípidos: Hidrólisis de lecitina
 Determinación de enzimas microbianas
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Los azúcares son los sustratos orgánicos utilizados por los microorganismos, mediante la fermentación
(en ausencia de O2) y la oxidación. Los azúcares son convertidos en ácidos orgánicos y con frecuencia se
liberan gases con variación de hidrógenos en el medio, este hace variar el color del indicador de pH ácido.
El uso de azúcares sirve para la clasificación e identificación de los microorganismos.
OBJETIVO
Determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un hidrato de carbono incorporado a un
medio de cultivo, produciendo alcohol, ácido y/o gas.
MATERIALES:
Microorganismos:
 Klebsiella sp
 Salmonella sp
Medios de cultivo:
 Medio semisólido rojo de fenol conteniendo un azúcar al 1% (glucosa, galactosa, sacarosa,
lactosa o manitol).
 Agar KIA (Kligger Iron Agar)
 Agar Citrato de Simmons
PROCEDIMIENTO:
 Medio semisólido: Sembrar con asa de aguja un mismo microorganismo en cada uno de los
tubos, hasta una profundidad de 2/3 del medio de cultivo.
 Agar TSI: Sembrar con asa de aguja en los 2/3 superiores del medio y seguidamente hacer
estrías en la parte inclinada del agar.
 Agar citrato: Sembrar con el asa de aguja haciendo estrías en la parte inclinada del agar.
 Incubar todos los tubos a 37º C x 24 horas.
 Si hay metabolismo del azúcar por el microorganismo, se podrá observar el cambio de color y la
presencia de gas (CO2 y H2).

Resultados del medio rojo de fenol
glucosa galactosa sacarosa lactosa manitol

E. coli
Klebsiella sp.
Salmonella sp.
P.aeruginosa
S. aureus
Resultados en el Agar KIA
Resultados
E. coli
Klebsiella sp.
Salmonella sp.
P. aeruginosa
S. aureus
Resultados en el Agar Citrato
Resultados
E. coli
Klebsiella
Salmonella
P. aeruginosa
S .aureus
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA
OBJETIVO
Identificar si las bacterias utilizan de carbohidratos por oxidación y/o fermentación.
MATERIALES
 CEPAS
o Pseudomonas aeruginosa.
o Escherichia coli o Klebsiella sp.
 MEDIOS DE CULTIVO
o Medio de Hugh & Leifson (O/F)
PROCEDIMIENTO
 Sembrar en medio O/F, con el asa de aguja hasta el fondo, se siembra en dos tubos, luego uno de los
tubos se cubre con una capa parafinada. Se deja incubar por 48 h a 37 ºC.
INTERPRETACIÓN DE PRUEBA OXIDATIVA – FERMENTATIVA
Tubo abierto Tubo cubierto
Acido (amarillo) Alcalino (verde)  Oxidativo
Acido (amarillo) Acido (amarillo)  Fermentativo
ANOTAR RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Resultados
E. coli
Klebsiella sp.
P. aeruginosa

METABOLISMO DE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS
Las numerosas reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo de síntesis y el energético de los
microorganismos se realizan por medio del control de enzimas.
A. METABOLISMO DE LÍPIDOS
Hidrólisis de Triglicéridos
Los triglicéridos son esteres de glicerol y ácidos grasos, los microorganismos utilizan los triglicéridos
después de la hidrólisis del enlace éster que llevan a cabo las enzimas extracelulares llamadas lipasas,
dando como resultado glicerol y ácidos grasos libres, las lipasas no son muy específicas y atacan
triglicéridos con ácidos grasos de longitud de cadena variable.
OBJETIVO
Reconocimiento e identificación de la actividad lipolítica de las bacterias.
MATERIALES:
Microorganismos:
Medios de cultivo:
 Agar nutritivo conteniendo grasa vegetal (margarina) al 4%
 Agar nutritivo conteniendo yema de huevo al 10%
PROCEDIMIENTO:
 Dividir la placa en cuatro cuadrantes

 Sembrar un microorganismo en cada cuadrante.
 Incubar a 37º C x 24 hrs.
 En la placa de grasa vegetal, observar el crecimiento y agregar sulfato de cobre al 2%. Dejar en
reposo por 10 min. Alrededor del crecimiento de la colonia aparecerá una coloración verde
azulada indicando hidrólisis del glicerol y una coloración azul brillante sobre el crecimiento
indica la presencia de ácidos grasos.
 En la placa de agar yema de huevo, interpretar directamente luego de la incubación. Se observa
un halo opaco o transparente alrededor del crecimiento bacteriano.
Resultados Placa de grasa vegetal Agar yema de huevo

E. coli
S .aureus
Bacilus subtilis
P. aeruginosa

B. METABOLISMO DE PROTEÍNAS
Degradación de la Caseína.- Los microorganismos poseen diferente capacidad proteolítica, liberando

aminoácidos o sus derivados metilmercaptanos, SH2, indol, etc.
Degradación de la Gelatina.- Los microorganismos que poseen la enzima gelatinasa actúan sobre la
gelatina, hasta la producción de aminoácidos.
OBJETIVO:
Reconocimiento e identificación de la actividad proteolítica de las bacterias.
MATERIALES:
Microorganismos:
 Bacillus cereus
Medios de cultivo:
 Agar nutritivo conteniendo leche descremada al 5%
 Agar gelatina
PROCEDIMIENTO:
 Dividir la placa en tres partes

 Sembrar un microorganismo en cada división.
 Incubar a 37 ºC x 24 hrs.
 Observar la zona de hidrólisis (halo) en los alrededores de la colonia lo cual traduce la acción de
la enzima.
 En el caso del agar gelatina finalizada la incubación agregar con cuidado ácido pícrico
directamente sobre toda la placa y se observa un halo transparente que significa que la gelatina
ha sido hidrolizada.
ANOTAR RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Degrada caseína Degrada gelatina

Bacilus subtilis
Bacilus cereus
S. aureus

PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA BACTERIANA: FACTORES QUE LA

MODIFICAN
Los factores más importantes que afectan la producción de las enzimas bacterianas como gelatinasa,
amilasa, DNAsa, etc. y a la vez la velocidad de las reacciones catalizadas por éstas, son: pH,
concentración de glucosa y la presencia de inhibidores presentes en el medio de cultivo.
Cuando se analizan de manera apropiada estos factores, es posible conocer gran parte de la naturaleza de
la reacción enzimática bacteriana, deduciendo si el efecto de las variaciones en estos factores son
favorables o no a la producción enzimática.
A continuación presentamos algunas enzimas importantes:
AMILASAS
Algunos microorganismos, colocados en medios de cultivo apropiados, segregan cantidades considerables
de amilasas o de proteasas. Después de separar las células y otras impurezas, las disoluciones se
concentran por evaporación al vacío a bajas temperaturas y las enzimas de estas disoluciones se precipitan
por adición de sales inorgánicas (como el sulfato de sodio) o disolventes orgánicos miscibles en agua.
Como ejemplos de amilasas y de proteasas microbianas, se pueden citar:
Las –amilasas bacterianas (obtenidas fundamentalmente por medio del Bacillus subtilis): son enzimas
que licúan el almidón y que se utilizan para la producción de adhesivos o de recubrimientos a base de
almidón para papeles, en panadería o en otras industrias alimentarias o para la obtención de productos de
desencolado en la industria textil.
UREASA
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por
acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se
usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en inclinación en agar urea de Christensen. Este medio se complementa
después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces
de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador
de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que
especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser
leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen
actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación

PRÁCTICA: VIII
BACILOS GRAM NEGATIVOS 1
Enterobacterias patógenas
Cultivo e identificación de:
 Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Yersinia.
BACILOS GRAM NEGATIVOS: ENTEROBACTERIAS PATÓGENAS

La familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos gramnegativos con
importancia clínica. Con 40 géneros de más de 150 especies. Estos géneros se han clasificado según sus
propiedades bioquímicas, estructura antigénica e hibridación y secuenciación de los ácidos nucleicos.
Son menos de 20 las especies responsables de más del 95% de las infecciones. Las enterobacterias son
microorganismos cosmopolitas, se encuentran en el suelo, el agua y la vegetación; y también en la flora
intestinal normal de muchos animales, incluido el ser humano. Producen muchas enfermedades en el ser
humano, como el 30% al 35% de las septicemias, más del 70% de las infecciones del aparato urinario
(ITU) y muchas infecciones intestinales.
Algunos microorganismos (p. ej., Salmonella typhi, Shigella, Yersinia) se asocian siempre a enfermedad,
mientras que otros (p. ej., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabílis) forman parte de la
microflora comensal normal y pueden producir infecciones oportunistas. Algunos de los géneros
comúnmente de importancia clínica son:
ENTEROBACTERIAS PATÓGENAS ENTEROBACTERIAS OPORTUNISTAS

 Escherichia coli  Klebsiella
 Salmonella  Enterobacter
 Shigella  Proteus
 Yersinia  Serratia
CARACTERÍSTICAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Esta familia tiene unos requerimientos nutricionales sencillos: Son bacilos gramnegativos, no forman
esporas, aerobios o anaerobios facultativos, catalasa variable- por lo común positivos-, presencia de
capsulas variable, Movilidad variable (si es positiva tiene flagelos peritricos) – caso especial es el
denominado movimiento ondulante de la especie Proteus conocido como “swarming” en el cultivo de
agar, interfiriendo con su aislamiento- también se caracterizan por ser Oxidasa Negativas, O/F (oxido-
fermentación de la glucosa), algunas especies de esta familia tienden a producir gas CO 2 y H2S,
Temperatura optima de crecimiento es de 37ºC, reducen los nitratos a nitratos. La ausencia de actividad
de citocromo oxidasa es una característica importante, debido a que se puede determinar rápidamente
mediante una sencilla prueba, y se utiliza para diferenciar a las enterobacterias de otros bacilos
gramnegativos fermentadores y no fermentadores.
Crecimiento sugerido en agar MacConkey.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Las características de las colonias de estos microorganismos en los diferentes medios se han utilizado
para distinguir a los miembros más frecuentes de esta familia. Por ejemplo, la capacidad de fermentar
lactosa se ha utilizado para distinguir a las cepas
fermentadoras de lactosa (Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Citrobacter y Serratía) de las cepas que no
fermentan lactosa o lo hacen lentamente (Proteus, Salmonella,
Shigella y Yersinia spp.). Las sales biliares en algunos
medios selectivos se ha utilizado para separar a los patógenos
entéricos (Shigella, Salmonella) de los microorganismos
comensales que se inhiben con las sales biliares (bacterias
grampositivas y algunas gramnegativas presentes en el sistema

digestivo). Algunos son resistentes a ciertos colorantes con inhibición bacteriostática (verde brillante).
OBJETIVOS
 Utilizar medios selectivos y diferenciales para el aislamiento de enterobacterias.

 Identificar las enterobacterias del tipo patógeno, mediante pruebas bioquímicas.
 Reconocer las características particulares de cada género patógeno en los aislamientos.
MATERIALES:
Cepas de Enterobacterias
Escherichia coli
Shigella
PATOGENAS Salmonella
Yersinia
Medios de cultivos
 Agar MAC (MacConkey)

 Agar EMB (Eosina azul de metileno)
 Agar SS (Salmonella – Shigella)
 Agar XLD (Xilosa, lisina, desoxicolato)
 Agar TSI (Triple azúcar hierro)
 Agar LIA (lisina hierro)
 Agar Citrato de Simmons
 Medio MIO (Movilidad – Indol – Ornitina)
Reactivos
 Reactivo de Kovacs
PROCEDIMIENTO:
AISLAMIENTO:
Para ello se utilizan medios que son selectivos, donde podremos ver la morfología, color y otras
características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra.
Inocular con el asa de siembra cada cepa en los medios de cultivos (agar MAC, ENDO y XLD).
Incubar por 24 h a 37 ºC.
IDENTIFICACIÓN
 Trabajar con las colonias aisladas previamente en agar Mac Conkey.
 En TSI inocular con asa de Kohle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar el asa hacer estrías en la
parte inclinada.
 En LIA inocular con el asa de Kohle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 partes del agar y al
retirar el asa hacer estrías en la parte inclinada.
 En Citrato sembrar con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada.
 En el medio MIO sembrar con el asa de Kohle en aguja.
 Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas por 18 a 24 horas a 37 ºC.
 Agregar gotas del reactivo de Kovacs (para Indol) al resultado del MIO, pero después de hacer las
lecturas de Movilidad y descarboxilación de la Ornitina.

GUÍA PARA LA INTERPRETACIÓN:
 Agar TSI:
-Pico alcalino/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo=K/A): el microorganismo solamente
fermenta glucosa.
- Pico ácido/profundidad ácida (pico amarillo/fondo amarillo= A/A): el microorganismo fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
- Pico alcalino/profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo = K/K): el microorganismo no fermenta
azúcares.
- Presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo indican que el microrganismo produce gas.
- El Ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce H2S.
 Agar LIA:
- Descarboxilación de la lisina: Resultado positivo: pico alcalino(violeta)/profundidad alcalina
(violeta). Resultado negativo: pico alcalino (violeta)/ profundidad ácida (amarillo).
- Desaminación de la lisina: Pico rojizo/profundidad ácida.
- Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio.
 Agar citrato de Simmons:

-Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul.
-Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia de color verde del medio de cultivo.
 Medio MIO:
-Movilidad: Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
-Ornitina descarboxilasa: Resultado positivo: color púrpura. Resultado negativo: color amarillo, a
veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.
-prueba del indol: Agregar gotas del reactivo de Kovacs, pero después de hacer las lecturas de
Movilidad y descarboxilación de la Ornitina. Resultado positivo: color rojo. Resultado negativo: el
color del reactivo permanece incoloro-amarillento.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN.
Descripción de crecimiento en agar:

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Microorganismo: _______________________________________________________

RESULTADOS DE GRUPO
Mesa Nº :____ Mesa Nº :____

Prueba Prueba
Resultado Interpretación Resultado Interpretación
Bioquímica Bioquímica
TSI TSI
LIA LIA
CITRATO CITRATO
MIO MIO
OTRO: OTRO:
Microorganismo: Microorganismo:

Prueba Prueba
TSI TSI
LIA LIA
CITRATO CITRATO
MIO MIO
OTRO: OTRO:

PRÁCTICA: IX
BACILOS GRAM NEGATIVOS 2
Enterobacterias oportunistas
Cultivo e identificación de:
 Klebsiella, enterobacter, Proteus y Serratia.
BACILOS GRAM NEGATIVOS: ENTEROBACTERIAS OPORTUNISTAS

 Klebsiella  Proteus
 Enterobacter  Serratia
Las enterobacterias son microorganismos cosmopolitas, se encuentran en el suelo, el agua y la

vegetación; y también en la flora intestinal normal de muchos animales, incluido el ser humano.
Anteriormente vimos y reconocimos las características de estos microorganismos en el aspecto patógeno,
En el caso de esta practica veremos también microorganismos de esta misma familia, pero que son
oportunistas, que existen en el medio ambiente en forma libre, pero debido a una circunstancia como,
exposición extrema, disminución de las defensas u otras como contaminación por cateterismo producen la
infección muy frecuente de este grupo de bacterias.
Entre las que comúnmente se les encuentra en forma libre están, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Proteus mirabilis, Enterobacter sp. y Serratia sp. que forman parte de la microflora comensal normal y
pueden producir infecciones oportunistas. Algunos de los géneros comúnmente tienen afecciones
específicas en niños, enfermos y ancianos.
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS:
 Aislar e identificar los géneros oportunistas más importantes de enterobacterias, mediante pruebas
bioquímicas.
 Reconocer la importancia clínica de esta familia en infecciones humanas.
MATERIALES
Cepas de Enterobacterias
Serratia
Klebsiella
OPORTUNISTAS Enterobacter
Proteus
Medios de cultivos
 Agar MAC - Mac Conkey

 Agar EMB - Eosina azul de metileno
 Agar XLD – Xilosa, lisina y desoxicolato
 TSI – Agar Triple azúcar hierro
 LIA – Agar lisina hierro
 Citrato – Agar Citrato de Simmons
 MIO – Agar para movilidad – indol – Ornitina
Reactivos
 Reactivo Voges-Proskauer
 Reactivo de Kovacs

PROCEDIMIENTO
Aislamiento:
Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde se puede ver
la morfología, color y otras características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la
muestra.
Sembrar por aislamiento la cepa de enterobacteria en los medios de cultivos (agar Mac Conkey, ENDO y
XLD) con el asa de Kohle en aro. Incubar por 24 h a 37 ºC.
IDENTIFICACIÓN
 Trabajar con las colonias aisladas previamente en agar Mac Conkey.
 En TSI inocular con asa de Kohle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar el asa hacer estrías en la
parte inclinada.
 En LIA inocular con el asa de Kohle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 partes del agar y al
retirar el asa hacer estrías en la parte inclinada.
 En Citrato sembrar con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada.
 En el medio MIO sembrar con el asa de Kohle en aguja.
 Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas por 18 a 24 horas a 37 ºC.
 Al tubo con medio MIO agregar gotas del reactivo de Kovacs, para la lectura del indol.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN.
Descripción de crecimiento en agar:
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
________________________________________
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Microorganismo: _______________________________________________________
RESULTADOS DE GRUPO


Prueba Prueba
TSI TSI
LIA LIA
CITRATO CITRATO
MIO MIO
OTRO: OTRO:

Prueba Prueba
TSI TSI
LIA LIA
CITRATO CITRATO
MIO MIO
OTRO: OTRO:

PRÁCTICA: X
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES
 Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter y Vibrio cholerae
Los bacilos Gram negativos no fermentadores son un grupo de bacilos aerobios no formadores de esporas
que no utilizan los hidratos de carbono como fuente de energía o los degradan a través de vías
metabólicas diferentes a la fermentación.
Dentro de estos bacilos tenemos al Género Pseudomonas, Acinetobacter, y Alcalígenes, algunos de ellos,
en general desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, los microorganismos objeto de
esta práctica son saprófitos en la naturaleza no producen enfermedad en el individuo sano pero pueden
comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos.
Todos ellos comparten una característica común: son incapaces de fermentar la glucosa.
Género Pseudomonas
 Bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvados.
 No forman esporas.
 Mide aprox. 0,6 x 2 μm.
 Móviles mediante flagelos polares.
 Crecen bien en agar sangre y Mac Conkey
 Elaboran pigmentos verdoso (pioverdina), azulado (piocianina), rojo oscuro (piorrubina), etc.
 Es aerobio obligado, excepto aquellas que utilizan la desnitrificación como medio de respiración.
 Es oxidasa positiva.
 La Pseudomonas aeruginosa crece bien a 42 ºC a diferencia de las otras especies del género como P.
fluorescens, P. putida, P. mullei, P. cepacia.
Género Acinetobacter
 Bacilo o cocobacilo Gram negativo.
 A menudo se ven en pares.
 Se encuentran diseminadas en suelo y agua.
 Crecen bien en agra Mac Conkey y producen un suave pigmento azul.
 También puede detectarse un olor parecido al amoniaco.
 Aerobio obligado.
 Oxidasa negativa
Género Alcalígenes
 Bacilos Gram negativos
 Oxidasa positivos
 Móviles mediante flagelos perítricos.
 Alcalinizan el medio con citrato y el medio O/F que contiene glucosa.
 Negativos a ureasa.
 Pueden formar parte de la flora bacteriana humana normal.
P. aeruginosa es la especie patógena aislada con mayor frecuencia en muestras humanas. Es un bacilo
aeróbico obligado que mide aproximadamente de 0,5 a 1 µm de ancho por 3 a 4 µm de largo, posee un
solo flagelo, pero en forma ocasional algunos pueden tener dos o tres. Producen dos pigmentos de
importancia clínica: piocianina, que puede colorear de azul verdoso el pus de una herida, y pioverdina
(fluoresceína), pigmento amarillo verdoso que fluoresce bajo la luz ultravioleta. Esta especie puede
infectar heridas, vías urinarias, quemaduras y el tracto respiratorio inferior, especialmente en individuos
inmunosuprimidos, considerado además un patógeno oportunista, causante principal de mortalidad en
pacientes con fibrosis quística, enfermedades neoplásicas y quemaduras severas. En ambientes
industriales y hospitalarios tiene la capacidad de sobrevivir y multiplicarse en medios húmedos, con el
mínimo de materia orgánica, condiciones favorables para convertirse en un gran contaminante y posterior
patógeno. Actualmente, este grupo de bacterias ocasiona un problema de salud pública, principalmente la
especie P. aeruginosa, debido a la notable incidencia en las infecciones intrahospitalarias; además ha
mostrado elevada multirresistencia a diferentes antibióticos.

OBJETIVO
Identificar el género Pseudomonas mediante pruebas bioquímicas y comprobar que es una bacteria no
fermentadora.
FUNDAMENTO
PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA Hugh & Leifson (O/F)

En el medio OF la concentración de peptonas está disminuida, la de carbohidratos aumentada y la de agar
disminuida (lo que le da consistencia semisólida) en comparación con los medios de fermentación.
La relación de proteínas: carbohidratos más baja reduce la formación de aminas alcalinas capaces de
neutralizar la pequeña cantidad de ácidos débiles que pueden formarse por el metabolismo oxidativo. La
mayor cantidad de carbohidratos sirve para aumentar la cantidad de ácidos que pueden formarse
potencialmente y la consistencia semisólida del agar permite que los ácidos que se forman en la superficie
del agar infiltren todo el medio lo que hace fácil su visualización del cambio de pH del indicador.
PRUEBA DE LA OXIDASA
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema de
citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es
reducido por el oxígeno molecular. La prueba utiliza ciertos
reactivos colorantes como clorhidrato de p-fenilendiamina, que
sustituye al O2 como aceptor de electrones.
Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-
fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo c en
su presencia, produciendo formas coloreadas (azul/morado).
Permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de
citocromo c) del género Pseudomonas (que posee citocromo c).
MATERIALES
 CEPAS
o Pseudomonas aeruginosa.
o Escherichia coli.
 PRUEBAS BIOQUIMICAS
o LIA, TSI, Citrato, MIO
.
o Agar Mac Conkey
o Agar Cetrimide
o Agar Tripticasa Soya
o Medio Hugh & Leifson (O/F)
 REACTIVOS
o Sol. de α-naftol / etanol.
o Sol. de Dimetil p-fenilendiamino/agua.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar en agar Mac Conkey las cepas de Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli tratando de
obtener colonias aisladas para poder sembrar en los medios de identificación bioquímica; incubar a
37 ºC x 24 h.
 Sembrar de una colonia aislada del agar Mac Conkey, en los medios de identificación bioquímica.
Luego incubar a 37 ºC x 24 h. Transcurrido ese tiempo realizar las lecturas correspondientes.
 Sembrar en medio O/F. En este medio se siembra por puntura hasta el fondo, se siembra en dos
tubos, uno con capa parafinada y otra sin ella. Se deja incubar por 48 h a 37 ºC.
 Sembrar en TSA para ver la producción de oxidasa, se deja incubar por 24 h a 37 ºC, luego de los
cuales se agrega los reactivos: 0,2 mL de la sol. de α-naftol y 0,3 mL de la solución de Dimetil-p-
fenilendiamino y proceder a leer. Alternativamente se puede coger un papel embebido con un
reactivo de oxidasa; en este papel se extiende con el asa de siembra un colonia. La reacción de color
positiva se produce a los 5 a 10 segundos (color azul-violeta).

PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA
Tubo abierto Tubo cubierto
Acido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
Acido (amarillo) Acido (amarillo) Fermentativo
PRUEBA DE OXIDASA
Positiva color azul-violeta

PRÁCTICA: XI
BACILOS GRAM POSITIVOS
Bacilos Gram positivos no esporulados aerobios
 Lactobacillus
Bacilos Gram positivos esporulados aerobios
 Bacillus subtillis, Bacillus cereus
Los bacilos Grampositivos aerobios incluyéndose a los anaerobios facultativos son comúnmente hallados
en el laboratorio de microbiología clínica, sobresaliendo por su naturaleza los géneros Bacillus y
Lactobacillus. La mayoría de estos bacilos son ubicuos en la naturaleza y habitan en suelos, aguas, en la
piel y mucosas de diversos animales; en el hombre especies de estos bacilos causan enfermedades
importantes.
Es esencial que el microbiólogo reconozca y diferencie si el bacilo Grampositivo aerobio esporula o no,
pues la formación de endosporas le confiere a estas bacterias, patogenicidad y resistencia al calor y
agentes químicos, constituyéndose en un gran problema tanto en medicina como en la industria
alimentaria.
BACILLUS
Este género es prototipo de la familia Bacillaceae. Son Bacilos Gram Positivos (BGP) grandes y
esporulados, no exigentes y en general móviles. Incluye bacterias aerobias y anaerobias facultativas.
Están ampliamente distribuidos en la naturaleza; algunos forman parte de la flora normal y suelen ser
contaminantes del laboratorio. El Bacillus anthracis es el más importante en microbiología médica y
veterinaria. Existe una gran diversidad de contenido G+C en su genoma, 32-62 mol % dentro del género,
lo que refleja su gran heterogeneidad.
Ciertos miembros del género tienen implicancias médicas por la producción de antibióticos como
polimixina y bacitracina, además de uso industrial en la producción de solventes, enzimas, vitaminas, etc.
Microscopía: se observan bacilos Gram positivos grandes (1 por 3 a

10 μm) de extremos rectos, aislados, en pares o cadenas con tinción
de Gram. Se observan áreas claras sin teñir que corresponden a
endosporas, ovoides, de posición subterminal, que no deforman el
soma bacteriano. Pueden teñirse con técnicas de coloración especiales
como el verde de Malaquita. La endospora solo se observa a partir de
cultivos viejos o mediante técnicas que provoquen la esporulación, no
a partir de muestras clínicas. Lo opuesto sucede con la expresión de la
cápsula, que se pierde al ser cultivada en medios artificiales.
Macroscopía: para su observación deben ser cultivados en medios

ricos y simples tales como agar sangre, agar chocolate y agar
nutriente.
LACTOBACILLUS
El género Lactobacillus está constituído por bacilos Grampositivos no esporulados clasificados en la

familia Lactobacillaceae.
Los lactobacilos carecen de sistema de citocromos y son incapaces de utilizar oxígeno como aceptor de
electrones. En lugar de ello estos bacilos aerotolerantes producen ácido láctico a partir de azúcares
sencillos y crecen bien en medios ácidos.

Son componentes importantes de la flora autóctona encontrándose en la vagina, tracto intestinal y cavidad
oral. También son utilizados en la industria producir yogurt, encurtidos y mantequilla.
Desarrollan generalmente en agar sangre y en agar chocolate. También se obtiene buen desarrollo en el
medio selectivo de Rogosa, agar jugo de tomate que tienen pH ácido.
Identificación de Bacilos Gram Positivos (BGP)
Al igual que para la identificación de cualquier especie bacteriana, lo primero a realizar es un frotis con
tinción de Gram. Luego debemos conocer los requerimientos atmosféricos de la cepa a identificar, ya que
sabemos que este grupo posee tanto bacterias aerobias como aerobias facultativas y anaerobias. Para esto
sembramos en un caldo de tioglicolato. Realizaremos posteriormente un cultivo en medios agar simple,
agar sangre y las diferentes pruebas bioquímicas.
Grandes
esporulados

- 
Bacillus subtilis.
Otros.
Catalasa + Lecitinasa
 Clostridium
+
Bacillus anthracis Clostridium botulinum

botulinum
☺ Sabias que ………

Es un desafío para el egresado de la EAP de Ciencia de los Alimentos diferenciar B. anthracis de
las muchas especies no patógenas que se encuentran en el ambiente como contaminantes.
Las pruebas más comúnmente realizadas son las que se observan en el diagrama (en la parte
superior): lecitinasa, movilidad, y otras como indol, nitratos, citrato, Voges Proskauer, etc.; además
de la observación de la macroscopía y microscopía, bastante características de cada especie en
particular.
También se pueden utilizar técnicas de biología molecular como análisis de los fragmentos de
restricción o métodos inmunológicos para detección de las toxinas.

OBJETIVO:
Reconocer y diferenciar las especies Grampositivas aerobias o anaerobias facultativas esporuladas y no

esporuladas de los géneros Bacillus y Lactobacillus de importancia clínica y alimentaria.
MATERIALES:
Microorganismos
 Bacillus cereus
 Bacillus subtilis

Medios de Cultivo
 Agar TSA
 Agar Mossel
 Agar leche descremada
 Medio tioglicolato
PROCEDIMIENTO
Sembrar por la técnica de aislamiento en agar TSA y hacer dos líneas en los otros agares con
las muestras de Bacillus cereus y Bacillus subtilis
Incubar las placas a 37 ºC x 24 h
En la placa de agar Mossel, interpretar directamente luego de la incubación. Se observa un
halo opaco o transparente.
En el agar leche descremada sembrar la cepa de Lactobacillus, y luego incubar en
condiciones anaeróbicas
En los tubos con medio tioglicolato sembrar con el asa en aguja
Realizar la prueba de catalasa, tomando una colonia aislada de una placa y disolviendo en
una gota de suero, luego agregar gotas de peróxido de Hidrógeno, es positivo cuando se
generan burbujas.
RESULTADOS:
Microorganismo Hemólisis A. Mossel M. Tioglicolato Catalasa
Bacillus
cereus
Bacillus subtilis
Lactobacillus sp.

PRÁCTICA: XII
ANAEROBIOS ESTRICTOS
 Clostridium perfringens
 Clostridium sporogenes
ANAEROBIOS ESTRICTOS
Las bacterias anaerobias pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, y éste les es tóxico.
Las anaerobias facultativas pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero en este caso el oxígeno
no les es tóxico.
Los géneros que se encuentran clasificados en anaerobios estrictos están: Bifidum, Sarcina, Clostridium,
Bacteroides y Eubacterium entre otros.
Género Clostridium
Comprende organismos normalmente presentes en el suelo, especies responsables de enfermedades del

hombre y animales y algunas asociadas con alteraciones de los alimento.
Clostridium “fusiforme”, describe el aspecto de muchos miembros del género, porque frecuentemente las
esporas distienden la célula bacteriana.
Los miembros del género Clostridium son anaerobios obligados, son a menudo grandes y rectos, pero se
hallan también formas delgadas o filamentosas. Tienen escasa tendencia a la formación de cadenas, su
longitud varía entre 3 y 8 um. Algunas esporas de Clostridium pueden resistir temperaturas de 120 ºC
durante15 minutos.
Las especies más importante son el Clostridium botulinum productor del botulismo, el Clostridium novyi,
Clostridium septicum, Clostridium perfringens productor de la gangrena gaseosa y Clostridium tetani
productor del tétanos.
MÉTODOS DE CULTIVO EN ANAEROBIOSIS

1. SIEMBRA EN PROFUNDIDAD EN PLACA
Transfiera 1 ml del inóculo a una placa Petri estéril vacía, añada el medio de cultivo con agar fundido y
atemperado a 45 – 50ºC, y homogenice la mezcla girando repetidamente las placas de modo que se
distribuya el inóculo uniformemente. Una vez que haya solidificado el agar, añada una segunda capa del
medio de cultivo. Este método no es muy eficaz debido a que el O 2 se difunde pronto.
2. SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO SÓLIDO FUNDIDO

Transferir el inóculo con una pipeta estéril o un asa de siembra a un tubo con el medio de cultivo fundido
y atemperado a 45-50ºC. Dejar enfriar el tubo antes de la incubación para que solidifique el agar.
NOTA: No agite el tubo durante la siembra para evitar la oxigenación del medio.
3. SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO

Transferir el inóculo a un tubo de medio de cultivo líquido (caldo), y añadir una capa de vaselina estéril,
de forma que la superficie del caldo quede totalmente cubierta para impedir la difusión del O 2 al medio.
Antes de inocular es conveniente hervir el medio durante 10 minutos para liberar el O2.
4. UTILIZACIÓN DE JARRAS DE ANAEROBIOS

Para conseguir unas condiciones de anaerobiosis más estrictas que las descritas anteriormente, se pueden
introducir los tubos y placas en una jarra especial donde la atmósfera está libre de O2, llamada jarra de
anaerobiosis.

MÉTODO DE JARRA Y VELA
Para conseguir la atmósfera anaerobia se necesita un frasco con tapón de

rosca y una vela. Una vez sembradas las placas y los tubos, se colocan en
el interior del frasco junto con la vela encendida y se cierra en el interior
del frasco junto con la vela encendida y se cierra el frasco
herméticamente. El cese de la combustión de la llama será el indicador de
que se ha consumido todo el O2 del frasco.
NOTA: Se consigue una atmósfera de 5 -7% O2 (microaerofílico)
 RECIPIENTE GASPAK E INDICADOR AZUL DE

METILENO
a
La jarra de anaerobiosis consta de un soporte para las
placas incluido en una cubeta transparente con tapa
hermética y con un catalizador. Para crear la atmósfera
anaerobia se utiliza un sobre comercial que elimina el
O2 y desprende CO2. Dicho sobre contiene una tableta
de borhidruro sódico (NaBH4) y otra de bicarbonato
sódico (NaHCO2) y ácido cítrico (C6H8O7).
Las placas y los tubos sembrados se colocan dentro del
soporte en el interior de la jarra junto al sobre abierto
que previamente se le han añadido 10ml de agua
desionizada estéril para generar la liberación de dióxido
de carbono (CO2) e hidrógeno (H2), mediante las
siguientes reacciones químicas:
El paladio o platino al ser calentados, actúan
como catalizador, dando lugar a la formación de
agua (H2O) a partir del H2 generado y el O2
contenido en la atmósfera del frasco.
Para confirmar que la atmósfera es anaerobia, se coloca dentro de la jarra una tira de papel impregnada
con un indicador que vira de color en presencia de CO2. Como el azul de metileno que es de color azul
cuando se expone al aire y se vuelve incoloro cuando está totalmente reducido. Incubar las placas dentro
de la jarra de anaerobiosis durante 48 horas a la temperatura más adecuada.
MEDIOS DE CULTIVO
1. MEDIO DE TIOGLICOLATO
Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Contiene
tioglicolato de sodio y císteina para reducir el potencial redox del medio. Logrando que haya oxígeno en
la superficie y no en el resto del tubo. Posee un indicador redox, resazurina, el cual en presencia de
oxígeno toma un color rojo o rosado fucsia y en ausencia de oxigeno es incoloro. La baja cantidad de agar
ayuda a retardar la dispersión de CO2 y O2
2. AGAR SANGRE
Las placas de agar sangre son preparadas con agar tripticasa soya (TSA) u otro
agar base, y un 5% de sangre de cordero desfibrinada, se inocula el espécimen y
es llevada a la jarra de anaerobiosis.
En el agar sangre, Clostridium perfringens forma colonias rodeadas por una
doble zona de hemólisis característica, donde la hemólisis interior es completa
mientras que la hemólisis exterior es incompleta, mientras que Clostridium
sporogenes, no produce hemólisis.

☺SABIAS QUE….
La prueba de CAMP inversa, en donde se inocula en agar sangre una
estría del microorganismo sospechoso y otra de un Estreptococo del grupo
B formando un ángulo recto. Si la reacción es positiva, tras la incubación
aparece una zona de hemólisis sinérgica en forma de punta de flecha.
3. AGAR SELECTIVO PARA CLOSTRIDIUM

Es un medio de cultivo que como su nombre indica sirve para el aislamiento de Clostridium patógenos.
La selectividad de este medio se debe a dos inhibidores, la azida y la neomicina. Además de poseer
sustancias reductoras como el tioglicolato, formaldehidosulfoxolato y cistina, las cuales proporcionaran
las condiciones de anaerobiosis.
PARTE EXPERIMENTAL
OBJETIVOS:
 Conocer los requisitos para cultivar y lograr el desarrollo de bacterias anaerobias estrictas, como
las técnicas usadas comúnmente.
 Aprender los métodos mas usados en la siembra de anaerobios
 Conocer las pruebas bioquímicas que se realizan
MATERIALES
 Microorganismos
o Clostridium sporogenes
o Lactobacillus
o
 Medios de Cultivo
o Agar selectivo para Clostridium
o Agar Sangre
o Medio tioglicolato
o Caldo nutritivo
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra de Clostridium sporogenes con la ayuda de una asa en aguja en forma
perpendicular hasta casi el fondo del tubo con medio tioglicolato.
2. Sembrar empleando la técnica de aislamiento la muestra de Clostridium sporogenes en el agar
selectivo para Clostridium y en placas de agar sangre.
3. Colocar las placas y los tubos a una jarra para anaerobiosis o en una jarra bien cerrada con una vela
prendida adentro.
4. Incubar las placas y tubos a 37 ºC por 24-48 hs.
5. Describir e interpretar los resultados en el medio tioglicolato
6. Observar y describir el desarrollo de las colonias en la placa.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES
 OBSERVACIONES DE LOS TUBOS
Descripción de resultados
Medio tioglicolato
Caldo nutritivo
Conclusiones:
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
 OBSERVACIONES DE LAS PLACAS

Descripción de colonias
AGAR SANGRE
AGAR SELECTIVO DE
CLOSTRIDIUM

PRÁCTICA: XIII
COCOS GRAM POSITIVOS
 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
 Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, y Streptococcus pneumoniae
El creciente aumento de las infecciones estafilocócicas adquiridas en los hospitales y resistentes a la

terapia antimicrobiana, ha dado como resultado el desarrollo de numerosas pruebas para la identificación
de estafilococos. Así mismo en la industria de alimentos es un problema latente ya que muchas personas
que manipulan alimentos directamente, son portadores sanos de esta bacteria.
Los cocos Gram positivos se pueden clasificar de acuerdo a sus requerimientos de oxígeno en:
 Cocos Gram positivos anaerobios estrictos

 Cocos Gram positivos aerobios
 Cocos Gram positivos anaerobios facultativos
IDENTIFICACIÓN DEl GÉNERO: COCO GRAM-POSITIVOS
Cocos Gram positivos
Catalasa
( +) ( )
Staphylococcus Streptococcus
Coagulasa Hemólisis
(+) ( ) (1) Beta: Bacitracina (+) S. pyogenes (grupo A)

Staphylococcus Staphylococcus CAMP (+) S. agalactiae (grupoB)
aureus epidermidis
(2) Alfa: Optoquina (+) S. pneumoniae
(3) Gamma: Bilis esculina (+),6.5%NaCl(+)(grupo D)

Enterococcus
Bilis esculina (+) ,6.5%NaCl (-)(Grupo D)
No Enterococcus

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESTAFILOCOCOS
En ocasiones las colonias de estafilococos y micrococos en medio de agar, se pueden confundir con las de
algunos estreptococos. La diferenciación se lleva a cabo rápida y fácilmente mediante la prueba de la
catalasa, los estafilococos y micrococos descomponen el peroxido de hidrogeno (catalasa positivo), pero
no los estreptococos.
Morfología microscópica: Para la misma se debe realizar un frotis, de preferencia a partir de medio
liquido, realizando luego la tinción de Gram, lo que nos permitirá apreciar la forma, agrupación de la
cepa en estudio.
En el Agar sangre Colonias circulares de 1-2mm de diámetro, lisas. Habitualmente producen hemólisis
(β-hemólisis) las cepas de Staphylococcus aureus.
Las cepas de Staphylococcus epidermidis en cambio tienen gamma-hemólisis (alguna literatura ya no
considera este tipo de hemólisis).
En el Agar manitol salado: Staphylococcus aureus da colonias grandes, convexas, con halo amarillo
intenso (debido a la producción de ácido a partir del manitol, lo que hace virar al indicador rojo de fenol).
Las cepas de Staphylococcus epidermidis en cambio son pequeñas y sin cambio de color.
El medio de Baird Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros gérmenes Gram positivos
presentándose las colonias de Staphylococcus aureus negras con borde incoloro, convexas, rodeadas de
una zona opaca con una zona clara externa.
El agar DNasa. Contiene DNasa, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa en
bacterias S. aureus producirá una lisis del DNA presente en la placa si posee esta enzima, con el
consiguiente aclaración del medio.
Prueba de Coagulasa

OBJETIVO
Aislar e identificar estafilococos
Materiales:
 Cepas de Bacterias
o Staphylococcus aureus
o Staphylococcus epidermidis
 Medio de cultivo
o Placas de agar sangre
o Placas de agar manitol salado
o Placas con agar tripticasa soya
o Placas con agar DNA
o Placas con agar Baird Parker
o Tubos con gradiente de solución salina (1%,5%,10%)
 Reactivos
o Set de colorantes para Gram.
o Acido clorhídrico concentrado.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar por la técnica de aislamiento en agar sangre, TSA, manitol salado y Baird Parker las
muestras de Staphylococcus aureus y S. epidermidis.
 Sembrar las muestras en forma de estría en agar DNAsa.
 Incubar las placas a 37 ºC x 24h.
 Realice un frotis de las colonias aisladas en manitol salado y colorear con Gram.
 Observar con el microscopio de inmersión.
 Sembrar las muestras en los tubos con la gradiente de concentración salina.
 Agregar ácido clorhídrico concentrado ala placa de agar DNA y observar un halo transparente
alrededor de las colonias.
Bacteria Coloración Fermentación de
Gram Manitol Hemólisis DNAsa
S. aureus
S. epidermidis

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS
Los estreptococos tienen una historia interesante y como género bacteriano individual han causado
probablemente más enfermedad y morbilidad humana a través de los siglos que casi cualquier bacteria,
con la posible excepción del bacilo tuberculoso. Originalmente han sido agrupados por su capacidad para
producir lisis de los hematíes; y así tenemos los estreptococos alfa hemolíticos, estreptococos beta
hemolíticos y los estreptococos gamma hemolíticos según la lisis sea parcial, total y nula
respectivamente.
De gran importancia en la constitución de la flora microbiana normal y en la patogenicidad del sistema
respiratorio, su virulencia depende de la producción de ciertas toxinas (hemolíticas, leucocidina,
eritrogénicas, etc.) y enzimas (fibribolisina, hialuronidasa, etc.)
Podemos clasificar a los Estreptococos de muy diversas formas según sea el objetivo y necesidad de dicha
clasificación.
Según el tipo de hemólisis producida:
α-hemólisis β-hemólisis Gamma hemólisis

Streptococcus pyogenes
NO SIEMPRE NO
Streptococcus agalactiae
NO GENERALMENTE A VECES
Streptococcus bovis
A VECES A VECES GENERALMENTE
Streptococcus neumoniae
SIEMPRE NO NO
Streptococcus Grupo
GENERALMENTE NO NO
Viridans
Según sus antígenos específicos: (Grupos de Lancefield):

Los estreptococos poseen unos antígenos específicos de naturaleza hidrocarbonada que pueden ser
puestos de manifiesto mediante diversas técnicas inmunológicas, como la aglutinación.
Los grupos antígenos mas importantes son los grupos A, B y D seguidos de C, F y G.
Algunos Streptococcos como S. pneumoniae no poseen antígenos de Lancefield demostrables. Los
Streptococcus no agrupables y alfa hemolíticos se conocen con el nombre de Streptococos viridans.
ANTIGENO ESPECIE HEMÓLISIS

GRUPO A S. pyogenes Β hemolítico, siempre
GRUPO B S. agalactiae Β hemolítico generalmente
GRUPO D E. faecalis No hemolitico generalmente
GRUPO D S. bovis No hemolitico generalmente
No agrupable S. pneumoniae α hemolítico siempre
No agrupable Estreptococos grupo viridans α hemolítico generalmente
Agrupable o no Estreptococos grupo milleri Alfa, beta o no hemolítico

OBJETIVO
Entrenar al estudiante en el aislamiento, coloración e identificación de estreptococos.
MATERIALES
 CEPAS DE BACTERIAS
o Streptococcus sp.
o Streptococcus mutans
o Placas de agar sangre
o Placas con Agar BHI
o Tubo con caldo tioglicolato
 REACTIVOS
o Set. de colorantes para Gram
PROCEDIMIENTO
 Siembre con un asa de Kohle procurando aislar las bacterias en las placas de agar sangre.
 Siembre en el tubo que contiene caldo tioglicolato.
 Incubar a 37 ºC por 24 horas en anaerobiosis.
 Después de la incubación, seleccione una colonia β-hemolítica y realice una coloración Gram.
 Observe con lente de inmersión.
Realizar la lectura teniendo en cuenta:
 En el caldo tioglicolato: Desarrolla grumos pequeños sin producir turbidez
 En el agar sangre: Observe de preferencia las colonias puntiformes y rodeadas de β hemólisis
β-hemólisis son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose como un
halo transparente alrededor de las colonias.
α-hemólisis Son aquellos que producen hemólisis parcial la cual se observa como un halo con tonalidad
verdosa alrededor de las colonias.
 –hemólisis Son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.
 Anote las características de forma y reacción Gram.

PRÁCTICA: XIV
MICOLOGÍA
 Cultivo de mohos ambientales y levaduras.
 Cultivo de dermatofitos.
Micología
LOS HONGOS - GENERALIDADES
Los hongos son organismos:
Constituidos por células que poseen orgánulos

Eucarióticos membranosos y núcleo rodeado por membrana.
No pueden fotosintetizar por carecer de clorofila y,

por tanto, deben utilizar el carbono de los compuestos
Heterótrofos
orgánicos.
Es decir sólo son capaces de incorporar nutriente

Se nutren por absorción simples solubles.
En la mayoría de los casos la quitina es el

Presentan pared celular rígida componente más importante.
Morfología y estructura
En la naturaleza pueden encontrase formas muy simples como las levaduras, formas filamentosas
multinucleadas y estructuras macroscópicas más complejas como los denominados hongos de sombrero.
- Levaduras: Son hongos unicelulares. Pueden ser esféricas, ovoides, elípticas,

cilíndricas o muy alargadas. La mayoría de las veces se encuentran aisladas, pero, en
algunos casos permanecen unidas formando pseudohifas, cuyo entrecruzamiento
constituye el pseudomicelio. Ejemplo: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.
- Hongos filamentosos: Están constituidos por un conjunto de filamentos llamados

hifas, cuyo entrecruzamiento constituye el micelio. Las hifas pueden poseer septos a
intervalos regulares o carecer de ellos. Cuando un hongo presenta hifas no septadas
se dice que su micelio es cenocítico. Ejemplo: Cladosporium, Penicillium,
Alternaria, Aspergillus, Mucor.
- Hongos de sombrero: Presenta estructuras subterráneas formadas por la

ramificación y el entrecruzamiento de las hifas. Además desarrollan un conjunto de
hifas aéreas que forman un cuerpo denominado seta. Ejemplo: Pleurotus ostreatus,
Agaricus bisporus (Champiñón).

Micelio
Según su función, el micelio de los hongos se diferencia en:
- Micelio vegetativo: Esta constituido por hifas que crecen dentro y sobre el sustrato que contiene los
nutrientes. Cumple funciones de absorción.
- Micelio aéreo o de reproducción: Esta constituido por estructuras aéreas que se originan a partir del
micelio vegetativo y, como su nombre lo indica, cumple funciones relacionadas con la reproducción y
multiplicación.
REPRODUCCIÓN
Pueden presentar dos tipos de reproducción: Sexual y asexual.
No todos los hongos se reproducen de las dos maneras, algunos sólo de forma asexual, los hongos que se
reproducen de forma asexual son los hongos imperfectos (anamorfos). Los hongos que se reproducen
tanto asexual como sexual son los hongos perfectos (teleomorfos).
Esporas asexuales Esporas sexuales
 Endosporas Oosporas
- Esporangiosporas
Zigosporas
 Exosporas (Conidias)
- Artroconidias Ascosporas
- Blastoconidias
- Clamidosporas Basidioesporas
DERMATOFITOS
Son un grupo de hongos que presentan la capacidad de invadir los tejidos queratinizados (piel, pelo, uñas)
del hombre y de los animales, produciendo una enfermedad que se denomina dermatofitosis o, más
comúnmente, tiña.
Su identificación rutinaria en el laboratorio se basa fundamentalmente en criterios morfológicos, macro y

microscópicos. Los géneros que agrupan a las especies productoras de dermatofitosis son:
Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton.
En medios selectivos para el aislamiento de dermatofitos son hongos hialinos que forman colonias que
presentan en general colores claros, con gamas de color restringidas a tonos blanquecinos, amarillentos y
marronáceos.
Existen diferentes estructuras microscópicas a tener en cuenta para la identificación de estos hongos
(clamidosporas, distintos tipos de hifas, etc.). No obstante, la forma y distribución de macroconidias y
microconidias es fundamental a la hora de definir los géneros y especies.

OBJETIVOS
 Observar diferencias morfológicas entre hongos filamentosos y levaduras.
 Observar colonias de diferentes especies de levaduras.
 Poner de manifiesto las principales características microscópicas de las levaduras, hongos
filamentosos y dermatofitos.
MATERIALES:
 Cultivos puros en Agar Sabouraud de Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus
niger
 Cultivos puros en Agar selectivo para dermatofitos de Microsporum canis
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Solución de KOH al 10%
 Placas de Agar Sabouraud
 Agar Selectivo para Dermatofitos (DTM)
PROCEDIMIENTO:
1. A partir de los cultivos puros se inoculan las dos levaduras en placas de agar Sabouraud. Para ello se
toma una pequeña parte de una colonia aislada y se realizan estrías en una porción de la placa. Se
incuban las placas durante tres días a temperatura ambiente.
2. Observar al microscopio las estructuras características de cada especie. Colocar en un portaobjetos
una gota de solución de KOH al 10% sobre al cual se suspenderá una pequeña cantidad de inóculo.
Observar con objetivo de 10 X y 40 X
3. Exponer placas destapadas de agar Sabouraud durante un período no menor de 10 minutos. Luego
incubar a temperatura ambiente por una semana.
4. A partir de un cultivo puro de dermatofitos, sembrar en agar selectivo para dermatofitos (DTM).
RESULTADOS:
1. Observación microscópica y macroscópica: Esquematice y describa las estructuras observadas
- Levadura:
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______________________________________
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- Hongo Filamentoso:
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- Dermatofito:
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______________________________________
 Otro: ……………………………………….
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______________________________________
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______________________________________
______________________________________
 Otro: ……………………………………….
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Microbiology”. 8ª ed. Mc Graw-Hill Science.
2. Botero M, Toro D, Castaño J. Manual práctico de Microbiología General. 1ra. Edición. Editorial
Universidad de Caldas. Manizales. 2011.
3. Brooks, G.F, K.C. Carroll, J.S. Butel, S.A. Morse. 2007. Medical Microbiology, (Jawetz, Melnick &
Adelberg’s Medical Microbiolgy) 24 ed. Mc Graw- Hill Medical
4. FDA/BAM (Division of Microbiology Center for Food Safety and Applied Nutrition U.S. Food and
Drug Administration). 1999. Bacteriological Analytical Manual. 9ª ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~comm/microbio.html.
5. Gamazo C, Sánchez S, Camacho A. Microbiología basada en la Experimentación.1ra. edición. Edit.
Elsevier. Barcelona. 2013.
6. Kaiser G.E. 2007 BIOL 230 Microbiology Lab Manual 9ª ed. Baltimore.
7. Koneman, EW. et al. Diagnóstico Microbiológico; 5ta. Edición. Editorial Médica Panamericana.
Buenos Aires 2004
8. Lindquist, J. A. 2006. General Microbiology: A Laboratory Manual, Fourth Edition. McGraw-Hill
9. Mac Faddin J.F. 2003 Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia
Clínica 3ª ed. Buenos Aires: Médica Panamericana
10. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. 2004. Brock. Biología de Los Microorganismos. 10ª
ed. Pearson Education.
11. Merck Microbiology Manual 12th Edition. 2007 Darmstadt
12. Murray, P.R., K.S. Rosenthal, M.A Pfaller. 2006. Microbiología Médica. 5ª ed. Elsevier.
13. PANREAC QUÍMICA 2003 Manual Básico de Microbiología. España
14. Organización Mundial de la Salud. 2005 Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. – 3ª ed. Ginebra
15. Tortora G.J., B.R. Funke, C.L. Case. 2007. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires.
16. Winn, WC., Allen, SD., Janda, W., Koneman, EW. 2008. Diagnostico Microbiológico, 6ª Edición.
Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.
LABORATORIOS Y PAGINAS WEB

1. Laboratorios Britania
Laboratorio argentino de medios de cultivo
http://www.britanialab.com.ar/esp/paginas/empresa.htm
2. Laboratorios BD
Link donde encontraran numerosos archivos de medios de cultivo
http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/qcpiManual.asp
3. Laboratorios Oxoid
Excelente página donde encontrará información sobre medios de cultivo
http://www.oxoid.com/uk/blue/index.asp
4. BIOLOGY WEB SITE REFERENCES FOR STUDENTS AND TEACHERS
Enlaces interesantes para la práctica de microbiología
http://www.kensbiorefs.com/Microbio.html
5. LAB MANUAL
Interesante manual de la Universidad de Fullerton
http://biology.fullerton.edu/biol302/302labf99/manual.html
6. MANUAL DE LABORATORIO EN INGLES
excelente manual completo de practicas de microbiología
http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/labmanua/toc.html
7. MICROBE LIBRARY
Página de la asociación americana de microbiología, la cuál tiene una interesante galería de fotos de
acceso libre
http://www.microbelibrary.org/index.asp

ANEXO: BIOSEGURIDAD
Bioseguridad
Conjunto de medidas preventivas reconocidas internacionalmente orientadas a proteger la salud y la
seguridad del personal y su entorno. Complementariamente se incluye normas contra riesgos producidos
por agentes físicos, químicos y mecánicos. Modernamente se incorporan también las acciones o medidas
de seguridad requeridas para minimizar los riesgos derivados del manejo de un organismo modificado
genéticamente (OMG), sus derivados o productos que los contengan, y uso de la tecnología del ADN
recombinante (ingeniería genética) y otras técnicas moleculares más recientes.
Agentes Biopeligrosos
Son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres
humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos,
productos recombinantes, alergenos, priones, etc.
Riesgo Microbiológico
En el Laboratorio de Microbiología existen dos fuentes principales de peligros biológicos, uno de ellos lo
representa el procesamiento de muestras provenientes de un paciente y en segundo lugar el manejo de
cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a
provocar una infección si no son manipulados con precaución.
El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que realicemos una actividad práctica en el
Laboratorio de Microbiología, razón por la cual debemos llevarlas a cabo con precaución, además de
tener un ambiente de trabajo en el que seamos capaces de reconocer y evitar los peligros involucrados con
estas actividades, para así poder evitar posibles accidentes.
Cabina de seguridad biológica: Son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar
de forma segura con agentes infecciosos. Permiten proteger según su diseño y clasificación al trabajador,
medio ambiente o al producto. Es una combinación de elementos electromecánicos/electrónicos y
procesos físicos que impulsan el aire a través de unos filtros especiales de gran superficie
estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas del 99,99%,
cuando el tamaño de éstas es de 0,3 μ.
Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo

Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los
animales.
Ejemplo: E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la industria de la
alimentación para la elaboración de quesos, embutidos, entre otros.
Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)
Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas
probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el
medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen
medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.
Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella sp, entre otros.
Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario
no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
Ejemplo: M. tuberculosis, Brucella sp, Coxiella burneti, entre otros.
Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas
preventivas y terapéuticas eficaces.
Ejemplo: Arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa, Machupo, Ebola, Hantavirus, etc.

Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el equipo
GRUPO DE NIVEL DE TIPO DE PRÁCTICAS DE
EQUIPO DE BIOSEGURIDAD
RIESGO BIOSEGURIDAD LABORATORIO LABORATORIO
Básico Enseñanza básica, Ninguno, trabajo en mesa de

1 TMA
Nivel 1 investigación laboratorio al descubierto
Servicios de atención Trabajo en mesa al

Básico TMA y ropa protectora;
2 primaria; diagnóstico, descubierto y CSB para
Nivel 2 señal de riesgo biológico
investigación posibles aerosoles
Prácticas de nivel 2 más CSB además de otros

Contención Diagnóstico especial, ropa especial, acceso medios de contención
3
Nivel 3 investigación controlado y flujo primaria para todas las
direccional del aire actividades
Prácticas de nivel 3 más CSB de clase III o trajes

cámara de entrada con presurizados junto con CSB
Contención
4 Unidad de patógenos cierre hermético, salida de clase II, autoclave de
máxima
con ducha y eliminación doble puerta (a través de la
especial de residuos pared), aire filtrado
TMA: Técnicas Microbiológicas apropiadas CSB: Cámara de Seguridad Biológica
Resumen de los requisitos por nivel de bioseguridad

NIVEL DE BIOSEGURIDAD
1 2 3 4
a
Aislamiento del laboratorio No No Sí Sí
Sala que pueda precintarse para ser descontaminada No No Sí Sí
Ventilación:
- Flujo de aire hacia el interior No Conveniente Sí Sí
- Sistema de ventilación controlada No Conveniente Sí Sí
- Salida de aire con HEPA No No Sí/Nob Sí
Entrada de doble puerta No No Sí Sí
Cámara de cierre hermético No No No Sí
Cámara de cierre hermético con ducha No No No Sí
Antesala No No Sí
Antesala con ducha No No Sí/Noc
Tratamiento de efluentes No No Sí/Noc Sí
Autoclave:
- En el local No Conveniente Sí Sí
- En la sala de trabajo No No Conveniente Sí
- De doble puerta No No Conveniente Sí
CSB No Conveniente Sí Sí
d
Capacidad de vigilancia de la seguridad del personal No No Sí
a
Aislamiento ambiental y funcional respecto del tráfico general
b
Según la localización de la salida de aire
c
Según cuales sean los agentes empleados en el laboratorio
d
Por ejemplo, ventana, sistema de televisión en circuito cerrado, comunicación en dos sentidos
HEPÁ: Filtración de partículas aéreas de gran eficiencia (del inglés (High-Efficiency Particulate Air)
CSB: Cámara de seguridad biológica


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Guía de Prácticas – Microbiología General 2019-I

EP. Farmacia y Bioquímica

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

 DRA. MARIA ELENA SALAZAR SALVATIERRA

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 1

6 NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

8 PRACTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

13 PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

18 PRÁCTICA III: TINCIONES MICROBIANAS

25 PRÁCTICA IV: RECUENTO MICROBIANO

28 PRÁCTICA V: GENÉTICA MICROBIANA

32 ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS

37 PRÁCTICA VI: NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

42 PRÁCTICA VII: METABOLISMO MICROBIANO

48 PRÁCTICA VIII: BACILOS GRAM NEGATIVOS 1

52 PRÁCTICA IX: BACILOS GRAM NEGATIVOS 2

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 2

55 PRÁCTICA X: BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

58 PRÁCTICA XI: BACILOS GRAM POSITIVOS

61 PRÁCTICA XII: ANAEROBIOS ESTRICTOS

65 PRÁCTICA XIII: COCOS GRAM POSITIVOS

70 PRÁCTICA XIV: MICOLOGÍA

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 3

Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de

El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se

Esta guía contiene 14 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 4

Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados.

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 5

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

INSTRUCCIONES ESPECÍFICAS PARA EL TRABAJO EN EL

NORMAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 6

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

ES PRECISO SER RESPONSABLE, ORDENADO Y RÁPIDO PARA LA

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 7

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS, APARATOS Y MATERIALES DE

Autoclave Placas Petri

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 8

Agente Sistema de Esterilización Método

ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DE MATERIAL CONTAMINADO

PROCESO DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Y CALOR

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 9

EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 10

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

A) Por su estado físico:

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 11

EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 12

Condiciones para la siembra de los microorganismos:

Manejo del asa de siembra durante una inoculación

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 13

Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo

1. Siembra en Medio Líquido o Caldo (Fig. 1)

Fig. 2: Siembra en agar inclinado

Fig. 1: Siembra en medio líquido Fig. 3: Siembra

Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 14

Siembra por Siembra por aislamiento

LECTURA DE COLONIAS, ESTUDIO DE CRECIMIENTO MICROBIANO

En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se