EVALUACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE LICOPENO EN FRUTOS DE GUAYABA

(Psidium guajava L.) PRE-TRATADOS CON PECTINASA – ESTUDIO PRELIMINAR.

JENNY CAROLINA ROSERO HENAO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE PALMIRA

FACULTAD DE INGENIERÍA Y ADMISNISTRACIÓN

INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PALMIRA

2012
 EVALUACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE LICOPENO EN FRUTOS DE GUAYABA
(Psidium guajava L.) PRE-TRATADOS CON PECTINASA – ESTUDIO PRELIMINAR.

JENNY CAROLINA ROSERO HENAO

Trabajo de grado presentado para optar al título de:

Ingeniera Agroindustrial

Dirigido por:

LUIS EDUARDO ORDÓÑEZ SANTOS

Ingeniero Agroindustrial, Ph.D en Ciencia y Tecnología de Alimentos.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE PALMIRA

FACULTAD DE INGENIERÍA Y ADMISNISTRACIÓN

INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PALMIRA

2012
 Nota de Aceptación:

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

Firma del Director

Palmira, Valle del Cauca. 29 de Julio de 2012

 A mi Madre, Elizabeth Henao Morales

A mi Padre William Hurtado Herrera y

A mi Abuela Edelmira Morales

Porque son la razón de todo lo que soy…

 AGRADECIMIENTOS

Habiendo alcanzado este logro quiero agradecer a:

La Universidad Nacional de Colombia nido de experiencias, conocimiento y

posibilidades.

Al profesor Luis Eduardo Ordoñez Santos quien no sólo puso a mi disposición todos
los recursos necesarios para el correcto desarrollo de este trabajo de grado, sino que
también me brindo lecciones académicas y personales que he de tener presentes para
muchos aspectos en mi vida.

A los profesores: Dra. Liliana Serna Cock, Dr. José Igor Hlaep, Dr. Pedro Vanegas y al
Dr. Hugo Alexander Martínez del Departamento de Ingeniería de la Facultad de
Ingeniería y Administración; por contribuir con sus conocimientos, sabiduría y
experiencia en mi formación.

A la Ingeniera Andrea Melisa Riascos, por su orientación y amistad a través de todo

este proceso de aprendizaje.

Al Grupo de Investigación en Procesos Agroindustriales GIPA, por apoyarme en la

realización de este estudio y abrir la etapa de Investigación en mi vida.

A María Enith Arias, auxiliar del laboratorio Tecnología de Frutas y Hortalizas de la

Universidad Nacional de Colombia – sede Palmira, por su orientación y sus consejos.

A mi familia por su apoyo incondicional, su paciencia y compañía. De ella replique

valores y cualidades como la perseverancia, la dedicación y la entrega.

A Diego Mauricio Carrera por complementar mi vida con su compañía, apoyo y

dedicación. A su lado, las dificultades son tan solo retos.
 TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN...................................................................................................................................................................12
2. OBJETIVOS.........................................................................................................................................................................13
GENERAL ...........................................................................................................................................................................13
ESPECÍFICOS ....................................................................................................................................................................13
3. MARCO TEÓRICO ...........................................................................................................................................................14
3.1. LA GUAYABA ...........................................................................................................................................................14
3.2. Los Antioxidantes en la Guayaba..................................................................................................................20
3.2.1. Los Carotenoides...............................................................................................................................................20
3.2.1.1. El Licopeno .......................................................................................................................................................21
3.2.1.1.1. Generalidades. ............................................................................................................................................21
3.2.1.1.2. Métodos de Extracción y Análisis. ....................................................................................................22
3.3. Uso de Enzimas para la Extracción de Compuestos Bioactivos....................................................23
4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................................26
4.1. Material de estudio. .............................................................................................................................................26
4.2. Tratamiento enzimático. ...................................................................................................................................27
4.3. Extracción y cuantificación de licopeno....................................................................................................28
4.4. Determinaciones fisicoquímicas de los frutos de guayaba. ............................................................30
4.4.1. Determinación de las Coordenadas de Color. ....................................................................................30
4.4.2. Determinación de Firmeza mediante el Penetrómetro. ...............................................................32
5.4.3. Determinación del Contenido de Sólidos Solubles (SS). ...............................................................33
5.4.4. Determinación del pH.....................................................................................................................................33
5.4.5. Determinación de la Acidez Titulable. ...................................................................................................34
5. ANÁLISIS ESTADISTICO. ............................................................................................................................................36
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ....................................................................................................................................37
7. CONCLUSIONES. .............................................................................................................................................................42
8. BIBLIOGRAFÍA. ...............................................................................................................................................................43
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Caracteristicas del Cultivo de Guayaba - Palmira ICA-1. ........................................ 15

Tabla 2. Producción Mundial de Mangos, Mangostanes y Guayabas, 2010. (ton.) ......... 16
Tabla 3. Producción por Región de Mangos, Mangostanes y Guayabas, 2010. (ton.) ... 16
Tabla 4. Área Cosechada, Producción y Rendimiento de la Guayaba en Colombia en
el 2010 ....................................................................................................................................... 17
Tabla 5. Composición Nutricional de la Guayaba ........................................................................ 19
Tabla 6. Tabla de análisis de varianza para modelo factorial con dos factores, efectos
fijos. .............................................................................................................................................. 36
Tabla 7. Caracterización Fisicoquímica de la Guayaba Fresca ............................................... 37
Tabla 8. Efecto de las variables estudiadas en la extracción de licopeno .......................... 39
Tabla 9. Índice de Aumento de Licopeno en Frutos de Guayaba Pre-tratados
Enzimáticamente .................................................................................................................... 40
 LISTA DE DIAGRAMAS

Diagrama 1. Producción de Guayaba por Departamento en Colombia .............................. 18

Diagrama 2. Opciones de Transformación Industrial de la Guayaba. ................................. 18
Diagrama 3. Estructura del Licopeno .............................................................................................. 21
Diagrama 4. Tratamiento Enzimático .............................................................................................. 29
Diagrama 5. Determinación de Coordenadas de Color - Cromaticidad de a*, b* ............ 31
Diagrama 6. Puntos de localización de las medidas de color ................................................. 31
Diagrama 7. Coordenadas de color en la Guayaba...................................................................... 39
 LISTA DE IMÁGENES

Imagen 1. Material Vegetal Seleccionado ....................................................................................... 26

Imagen 2. Preparación de las Muestras ......................................................................................... 27
Imagen 3. Chroma Meter CR-400 de KONICA MINOLTA. ........................................................ 32
Imagen 4. Penetrómetro Forcedial FDK 30 Wagner (R) ........................................................... 32
Imagen 5. Refractómetro ATAGO - Pal-1 ........................................................................................ 33
Imagen 6. pH-metro HANNA – HI 4221 .......................................................................................... 34
Imagen 7. Titulador BRAND-Titrette ®. ......................................................................................... 35
 RESUMEN

El licopeno es un carotenoide con conocidos beneficios en la salud humana y amplio

uso en la industria farmacéutica y de alimentos. El objetivo de esta investigación fue
evaluar el efecto de un pre-tratamiento enzimático en la extracción de licopeno en el
fruto de la guayaba (Psidium guajava L). Se evaluaron concentraciones de pectinasa de
0,01, 0,0135, 0,017 y 0,02% (v/p) a 28°C, pH 4,5 y con tiempos de tratamiento de 15,
30, 45 y 60 minutos, frente a un control. A cada una de las muestras se le determino
los sólidos solubles (SS), el pH, la acidez total (AT) y el contenido de licopeno por
espectrofotometría a 503nm. Los resultados indican que las características
fisicoquímicas de los frutos de guayaba utilizados en el presente estudio alcanzaron
valores de SS de 9,24±1,18°Brix, pH 4,19±0,09 y AT de 0,45±0,10% de ácido cítrico. El
contenido de licopeno de 38,89±0,02ug/g en fruta fresca, se logro aumentar de
manera significativa (p<0,0001) en un 38,6% con pectinasa al 0,02% a 45 minutos. Se
puede concluir que el tratamiento con pectinasa aumenta la biodisponibilidad del
licopeno en los frutos de guayaba, ofreciendo una alternativa interesante en los
procesos de extracción de tan importante antioxidante.

Palabras Clave: Extracción de licopeno, pre-tratamiento enzimático, pectinasa,

tiempo de incubación.
 ABSTRACT

Lycopene is a carotenoid with known positive effects on human health and a wide use
in the pharmaceutical and food industry. The aim of the present investigation was to
evaluate de effect of an enzymatic pre-treatment in its extraction, using guava
(Psidium guajava L) as a matrix tissue. Physical determinations such as firmness and
CieL*a*b* colour coordinates were used to standardize the grades of maturity of the
raw material used, and chemical characteristics such as soluble solids (9.24°Brix), pH
(4.19) and titrable acid (0.45%), of the fruit were determined. Thus, different ranges
of enzymatic concentrations of pectinase (0.01-0.02% v/w) and times of incubation
(20-65 min) were analyzed at 28°C and 4.5 of pH, gaining an effect of high stadistical
significance (<.0001) by the concentration, as opposed to de time of incubation. As a
result, a 38.65% increase in extraction was achieved at 0.02% and during a 50 min
incubation time.

Key words: Lycopene, Enzymatic pre-treatment, pectinase, enzymatic concentration,

time of incubation
 INTRODUCCIÓN

Las frutas son una fuente importante de micronutrientes de alto valor tales como
vitaminas, minerales esenciales, compuestos fenólicos, glucosinolatos y otras
sustancias bioactivas que contribuyen al buen funcionamiento del organismo, así
como al crecimiento y la reparación de los órganos y tejidos del cuerpo (FAO, 2003);
sus efectos benéficos para la salud han sido ampliamente documentado de manera
que en los últimos 15 años se ha asociado el incremento en el consumo de frutas a la
reducción del 35% del riesgo de desarrollar todos los canceres y a la disminución del
31% del riesgo de contraer cardiopatías, entre otras enfermedades crónicas, mucho
de lo cual ha sido específicamente adjudicado a compuestos que actúan como
antioxidantes tales como el licopeno, este es actualmente usado como un aditivo en la
industria de alimentos con el objetivo de mantener la calidad nutricional y sensorial,
así como en la industria farmacéutica (Jacoby & Keller 2006; Rojas-Barquera &
Narváez-Cuenca, 2009; Østerlie & Lerfall, 2005, citado por: Kong & Ismail, 2011)

Por lo anterior en los últimos años ha surgido un creciente interés por la extracción y
búsqueda de fuentes alternativas del licopeno (Kong & Ismail, 2011) donde el fruto de
la guayaba (Psidium guajava L), al cual le atribuyen un contenido entre 4-6 mg/100g
de porción comestible (Wilberg & Rodríguez, 1995, citado por: Kong et al., 2010),
representa una valiosa fuente; y la lisis enzimática de la pared celular, empleando
enzimas hidroliticas para su degradación de manera que se favorezca la extracción de
los contenidos intracelulares, es un método novedoso que ha cobrado interés en la
extracción de diferentes tipos de sustancias (Choudhari & Ananthanarayan, 2007).

Así, teniendo en cuenta los resultados de los estudios que guardan relación con un
considerable potencial de licopeno en la guayaba y que ello puede significar diversos
usos para esta fruta, se pretende con esta investigación presentar un pre-tratamiento
a base de enzimas como alternativa para la extracción de estos compuestos.
 2. OBJETIVOS

GENERAL

Evaluar la extracción de licopeno en frutos de guayaba (Psidium guajava L) pre-

tratados enzimáticamente.

ESPECÍFICOS

 Cuantificar el contenido de licopeno en el fruto de guayaba pre-tratado con la

enzima poligalactunorasa.
 Determinar las propiedades fisicoquímicas de los frutos de guayaba.

13
 3. MARCO TEÓRICO

3.1. LA GUAYABA

La guayaba (Psidium guajava L.) es una especie que se encuentra prácticamente en

todas las áreas tropicales y subtropicales del mundo gracias a que se adapta a
distintas condiciones climáticas pese a su origen tropical (FAO, 2006b).

Se considera originaria de América posiblemente de algún lugar de Centroamérica, el

Caribe, Brasil o Colombia y pertenece a la familia de las Myrtáceas (FAO, 2006b). Su
cultivo siempre verde se caracteriza por un arbusto frondoso que en promedio
alcanza de 5 a 6 metros de altura, provisto de tallos angulosos y hojas que nacen en
pares con pelos finos y suaves en ambos lados de color verde pálido y forma alargada
con terminación en punta y longitud que oscila entre 10 y 20cm con 8cm de ancho
(FAO, 2006b; Yam-Tzec et al., 2010).

Según la FAO (2006), lo ideal para su desarrollo es una temperatura entre los 23 y
28ºC, con lluvias bien distribuidas principalmente en la fase de brotación, floración y
desarrollo de frutos; adicionalmente requiere suelos del tipo areno-arcilloso,
profundos, bien drenados y con buen contenido de materia orgánica.

La forma de los frutos de la guayaba depende de la variedad de la misma, así como el

color de la cascara y la pulpa, de esta manera los hay redondeados y ovalados en
forma de pera, con diámetros de 4 a 8cm, peso promedio entre 50 y 500 gramos y
densidad promedio de 1,88g/cm3 (FAO, 2006b; Yam-Tzec et al., 2010). En general
presentan un alto contenido de semillas, alrededor de 100-500 por fruto, un aroma
intenso y agradable, sabor dulce y acidez que varía de un fruto a otro (Bonilla & Peña,
s.f, citados por: González Cardenas, 2010).

Debido a su cualidad de fruto climatérico, una vez que la guayaba es cosechada su

actividad metabólica continúa, por consiguiente sus propiedades fisicoquímicas,
sensoriales y nutricionales cambian conforme avanza el proceso de maduración
(Bashir et al., 2003, citado por: Espinal Ruiz, 2010). Estas transformaciones están
relacionadas, entre otras, con la necrosis, el pardeamiento y el ablandamiento tanto en
la corteza como en la pulpa, estos fenómenos se atribuyen a la acción de algunas
enzimas que actúan sobre diversos sustratos presentes en el tejido del fruto (Espinal
Ruiz, 2010).

La variedad Palmira ICA–I, también llamada "Indian Pink" o “Guayaba Pera”, que se ha
seleccionado para esta investigación, es una variedad modificada en el Instituto
Colombiano Agropecuario – ICA – de la ciudad de Palmira; se caracteriza por que tiene
forma de pera, cascara verde suave y delgada, pulpa cremosa de color rosado intenso,
14
sabor dulce gracias al alto contenido de azucares y un bajo contenido de semillas de
alrededor del 2,2% del peso total del fruto, razón por la cual su alto rendimiento. Otra
característica importante de este fruto es su mayor resistencia a las plagas en
comparación con otras especies. Por todo esto es la guayaba más consumida en
Colombia como fruta fresca (González Cardenas, 2010).

Tabla 1. Caracteristicas Guayaba Palmira ICA - 1.

Palmira ICA -1
Rango de Adaptación (m.s.n.m): 0 – 1600
Distancia de Siembra (m): 7x7–5
Arboles por Hectárea: 236 – 460
Peso Promedio Fruto (g): 152,13
Sólidos Solubles (%): 8,12
Acidez (%): 0,41 0,41
Vitamina C (mg/100ml): 105,26
Peptina (%): 0,90
Kg/Árbol/Año: 246
t/ha/Año: 58
Fuente: PROFRUTALES LTDA., 2012

En cuanto a la producción de guayaba a nivel mundial, es posible encontrar un

estimado en la base estadística de la Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentación y la Agricultura – FAO – la cual indica que los principales
productores en el 2010 fueron en orden descendente: India, China, Tailandia,
Pakistán y México con el 42.25%, 11.25%, 6.0%, 4.61% y 4,22%
respectivamente1. En la Tabla 1 se puede observar la producción total de los
productos indicados en el 2010 y en la Tabla 2 la participación de cada país en la
producción total. Es de resaltar que Colombia ocupa el puesto 20, con el 0.63%.

1Este dato se presenta como un estimado debido a que la fuente no provee el dato concreto en cuanto a
producción del fruto objetivo, sino un compilado de la producción de Mangos, Mangostanes y Guayabas.
15
 Tabla 2. Producción Mundial de Mangos, Mangostanes y Guayabas, 2010. (ton.)

Variable Producto 2010

Mundo + (Total) Mangos, mangostanes y guayabas 38.665.809 A

A = Puede incluir datos oficiales, semi-oficiales o estimados
FAOSTAT | © FAO Dirección de Estadística 2012 | 25 mayo 2012

Tabla 3. Producción por Región de Mangos, Mangostanes y Guayabas, 2010. (ton.)

Puesto Región Producción (T) Participación

1 India 16.337.400 Im 42,25%

2 China 4.351.593 Im 11,25%

3 Tailandia 2.550.600 6,60%

4 Pakistán 17.84.300 Im 4,61%

5 México 1.632.650 4,22%

6 Indonesia 1.313.540 3,40%

7 Brasil 1.188.910 3,07%

8 Bangladesh 1.047.850 2,71%

9 Filipinas 825.676 2,14%

10 Nigeria 790.200 Im 2,04%

20 Colombia 243.375 0,63%

Cifras no oficiales.
Im: Datos FAO basados en una metodología de imputación
FAOSTAT | © FAO Dirección de Estadística 2012 | 25 mayo 2012

En Colombia se cultivan diferentes variedades de este fruto dentro de las que se

incluyen la "Regional Roja", "Regional Blanca", "Pera" y "Manzana", su producción de
16
126.479 toneladas en el 2010 según la Red de Información y Comunicación
Estratégica del Sector Agropecuario – AGRONET - se concentro principalmente en los
departamentos de Meta, Santander y Valle del Cauca con 27.96%, 25.37% y 13.56% de
participación respectivamente (Ver Tabla 3 y Diagrama 1), mientras su exportación
ascendió en el mismo año a 177,66 toneladas y contó con Estados Unidos como
principal mercado con el 87.67% seguido por España y Canadá con 5.45% y 3.45%.

Tabla 4. Área Cosechada, Producción y Rendimiento de Guayaba, 2010

Área Cos. Producción Rendimiento Participación

Departamento
(Hectáreas) (Toneladas) (ton/has) Producción

Meta 1.843 35.363 19,2 27,96%

Santander 4.027 32.089 8,0 25,37%

Valle del Cauca 1.320 17.152 13,0 13,56%

Boyacá 1.405 9.389 6,7 7,42%

Antioquia 833 7.244 8,7 5,73%

Caldas 331 4.712 14,2 3,73%

Tolima 962 4.587 4,8 3,63%

Total 12.351 126.479 10,2 100,00%

Elaboró AGRONET con base en Evaluaciones Agropecuarias -
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural

La guayaba además de consumirse en fresco es utilizada en la industria para la

producción de bocadillos, jaleas, néctares y pulpas, de manera que sustenta una
importante agroindustria rural y representa un renglón importante en la economía
regional. Así, diferentes reportes afirman que existen más de 9.000 fruticultores en el
país que manejan más de 15.000 hectáreas y generan una producción cuyo valor anual
se puede estimar entre US$14 a US$20 millones, adicionalmente se conoce que tan
solo en la Hoya del río Suárez (Santander) existe una producción anual de bocadillo
valorada en más de US$24 millones provenientes de aproximadamente 130 fábricas.
(CORPOICA citado por: Rojas-Barquera & Narváez-Cuenca, 2009).

En el Diagrama 2, se pueden observar las diferentes posibilidades de transformación

industrial de los frutos de guayaba, donde se generan considerables cantidades de
residuos como cascara y semilla, los cuales según Kong & Ismail (2011), tan sólo en el
procesamiento de este fruto como puré representan el 25% de la materia prima.
17
 Diagrama 1. Participación Producción por Departamento

Meta
Otros 28,0%
16,2%
Caldas
3,7%
Antioquia
5,7%

Boy acá
7,4% Santander
Valle del Cauca 25,4%
13,6%

Elaboró AGRONET con base en Evaluaciones Agropecuarias -

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural

Diagrama 2. Posibilidades de Transformación Industrial para la Guayaba.

Fuente: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, FAO 2006.

18
Con respecto a su composición nutricional, esta fruta es reconocida en términos
generales por su alto contenido de vitaminas, donde se destacan la A, C, B1 y B3; de
minerales como el calcio, fósforo y el hierro y de antioxidantes (carotenoides,
compuestos fenólicos y acido ascórbico) (Ver Tabla 5) (FAO, 2006b; Rojas-Barquera &
Narváez-Cuenca, 2009). De esta manera su contenido de vitamina C (acido ascórbico)
que oscila entre los 200 - 300 mg/100g es de tres a siete veces mayor al de la naranja
y su contenido de licopeno que representa el 86% de los carotenos ha sido
cuantificado en 4-6 mg/100g de porción comestible (Wilberg & Rodríguez, 1995,
citado por: Kong et al., 2010). Según Rojas-Barquera & Narváez-Cuenca (2009), la
variedad “regional roja” posee un mayor contenido de vitamina C y de fenoles en
comparación a otras variedades como la “Pera" y la "Manzana", sin embargo los
contenidos de dichos compuestos en éstas, no se alejan mucho de la primera y
concluye que en promedio la “guayaba pera” tiene 78.4 mg/100g de fracción
comestible.

Adicionalmente esta fruta tiene un porcentaje de fibra elevado y un escaso aporte de

hidratos de carbono que le confieren un suave efecto laxante y un bajo valor calórico;
sin embargo su alto contenido de agua la califica como un alimento altamente
perecedero. (FNFH, 2003, citado por: Rojas - Barquera & Narváez - Cuenca, 2009;
Vásquez Riascos, 2009; Wilberg & Rodríguez, 1995, citado por: Kong et al., 2010).

Es de resaltar que la composición nutricional de este fruto depende principalmente de

la variabilidad genética, el manejo agronómico, el estado de madurez y el manejo pos-
cosecha del fruto.

Tabla 5. Composición Nutricional

Compuesto Cantidad
Calorías 51 Kcal
Agua 86.10 g.
Proteína 0.82 g.
Grasa 0.60 g.
Cenizas 0.60 g.
Carbohidratos 11.88 g.
Fibra 5.4 g.
Calcio 20 mg.
Hierro 0.31 mg
Fosforo 25 mg.
Vitamina C 183.5 mg.
Licopeno* 5204 ug.
Valores en 100 g de porción comestible.

19
 Fuente: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, FAO 2006; *USDA,
2009.

3.2. Los Antioxidantes en la Guayaba.

Los antioxidantes naturales en las frutas y verduras están relacionados con tres
grandes grupos: vitaminas, compuestos fenólicos y carotenoides. El ácido ascórbico
(Vitamina C) y los compuestos fenólicos son conocidos como antioxidantes
hidrofílicos, mientras que los carotenoides son conocidos como antioxidantes
lipofílicos (Thaipong et al., 2006). La presente investigación se centró en el licopeno
de la familia de los carotenoides.

3.2.1. Los Carotenoides.

Los carotenoides son compuestos que presentan inestabilidad química asociada a su

estructura, condición que los hace susceptibles a la isomerización y oxidación que se
acentúa con los tratamientos térmicos del procesamiento de los alimentos (Minguez-
Mosquera & Hornero-Méndez, 1994, Minguez-Mosquera et al., 1994, Lessin et al.,
1997, Mosha et al., 1997, Rodriguez-Amaya, 1999b, Hernandez & Moreno-Alvarez,
2000, Shi & Le-Manguer, 2000, citados por: Belén et al., 2004; González Cardenas,
2010).

Están presentes en todos los tejidos fotosintéticos junto con las clorofilas así como en
tejidos vegetales no fotosintéticos como parte de los cromoplastos, y son potentes
pigmentos que proveen a las frutas y verduras de colores amarillos, anaranjados y
rojos intensos gracias a los dobles enlaces conjugados que presentan (Melendez-
Martinez et al., 2004; Thaipong, et al., 2006). De esta manera, se ha demostrado que
los colores naranja de la zanahoria y rojo del tomate, se deben a la presencia de β-
caroteno y licopeno, respectivamente y que suelen estar más concentrados en la piel
que en la fruta de manera proporcional a la maduración, presentándose en mayor
medida en las frutas tropicales (Melendez-Martinez et al., 2004; Marquina et al.,
2008).

Químicamente los carotenoides son terpenoides, están formados básicamente por

ocho unidades de isopreno de tal forma que la unión de cada unidad se invierte en el
centro de la molécula. Se pueden distinguir dos grupos: Los carotenos, que son
hidrocarburos y las xantofilas que poseen oxigeno en su molécula, así, en los
carotenos naturales sólo se encuentran tres elementos: C, H y O, este ultimo puede
estar presente como grupo hidroxilo, metoxilo, epóxido, carboxilo o carbonilo
(Melendez-Martinez et al., 2004; González Cardenas, 2010).

20
3.2.1.1. El Licopeno

3.2.1.1.1. Generalidades.

El licopeno (C40H56) es un carotenoide aciclico con trece enlaces dobles dispuestos

linealmente, once conjugados y dos no conjugados; que a pesar de que no tiene
actividad como provitamina A debido a que carece de la estructura de un anillo β-
ionona (Ver Diagrama 3) es considerado un antioxidante eficiente ( Rao & Agarwal,
1999; Kohlmeier et al., 1997 & Giovannucci, 1999, citados por: Bohm et al., 2003;
Lugasi et al., 2003; Yi et al., 2009; Oliver & Palou, 2000, citado por: González Cardenas,
2010).

Como antioxidante puede prevenir o retrasar el daño oxidativo de los lípidos,

proteínas y ácidos nucleicos, generado por especies reactivas del oxígeno que incluyen
radicales libres, reactivos como el superóxido, hidroxilo, peroxilo, alcoxilo y no
radicales como el peróxido de hidrógeno, etc. (Lim et al., 2007). Este efecto se logra
por medio de la inhibición de la iniciación y de la propagación de la cadena de dichos
radicales o suprimiendo la formación de los mismos ocultando los iones de metal,
reduciendo el peróxido de hidrógeno y extinguiendo el superóxido y el oxígeno (Shi,
Noguchi & Niki, 2001, citado por: Lim et al., 2007). De esta forma los antioxidantes no
sólo presentan beneficios para la salud humana, sino también para la conservación de
productos alimenticios (Thaipong et al., 2006; Stahl & Sies, 1996, citado por:
Choudhari & Ananthanarayan, 2007).

Diagrama 3. Estructura del Licopeno

Fuente: Melendez-Martinez et al.,2004

Está asociado a la prevención de riesgos de enfermedades como la aterosclerosis, las

cardiovasculares y el desarrollo de diferentes tipos de cáncer, localizados en la
glándula de la próstata, el estómago y el pulmón (Stahl & Sies, 1996, citado por:
Choudhari & Ananthanarayan, 2007; Misra et al., 2006, Ito et al., 2006, citados por:
Kong & Ismail, 2011). En la industria de alimentos es usado como un aditivo para
mantener la calidad nutricional y sensorial, así como para prevenir la oxidación
durante los procesamientos o el almacenamiento (Østerlie & Lerfall, 2005, citado por:
Kong & Ismail, 2011).

La fuente principal del licopeno es el tomate y sus derivados, los cuales son capaces de
aportar en gran medida al alcance de los valores de consumo diario recomendados

21
para una buena salud (6-15 mg), sin embargo, debido a insuficiencias en los hábitos
alimenticios sólo logran aportar en países donde a menudo se consumen alimentos a
base de tomate aproximadamente 3 mg diarios (Bohm et al., 2003; Markovic’ et al.,
2006); de esta manera ha sido necesaria la creación de suplementos alimenticios a
base de este compuesto y se ha afianzado su uso como aditivo en diferentes tipos de
productos con el fin de lograr aumentar su índice de consumo. Lo anterior ha
ocasionado en los últimos años un creciente interés en sus métodos de extracción y
cuantificación, así como en la búsqueda de fuentes alternativas (Kong & Ismail, 2011).

3.2.1.1.2. Métodos de Extracción y Análisis.

La extracción, manipulación y análisis del licopeno debe llevarse a cabo bajo

condiciones ambientales controladas no sólo para minimizar su degradación sino
también la formación de isómeros, por ejemplo, evitando su exposición a la luz,
utilizando solo luz de oro, amarilla o roja, empleando solventes no polares como éter
etílico, éter de petróleo o hexano, e involucrando antioxidantes tales como el
butilhidroxitolueno (BHT) y el nitrógeno para mantener la exposición al oxigeno
atmosférico al mínimo (Choudhari & Ananthanarayan, 2007). Adicionalmente se
conoce que su disponibilidad mejora en alimentos procesados debido a la destrucción
de las estructuras celulares con la consecuente disociación de los complejos caroteno-
proteína y aumenta en alimentos calentados debido a la estimulación que ejerce el
calor sobre algunos carotenoides que los conduce a transformarse a licopeno (Bohm
et al., 2003; Ordóñez-Santos & Vázquez-Riascos, 2010; Kong et al., 2010).

Diferentes ensayos que involucran desde el uso de solventes orgánicos hasta técnicas
más amables con el medio ambiente han sido empleados para la extracción,
solubilización y cuantificación de este compuesto. Para su extracción se han usado
diferentes sistemas de extracción liquido-liquido, extracción en fase solida o
extracción con fluidos supercríticos (SCE) (Gomez-Prieto et al., 2003, Kozukue &
Friedman, 2003, Rozzi et al., 2002, Tzouganaki et al., 2002, citados por: Olives et al.,
2006). La primera ha sido la más empleada y cuenta con numerosas opciones de
optimización mediante la variación de los solventes y de su relación, la AOAC (1993)
por ejemplo recomienda metanol/tetrahidrofurano (THF) (50:50 v/v), mientras otros
autores recomiendan diferentes mezclas de hexano/acetona/etanol/ (50:25:25 v/v)
(Ordóñez-Santos & Vázquez-Riascos, 2010), acetato/hexano o acetona/hexano (Lin &
Chen, 2003 & Pichini et al., 2002, citados por Olives et al., 2006); sin embargo la
inestabilidad del licopeno sumada al potencial tóxico y nocivo de los solventes
orgánicos para el medio ambiente, los riesgos de seguridad, los altos gastos
energéticos que conllevan; sin mencionar los problemas que presenta la técnica
como: Bajos rendimientos, largos periodos de extracción, baja calidad, trazas de
disolventes orgánicos en el producto final (Yang et al., 2011, citado por: Puri et al.,

22
2012) hacen que estas extracciones sean complejas y frente a esto la SCE representa
una alternativa con gran potencial a desarrollar (Olives et al., 2006; Yi et al., 2009).

En cuanto a su evaluación o cuantificación, ésta se ha llevado a cabo mediante la

cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), la espectrofotometría y la evaluación
de color (Schoefs, 2002, citado por Olives et al., 2006); entre las cuales el método por
HPLC que cuenta con una amplia variedad de mezclas de diferentes solventes
orgánicos como fases móviles, ha resaltado como uno de los más confiables y
sensibles. Sin embargo características propias de los métodos de colorimetría y
espectroscopía Ultravioleta-Visible (UV-Vis), como sus protocolos de detección
simples, económicos y rápidos, son ventajas significativas que acreditan su uso.
Adicionalmente, el desarrollo de múltiples propuestas para la complementación de
estas técnicas, como el uso de un colorímetro triestímulos y de diodos de xenón, entre
otros (Davis et al., 2003; Olives et al., 2006); abre las puertas para aplicaciones de
mayor precisión en los análisis.

3.3. Uso de Enzimas para la Extracción de Compuestos Bioactivos.

Teniendo en cuenta los efectos positivos que tienen los compuestos bioactivos (como
el licopeno) sobre la salud humana y sobre los alimentos procesados, así como los
problemas que presenta su extracción a base de solventes orgánicos, se ha hecho
necesario desarrollar métodos de extracción más efectivos y selectivos, donde el uso
de enzimas como asistentes exhibe gran potencial.

Dicho potencial radica no sólo en su capacidad para catalizar reacciones con una alta
especificidad y en su regioselectividad, sino también en su habilidad para funcionar en
soluciones acuosas bajo condiciones moderadas de procesamiento; permitiendo entre
otras cosas aumentar el índice de extracción del licopeno intracelular, convirtiéndose
en ayudantes ideales en la extracción, modificación o síntesis de complejos
compuestos bioactivos de origen natural (Fu, 2008; Gardossi et al., 2009, citado por:
Puri et al., 2012).

Generalmente las paredes celulares están formadas por biopolimeros altamente

complejos tales como la celulosa, hemicelulosa, lignina y pectina, que obstruyen la
liberación de sustancias intracelulares (Fu, 2008; Wijesinghe & Jeon, 2012). La
celulosa es el componente principal de la estructura de la pared celular y el más difícil
de degradar debido a su insolubilidad y a que está presente como un enlace de
hidrogeno en las fibras cristalinas (Wijesinghe & Jeon, 2012).

Las enzimas son proteínas que pueden ser derivadas de bacterias, hongos, órganos
animales o extractos de frutas/vegetales (Puri et al., 2012) y tienen la capacidad de
degradar o penetrar las paredes celulares y las membranas, lo que permite una mejor
liberación y una extracción más eficiente de los bioactivos (Pinelo et al., 2006;
23
Choudhari & Ananthanarayan, 2007), razón por la cual se han convertido en
alternativas atractivas en contra de los procesos químicos o mecánicos. Así, la celulosa
y la hemicelulosa pueden ser hidrolizadas utilizando celulasas y beta-glucosidasas
para producir glucosa y celulosa, respectivamente, mientras que para hidrolizar la
pectina se pueden emplear diferentes preparaciones comerciales de pectinasa
producidas a partir de Aspergillus niger que pueden presentar actividad como
pectinesterasa (PE), poligalacturinasa (PG) y pectina liasa (PL) (Fu, 2008); para lo cual
cabe anotar que la hidrolisis enzimática de un compuesto depende de varios factores
fisicoquímicos como: (Wijesinghe & Jeon, 2012):

- La selección apropiada de una enzima hidrolítica o de una mezcla de enzimas,

que debe ser la adecuada para digerir de manera específica los enlaces de
polímeros presentes en la materia prima objetivo.
- El factor combinado de tiempo de incubación y temperatura del tratamiento
enzimático, que es uno de los factores más importantes y debe ajustarse con
respecto a las condiciones definidas como óptimas para la actividad de la
enzima.
- El pH que influencia el nivel de la actividad enzimática en un amplio rango y
debe ser ajustado al punto de pH óptimo.
- La proporción sustrato-enzima o la concentración de la enzima.

Las enzimas han sido ampliamente usadas como asistentes en conocidos procesos
industriales, las lacasas por ejemplo, se han usado para el blanqueamiento en la
industria de la pulpa y el papel, complejos de proteasa/lipasa se han aplicado en la
fabricación del cuero, las lipasas en la elaboración de productos para el cuidado de la
piel, la fosfolipasa en el desgomado del aceite de soya y las pectinasas, celulasas y
hemicelulasas en el procesamiento de jugo y en la clarificación de la cerveza (Puri et
al., 2012).

En cuanto a los métodos de extracción asistidos por enzimas éstos se han evaluado en
la extracción de diferentes tipos de sustancias, como por ejemplo para la extracción de
carotenoides y capsaicinoides del chili (Capsicum annuum L.) aumentando el
rendimiento en un 11% y 7% por cuenta únicamente de las enzimas (Santamaría et
al., 2000), en la extracción de aceite de la avellana chilena (Geuvina avellana Mol) y de
las semillas de cardo mariano (Silybum marianum) con mejoras del 98% y 10.46%
respectivamente (Zuñiga et al., 2003; Li et al., 2012), en la extracción de licopeno del
tomate (Lycopersicum esculentum S.) incrementando los rendimientos de la extracción
en un 198% por medio de la celulasa y 224% con la pectinasa (Choudhari &
Ananthanarayan, 2007), para la extracción de compuestos fenólicos de cascaras de
cítricos donde se obtuvo una recuperación máxima de 65.5% usando Celluzyme MX
(Li et al., 2006) y continúan siendo objeto de investigación con el potencial de
convertirse en un atractivo comercial puesto que no sólo han demostrado niveles de
recuperación más altos y extracciones más rápidas sino también reducción en
consumo de solventes y energía, en comparación con métodos no enzimáticos.
24
 Se identifican limitantes como lo son el costo de las enzimas y la dificultad de su
aplicación a escala industrial debido a que las enzimas se comportan diferente de
acuerdo a las condiciones del ambiente (Puri et al., 2012). Sin embargo son
limitaciones que de la mano de la investigación se pueden superar.

25
 4. MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de Tecnología de Frutas y Hortalizas de la

Universidad Nacional de Colombia, ubicada en la ciudad de Palmira a 1001 metros
sobre el nivel del mar, en la región sur del departamento del Valle del Cauca, con una
temperatura media de 23°C y pisos térmicos que van desde el frío (Páramo de las
Hermosas) hasta la zona cálida del valle del río Cauca.

4.1. Material de estudio.

Material Vegetal

Guayabas (Psidium guajava L.) de la variedad “pera” provenientes del Bolo, zona rural
del municipio de Palmira (V) con madurez de grado 5/6 que se seleccionaron de
acuerdo a lo establecido por la Norma Técnica Colombiana (NTC) No.1263 frescas,
limpias, libres de daños y sin presencia de coloraciones extrañas a las de un fruto
sano; sometidas a un proceso de lavado y desinfección con agua clorada a 50 ppm
para eliminar bacterias superficiales, residuos de insecticidas y suciedad adherida a la
fruta.

Imagen 1. Tipo de Guayaba Seleccionada

Fuente: Autora
26
Enzimas.

Celulasa y Pectinasa (poligalactunorasa) obtenidas de la empresa Novozyme,

conocidas por sus nombres comerciales, la primera como Celluclast 1.5L® producida
a partir de la fermentación sumergida de una cepa seleccionada del hongo
Trichoderma reesei y la segunda como Pectinex Ultra Clear® producida a partir de una
combinación de Aspergillus niger y aculeatus, con actividades declaradas de 700
EGU/g y 7900 PGNU/ml, respectivamente.

Reactivos.

Reactivos de grado analítico como: Hexano (96%), Etanol Absoluto (99.9%), Acetona
(99,8%), Acido Acético Glacial (99,5%), Acetato de Sodio Trihidratado (99,5%) e
Hidroxido de sodio en lentejas (97%)

4.2. Tratamiento enzimático.

Preparación de las muestras.

Lotes de 800 gramos de guayaba fueron licuados durante 3 minutos en una licuadora
domestica con un Buffer Acetato de Sodio 0,2M en relación 1:0.5 y luego divididos en
cuatro cantidades iguales que constituyeron las tres repeticiones y la muestra control
que fueron empleadas para evaluar cada tratamiento.

El pH y la temperatura de las muestras se controló de manera estricta usando un pH-

metro HANNA - HI 4221® provisto con una termocupla y siguiendo la NTC 4592 de
manera que la actividad de la enzima usada fuese la ideal.

Imagen 2. Muestras para Tratamiento

Fuente: Autora

27
Tratamiento.

Se evaluaron concentraciones enzimáticas de 0.01 a 0.02% v/p y se definieron las

siguientes condiciones de tratamiento: Temperatura de 28±2°C, pH 4,5 y tiempos de
incubación de 20 a 65 minutos.

En cuanto a la inactivación enzimática ésta se llevo a cabo mediante un tratamiento

térmico con agitación a 70°C por 5 minutos en una plancha de agitación y
calentamiento Fisher Scientific - Isotemp ®. El producto obtenido fue envasado de
manera que la luz no lo alterará y se conservó bajo refrigeración para la posterior
cuantificación de licopeno, paralelamente las muestras de control fueron sometidas a
las mismas condiciones de pH y temperatura para calcular el incremento en la
extracción del compuesto objetivo (ver Diagrama 4).

4.3. Extracción y cuantificación de licopeno

Referencia: Se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Ordóñez-Santos &

Vázquez-Riascos, 2010.

Principio: El principio de la espectrofotometría parte del concepto de que las

propiedades de absorción de energía de las moléculas pueden ser usadas para medir
la concentración de grupos funcionales de la misma en una solución y en un rango
limitado del espectro de radiación electromagnética, gracias a la excitación de los
electrones de enlace de la misma molécula (Skoog et al., 2000, citado por: Ordóñez -
Santos & Vázquez - Riascos, 2010).

Procedimiento:

Se tomaron 2.5 gramos de muestra en un erlenmeyer cubierto con papel aluminio y se

le adicionaron 25ml de solvente (50:25:25 hexano/acetona/etanol). La mezcla fue
sometida a agitación en contacto con agua helada por 15 minutos en una plancha de
agitación Fisher Scientific – Isotemp ® y seguidamente se le adicionaron 10ml de agua
destilada. Luego de un reposo de 10 minutos se separó la fase orgánica de la muestra y
se midió su absorbancia a 503nm frente a un blanco de hexano en un
Espectrofotómetro Genesys 20 (Thermo Scientific Instruments LLC, Madison, WI,
USA) con celdas de cuarzo UV-6030. El contenido de licopeno se cuantifico por medio
de la ecuación 1.

Ecuación 1. Contenido de Licopeno

537
=
172
28
Donde:

A503=Absorbancia del licopeno a 503 nm en el espectrofotómetro.

537=Peso molecular del licopeno en g/mol,

VH=Volumen de la capa de hexano (12,5 ml)

172=Coeficiente de extinción del licopeno en el hexano en mM-1

Wproducto= Peso del producto en gramos

Wmuestra= Peso de la muestra en gramos

Diagrama 4. Tratamiento Enzimático

Material Vegetal

Buffer Acetato de Sodio

0,2M
Homogenización

Control de pH y Temperatura
(4,5 / 28 ±2°C)

Adición de la enzima

Incubación
(20, 35, 50 y 60 min.)

Inactivación Enzimática
(70±2°C x 5 min, 1200
rpm)

Almacenamiento

Extracción y Cuantificación de
Licopeno
(50:25:25 hexano/acetona/etanol,

29
4.4. Determinaciones fisicoquímicas de los frutos de guayaba.

En el presente estudio determinaciones físicas como la firmeza y las coordenadas de

color CieL*a*b* se emplearon para estandarizar los grados de madurez de la materia
prima y se determinaron las siguientes características químicas del fruto por medio de
muestras representativas de fruta fresca: Contenido de sólidos solubles (SS), pH y
acidez titulable (AT).

4.4.1. Determinación de las Coordenadas de Color.

Principio (González Cardenas, 2010): Siendo el color una respuesta mental al

estimulo producido en la retina por una radiación luminosa visible cuya medida
depende de las condiciones que lo rodean, ha sido necesario unificar dichas medidas
bajo condiciones estándar que permitiesen obtener resultados comparables y son: el
observador, el iluminante, la geometría de iluminación-observación y el intervalo de
medida.

La colorimetría triestímulo permite obtener una medida objetiva de color por medio
de tres (3) sensaciones o atributos psicométricos que le dan un carácter
tridimensional: El tono, la saturación y la luminosidad. (1) El tono o matiz que es el
atributo cualitativo del color se refiere a la característica que permite clasificar un
color como rojo, amarillo, verde o azul y está relacionado con las diferencias de
absorbancia/transmitancia de la energía radiante a diferentes longitudes de onda. (2)
La saturación que es considerada el atributo cuantitativo de la cromaticidad, describe
el grado/intensidad con la que un color se separa del gris neutro y se acerca a un color
puro del espectro, así como su reflexión/transmisión a una determinada longitud de
onda. Y finalmente (3) la luminosidad, definida como la característica de una
sensación de color que la hace equivalente a la producida por algún elemento de la
escala de grises que va desde el blanco (máxima luminosidad – 100) hasta el negro
(mínima luminosidad – 0), permite clasificar el color como claro u oscuro.

De esta manera, la Comisión Internacional de Iluminación – CIE, organismo encargado

de recoger y unificar los términos teorías y sistemas de color, propone el sistema de
espacio CieL*a*b* para definir el color, representado en coordenadas rectangulares
como la Luminosidad L* y la cromaticidad a* y b* que presentan valores desde (-a*) a
(+a) y (-b*) a (+b), donde a* va del verde al rojo y b* del azul al amarillo (ver Diagrama
5).

Procedimiento:

Las coordenadas de color se calcularon en la superficie (piel) del fruto y al interior del
mismo (pulpa) mediante un colorímetro CieL*a*b* Konica Minolta Sensing CR400®
30
provisto con un observador de 2 grados y un iluminante D65. El patrón de calibración
fue un patrón blanco con coordenadas Y(89,5) x(.3176) y(.3347).

En la superficie de cada fruto de cada tratamiento se tomaron ocho medidas, cuatro

alrededor del centro de la fruta, dos en la parte superior e inferior y otras dos en
trazado diagonal. En cuanto al interior del fruto se tomaron cinco medidas, como se
indica en el Diagrama 6. Los datos se procesaron mediante el Spectra Magic TM NX
Color Data Software CM-S100w y se expresan en coordenadas triestimulo del espacio
CieL*a*b*.
Diagrama 5. Cromaticidad de a*, b*

Fuente: Konica Minolta Sensing, INC. 2003

Diagrama 6. Puntos de localización de las medidas de color

Fuente: Autora

31
 Imagen 3. Chroma Meter CR-400 de KONICA MINOLTA.

4.4.2. Determinación de Firmeza mediante el Penetrómetro.

Principio: Esta determinación se basa en la presión necesaria para insertar un puntal

de tamaño específico en la pulpa de una fruta a una profundidad dada.

Procedimiento:

Mediante un penetrómetro de frutas FORCEDIAL FDK-30 Wagner® provisto con un

puntal de 8mm, se tomaron dos lecturas desde los lados opuestos de cada fruto luego
de haber retirado su cáscara. El procedimiento se realizó a una cantidad de frutos
representativos para cada lote insertando el puntal hasta la marca dada por el equipo.
Los valores obtenidos se reportan en unidades kgf.

Imagen 4. Penetrómetro Forcedial FDK 30 Wagner (R)

Fuente: Autora

32
5.4.3. Determinación del Contenido de Sólidos Solubles (SS).

Se realizó siguiendo el método refractométrico establecido por la NTC 4624

Principio: El contenido de SS se basa en el porcentaje en masa de sacarosa de una

solución acuosa de sacarosa que, en determinadas condiciones, tiene el mismo índice
de refracción que el producto analizado.

Procedimiento:

Una muestra homogénea de cada lote tratado se vertió directamente en la superficie

de cristal del refractómetro ATAGO – Pal-1, certificando la limpieza y el cubrimiento
uniforme de la misma. El refractómetro fue calibrado antes de cada grupo de medidas,
las cuales se desarrollaron por duplicado y a 20 ± 0.5°C de temperatura.

Imagen 5. Refractómetro ATAGO - Pal-1

Fuente: Autora

5.4.4. Determinación del pH.

Se efectuó teniendo en cuenta la metodología dictada en la NTC 4592.

Principio: Consiste en la medida de la diferencia de potencial entre dos electrodos,

sumergidos en el líquido que se va a analizar.

33
Procedimiento:

Un gramo de muestra homogénea fue mezclado con 10 ml de agua destilada por

medio de agitación magnética para posteriormente introducirle el electrodo del pH-
metro HANNA – HI 4221 equipado con un sistema de corrección de temperatura y
calibrado previamente con soluciones tampón de pH 7.01 y 4.01 marca HANNA
códigos HI-70007 y HI-7004 respectivamente. Para cada muestra se realizaron dos
determinaciones.

Imagen 6. pH-metro HANNA – HI 4221

Fuente: Autora

5.4.5. Determinación de la Acidez Titulable.

Esta determinación se desarrollo acorde al método potenciométrico dictado por la

NTC 4623.

Principio: Titulación potenciométrica mediante solución estándar de hidróxido de

sodio hasta alcanzar un pH de 8.1 en la muestra.

Procedimiento:

Un gramo de muestra homogenizada se mezclo por medio de agitación magnética con

10 ml de agua destilada para posteriormente determinar su pH, enseguida la mezcla
34
fue titulada con hidróxido de sodio 0,1N por medio de un titulador BRAND-Titrette ®,
hasta llegar a un pH aproximado de 7±0.2 para continuar titulando lentamente hasta
el pH 8.1±0.2.

De esta manera se realizaran dos determinaciones para cada muestra y se calculo la

acidez titulable considerando la ecuación 2. Los resultados se reportaron como % de
Acidez Total.

Ecuación 2. Porcentaje de Acidez Total.

% = 100
( )

Donde:

VNaOH gastados= ml de solución de NaOH consumidos.

NNaOH= Normalidad de la solución NaOH.

meq= peso equivalente del acido predominante en la fruta (Acido cítrico: 0,064).

Imagen 7. Titulador BRAND-Titrette ®.

Fuente: Autora

35
 5. ANÁLISIS ESTADISTICO.

Los resultados de este estudio son presentados como las medias ± desviación
estándar de los lotes evaluados. Para lo cual se empleo un diseño experimental
aleatorizado con arreglo factorial. Cada tratamiento, que constituyo una
concentración de enzima diferente, se desarrollo por duplicado.

De esta manera se evaluó la concentración de la enzima y el tiempo de tratamiento o

incubación (20, 35, 50 y 65 minutos). La significancia entre las medias se identifico
mediante la prueba de Tukey y se manejaron las siguientes hipótesis:

H0= No existe diferencia significativa entre la variables de respuesta debido al

tratamiento.
H1= Existe diferencia significativa entre la variables de respuesta debido al
tratamiento.

El modelo matemático se determino con la ecuación 2, donde µ corresponde a la

media, τ al tratamiento y ε al error. Los datos se analizaron mediante el software SPSS
18.
Ecuación 3. Modelo matemático

= + +

Tabla 6. Tabla de análisis de varianza para el modelo factorial con dos factores, efectos
fijos.

Suma de Grados de
Fuente de Variación Media de Cuadrados Fo
Cuadrados Libertad

SSA a–1 =
Tratamientos A −1

SSB b–1 =
Tratamientos B −1

SSAB (a - 1)(b – 1) =
Interacción ( − 1)( − 1)

Error SSE ab (n – 1)

SST abn – 1 =
Total ( − 1)

Fuente: Mongomery & Runger (1996), Probabilidad y estadística aplicadas a la ingeniería. McGraw-Hill Interamericana editores S.A. México D.F.

36
 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

La caracterización fisicoquímica de los frutos de guayaba empleados se puede

observar en la Tabla 7; se determino el pH, el contenido de sólidos solubles (SS) y la
acidez titulable (AT) y con estos dos últimos valores se calculo el índice de madurez.
Adicionalmente se determinaron las coordenadas de color de la piel y la pulpa de los
frutos, así como la firmeza.

Tabla 7. Caracterización Fisicoquímica de la Guayaba Fresca

Variable Valor*
Coordenadas de Color
Piel
L* 70,33 ± 1,53
a* 9,58 ± 2,29
b* 39,14 ± 3,21
Pulpa
L* 55,17 ± 2,03
a* 32,51 ± 2,43
b* 17,51 ± 1,41
Firmeza (kgf) 1,95 ± 0,20
pH 4,19 ± 0,09
Sólidos Solubles (°Brix) 9,24 ± 1,18
Acidez Titulable1 0,45 ± 0,10
Índice de Madurez (SS/AT) 21,31 ± 5,65
Licopeno (ug/g de muestra) 38.89 ± 2,00
* Valores promedio ± DS (n=8)
1 Expresados como % acido cítrico.

De esta manera y teniendo en cuenta diversas fuentes que estudiaron la misma

variedad de fruto, se observa que los valores de pH obtenidos en el presente estudio
fueron superiores a los valores reportados por González Cardenas (2010) y Vásquez
Riascos (2009) encontrándose dentro del rango informado por Rojas - Barquera &
Narváez – Cuenca (2009), a saber: 3.90, 3.61 y 3.77-4.28 respectivamente. Mientras
que la AT fue menor a la reportada por las dos primeras fuentes (0.70% y 0.53%) y se
ubico nuevamente dentro del rango de la tercera fuente (0.28% - 1.33%) y del
presentado por Espinal Ruiz (2010) (0.25% - 2.09%).

En cuanto al contenido de SS, este también difirió de lo registrado por González

Cardenas, (2010) y Vásquez Riascos (2009), quienes informaron valores de 9.9 y

37
8.23°Brix, más coincidió con los rangos de Rojas - Barquera & Narváez – Cuenca
(2009) de 5.2 – 10.4°Brix y Espinal Ruiz (2010) con 6.57 – 10.23°Brix.

Lo anterior se debe probablemente a los cambios bioquímicos a los que están sujetos
las frutas como producto no solo de la maduración, sino también de su manejo
agronómico y su manejo pos-cosecha (Rodríguez et al., S.F; Espinal Ruiz, 2010). Así
vemos por ejemplo que el índice de madurez (IM) reportado por González Cardenas
(2010) de 14.1 fue menor al manejado en el presente estudio y como es sabido la
maduración genera entre otras cosas el aumento del contenido de SS y la disminución
de la AT por la degradación hidrolítica de polímeros en monosacáridos solubles, como
la glucosa y el ácido galacturónico; y por la degradación de los ácidos orgánicos en el
Ciclo de Krebs, lo cual se expresa en un sabor más dulce y menos ácido de los frutos
(Espinal Ruiz, 2010; González Cardenas, 2010).

Las coordenadas de color de la piel y la pulpa de los frutos, se pueden observar con
mayor claridad en el Diagrama 7, donde los valores de L (Luminosidad), a* y b*
definidos mediante rangos de 0 a 100 (oscuro-claro), de -60 a 60 (verde-rojo) y de -60
a 60 (azul-amarillo) respectivamente, describen que la piel del fruto en el grado de
madurez manejado era de color amarillo claro (L=70.33), un poco cercano al café
característico de la aparición de melaninas producto del proceso de pardeamiento
enzimático que parte de la senescencia (Quevedo et al., 2009; mientras que la pulpa
fue de un color rojo medianamente oscuro (L=55.17). Esto no solo coincide con la
caracterización descrita por Espinal Ruiz (2010) y González Cardenas (2010), con
diferencias en esta ultima en el L de la piel por el grado de madurez (IM=14.1)
(L=57.95 a*=8.88 y b*=36,56 en piel) (L=53.23 a*=30.27 y b*=16.23 en pulpa); sino
que además sustenta diferencias con la variedad “Blanca” caracterizada por Soares et
al. (2007), que presenta tonalidades más hacia el amarillo verdoso con mayor
luminosidad en su piel y pulpa (L=71.87 a*=4.23 y b*=32.83).

Por otra parte la firmeza del fruto, valorada en 1.95±0.2 kgf coincidió con el valor
obtenido por Espinal Ruiz (2010) de 1.911 kgf.

El contenido de licopeno determinado en 38.89±2.00 ug/g de muestra, es bastante

cercano al registrado por Vásquez Riascos (2009) de 34.19±12.51 ug/g de muestra y
por Ordóñez - Santos & Vázquez – Riascos (2010) de 35,50±1.38 ug/g de muestra,
pero difiere a los valores expresados por Espinal Ruiz (2010) y González Cardenas
(2010) de 244.9 y 28.07 ug/g de muestra, respectivamente. Esto último posiblemente
es debido a las diferencias entre las técnicas de extracción y cuantificación del
compuesto objetivo. Adicionalmente, haciendo una comparación con los contenidos
de licopeno reportados para otras variedades de guayaba, se confirma que la variedad
Palmira ICA-1 o “Guayaba pera” posee una mayor cantidad de dicho carotenoide
(González Cardenas, 2010; Kong & Ismail, 2011)

38
 Diagrama 7. Coordenadas de color en la Guayaba

En la Tabla 8 y 9 podemos observar los efectos de los pre-tratamientos enzimáticos

aplicados al fruto de guayaba, expresados como un “Índice de Aumento de Licopeno”,
producto de la resta entre el contenido del compuesto en las muestras tratadas y el
contenido del mismo en las muestras control de cada lote. De esta manera
encontramos que la concentración de la enzima empleada tuvo un efecto de alta
significancia estadística (<,0001) en comparación con el tiempo de incubación (TI) y la
relación concentración-tiempo con valores de 0.1754 y 0.2044 respectivamente.

Tabla 8. Efecto de las variables estudiadas en la extracción de licopeno

Cuadrado
Fuente DF Pr > F
de la Media
% Pectinasa 3 24,955 <,0001
Tiempo de Incubación (T.I) 3 2,250 0,1754
%Pectinex*T.I 9 1,898 0,2044

Si bien no se encontró una diferencia significativa entre los T.I, vemos en la tabla 9 que
si existió una diferencia entre los valores obtenidos a los 50 y 65 minutos de
tratamiento. Así, a partir de los resultados, podemos distinguir que la extracción del
licopeno aumenta de manera proporcional a las concentraciones de enzima
empleadas en el pre-tratamiento del fruto; y que el mejor tiempo de incubación
aumento con la concentración de la enzima de los 35 a 50 minutos, luego de los cuales
se observa una degradación en el compuesto. Adicionalmente, calculando el
porcentaje de extracción (ver Grafica 1) vemos un incremento en la extracción de
hasta 38,65% a los 0,02% (v/p) de Pectinasa y 50 min de incubación.

39
 Tabla 9. Índice de Aumento de Licopeno en Frutos de Guayaba Pre-tratada
Enzimáticamente

% Tiempo de Tratamiento (min)

Media3
Pectinasa1,2 203 353 503 653
0.01 6,778 ± 0,09 6,866 ± 1,92 5,262 ± 2,16a 4,863 ± 0,76a 5,9425a
0.0135 7,925 ± 0,17 9,208 ± 0,11 7,680 ± 0,82b 5,995 ± 1,29a 7,7021b
0.017 8,637 ± 1,18 9,142 ± 0,72 9,048 ± 0,34bc 9,458 ± 0,30b 9,0713bc
0.02 8,770 ± 1,78 10,068 ± 0,40 11,277 ± 1,49c 9,903 ± 0,33b 10,0046c
Media3 8,028 8,821 8,317 7,555 --
ANOVA NS NS ** *** --
Valores Promedio ± DS (n=2)
1 Pectinex Ultra Clear ®
2 Expresados como % v/p
3 Expresados como ug/g de muestra.

Nivel de Significancia estadística: NS, no significativo; * p<0,05; ** p<0,01; ***p<0,001. Letras diferentes
en los superíndices de una misma columna indican diferencias significativas de acuerdo a la
comparación de medias de Tukey (P<0.05)

Grafica 1. Porcentaje de Extracción del Licopeno

100.00
90.00
80.00
70.00
% Aumento

60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
5 20 35 50 65 80
Tiempo de Tratamiento (min)
0,01% 0,0135% 0.017% 0,02%

Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos por Choudhari & Ananthanarayan
(2007) quienes evaluaron la extracción del licopeno asistida por enzimas en tomate,
empleando una enzima con similares características (Pectinex Ultra SP-L) y
manifestaron también una disminución en el contenido de dicho compuesto a medida
que aumentaban el tiempo de incubación, con la diferencia de que el mejor tiempo de
40
incubación expresando fue de 20 min, así los autores indicados obtuvieron un
incremento del 224% en la extracción, ante lo cual cabe anotar que la concentración
de enzima empleada fue mayor (0.5% p/p) así como la temperatura de tratamiento
(60°C).

De la misma manera podemos observar resultados similares, en lo que se refiere a la

relación proporcional existente entre el aumento en la extracción y la concentración
de la enzima, en las investigaciones desarrolladas por Fu et al., (2008) y Li et al.,
(2012). Sin embargo el estudio de Fu et al., (2008) también nos provee de un punto de
discordancia y es en la evaluación del efecto del tiempo que no coincide con los
resultados obtenidos en el presente estudio, pues de hecho afirma que hubo un
incremento en la extracción durante 18 horas de incubación, tiempo después del cual
el rendimiento en la extracción se mantuvo estable.

Esta incoherencia de los efectos del tiempo en la extracción, puede explicarse si se

tiene en cuenta la inestabilidad del compuesto objetivo de este estudio, el cual al ser
altamente insaturado se degrada fácilmente debido a procesos oxidativos y más aun
cuando son extraídos en disolución en aceites o disolventes orgánicos pues se vuelven
mucho más lábiles (Melendez-Martinez et al., 2004). Así, factores como la
temperatura, la luz y el pH pueden haber generado cambios en el compuesto por
reacciones de isomerización, razón por la cual sería importante rediseñar el estudio
de manera que se controlara de mejor manera las condiciones atmosféricas, para
alivianar la vulnerabilidad generada por la pérdida de la integridad celular de los
tejidos del fruto.

Finalmente Zuorro et al., (2011) al evaluar la extracción asistida por enzimas de

licopeno en desechos del procesamiento de tomate y aumentar el rendimiento en la
extracción de 8 a 18 veces, tambien nos suministra un punto importante para tener en
cuenta, al argumentar que la extracción de este compuesto puede ser mucho mayor
con el uso de preparados enzimaticos con actividades celuloliticas y pectinoliticas.

41
 7. CONCLUSIONES.

Es posible mediante un pre-tratamiento enzimático aumentar la extracción de

licopeno del tejido matriz de la guayaba, sin embargo dicho efecto estará sujeto, en
mayor o menor medida a factores tales como la concentración de la enzima y la
temperatura y el pH del medio.

A diferencia, el tiempo de incubación de la enzima y el factor combinado de tiempo de

incubación- concentración de enzima, a las condiciones evaluadas, no generaran
efectos estadísticamente significativos para la extracción del compuesto objetivo.

Si bien mediante las concentraciones enzimáticas evaluadas se observó una relación

directamente proporcional entre esta variable y el aumento en la extracción de
licopeno, es necesario realizar el estudio con concentraciones mayores para definir en
mejor medida el comportamiento de la enzima.

El licopeno extraído mediante la lisis enzimática de la pared celular presenta alta

inestabilidad, razón por la cual se requiere complementar este estudio con medidas de
control del medio en el que se desarrolla el mismo, para de esta manera poder
cuantificar mejor el alcance del pre-tratamiento.

42
 8. BIBLIOGRAFÍA.

1. AGRONET. (28 de Mayo de 2012). Recuperado el 28 de Mayo de 2012, de

http://www.agronet.gov.co/agronetweb/AnalisisEstadisticas/tabid/73/Defau
lt.aspx

2. Belén Camacho, D. R., Moreno Álvarez, M. J., Alemán, R., & Álvarez, F. (2004).
Efecto de la temperatura de secado sobre la degradación de carotenoides en
frutos de Cordoba (Jessenia polycarpa Karst). Ciencia y Tecnología de
Alimentos, 206-210.

3. Bohm, V., Frohlich, K., & Bitsch, R. (2003). Rosehip –– a ‘‘new’’ source of
lycopene?. Molecular Aspects of Medicine , 385-389.

4. Choudhari, S. M., & Ananthanarayan, L. (2007). Enzyme aided extraction of

lycopene from tomato tissues. Food Chemistry , 77-81.

5. Davis, A. R., Fish, W. W., & Perkins- Veazie, P. (2003). A rapid

spectrophotometric method for analyzing lycopene content in tomato and
tomato products.. Postharvest Biology and Technology , 425 /430.

6. Espinal Ruiz, M. (2010). Capacidad antioxidante y ablandamiento de la guayaba

palmira. Tesis presentada como requisito para optar al título de Magíster en
Ciencias Química. Universidad Nacional de Colombia.

7. FAO. (2006b). Fichas Técnicas, Guayaba. Recuperado el 17 de Febrero de 2011,

de Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación:
http://www.fao.org/inpho/content/documents/vlibrary/ae620s/Pfrescos/GU
AYABA.HTM

8. FAO. (2006a). Guía de Nutrición de la Familia. Recuperado el 21 de Septiembre

de 2011, de Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/008/y5740s/y5740s05.pdf

9. FAO. (2003). Manual Para la Preparación y Venta de Frutas y Hortalizas.

Recuperado el 21 de Septiembre de 2011, de Organización de la Naciones
Unidas para la Agricultura y la Alimentación:
http://www.fao.org/DOCREP/006/Y4893S/y4893s08.htm

10. Fu, Y.-J., Liu, W., Zu, Y.-G., Tong, M.-H., Li, S.-M., Yan, M.-M., y otros. (2008).
Enzyme assisted extraction of luteolin and apigenin from pigeonpea [Cajanus
cajan (L.) Millsp.] leaves. Food Chemistry .

43
11. González Cardenas, I. A. (2010). Caracterización química del color de diferentes
variedades de guayaba (Psidium guajava L.) Colombiana. Tesis presentada para
optar al título de Magister en Ciencias - Química. Universidad Nacional de
Colombia.

12. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación ICONTEC. (1970).

NTC 1263 Guayaba.

13. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación ICONTEC. (1999).

NTC 4292 Determinación de pH.

14. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación ICONTEC. (1999).

NTC 4623 Determinación de la Acidez Titulable.

15. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación ICONTEC. (1999).

NTC 4624 Determinación del Contenido de Sólidos Solubles. Método
Refractométrico.

16. Jacoby, E., & Keller, I. (2006). La promoción del consumo de frutas y verduras
en américa latina: buena oportunidad de acción intersectorial por una
alimentación saludable. Revista Chilena de Nutrición .

17. Kong, K. W., & Ismail, A. (2011). Lycopene content and lipophilic antioxidant
capacity of by-products from Psidium guajava fruits produced duringpuree
production industry. Foods and Bioproducts Processing, 53-61.

18. Kong, K. W., Ismail, A., Tan, C. P., & Rajab, N. F. (2010). Optimization of oven
drying conditions for lycopene content and lipophilic antioxidant capacity in a
by-product of the pink guava puree industry using response surface
methodology. Food Science and Technology, 729-735.

19. Li, B. B., Smith, B., & Hossain, M. (2006). Extraction of phenilica from citrus
peels II. Enzyme - assisted extraction method. Separation and Purification
Technology.

20. Li, F., Yang, L., Zhao, t., Zhao, J., Zou, Y., Zou, Y., y otros. (2012). Optimization of
enzymatic pretreatment for n-hexane extraction of oil from Silybum marianum
seeds using response surface methodology. Food and Bioproducts Processing.

21. Lim, Y. Y., Lim, T. T., & Tee, J. J. (2007). Antioxidant properties of several
tropical fruits: A comparative study. Food Chemistry, 1003-1008.

22. Lugasi, A., Bíró, L., Hóváie, J., Sági, K. V., Brandt, S., & Barna, É. (2003). Lycopene
content of foods and lycopene intake in two groups of the Hungarian
population. Nutrition Research.

44
23. Markovic’, K., Hruskar, M., & Vahcic, N. (2006). Lycopene content of tomato
products and their contribution to the lycopene intake of Croatians. Nutritio
Reserch, 556-560.

24. Marquina, V., Araujo, L., Ruiz, J., Rodriguez-Malaver, A., & Vit, P. (2008).
Composiciónquimica y capacidad antioxidante en fruta, pulpa y mermelada de
guayaba. Archivos Latinoamericanos De Nutricion.

25. Melendez-Martinez, A. J., Vicario, I. M., & Heredia, F. J. (Junio de 2004).

Estabilidad de los pigmentos carotenoides en los alimentos. Recuperado el 3 de
Junio de 2012, de Archivos Latinoamericanos de Nutrición:
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-
06222004000200011&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0004-0622

26. Olives Barba, A. I., Cámara Hurtado, M., Sánchez Mata, M. C., Fernández Ruiz, M.,
& López Sáenz de Tejada, M. (2006). Application of a UV-vis detection-HPLC
method for a repid determination of lycopene and B-carotene in vegetables.
Food Chemistry , 328-336.

27. Ordóñez - Santos, L. E., & Vázquez - Riascos, A. (2010). Effect of processing and
storage time on the vitamin C and lycopene contents of nectar of pink guava
(Psidium guajava L.). Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 280-284.

28. (Santamaría, y otros, 2000)Pinelo, M., Arnous, A., & Meyer, A. S. (2006).
Upgrading of grape skins: Significance of plant cell-wall structural components
and extraction techniques for phenol release. Trends in Food Science &
Technology.

29. PROFRUTALES LTDA. (30 de 05 de 2012). Catalogo de Arboles Frutales.

Recuperado el 30 de 05 de 2012, de
http://www.profrutales.com/html/catalogo.php?id_especie=4

30. Puri, M., Sharma, D., & Barrow, C. J. (2012). Enzyme-assisted extraction of
bioactives from plants - Review. Trends in Biotechnology.

31. Quevedo, R., Díaz, O., Ronceros, B., Pedreschi, F., & Aguilera, J. M. (2009).
Description of the kinetic enzymatic browning in banana (Musa cavendish)
slices using non-uniform color information from digital images. Food Research
International.

32. Rao, A. V., & Agarwal, S. (1999). Role of lycopene as antioxidant carotenoid in
the prevention of chronic diseases: a review. Nutrition Reserch.

33. (Diniz Soares, Pereira, Miao Marques, & Monteiro, 2007)Rodríguez, L., Lopez,
L., & Garcia, M. (S.F). Determinación de la composición química y actividad
45
 antioxidante en distintos estados de madurez de frutas de consumo habitual en
colombia, mora, maracuyá, guayaba y papayuela. Universidad Jorge Tadeo
Lozano.

34. Rojas - Barquera, D., & Narváez - Cuenca, C. E. (2009). Determinación de

vitamina C, compuestos fenólicos totales y actividad antioxidante de frutas de
guayaba (Psidium guajava L.) cultivadas en Colombia. Química Nova.

35. Santamaría, R. I., Reyes-Duarte, M. D., Bárzana, E., Fernando, D., Gama, F. M.,
Mota, M., y otros. (2000). Selective Enzyme-Mediated Extraction of
Capsaicinoids and Carotenoids from Chili Guajillo Puya (Capsicum annuum L.)
Using Ethanol as Solvent. J Agric. Food Chem .

36. Soares, F. D., Pereira, T., Maio Marquez, M. O., & Monteiro, A. R. (2007). Volatile
and non-volatile chemical composition of the white guava fruit (Psidium
guajava) at different stages of maturity. Food Chemistry .

37. Thaipong, K., Boonprakob, U., Crosby, K., Cisneros-Zevallos, L., & Hawkins
Byrne, D. (2006). Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for
estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food
Composition and Analysis , 669-675.

38. Vásquez Riascos, A. M. (2009). Efecto del tiempo de almacenamiento en las

características físico-químicas en néctar de guayaba. Trabajo de Grado para
optar al Titulo de Ingenieria Agroindustrial. Universidad Nacional de Colombia .

39. Wijesinghe, W. A., & Jeon, Y.-J. (2012). Enzyme-assistant extraction (EAE) of
bioactive components: A useful approach for recovery of industrially important
metabolites from seaweeds: A review. Fitoterapia .

40. Yam Tzec, J. A., Villaseñor Perea, C. A., Romantchik Kriuchkova, E., Soto
Escobar, M., & Peña Peralta, M. Á. (2010). Una revisión sobre la importancia del
fruto de Guayaba (Psidium guajava L.) y sus principales características en la
postcosecha. Revista Ciencias Técnicas Agropecuarias .

41. Yi, C., Shi, J., Jun Xue, S., Jiang, Y., & Li, D. (2009). Effects of supercritical fluid
extraction parameters on lycopene yield and antioxidant activity. Food
Chemistry , 1088-1094.

42. Zuñiga, M. E., Soto, C., Mora, A., Chamy, R., & Lema, J. M. (2003). Enzymic pre-
treatment of Guevina avellana mol oil extraction by pressing. Process
Biochemistry .

43. Zuorro, A., Fidaleo, M., & Lavecchia, R. (2011). Enzyme-assisted extraction of
lycopene from tomato processing waste. Enzyme and Microbial Technology
46