UNIVERZITET U SARAJEVU

FARMACEUTSKI FAKULTET
KATEDRA ZA FARMACEUTSKU ANALITIKU

EKOTOKSIKOLOŠKA ISPITIVANJA
ORGANSKIH ATMOSFERSKIH POLUTANATA
NASTALIH USLIJED SPALJIVANJA BIOMASE
NA ODABRANIM TESTNIM ORGANIZMIMA
ZAVRŠNI RAD INTEGRISANOG STUDIJA I I II CIKLUSA

Mentor: Prof. dr. Polonca Trebše Kandidat:Šenan Hadžidedić

Sarajevo, januar 2018.

 Ovaj rad je realizovan na Katedri za Biomedicinu u zdravstvu,
Zdravstvenog fakulteta Univerziteta u Ljubljani,
pod mentorstvom prof. dr. Polonce Trebše, kojoj dugujem najveću
zahvalnost za svu ukazanu pomoć i savjete koji su mi pomogli pri
realizaciji ovoga rada, stečenim znanjima i vještinama.

Veliku zahvalnost izražavam i dr.sc. Marilyne Pflieger te

dr.sc. Sanji Babić na korisnim savjetima i pomoći u laboratoriju.

Zahvaljujem se i svojim roditeljima, sestri i prijateljima na podršci koju su

mi pružali tokom studija.

1
 SADRŽAJ

1. UVOD........................................................................................................................ 1
1.1. Polutanti ............................................................................................................. 1
1.2. Atmosfera, atmosferske reakcije i polutanti....................................................... 2
1.2.1. Nitrogenovi spojevi u atmosferi ................................................................. 3
1.2.2. Procesi koji se odvijaju danju ..................................................................... 3
1.2.3. Procesi koji se odvijaju noću ...................................................................... 4
1.3. Spaljivanje biomase ........................................................................................... 5
1.4. Drvo kao biomasa .............................................................................................. 6
1.5. Lignin ................................................................................................................. 6
1.6. Ispitivani spojevi ................................................................................................ 7
1.6.1. Metoksifenoli .............................................................................................. 8
1.6.2. Fenoli .......................................................................................................... 9
1.6.3. Nitrirani derivati fenola i metoksifenola ..................................................... 9
1.10. Značaj istraživanja ........................................................................................ 19
2. HIPOTEZA.............................................................................................................. 20
3. CILJ I ZADACI ....................................................................................................... 21
4. MATERIJALI I METODE...................................................................................... 22
4.1. Materijali .......................................................................................................... 22
4.1.1. Hemikalije ................................................................................................. 22
4.2. Metode i testni organizmi................................................................................. 23
4.2.1. Test bioluminiscencije .............................................................................. 24
4.2.2. Inhibicija germinacije i rasta korijenja ..................................................... 26
4.2.3. Akutni imobilizacijski test na Daphnia magna ......................................... 27
4.2.4. Letalni test na Saccharomyces cerevisiae ................................................. 29
4.3. Tečna hromatografija visokih preformansi (HPLC) ........................................ 30
4.4. ECOSAR .......................................................................................................... 31
5. REZULTATI ........................................................................................................... 33
5.1. Inhibicija bioluminiscencije ............................................................................. 33
5.1.1. Ekotokičnost pojedinačnih hemijskih spojeva .......................................... 33
5.1.2. Ekotoksičnost mješavina........................................................................... 34
5.2. Inhibicija germinacije i rasta korijenja ............................................................. 36
2
 5.2.1. Inhibicija germinacije ............................................................................... 36
5.2.2. Inhibicija rasta korijenja ........................................................................... 37
5.3. Daphnia magna imobilizacijski test ................................................................. 39
5.4. Letalni test na Saccharomyces cerevisiae ........................................................ 40
5.5. ECOSAR .......................................................................................................... 41
5.6. Hromatografska analiza ................................................................................... 42
6. DISKUSIJA ............................................................................................................. 43
6.1. Test bioluminiscencije ..................................................................................... 43
6.2. Akutni imobilizacijski test na D. magna .......................................................... 44
6.3. Inhibicija germinacije i rasta korijenja ............................................................. 45
6.4. Letalni test na S. cerevisiae .............................................................................. 46
6.5. ECOSAR .......................................................................................................... 47
7. ZAKLJUČCI ........................................................................................................... 48
8. REFERENCE .......................................................................................................... 49
9. POPIS SLIKA I GRAFIKA .................................................................................... 55
9.1. Slike.................................................................................................................. 55
9.2. Grafici .............................................................................................................. 55
10. POPIS TABELA .................................................................................................. 56

3
SAŽETAK

Drvna biomasa predstavlja najvažniji izvor semivolatilnih polutanata u atmosferi.

Spaljivanjem biomase, osim nastanka ugljikovog monoksida, ugljikovog dioksida,
dušikovih oksida i PM čestica, nastaju i velike količine organskih molekula, uglavnom
fenola i metoksifenola. Ovi spojevi, procesom nitracije u troposveri prelaze u još
toksičnije produkte. Iako su ispitivani spojevi prema EU regulativi klasificirani kao štetni
ili toksični, do sada nisu provedena ekotoksikološka ispitivanja ili podaci o njihovoj
toksičnosti su vrlo oskudni. Ovo istraživanje nudi prve ekotoksikološke podatke
ispitivanih spojeva na različitim modelnim organizmima i to: Vibrio fischeri, Daphnia
magna, Triticum aestivum, Trifolum repens i Saccharomyces cerevisiae. Osim toksičnosti
pojedinačnih spojeva, ispitana je i toksičnost mješavina. Mješavine gvajakola i siringola
te njihovih nitriranih derivata nisu pokazale zajedničko djelovanje, dok je mješavina
katehola i nitrokatehola pokazala sinergističko djelovanje.

Ključne riječi: spaljivanje biomase, zagađenje zraka, gvajakol, toksičnost mješavina

4
1. UVOD
1.1. Polutanti

Zagađenje zraka se može definirati kao povećanje koncentracije supstanci u

atmosferi iznad koncentracije u kojoj su uobičajno prisutne, što može uzrokovati
negativan učinak na čovjeka, životinje, vegetaciju i/ili materijale (1). Među toksične
supstance ubrajaju se različiti hemijski spojevi koji mogu biti u obliku gasova, tekućih
kapljica ili čvrstih čestica. U najvažnije atmosferske polutante ubrajaju se ugljikov
monoksid i dioksid, sumporovi oksidi, nitrogenovi oksidi, volatilni organski spojevi, PM
čestice, te ozon (2). Svakodnevno se u atmosferu emitiraju različiti organski spojevi, bilo
prirodnim putem ili ljudskom aktivnošću (antropogeno). S obzirom na porijeklo,
zagađivači se mogu podijeliti na dvije kategorije i to na primarne i sekundarne polutante.
U primarne polutante ubrajaju se oni polutanti koji nastaju direktno iz svojih izvora (npr.
dim iz industrijskih postrojenja, pepeo iz erupcija vulkana), dok sekundarni polutanti
nastaju atmosferskim procesima starenja poput hemijskih i fotohemijskih reakcija. Glavni
izvori zagađenja zraka su transport, industrijska izgaranja i izgaranja goriva u
domaćinstvu, industrijski procesi te spaljivanje biomase (3). Prema podacima Europske
agencije za okoliš (EEA - Air quality in Europe 2017) za 2017. godinu, u tabeli br. 1.
prikazane su godišnje srednje vrijednosti polutanata PM2.5, NO2 i O3 za Europu, odnosno
Bosnu i Hercegovinu (4).

Tabela br.1. : Godišnje srednje vrijednosti atmosferskih polutanata u Europi i

Bosni i Hercegovini. Koncentracije PM2.5 i NO2 su izražene u µg/m3, dok je koncentracija
O3 izražena kao broj ozonskih prosjeka iznad 35 ppb (SOMO35).

Bosna i Europski zdravstveni

Polutant Europa
Hercegovina standard*
PM2.5 (µg/m3) 14,1 15,3 10 µg/m3/godina
NO2 (µg/m3) 18,6 15,1 40 µg/m3/godina
100 µg/m3/max dnevni
O3 (SOMO35)(µg/m3.dani) 3501 3825
osmosatni prosjek
* http://ec.europa.eu/environment/air/quality/standards.htm

1
 1.2. Atmosfera, atmosferske reakcije i polutanti

Kako bi se bolje razumjele hemijske reakcije važne za ovu temu, potrebno je znati
mjesto odvijanja istih u atmosferi. Atmosfera se generalno može podjeliti na nekoliko
slojeva: troposfera, stratosfera, mezosfera, i termosfera. Većina hemijskih reakcija se
odvija u troposferi i stratosferi, odnosno u regionima najbližim Zemljinoj površini.
Troposfera se proteže do 10-15 km, a stratosfera do 50 km od Zemljine površine, što je
prikazano na slici br. 1.

Slika br.1: Slojevi atmosfere i njihov položaj u odnosu na površinu Zemlje (5)

U najnižim dijelovima atmosfere stvara se kompleksan sistem u koji se, uglavnom

ljudskom aktivnošću, emitiraju oksidi nitrogena i volatilni organski spojevi. U tom
regionu dešavaju se brojne hemijske reakcije koje dovode do formiranja ozona i smoga,
depozicije kiselina i produkcije sekundarnih aerosola koje mogu dovesti do takozvanog
efekta saklenika. Nitrogenovi oksidi i volatilni organski spojevi se mogu ukloniti fizičkim
procesima poput suhog i vlažnog taloženja (6) ili se mogu transformirati hemijskim
procesima fotolize i oksidacije slobodnim radikalima poput hidroksil (OH) radikala, nitrat
(NO3) radikala i ozonom (O3). Na hemijske procese koji se dešavaju u atmosferi uveliko
utiče prisutstvo sunčeve svjetlosti, pa se ovi procesi mogu podijeliti na procese koji se
dešavaju danju (uz prisustvo fotoradikala OH i O3), te procese koji se odvijaju noću (uz
NO3).

2
 1.2.1. Nitrogenovi spojevi u atmosferi

Osim nitrogena koji je u najvećoj količini prisutan u atmosferi, postoje i važni

nitrogenovi spojevi koji se u atmosferi nalaze u tragovima. To su nitrogen (I) oksid (N2O),
nitrogen monoksid (NO), nitrogen dioksid (NO2), nitratna kiselina (HNO3) i amonijak
(NH3). Nitrogen (I) oksid (N2O) je važan staklenički gas koji se emitira u atmosferu
agrikulturnim procesima ili prirodnim izvorima poput udara gromova. Nitrogenovi
oksidi, NO i NO2, se u atmosferi mogu naći procesom sagorjevanja fosilnih goriva ili
sagorjevanjem biomase. NO2 uglavnom nastaje u atmosferi pretvorbom iz NO, dok je NO
glavni oksid nitrogena koji nastaje sagorjevanjem nitrogena iz goriva sa kisikom pri
visokim temperaturama. Procjenjuje se da iz sagorjevanja fosilnih goriva nastaje oko 33
miliona tona, a iz sagorjevanja biomase oko 7,1 miliona tona nitrogena na godišnjem
nivou (1). Ostali oksidi nitrogena poput NO3 i N2O5 su prisutni u atmosferi u relativno
niskim koncentracijama, ali mogu učestvovati u važnim atmosferskim hemijskim
reakcijama. Nitratna kiselina je oksidacijski produkt NO2 iz atmosfere, dok se amonijak
primarno emituje iz prirodnih izvora. Reaktivni nitrogen se može definirati kao skup
nitrogenovih oksida i svih spojeva koji su proizvodi atmosferske oksidacije nitrogenovih
oksida. U ove spojeve spadaju i nitratna kiselina (HNO3), nitritna kiselina (HNO2),
nitratni radikal (NO3), dinitrogen pentoksid (N2O5) peroksinitratna kiselina (HNO4) i
ostali. Nitratna kiselina se vrlo lako otapa u vodi prisutnoj u atmosferi, a nitratni radikal
je važan konstituent u hemiji troposfere, posebno u noćnim uvjetima (1).

1.2.2. Procesi koji se odvijaju danju

Prije objašnjenja mehanizma nastanka određenih spojeva u atmosferi, bitno je

naglasiti da su hidroksil radikal, nitrogenovi oksidi i ozon međusobno usko povezani.
Jedna od vodećih hemijskih reakcija koja se dešava danju jeste fotoliza ozona prilikom
koje nastaje hidroksil radikal. Najprije iz ozona nastaje molekula kisika, te reaktivni kisik
koji stupa u reakciju sa vodom, prilikom čega nastaju dvije molekule hidroksil radikala
(jednačine 1 i 2) (7).

O3 + λ(240-310 nm) → O(1D) + O2 (1)

O(1D) + H2O → 2 •OH (2)

3
 Reakcije OH sa gasovima koji se nalaze u tragovima uglavnom dovode do
stvaranja hidroperoksid radikala (HO2) koji se ponovo reciklira do OH u reakciji sa NO.
U tom procesu NO je oksidiran do NO2. Novonastali NO2 u prisustvu svjetlosti se razlaže
na NO i elementarni kisik, koji reaguje sa molekulom kisika stvarajući ozon (jednačine
3-5).

HO2• + NO → •OH + NO2 (3)

NO2 + λ(290-400 nm) → NO + O • (4)

O• + O2 → O3 (5)

Danju se odvijaju i reakcije fotolize nitrogenovih oksida (jednačina 4) te fotoliza

NO3 do NO2 ili NO na valnim dužinama manjim od 640 nm (jednačina 6).

NO3 + svjetlost → NO2 + O(3P) (6)

1.2.3. Procesi koji se odvijaju noću

U uslovima u kojima nema sučevog svjetla producira se NO3 ili noćni oksidant,
reakcijom NO2 sa ozonom (8), dok je koncentracija OH gotovo jednaka nuli (jednačina
7) . Drugi izvori NO3 mogu biti reakcija OH sa HNO3 ili reakcije nekih organskih nitrata
(9).

NO2 + O3 → NO3 + O2 (7)

Nitratni radikal je važan inicijator degradacije mnogih volatilnih organskih

spojeva poput monoterpena i dimetilsulfida. Nastali NO3 može reagovati sa NO2 dajući
nitrogen pentoksid N2O5 (jednačina 8).

NO3 + NO2 ⇌ N2O5 (8)

Pentoksid može pri višim temperaturama preći u NO3, odnosno NO2, tako da se
N2O5 može smatrati rezervoarom nitrogenovih oksida. Osim toga, pentoksid se može
otapati u vodenim kapljicama gdje se procesom hidrolize stvara nitratna kiselina.
Nitrogenov pentoksid može stupati i u reakciju sa hloridnim jonima u aerosolu morske

4
vode, pri čemu nastaje nitril-hlorid (ClNO2), ali se isti razlaže pojavom sunčevog svjetla
(10). Ciklus nitrogenovih oksida i reakcije prikazan je na slici br. 2

Slika br. 2.: Procesi u atmosferi koji se odvijaju noću – hemijski spojevi obojeni
crvenom bojom su prisutni u atmosferi samo noću. Pojavom sunčevog svjetla dolazi do
njihovog razlaganja, pa je prema tome njihova koncentracija tokom dana približno
jednaka nuli. Nitro-radikal se u prisutstvu svjetlosti razlaže na NO2 i NO, tako da su
njegove dnevne koncentracije vrlo niske (10).

1.3. Spaljivanje biomase

Biomasa je živa ili mrtva materija, koja može biti biljnog ili životinjskog porijekla,
a koristi se kao gorivo ili u industrijskoj proizvodnji. Spaljivanje biomase je sagorjevanje
organske materije koje može nastati prirodnim putem ili može biti uzrokovano ljudskim
faktorom. Primjeri spaljivanja biomase su požari, paljenje drvnog ogrjeva, spaljivanje
ostataka usjeva prilikom čišćenja zemljišta, i slično. Smatra se da je 90% spaljivanja
biomase na Zemlji uzrokovano ljudskim faktorom (11). Prilikom spaljivanja nastaju
velike količine dima koji je kompleksnog sastava. Osim što sadrži velike količine
ugljikovog dioksida i monoksida, vodene pare, čestica i dušikovih oksida, dim sadrži i
određenu količinu organskih materija, poput fenola i njegovih derivata (11). Smatra se da
je spaljivanje biomase drugi po veličini izvor gasovitih nemetanskih organskih spojeva i
glavni izvor organskog aerosola u troposferi (12). Gledajući globalno, procjenjuje se da
5
se godišnje spali oko 5613 miliona tona suhe materije biomase, od čega je 2814 miliona
tona uzrokovano požarima, dok se ostatak odnosi na biogorivo (13). Čestice koje nastaju
prilikom spaljivanja biomase ne samo da utiču na klimatske promjene, nego mogu
izazvati i zdravstvene probleme kod ljudi i ostalih živih organizama (14).

1.4. Drvo kao biomasa

Drvo je kompozitni materijal koji se danas najviše koristi u drvnoj industriji i
proizvodnji namještaja, ali i za ogrjev i proizvodnju biogoriva (pelet). Drvo je heterogeni,
higroskopni materijal sastavljen od biljnih ćelija, a po hemijskoj strukturi je sačinjen od
mikrovlakana celuloze (40-50%) i hemiceluloze (15-25%) impregniranih ligninom (15-
30%) (15). Generalno, drva se prema tipu mogu podijeliti na tvrda drva i meka drva, iako
ovakva podjela ne mora nužno označavati tvrdoću drveta. Prema tome, mekim drvima se
smatraju golosjemenjače (npr. cedrovina, borovina, čempresi), dok su tvrda drva
kritosjemenjače (npr. mahagonij, javor, hrast). Osnovna razlika između ova dva tipa drva
je što tvrda drva imaju karakterističan tip ćelija koje čine provodne elemente (pore), dok
su ti elementi izostaju kod mekih drva (16). Osim toga, tvrda i meka drva se razlikuju po
udjelu lignina u drvetu te hemijskog sastava samog lignina.

1.5. Lignin

Lignin je prirodni polimer koji je, nakon celuloze, prisutan u najvećim količinama
kod vaskularnih biljaka. U biljkama je prisutan u količini od 24-33%, a ima nekoliko
funkcija značajnih za njihov opstanak. Lignin pruža čvrstoću ćelijskim zidovima i djeluje
kao vezivno sredstvo između ćelija, čime stvara kompozitni materijal koji je izvanredno
otporan na udare, kompresiju i savijanje. Također ima ulogu u transportu vode,
nutrijenata i metabolita na način da smanjuje propustljivost vode kroz stanične zidove u
provodnim snopićima (17).
Prema široko prihvaćenom konceptu, lignin se može definirati kao amorfni,
polifenolni materijal nastao enzimatskom polimerizacijom tri fenil-propanoidna
monomera, nazvanih konferil alkohol, sinapil alkohol i p-kumaril alkohol (18). Postoji
nekoliko tipova lignina u ovisnosti od udjela monomera u njegovom sastavu, pa tako
imamo lignin od mekog drveta (golosjemenjače), lignin od tvrdog drveta
(kritosjemenjače) i lignin trava. Lignin mekog drveta se sastoji uglavnom od konferil-
alkohola te nešto p-kumaril- alkohola, ali bez sinapil- alkohola. Lignin trvdog drveta se

6
sastoji od jednakih količina konferil- i sinapil- alkohola te manjeg dijela p-
hidroksifenilpropana. Lignin trava je sastavljen iz konferil- , sinapil- i p-
hidriksifenilpropana sa p-kumarinskom kiselinom, uglavnom esterificiranom sa
terminalnom hidroksi-grupom bočnih lanaca p-kumaril alkohola (19).

Na slici br. 3. prikazana je predložena, kompleksna polifenolna struktura lignina

mekog drveta. (19)

Slika br. 3.: Jedna od mogućih struktura lignina.

Tokom spaljivanja biomase, pirolizom lignina nastaju semivolatilni organski

spojevi derivati fenola, među kojima su najviše prisutni gvajakol, katehol i siringol (20).
Ovi novonastali spojevi ispoljavaju toksično djelovanje, te su predmet istraživanja ovog
rada.

1.6. Ispitivani spojevi

Pirolizom lignina nastaju mnogi volatilni fenoli, među kojima u najvećoj količini
gvajakol, siringol i katehol. Ovom pirolizom, metoksifenoli (gvajakol i siringol), te fenoli
(katehol) čine značajan udio čestica u dimu. Gvajakol i siringol čine 45%, a fenoli 21%

7
ukupne mase nastalog aerosola. Procjenjuje se da emisija metoksifenola prilikom
spaljivanja biomase u domaćinstvima prilikom grijanja iznosi između 420-900 mg/kg
biomase (21). Prema istraživanju Stockwella i suradnika (22) spaljivanjem biomase
različitiog porijekla, emisija katehola iznosi 0,73-1,72 mg/g, gvajakola 0,21-0,76 mg/g, a
siringola 0,07-0,21 mg/g biomase. Ovim procesom, prema istraživanju Schauera i
saradnika (23), emitiraju se fenoli i supstituirani fenoli u količini od 1,46 g/kg biomase,
kao i gvajakol i supstituirani gvajakoli koji čine 1.33 g/kg biomase.

1.6.1. Metoksifenoli

Gvajakol je hemijski spoj koji nastaje u najvećoj količini procesom pirolize

lignina. Po strukturi je metoksi-fenol, odnosno monometil eter katehola. Metabolizira se
procesom oksidacije, enzimima peroksidazom i ciklooksigenazom (24). Prirodni je
produkt koji je izoliran iz smole Guaiacum sanctum (porodica:Zygophyllaceae)– gvajak,
a u farmaciji se koristio kao ekspektorans, antiseptik, lokalni anestetik, pa čak i kao lijek
protiv sifilisa (25). Nalazi se u urinu pacijenata sa neuroblastomom i feohromocitom (26).
Također se koristi za sintetsko dobijanje vanilina. Najveći izvori gvajakola su smola breze
i Eucalyptus macarthurii (27). Gvajakol je tečnost, blijedo-žućkaste boje, te
karakterističnog mirisa na dim.
.
Hemijska struktura gvajakola prikazana je na slici br. 4.

Slika br. 4.:Struktura gvajakola Slika.br. 5.: Struktura siringola

Siringol je drugi značajni spoj, koji se osim gvajakola nalazi u sastavu dima.
Izoliran je iz Syringa vulgaris (porodica: Oleaceae) – jorgovana, po kome je i dobio ime.
Prema hemijskoj strukturi je 2,6-dimetoksifenol. Budući da se nalazi u dimu, prilikom
pripreme hrane sušenjem ili pečenjem na drvnom uglju, siringol dospjeva na tako
pripremljenu hranu i daje im aromu po dimu. Također, umjetne arome dima sadrže oko

8
13% siringola (28). Međutim, mora se istaći da aroma dima ne potiče samo od fenolnih
spojeva, nego je to kompleksna mješavina koja sadrži i različite organske kiseline,
alkohole i ketone, te da ovisi od pH sredine (29). Siringol se može naći i u vinu koje
dozrijeva u drvenim bačvama (30). Siringol ima upotrebu kao supstrat u određivanju
aktivnosti enzima lakaze (31). Hemijska struktura siringola prikazana je na slici br. 5.

1.6.2. Fenoli

Treći po količini produkt nastao pirolizom lignina je katehol. Po hemijskoj

strukturi je 1,2-dihidroksibenzen, odnosno 2-hidroksifenol. Osim imena katehol, u
upotrebi su i pirokatehol, te orto-benzendiol. Prvi put je izoliran destilacijom katehina iz
Senegalia catechu (porodica: Fabaceae) (32). Prirodno se nalazi u arganovom ulju (33) i
šampinjonima (34). Danas se upotrebljava u proizvodnji pesticida, parfema i lijekova
(35). Katehol je bezbojni prah, karakterističnog mirisa, koji stajanjem na zraku potamni.
Izvor katehola u okolišu i potencijalno izlaganje je putem kontaminirane vode i hrane, te
dimu cigareta. Kod ljudi, katehol u kontaktu sa kožom, može izazvati ekcematozni
dermatitis. Osim toga, apsorpcijom kroz kožu može uzrokovati efekte slične kao kod
trovanja fenolom, sa izražajnijim konvulzijama. Kod životinja, velike doze katehola
mogu izazvati depresiju centralnog nervnog sistema i produženi porast krvnog tlaka. Za
katehol nisu dostupne informacije o hroničnim efektima, uticaju na reproduktivni sistem
i rizik od razvijanja kancera (36).
Hemijska struktura katehola prikazana je na slici br. 6.

Slika br. 6. : Struktura katehola

1.6.3. Nitrirani derivati fenola i metoksifenola

Reakcija između fenola i nitritne kiseline je zanimljiva sa gledišta

ekotoksikologije zbog nastajanja nitrofenola koji ispoljavaju toksično djelovanje. NO3
ima vodeću ulogu u noćnoj troposferskoj hemiji zbog njegove brze reakcije sa drugim

9
radikalima i određenim organskim gasovima u tragovima, posebno onim biogenog
porijekla (37). Reakcija NO3 radikala sa fenolima su jako brze i u gasovitoj i u vodenoj
fazi, čime se stvaraju nitrofenoli. Tako u gasnoj fazi NO3 sa fenolom daje 2-nitrofenol,
dok u vodenoj fazi nastaju dva izomera, 2-nitrofenol i 4-nitrofenol (38). Primarni
polutanti koji nastaju pirolizom lignina (gvajakol, siringol i katehol) emitiraju se u
atmosferu u sastavu dima. Kao takvi dospijevaju u troposferu, gdje podliježu različitim
hemijskim reakcijama u gasnoj ili tečnoj fazi (39). U ovisnosti o dobu dana, može doći
do oksidacije ili nitracije primarnih polutanata. Nitracija ovih spojeva dešava se u tečnoj
fazi, tijekom noći. Sam mehanizam nitracije nije razjašnjen u potpunosti, ali se
najvjerovatnije radi o elektrofilnoj aromatskoj supstituciji. Kao izvor reaktivnog
nitrogena u troposferi najčešće se navodi dinitrogen-pentoksid (N2O5), ali on nije jedini
izvor nitronijevog jona (NO2+) u okolišu. Osim N2O5, prisutni su i peroksinitratna kiselina
(HOONO) i nitritna kiselina (HNO2) (40).

Na slici br. 7 opisan je predloženi mehanizam nitracije gvajakola u kiseloj sredini (41).

Slika br. 7.: Predložena reakcijska shema transformacije gvajakola u kiseloj otopini
natrijeva nitrita: 1. gvajakol (GUA), 2. 4-nitrogvajakol (4NG), 3. 6-nitrogvajakol (6NG),
4. 4,6-dinitrogvajakol (DNG). Model uzima u obzir i nastanak nitrozogvajakola (svijetlo
plavi dio sheme) (41)

10
 U istraživanju Kroflič i sur. (39) eksperimentalno je dokazana nitracija gvajakola
u uslovima koji vladaju u troposferi. Eksperimenti su provedeni u tami i u uslovima
simulirane sunčeve svjetlosti, uz dodatak natrijevog nitrita (NaNO2), te vodikovog
peroksida (H2O2). Nitritna kiselina u kiseloj vodenoj otopini se razlaže na NO• i NO2•

radikale, te su ovi radikali potencijalni nitracijski agensi aromatskih spojeva (jednačine 9

i 10). Osim njih, može nastati i NO+, ali je nitracija ovim agensom moguća samo kod
aktiviranih aromatskih prstenova.
2HNO2 → NO• + NO2• + H2O (9)

HNO2 + H+ → NO+ + H2O (10)

U kontroliranim uvjetima bez prisutstva svjetlosti, iz gvajakola primarno nastaje

6-nitrogvajakol (6NG) te se brzo konvertuje u i 4,6-dinitrogvajakol (DNG), dok je
nastanak 4-nitrogvajakola (4NG) usporen. U prisutnosti peroksida, nitracija gvajakola u
tami je značajno ubrzana, što se može objasniti stvaranjem peroksinitritne kiseline
(jednačina 11). Ona se može izomerizirati u nitratnu kiselinu, ali i doprinijeti stvaranju
OH• i NO2• radikala ili nitracijskih agenasa poput NO+ i NO2+.

HNO2 + H2O2 → HOONO + H2O (11)

Kada se govori o nitraciji u prisutstvu svjetlosti, glavni nitracijski produkti

gvajakola su 4NG, 6NG i 4,6-DNG što je prikazano na slici br. 8, dok se 5-nitrogvajakol
ne produkuje (42). U uslovima simulirane sunčeve svjetlosti peroksid nema značajan
učinak na kinetiku nastajanja nitrogvajakola, odnosno reaktivnost 4NG i 6NG je
podjednaka. Ova činjenica ukazuje da postoje najmanje dva agensa za nitraciju koji
različito reaguju pod uslovima simulirane sunčeve svjetlosti. Prema ovome, pretpostavlja
se da je NO2+ selektivniji prema 6NG, dok se 4NG vjerovatno uglavnom nitrira sa NO2•.

Na osnovu navedenog, nitracija produkata pirolize lignina se može odvijati i noću

i danju, ali je proces koji se odvija noću značajniji zbog nestabilnosti i fotodegradacije
organskih nitrata. Nitracijom u atmosferi nastaju 4-, 6- i dinitrogvajakoli, dok se 5-
nitrogvajakol ne produkuje. Osim gvajakola, nitraciji podliježu i siringol te katehol, što

11
za posljedicu ima stvaranje nitro-derivata: nitrosiringola i nitrokatehola. Na slici br. 9.
prikazane su hemijske strukture i nazivi nitro derivata ispitivanih spojeva u ovom radu.

Slika br. 8. : Hromatogram nastalih nitro produkata gvajakola i produkata velike

molekulske mase pod uslovima simulirane sunčeve svjetlosti (42)

4-nitrogvajakol 6-nitrogvajakol

5-nitrogvajakol 4,6-dinitrogvajakol

4-nitrosiringol 4-nitrokatehol

Slika br. 9: Nitro derivati ispitivanih spojeva

12
 Svi novonastali nitro derivati i primarni polutanti se kondenziraju i otapaju u
vodi prisutnoj u atmosferi. Nakon toga, precipitacijom putem kiše ili snijega mogu
dospjeti na površinu zemlje. Dospijevši na površinu zemlje, ovi produkti se mogu
akumulirati u zemljištu ili podzemnim vodama, te tamo ispoljavati toksično djelovanje
(43). Fizičko-hemijske karakteristike ispitivanih spojeva date su u tabeli br. 2.

13
14
 1.7. Ekotoksikološki testovi

Uloga toksikologije i ekotoksikologije je proučavanje odnosa između količine

hemikalije kojoj je organizam izložen te prirode i stepena štetnih (toksičnih) efekata
koji mogu proizaći. Veza između doze i efekta pruža osnovu za procjenu štetnosti i
rizika uzrokovanog hemikalijama u okolišu. Postoji nekoliko načina na koji se može
mjeriti toksičnost, a najčešći način je mjerenje smrtnosti organizma. Međutim, postoje
i drugi indikatori toksičnosti, pa se u testiranju toksičnosti koriste biohemijski,
fiziološki, reproduktivni i bihevioralni efekti koji mogu pružiti podatke o toksičnosti
određenih spojeva (44).

1.7.1. Pojmovi u toksikologiji

Postoji nekoliko pojmova u definiranju toksičnosti od kojih se najčešće koriste

LD50, NOED (NOEC), te LOEC. LD50 predstavlja srednju letalnu dozu, odnosno dozu
određene supstance dovoljnu da usmrti polovinu jedinki testirane populacije u
određenom vremenskom intervalu. U toksikološkim testovima moguće je odrediti
najviše doze, odnosno koncentracije, koje ne uzrokuju toksičnost - NOED (eng. no
observed effect dose) i NOEC (eng. no observed effect concentration). Ove vrijednosti
se mogu koristiti smo u slučaju u kojima je viša doza ili koncentracija ispitivanog spoja
pokazala efekat u istom toksikološkom testu, odnosno pokazala toksičnost. LOEC
(eng. lowest observed effect concentration) predstavlja najnižu koncentraciju
ispitivanog spoja koji je izazvao određeni efekat (44). Pojmovi koji se koriste u
toksikologiji ilustrirani su na slici br. 10.

Osim navedenog, proučavanje odnosa između strukture hemijskog spoja i

toksičnosti - QSAR (eng. quantitative structure-activity relationships) može pomoći u
identifikaciji toksičnih molekula. Ovakav pristup može poslužiti u boljem
razumijevanju mehanizma toksičnosti i molekularnim karakteristikama spojeva koje
dovode do interakcije sa ćelijskim makromolekulama ispitivanih organizama (44). Kao
primjer može se navesti ECOSAR.

15
 Slika br. 10. : Pojmovi LC50, LOEC, NOEC u testiranju toksičnosti

1.7.2. Tipovi toksikoloških testova

U ovisnosti od dužina trajanja izloženosti organizma, toksikološki testovi se

mogu podijeliti na akutne i na hronične. Akutni testovi su testovi kratkog izlaganja,
kod kojih je vrijeme izlaganja od nekoliko minuta do nekoliko dana, a kao završna
tačka testiranja se uglavnom posmatra smrtnost organizma. Kod ovog tipa testa,
organizmi dolaze u kontakt sa visokim dozama (koncentracijama) ispitivane supstance,
jednokratno ili višekratno u kratkom vremenskom razdoblju. Visoke doze
(koncentracije) toksikanta uzrokuju brzi odgovor organizma, a brzina djelovanja je u
ovisnosti o vremenu apsorpcije istog, odnosno puta primjene. Toksičnost kod akutnih
testova se izražava preko LD50 (LC50) ukoliko se posmatra smrtnost organizma ili ED50
(EC50) ukoliko se kao završna tačka posmatra neki drugi parametar. Hronični testovi
su testovi dugog izlaganja koji mogu trajati od nekoliko sedmica pa do nekoliko godina,
u ovisnosti od životnog vijeka organizma na kojem se vrši testiranje. Kod ovog tipa
testa, organizmi se izlažu niskim dozama toksikanta tokom dužeg vremenskog
razdoblja. Ovaj tip testa je pogodan kod ispitivanja supstanci koji se u okolišu nalaze u
niskim koncentracijama, ali imaju mogućnost drugog zadržavanja (perzistentnost).
Hronično izlaganje može izazvati iste efekte kao i akutno izlaganje, ali može pokazati
i određene efekte koji se sporo razvijaju. Toksičnost kod ovakvog tipa testa se izražava
preko NOEC ili LOEC (45).

16
 Procjena hronične toksičnosti na osnovu podataka dobijenih akutnim testom se
može vršiti pomoću ACR (eng. Acute to Chronic Ratio). Ova vrijednost se dobija
dijeljenjem LC50 vrijednosti dobijene akutnim testom sa vrijednosti MATC (eng.
Maximum Acceptable Toxicant Concentration), koji predstavlja korijen umnoška
NOEC i LOEC. Ekstrapolacija akutnih vrijednosti na hronične je važan pristup koji
ima praktičnu korist u procjeni opasnosti određenih hemikalija. Ovakav pristup ima
određene prednosti poput izbjegavanja testiranja na životinjama, ali i manjkavosti jer
određene hemikalije imaju različit mehanizam djelovanja kod kratkoročnog, odnosno
dugoročnog izlaganja (46). Prema istraživanju Ahlersa i suradnika (47) akutne
vrijednosti imaju ograničenu prediktivnu vrijednost za dugoročne efekte u akvatičkim
ekosistemima. Oni smatraju da ACR ne korelira niti s akutnom toksičnosti, niti sa
vrijednošću toksičnosti dobijenim modeliranjem. Također ne postoji korelacija između
organizama koji pripadaju različitom trofičkom nivou. Autori smatraju da se dugoročna
toksičnost može procjeniti samo na osnovu ispitivanja koja obuhvataju čitav životni
ciklus organizma.

1.7.3. Modelni organizmi u toksikološkim testovima

Izbor modelnog organizma u toksikološkim testovima ovisi od nekoliko

faktora: osjetljivosti organizma na različite supstance, dostupnosti, reprezentativnosti
različitih ekosistema, te lakoće održavanja i kultivacije u laboratorijskim uslovima
(48). Zbog različitog uticaja pojedinih toksikanata na ljude, životinje, biljke, gljive,
alge i bakterije, potrebno je koristiti različite bioeseje sa raznovrsnim biološkim
vrstama koje pripadaju različitom nivou u hranidbenom lancu (trofičkom nivou), kako
bi se realno procijenila opasnost za okoliš (49). Budući da različiti organizmi imaju
različitu osjetljivost na kontaminante u okolišu, procjena opasnosti određenih
hemikalija za okoliš se može dobiti testirajući toksičnost na više organizama
istovremeno. Ovakav pristup testiranja toksičnosti hemijskih spojeva se svodi na
kreiranje pojednostavljenog hipotetskog ekosistema, koji sadržava organizme koji
pripadaju različitim nivoima u hranidbenom lancu (50). Tako se kod procjene
toksičnosti na vodene organizme koriste alge kao primarni proizvođači (npr. Chlorella
vulgaris), beskralježnjaci kao primarni potrošači (npr. Daphnia magna) i ribe kao

17
sekundarni potrošači (npr. Danio rerio) (51). Kod procjene toksičnosti hemikalija na
kopnene organizme koriste se različite biljke kao proizvođači, kopneni beskralježnjaci
kao potrošači i mikroorganizmi kao razlagači.

1.8. Monitoring

Efekat polutanata na organizme je teško predvidjeti sa prihvatljivim stepenom

tačnosti samo na osnovu njihove koncentracije u okolini. Faktori koji utiču na
biodostupnost hemikalija organizmima jesu i promjene temperature okoline,
interakcije sa drugim polutantima, tipovima zemljišta i sedimenta, kiša, pH i salinitet.
Zbog toga se vrše in situ procjene koje bi uključile i sve navedene faktore. Postoji
nekoliko pristupa u in situ biološkom monitoringu:
1. Praćenje efekata zagađenja na prisutnost ili odsutnost vrsta, odnosno
praćenja promjena u sastavu vrsta, poznatije kao „efekti zajednice“,
2. Mjerenje koncentracije poluntanata u indikatorskim vrstama,
3. Procjena efekta polutanata na organizme i uticaj njihovih koncentracija na
biotičke i abiotičke indikatore,
4. Otkrivanje genetički izmjenjenih sojeva organizama koje su razvile
rezistenciju kao odgovor na zagađenje (44) .

1.9. Europska klasifikacija toksičnosti

Prema aneksu VI direktive 67/548/EEC toksičnost hemikalija na vodene

organizme se klasificira prema prema EC50 vrijednostima (52). Na ovaj način,
klasifikacija hemikalija prema toksičnosti se vrši kako je dato u tabeli br. 3.

Tabela br.3. : Klasifikacija toksičnosti hemikalija

Raspon koncentracija (mg/l) Klasa

EC50 ≤ 1 Vrlo toksično
1 < EC50 ≤ 10 Toksično
10 < EC50 ≤ 100 Štetno
EC50 > 100 Nije toksično (nije klasificirano)

18
 Prema ovoj klasifikaciji, ispitivani spojevi su klasificirani kao štetni, odnosno
toksični, u ovisnosti na koji se modelni organizam posmatra. Treba istaći da okolišni
faktori poput prisutstva drugih spojeva, pH sredine, te temperature mogu povisiti
hroničnu toksičnost ovih spojeva.

1.10. Značaj istraživanja

Prilikom spaljivanja biomase nastaju semivolatilni organski spojevi, među kojima

u najvećoj količini nastaje gvajakol. Ovi spojevi u atmosferi mogu biti u gasovitoj fazi,
ili preći u tečnu atmosfersku fazu. Kao takvi, oni mogu reagirati sa ostalim spojevima
prisutnim u atmosferi i stvarati nove polutante. Produkti nastali njihovom oksidacijom su
manje isparljivi i bolje topivi u vodi, sposobni apsorbirati sunčevu svjetlost, te mogu
formirati sekundarne organske aerosole (41). Kada se govori o nitro-aromatskim
derivatima, mora se istaći da oni predstavljaju snažne toksične, mutagene ili karcinogene
spojeve, koji mogu predstavljati opasnost za ljudsko zdravlje i ostala živa bića (14).
Upravo zbog toga, sekundarni produkti koji nastaju u atmosferi, a rezultat su nitracije
produkata nastalih pirolizom lignina, mogu se smatrati potencijalno opasnim za ljude i
ostala živa bića. Značaj predloženog istraživanja moguće je pretpostaviti navođenjem
rezultata istraživanja od strane Svjetske zdravstvene organizacije (World Health
Organization; WHO), regulatornih agencija poput Europske agencije za okoliš (European
Enviromental Agency; EEA) te Američke agencije za zaštitu okoliša (U.S. Environmental
Protection Agency; EPA), koji navode da hlapljivi organski spojevi mogu biti štetni za
ljudsko zdravlje (53).

Doprinos ovog istraživanja temelji se na tome da pruži prve ekotoksikološke

podatke ispitivanih spojeva na različitim modelnim organizmima. To su metoksifenoli:
gvajakol, 4-nitrogvajakol, 5-nitrogvajakol, 6-nitrogvajakol, 4,6-dinitrogvajakol, siringol,
4-nitrosiringol i fenoli: katehol i 4-nitrokatehol. Dokazano prisustvo ispitivanih spojeva
u različitim ekosistemima, te potencijalno toksična hemijska struktura upućuju na značaj
ispitivanja toksičnosti navedenih spojeva. Osim toga, vjeruje se da ovi spojevi pripadaju
istom biogenom ciklusu, što im omogućava da suistovremeno prisutni u okolišu (54).
Stoga, važno je da se evaluira moguće sinergističko ili aditivno djelovanje navedenih
spojeva.

19
2. HIPOTEZA

Radna hipoteza: Organski atmosferski polutanti nastali uslijed spaljivanja

biomase predstavljaju značajan ekotoksikološki faktor na ekosisteme i živi svijet u njima.

20
3. CILJ I ZADACI

Cilj: Cilj ovog završnog rada je odrediti ekotoksičnost katehola, siringola, gvajakola i
njihovih nitriranih derivata, te njihove akutne efekte na odabrane testne organizme.

Zadaci:

1. Odrediti EC50 (eng. Half maximal effective concentration; polovina maksimalne

efektivne koncentracije) svih pojedinačnih ispitivanih spojeva na različitim
testnim organizmima.
2. Budući da se ovi spojevi nalaze u dimu kao kompleksnoj mješavini, potrebno je
odrediti ekotoksičnost mješavine, odnosno utvrditi da li takve mješavine imaju
aditivnu ili sinergističku toksičnost na ispitivanim organizmima.
3. Utvrditi da li su sekundarni polutanti, nastali nitracijom u atmosferi toksičniji od
primarnih polutanata nastalih spaljivanjem biomase.

21
4. MATERIJALI I METODE

U realizaciji definisanih ciljeva i postavljenih zadataka korištene su raspoložive

laboratorijske metode u laboratorijama katedre za Biomedicinu u zdravstvu,
Zdravstvenog fakulteta Univerziteta u Ljubljani. Za statističku obradu rezultata korištene
su računarske aplikacije Microsoft Office Excel 2016, te GraphPad prism 6.01.

4.1. Materijali
4.1.1. Hemikalije

1. Natrijev hlorid (CAS № 7647-14-5; NaCl);

2. Natrijev hipohlorit (CAS № 7681-52-9; NaOCl);
3. Kalijev dihromat (CAS № 7778-50-9; K2Cr2O7);
4. Gvajakol (CAS № 90-05-1; (CH3O)C6H4OH);
5. 5-nitrogvajakol (CAS № 636-93-1; CH3OC6H3(NO2)OH);
6. Siringol (CAS № 91-10-1; (CH3O)2C6H3OH);
7. Katehol (CAS № 120-80-9; C6H6O2);
8. 4-nitrokatehol (CAS № 3316-09-4; O2NC6H3-1,2-(OH)2);
kupljeni su od Sigma Aldrich (Deisenhofen, Germany).
9. 4,6-dinitrogvajakol (CAS № 4097-63-6; CH3OC6H2(NO2)2OH)
kupljen od A1Synth, Ltd. (Vienna, Austria)
10. 4-nitrosiringol (CAS №19978-25-7; O2N(CH3O)2C6H2OH)
Kupljen od Debye Scientific Co, Ltd. (Hong Kong, China)
11. Reaktivacijska otopina za V. fischeri (glukoza / natrijev hlorid)
kupljena od Hach Dr. Lange GmbH, (Duesseldorf, Germany)
12. Umjetna voda pripremljena u skladu sa standardiziranim protokolom OECD 202 pri
čemu su korištene sljedeće hemikalije:
- Kalcijev hlorid (CAS №10043-52-4; CaCl2);
- Magnezijev sulfat (CAS №7487-88-9; MgSO4);
- Natrijev hidrogenkarbonat (CAS №144-55-8; NaHCO3);
- Kalijev hlorid (CAS №7447-40-7; KCl)
kupljene od Sigma Aldrich (Deisenhofen, Germany).

22
 4.2. Metode i testni organizmi

Određivanje EC50 ispitivanih spojeva vršeno upotrebnom nekoliko biomarkera te

različitih modelnih organizama, kao što je navedeno:
1. Test bioluminiscencije na bakteriji Vibrio fischeri (55), prilikom čega se
ispitala:
a) Toksičnost pojedinačnih hemijskih spojeva
b) Toksičnost mješavina
2. Inhibicija germinacije i rasta korijenja na vrstama:
a) Trifolium repens (porodica: Fabaceae) – bijela djetelina
b) Triticum aestivum (porodica: Poaceae)– pšenica
3. Akutni imobilizacijski test na Daphnia magna (56)
4. Letalni test na Saccharomyves cerevisiae– pivski kvasac

Tabela br. 4. : Testni organizmi, završna tačka i vrijeme izlaganja.

Vrijeme
Organizam Latinsko ime Završna tačka
izlaganja
15 min
Vibrio fischeri Vibrio fischeri Inhibicija bioluminiscencije
30 min
Vodena buha Daphnia magna Imobilizacija 48 sati
Inhibicija germinacije i rasta
Pšenica Triricum aestivum 4 dana
korijenja
Inhibicija germinacije i rasta
Bijela djetelina Trifolium repens 5 dana
korijenja
Saccharomyces
Pivski kvasac Smrt ćelija 1 sat
cerevisiae

23
 4.2.1. Test bioluminiscencije

Akutna toksičnost pojedinih spojeva određena je prema internacionalnom

standardu ISO 11348-2:2007 (55). Ovim testom mjerena je inhinibicija luminiscencije
koju emitiraju morske bakterije Vibrio fischeri. Luminiscencija koju proizvode bakterije
proporcionalna je njihovoj metaboličkoj aktivnosti, a mjerena je pomoću
fotomultiplikatora (LUMIStox 300 luminometer, Hach Dr. Lange GmbH, Germany),
opremljenog termoblokom (LUMIStherm, Hach Dr. Lange GmbH, Germany). U testu su
korištene liofilizirane luminiscentne bakterije soja Vibrio fischeri NRRL-B-11177 (Hach
Dr. LangeGmbH, Germany).

Inhibicija prirodne emisije svjetlosti u prisustvu uzorka je određena poređenjem s

negativnom kontrolom (2% NaCl sa podešenim pH), nakon inkubacije u vremenskim
intervalima od 15 i 30 minuta na temperaturi od 15°C ±1°C. Zbog prirodnog pada
luminiscencije sa proteklim vremenom, korigovanje rezultata je vršeno u odnosu na
negativnu kontrolu. Gubici luminiscencije koji se dešavaju zbog apsorpcije svjetlosti
obojenih rastvora kompenzirani su integriranom korekcijom boje primjenjenog prilikom
testiranja. Za pozitivnu kontrolu korišten je kalijev dihromat (K2Cr2O7) u koncentraciji
100 mg/l (±2 mg/l). Rezultati koji nisu bili validni sa kriterijumom ISO standarda nisu
uzimani u obzir. Dobijeni rezultati mjerenja obrađivani su uz pomoć LUMISsoft 4
softvera. Određivanje EC50 uzoraka vršeno je s 8 razblaženja osnovnog rastvora
geometrijskom dilucijom. Samo ona razblaženja koja su dovela do inhibicije
luminiscencije od 10 – 90% (uključujući barem jedno razblaženje koje je dovelo do
inhibicije veće od 50%) su uzimana u obzir (55).

Akutna toksičnost je izražena kao efektivna koncentracija ispitivanog spoja koja

prouzrokuje pad luminiscencije za 50% (EC50 u mg/l). Što je niža vrijednost EC50,
spojevi su toksičniji.

Na slici br. 11. prikazan je uređaj LUMIStox 300 luminometar sa termoblokom

LUMIStherm, Hach Dr. Lange Gmbh

24
 Slika br. 11 :Uređaj LUMIStox 300:Lijevo je prikazan termoblok koji služi za
održavanje konstantne temperature uzoraka na 15°C tokom testiranja; desno se nalazi
luminometar za mjerenje intenziteta luminiscencije

Budući da su hemijski spojevi nastali pirolizom lignina i njihovi nitrirani derivati

istovremeno prisutni u okolišu, ispitana je toksičnost takvih mješavina. Pri određivanju
toksičnosti mješavine, obično se koriste dva modela: zbirne koncentracije (eng.
Concentration Addition; CA) za hemikalije koje imaju sličan mehanizam djelovanja i
model nezavisnog djelovanja (eng. Indipended Action; IA) za hemikalije koje nemaju isti
mehanizam djelovanja (57). Ipak, studije su pokazale da CA model vrlo dobro predviđa
efekte mješavina i za hemikalije sa različitim mehanizmom djelovanja, te se zbog toga
koristi kao standardni model. CA model predpostavlja da ne dolazi do interakcija između
molekula koje se nalaze u sastavu smjese (58). Budući da su spojevi koje ispitujemo slične
hemijske strukture, u ispitivanju toksičnosti mješavine korišten je CA model.
Ispitane su dvije mješavine ovih spojeva u kojem je jednu komponentu čini
primarni polutant, a drugu komponentu njegov nitro-derivat. Na ovaj način formirane su
mješavine sirigola i 4-nitrosiringola, te katehola i 4-nitrokatehola. Mješavine su formirane
na način da su imale jednak koncentracioni odnos jedne i druge komponente, kod kojih
je koncentracija izražena kao toksična jedinica (eng. Toxic Unit; TU). Model toksičnih
jedinica se često koristi u ekotoksikologiji. Jedan TU predstavlja odnos koncentracije
komponente u smjesi i njegove EC50 vrijednosti (59). Toksična jedinica smjese (TUmix)
predstavlja zbir TU svih komponenti u mješavini, a u našem slučaju 1 TU osnovne
komponente (primarnog polutanta) i 1 TU nitro derivata. To praktično znači da ukoliko
određena smjesa ima EC50 na koncentraciji 0,5 TUmix, djelovanje smjese je aditivno,
odnosno proizvedeni efekat je rezultat zbira pojedinačnih komponenata u sastavu smjese.

25
Ukoliko bi TUmix bio veći od 0,5 toksičnost mješavine je smanjena, odnosno nastupio je
antagonistički efekat, a ukoliko je TUmix manji od 0,5 djelovanje je sinergističko. O
toksičnosti mješavine gvajakola i njegovih nitro-derivata već postoje podaci (60), pa
prema tome u ovom radu nije ispitivana toksičnost te mješavine.

4.2.2. Inhibicija germinacije i rasta korijenja

Inhibicija germinacije i rasta korijenja je testirana na dvije biljne vrste, Trifolium

repens– bijeloj djetelini i Triticum aestivum– pšenici. Kako bi se odstranile nečistoće
prisutne u sjemenkama, prije upotrebe sjemenke su isprane destiliranom vodom i osušene
na 30°C u trajanju od 2 sata. Toksičnost ispitivanih spojeva je određena testiranjem
germinacije i rasta korijenja u rastvorima ispitivanih spojeva u različitim
koncentracijama. Osnovni rastvori ispitivanih spojeva su pripremljeni u destiliranoj vodi.
Ispitivane koncentracije spojeva kretale su se od 1 g/l do 10-6 g/l u ovisnosti od spoja.
Stvarne vrijednosti koncentracija i mogući nastanak degradacionih produkata tokom
ispitivanja ispitane su pomoću tečne hromatografije visokih preformansi.

Ispitivanje toksičnosti je provedeno korišteći plastične Petrijeve posude veličine

100x15 mm i Whatman #1 filter papir. U svaku Petrijevu posudu se stavljalo 8
neoštećenih i pročišćenih sjemenki pšenice približno iste veličine, dok se za ispitivanje
toksičnosti na bijeloj djetelini koristilo 10 sjemenki. Za svaku biljnu vrstu testiranje je
vršeno u četiri replikata. Sjemenke su bile položene na filter papir koji je sadržavao 2,5
mL destilovane vode (u negativnoj kontroli), 2,5 mL kalijevog dihromata (u pozitivnoj
kontroli) ili 2,5 mL rastvora ispitivanih spojeva u različitim koncentracijama. Petrijeve
posude su potom oblijepljene ljepljivom trakom kako ne bi došlo do unakrsne
kontaminacije uzoraka. Petrijeve posude su potom inkubirane na 23°C u tamnoj komori
u trajanju od 96 sati za sjemenke pšenice, odnosno 120 sati za sjemenke bijele djeteline
(61).

Stopa germinacije je izračunata kao procenat sjemenki koje su proklijale u

odnosnu na ukupan broj sjemenki. Elongacija korijenja je izmjerena kao dužina (mm) od
vrha korijena do klice. Za svaku biljnu vrstu i ispitivani spoj izračunata je krivulja
koncetracija-odgovor koristeći nelinearnu regresijsku tehniku utemeljenu na logističkom
modelu s četiri, odnosno tri parametra. Iz date krljivulje izračunata je EC50 vrijednost za
svaki spoj.

26
 EC50 vrijednost predstavlja efektivnu koncentraciju koja uzrokuje 50% smanjenje
rasta korijenja uzrokovano ispitivanim hemijskim spojevima.

Primjer inhibicije rasta korijenja dat je na slici br. 12. Na slici je prikazano djelovanje
gvajakola na sjemenke pšenice nakon četiri dana inkubacije

Slika br. 12. : Inhibicija rasta korijenja pšenice: slika lijevo prikazuje rast pšenice
u kontrolnom uzorku; slika desno prikazuje inhibiran rast korijenja nakon inkubacije sa
rastvoromgvajakola (1000 mg/l)

4.2.3. Akutni imobilizacijski test na Daphnia magna

Ispitivanje toksičnosti pomoću Daphnia magna (Straus, 1820. god.), porodica:

Daphiidae; je jedna od najčešće korištenih metoda u evaluaciji ekotoksičnosti raznih
hemijskih spojeva. D.magna je planktonski račić, poznatiji kao vodena buha. Široko je
rasprostranjen u slatkovodnim sistemima i ima ključnu ulogu u hranidbenom lancu kao
intermedijer između nižih organizama i riba (62). Ovaj organizam ima kratak životni
vijek, jednostavan je za kultivaciju, i vrlo je osjetljiv na različite otrove. Upravo zbog
ovih karakteristika, široko je korišten kao modelni organizam u ekotoksikoličkim
studijama i procjenama ekoloških rizika (63). Na slici br. 13. prikazana je građa Daphnia
magna. Ovaj metod je koristan za određivanje toksičnosti individualnih supstanci,
njihovih mješavima, kao i kompleksnih matriksa, kao što su otpadne vode (64).

27
 Princip ovoga testa jeste da se mlade D. magna (starosti manje od 24 sata), na
početku testa izlažu supstancama koje ispitujemo u različitim koncetracijama, u
vremenskom periodu od 48 sata. Imobilizacija se bilježi nakon 24 i 48 sata, te poredi sa
kontrolom. Rezultati se analiziraju i izračunavaju se EC50 vrijednosti nakon 48 sati
izlaganja.

Slika br. 13. : Prikaz odrasle jedinke vodene buhe, Daphnia magna.

Da bi se test smatrao validnim, u kontroli ne smije biti više od 10% imobiliziranih

jedinki, a koncentracija otopljenog kisika u vodi na kraju testa u kontroli i ispitivanim
uzorcima mora biti veća od 3 mg/l. Staklene viale u kojima se ispituje toksičnost spojeva
napunjene su volumenom od 20 ml ispitivane supstance u različitim koncentracijama ili
negativne kontrole (umjetna voda). Odnos zrak/volumen vode u posudama mora biti
identičan za testne i kontrolne grupe. Najmanje 20 jedinki se podijeli u četiri grupe po pet
jedinki. Temperatura pri kojoj se vrši testiranje bi trebala biti između 18°C i 22°C (56).

Umjetna voda koja se koristi u ispitivanju toksičnosti različitih hemijskih spojeva

na D. magna se koristi kao negativna kontrola, te kao otapalo za ispitivane spojeve. U
svom sastavu sadrži sljedeće soli otopljene u destiliranoj vodi: kalcijev hlorid, magnezijev
sulfat, natrijev hidrogenkarbonat i kalijev hlorid. Toksičnost se ispituje u najmanje 5
različitih koncentracija ispitivane supstance. Najprije se odredi opseg koncentracija, a
potom vrši konačno testiranje. Najviša koncentracija ispitivane supstance bi trebala

28
pokazati potpunu imobilizaciju jedinki, dok najniža koncentracija ne bi trebala davati
nikakav vidljivi učinak.

EC50 vrijednost je koncentracija ispitivanog spoja koji imobilizira 50% životinja

u definiranom vremenskom intervalu. Imobiliziranima se smatraju sve životinje koje nisu
u mogućnosti da plivaju 15 sekundi nakon laganog mućkanja posude u kojima se ispituje
toksičnost (56).

4.2.4. Letalni test na Saccharomyces cerevisiae

Letalni test na Saccharomyces cerevisiae (porodica: Saccharomycetaceae) –

pivskom kvascu, se temelji na detekciji preživljavanja organizma nakon izlaganja
toksičnoj supstanci. Ovim testom identificira se broj živih i mrtvih ćelija u suspenziji u
određenom vremenskom intervalu. Za identifikaciju se koristi boja metilensko modrilo
koja ima sposobnost da penetrira kroz ćelijsku membranu mrtvih ili jako oslabljenih
ćelija, dok je kod živih ćelija membrana nepropusna za boju te ćelije ostanu neobojane
(65).
Test se izvodi na način da se oko 0,05 grama kvasca suspendira u 5 ml uzorka
kojeg ispitujemo. Kao kontrolni uzorak koristi se suspenzija iste količine kvasca u
destiliranoj vodi. Kao pozitivnu kontrolu koristimo otopinu NaOCl. Ova količina kvasca
odgovara za oko 50-150 ćelija u jednom vidnom polju mikroskopa. Za jedan ispitivani
spoj potrebno je ispitati toksičnost u najmanje pet koncentracija ispitivane supstance.
Nakon inkubacije u trajanju od jednog sata, jedna kap suspenzije se pomiješa sa jednom
kapi metilenskog modrila na mikroskopskom staklu (66). Pomoću kamere (Olympus
SC50 5MP) na svjetlosnom mikroskopu (Olympus CX40), za jednu ispitivanu
koncentraciju uzorka snimljeno je najmanje 15 slika. Brojanje ćelija se izvodi pomoću
Grid cell countera (HeracleSofware, Romania).

Rezultati se izražavaju kao procenat umrlih ćelija u odnosu na ukupan broj ćelija
unutar vidnog polja. Potrebno je izbrojati i izračunati odnose na najmanje 15 polja za
jednu ispitivanu koncentraciju toksične supstance. EC50 u ovom slučaju predstavlja
koncentraciju toksične supstance pri kojoj umire 50% ćelija u ispitivanom uzorku.

Na slici br. 14. prikazan je primjer jednog vidnog polja na mikroskopu nakon
inkubacije Saccharomyces cerevisiae sa gvajakolom.

29
 Slika br. 14. : Mikroskopski snimak Saccharomyces cerevisiae : mrtve (plave)
ćelije su obojene uslijed narušavanja strukture ćelijskog zida, dok su žive ćelije ostale
neobojene

4.3. Tečna hromatografija visokih preformansi (HPLC)

Tečna hromatografija visokih preformansi (HPLC) se koristi za izračunavanje

tačne koncentracije ispitivanih spojeva u uzorcima, ali i za detekciju mogućih
degradacionih produkata nastalih tokom izvođenja testova. Uzorci za analizu će se
uzimati prije i nakon izvođenja testa, te čuvati na 4°C i u tami, do izvođenja analize na
HPLC-u.

Za analizu ispitivanih spojeva koristiti će se hromatograf Agilent 1100 HPLC-

DAD, sa C18 kolonom, 15 cm × 4,6 mm, veličina čestica 5μm (Sigma-Aldrich
Ascentis®Express C18 HPLC Column). Za pripremu mobilne faze koristiti će se
acetonitril (Chromasolv gradient grade, for HPLC, ≥99.9%), amonijev formijat (Puriss
p.a., eluent additive for LC/MS), mravlja kiselina (Puriss p.a., eluent additive for LC/MS)
i destilirana voda. Mobilna faza se sastoji od 35% acetonitrila i 65% amonij-formijatnog
pufera. Metoda za razdvajanje:brzina protoka mobilne faze je 0,5 ml/min, pri pritisku od
48 bara i na temperaturi od 26°C. Mjerenja se vrše na valnoj dužini od 230 nm.

30
 4.4. ECOSAR

Ekološki odnos između strukture i djelovanja (eng. Ecological Structure Activity

Relationships; ECOSAR) je računarska aplikacija, odnosno prediktivni sistem koji
procjenjuje toksičnost organskih spojevaza organizme koji žive u vodi. Program je
razvijen od strane Američke agencije za zaštitu okoliša (eng. U.S. Environmental
Protection Agency; EPA). Program ima mogućnost procjenjivanja akutne (kratkotrajne)
i hronične (dugotrajne ili odgođene) toksičnosti hemikalija za organizme koji žive u vodi,
kao što su ribe, vodeni beskralješnjaci i vodene biljke, odnosno alge. Za procjenu
toksičnosti, ovaj program koristi kvantitativni odnos između strukture i djelovanja –
QSAR (eng. Quantitative Structure-Activity Relationship). ECOSAR sadrži i bazu
podataka u kojoj su hemijske supstance podjeljene na klase, u zavisnosti od hemijske
sturkture supstance (67).

Prema ECOSAR-u osnovne tri klase hemijskih supstanci, u ovisnosti o njihovoj

toksičnosti su:
1. Neutralni organski spojevi – nejonizirani i nereaktivni spojevi koji obično djeluju
putem nepolarne narkoze, odnosno gubitka svijesti (generalna anestezija).
Ovakvi spojevi su najčešće alkoholi, ketoni, eteri, alkil-halidi, aril-halidi,
aromatski ugljikovodici, alifatski ugljikovodici, cijanati, sulfidi i disulfidi.
2. Organski spojevi sa povećanom toksičnosti – neke organske molekule imaju
specifičniji mehanizam toksičnosti zahvaljujući prisutnosti reaktivnih
funkcionalnih grupa. U ovu grupu spojeva spadaju: akrilati, metakrilati,aldehidi,
anilini, beta-diketoni (linearni oblici), benzotriazoli, esteri, fenoli, aziridini i
epoksidi.
3. Surfaktanti (površinski aktivne organske molekule) – materijali koji uveliko
mogu smanjiti površinsku napetost vode, čak i kada se koriste u maloj
koncentraciji. Prema ECOSAR-u, surfaktanti su grupirani u četiri grupe, na
osnovu ukupnog naboja molekula. Ove četiri osnovne grupe molekula su
anionska (negativan ukupni naboj), kationska (pozitivan ukupni naboj), nejonski
(neutralni) i amfotermni surfaktanti. (67)

Osim navedene klasifikacije, ECOSAR toksičnost supstanci klasificira i na „ne

štetne“, „štetne“, „toksične“ i „vrlo toksične“ (67).

31
 ECOSAR je korišten u svrhu poređenja teoretski dobijenih rezultata toksičnosti
sa eksperimentalno dobijenim vrijednostima. Osim toga, prikazane su i teoretske
vrijednosti toksičnosti hemijskih supstanci koje su ispitane u ovom radu, na organizmima
koji nisu obuhvaćeni ovim ispitivanjem.

32
5. REZULTATI

5.1. Inhibicija bioluminiscencije

5.1.1. Ekotokičnost pojedinačnih hemijskih spojeva

Inhibicija bioluminiscencije ispitivanih spojeva praćena je na 15 i 30 minuta

inkubacijskog perioda. EC50 vrijednosti (mg/l) ispitivanih spojeva su približno jednake u
oba inkubacijska perioda, osim u slučaju 4-nitrogvajakola, kod kojeg je EC50 vrijednost
nakon 30 minuta dvostruko niža u odnosu na inkubacijski period od 15 minuta. U slučaju
5-nitrogvajakola i katehola, vrijednost EC50 je nešto niža nakon 30 minuta u odnosu na
15 minuta inkubacijskog perioda, međutim razlika nije drastična kao u slučaju 4-
nitrogvajakola. Određene EC50 ispitivanih spojeva su u intervalu od 7,41 mg/l do 121,69
mg/l, a prikazane su u tabeli br. 5.

Tabela br.5. : Vrijednosti EC50 (mg/l) na Vibrio fischeri ispitivanih spojeva nakon
15 i 30 minuta inkubacije. *Vrijednosti GUA, 4NG, 6NG i DNG su od ranije poznate (60)

Ime spoja 15 minuta inkubacije 30 minuta inkubacije

*Gvajakol 100,60 ± 13,2 102,00 ±13,10
*4-nitrogvajakol 45,00 ± 3,80 23,30 ± 3,30
5-nitrogvajakol 121,69 ± 8,39 103,38 ± 8,24
*6-nitrogvajakol 38,60 ± 1,90 37,10 ± 3,20
*4,6-dinitrogvajakol 16,70 ± 2,40 17,40 ± 0,80
Siringol 76,88 ± 4,03 80,20 ± 3,04
4-nitrosiringol 7,41± 0,64 7,78 ± 0,73
Katehol 79,85 ± 8,04 68,53 ± 11,38
4-nitrokatehol 18,55 ± 1,67 17,20 ± 1,05

Vrijednosti EC50 (mg/l) gvajakola i njegovih nitriranih derivata prikazane su na

grafiku br. 1.

Toksičnost siringola i 4-nitrosiringola, te katehola i 4-nitrokatehola je analogna

rezultatima toksičnosti gvajakola i njegovih nitriranih derivata. Vrijednosti EC50 (mg/l)
siringola i katehola te njegovih nitriranih derivata prikazane su na graficima br. 2 odnosno
br. 3.

33
 Grafik br.1.: EC50 (mg/l) vrijednosti gvajakola i njegovih nitriranih derivata.

Grafici br. 2. i br. 3.: EC50 (mg/l) vrijednosti siringola i katehola te njegovih nitriranih
derivata.

5.1.2. Ekotoksičnost mješavina

Prilikom ispitivanja mješavine siringola i 4-nitrosiringola dobijene EC50

vrijednosti mješavina iznosile su 0,496 TU nakon 15 minuta, odnosno 0,493 TU nakon
30 minuta inkubacijskog perioda. Za razliku od mješavine sirigola i njegovog nitriranog
derivata, prilikom ispitivanja toksičnosti mješavine katehola i 4-nitrokatehola dobijene su

34
niže vrijednosti, a one su iznosile 0,470 TU nakon 15 minuta, odnosno 0,343 TU nakon
30 minuta inkubacijskog perioda. U tabeli br. 6 prikazane su dobijene vrijednosti
toksičnih jedinica i odgovarajuće vrijednosti koncentracija pojedinih komponenti u
sastavu mješavina. Grafički prikaz rezultata toksičnosti mješavine dat je na grafiku br. 4.

Tabela br. 6. : Kalkulacija koncentracija komponenti baziranih na individualnim EC50

Ime spoja TU C (mg/l)

Siringol + 4-nitrosiringol
15 minuta 0,496 ± 0,03 39,7 ± 2,2 (S) + 3,85 ±0,231(4NS)
30 minuta 0,493 ± 0,02 39,5 ± 1,58 (S) + 3,83 ± 0,15 (4NS)

Katehol + 4-nitrokatehol
15 minuta 0,470 ± 0,04 31,7±2,5 (K) + 8,0 ± 0,64 (4NK)
30 minuta 0,343 ± 0,04 23,5 ± 3,05 (K) + 5,9 ± 0,76 (4NK)

Grafik br. 4.: Toksičnost mješavina

35
 5.2. Inhibicija germinacije i rasta korijenja
5.2.1. Inhibicija germinacije

Inhibicija germinacije sjemena (klijavost) i rasta korijenja biljaka ovisi o

koncentraciji ispitivanog spoja u okruženju sjemenke. Kada se govori o germinaciji
sjemena pšenice, ispitivani spojevi uglavnom ne inhibiraju klijavost, te pri najvišim
ispitivanim koncentracijama ona iznosi 87,5-100%. Bijela djetelina kao modelni
organizam je osjetljiviji u odnosu na pšenicu, pa je tako pri najvišim ispitivanim
koncentracijama inhibicija potpuna. Grafički prikaz inhibicije germinacije prikazan je na
graficima 5-7, a numeričke vrijednosti inhibicije germinacije se nalaze u prilogu na kraju
rada.

Grafici 5-7: Inhibicija germinacije sjemena bijele djeteline u odnosu na ispitivanu

koncentraciju metoksifenola i fenola

36
 5.2.2. Inhibicija rasta korijenja

Kao i u slučaju germinacije sjemena, inhibicija rasta korijenja ovisi o koncentraciji

ispitivanog spoja, pa je tako pri višim koncentracijama viša inhibicija, odnosno smanjen
rast korijenja. Generalno govoreći, vrijednosti EC50 na ispitivanim biljkama se kreće u
rasponu od 53,3 mg/l do 535,0 mg/l.
U tabeli br. 7. prikazane su EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva za pšenicu i
djetelinu, a na grafiku br. 8. prikazan je odnos toksičnosti ispitivanih spojeva i biljne vrste.
Na graficima br. 9-14 prikazane su inhibicijske krivulje ispitivanih spojeva na pšenici i
bijeloj djetelini.

Tabela br. 7.: EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na pšenici i djetelini

EC50(mg/l)
Spoj Pšenica Djetelina
Gvajakol 412,0 ± 94,1 265,1 ± 25,4
5-nitrogvajakol 200,5 ± 7,0 359,3 ± 37,3
Siringol 173,5 ± 4,1 535 ± 24,8
4-nitrosiringol 119,8 ± 4,9 135,2 ± 5,4
Katehol 108,1 ± 4,5 73,89 ± 7,3
4-nitrokatehol 121,7 ± 11,1 53,3 ± 18,9

Grafik br. 8. : EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na pšenici i djetelini

37
Grafici 9-14: Inhibicijske krivulje elongacije korijenja: s lijeve strane prikazana je
inhibicija rasta korijenja na pšenic, dok je na desnoj prikazana inhibicija rasta korijenja
na bijeloj djetelini. Na ordinati su vrijednosti dužine korijenja u mm a na apscisi
logaritam koncentracije (mg/l) ispitivanih spojeva.

38
 5.3. Daphnia magna imobilizacijski test

Vrijednosti EC50 dobijene D. magna imobilizacijskim testom kreću se od 2,74-

17,98 mg/l. EC50 vrijednosti za sve ispitivane spojeve date su u tabeli br. 8. i prikazani na
grafiku br. 18. Inhibicijske krivulje ispitivanih spojeva na D. magna prikazane su na
graficima 15-17.

Tabela br. 8. : EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na D. magna

Ime spoja EC50 (mg/l)
Gvajakol 2,74 ± 0,17
5-nitrogvajakol 3,26 ± 0,21
4,6-dinitrogvajakol 3,96 ± 0,56
Siringol 11,42 ± 1,20
4-nitrosiringol 17,98 ± 3,09
Katehol 4,08 ± 0,36
4-nitrokatehol 9,12 ± 0,83

Grafici 15-17. : Inhibijske krivulje ispitivanih spojeva na D. magna: Na ordinati su

vrijednosti imobilizacije životinja, a na apscisi je logaritam koncentracije (mg/l)
ispitivanih spojeva.

39
 Grafik br. 18. : EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na D. magna

5.4. Letalni test na Saccharomyces cerevisiae

Prilikom ispitivanja toksičnosti produkata pirolize lignina i njihovih nitro-derivata

na kvascu, EC50 vrijednosti nisu dostignute pri ispitivanim koncentracijama. U tabeli br.
9. prikazana je stopa mortaliteta pri najvišim ispitivanim koncentracijama za određeni
spoj. Ispitivani spojevi izazivaju stopu mortaliteta 30.05 - 44.03 %, što nije dovoljno za
izračun EC50 vrijednosti.

Tabela br. 9. : Toksičnost ispitivanih spojeva na S. cerevisiae

Ime spoja Stopa mortaliteta (%)

Gvajakol 34,36 ± 4,05
5-nitrogvajakol 33,73 ± 1,53
Siringol 30,05 ± 1,85
Katehol 37,56 ± 0,35
4-nitrokatehol 44,03 ± 2,11

40
 5.5. ECOSAR

U sljedećim rezultatima date su predviđene EC50 vrijednosti za ribe, Daphnia

magna, zelene alge, gujavice te Lemna gibba za akutnu toksičnost i i vrijednosti za
hroničnu toksičnost ispitivanih spojeva. Kada su u pitanju nitro derivati spojeva,
ECOSAR ne pravi razliku u toksičnosti spojeva u ovisnosti o položaju nitro grupe na
aromatskom prstenu. Prema tome, predviđene vrijednosti EC50 različitih nitro derivata
istog spoja imaju iste vrijednosti za toksičnost. Dobijeni podaci prikazani su tabelarno u
tebelama 10-12.

Tabela br.10. : ECOSAR vrijednosti za gvajakol i nitrogvajakole u mg/l. Za

dinitrogvajakol nema podataka, ali se u ovom slučaju uzima predikcija za polinitrofenole.

EC50 (mg/l)
Gvajakol Nitrogvajakol Dinitrogvajakol*
Ribe (96h) 68,727 46,872 11,915
Daphnia magna (48h) 15,408 12,531 14,266
Zelena alga (96h) 75,577 59,150 nema podataka
Ribe (hronično) 6,297 4,550 0,942
Daphnia (hronično) 2,934 2,385 4,685
Zelena alga (hronično) 35,804 27,882 nema podataka
Gujavice (14 dana) 215,143 202,012 nema podataka
Lemna gibba (7 dana) 57,937 35,813 nema podataka

Tabela br.11.: ECOSAR vrijednosti za siringol i nitrosiringol u mg/l.

EC50 (mg/l)
Siringol Nitrosiringol
Ribe (96h) 115,958 74,985
Daphnia magna (48h) 24,046 18,544
Zelena alga (96h) 119,973 89,032
Ribe (hronično) 10,355 7,095
Daphnia (hronično) 4,581 3,530
Zelena alga (hronično) 56,963 42,061
Gujavice (14 dana) 315,068 280,508
Lemna gibba (7 dana) 102,103 59,843

41
Tabela br.12. : ECOSAR vrijednosti za katehol i nitrokatehol u mg/l.

EC50 (mg/l)
Katehol Nitrokatehol
Ribe (96h) 22,229 18,205
Daphnia magna (48h) 255,855 179,065
Zelena alga (96h) 4,899 5,073
Ribe (hronično) 14,176 10,932
Daphnia (hronično) 101,470 69,335
Zelena alga (hronično) 0,568 0,624
Gujavice (14 dana) nema podataka nema podataka
Lemna gibba (7 dana) nema podataka nema podataka

5.6. Hromatografska analiza

Hromatografskom analizom uzoraka uzetih prije i nakon testiranja različitim

metodama, ustanovljeno je da razlika u koncentraciji ispitivanih spojeva ne prelazi 5% u
ispitivanim uzorcima. Osim toga, zbog provođenja svih testova u kontroliranim uvjetima
(tami i konstantnoj temperaturi), te kratkog vremena trajanja testova, nije došlo do
stvaranja degradacionih produkata koji bi mogli uticati na rezultate istraživanja.

42
6. DISKUSIJA

Produkti pirolize lignina i njihovi nitrirani derivati predstavljaju važne okolišne

polutante. Iako su ispitivani spojevi prema EU regulativi klasificirani kao štetni ili
toksični, do sada nisu provedena ekotoksikološka ispitivanja ili su podaci o njihovoj
toksičnosti vrlo oskudni. Iz rezultata dobijenih ovim istraživanjem evidentno je da
toksičnost pojedinih spojeva ovisi o vrsti modelnog organizma na kojem se vršilo
ispitivanje. Prema tome, evaluacija toksičnosti ispitivanih spojeva je vršena prema
određenom organizmu, odnosno tipu testa.

6.1. Test bioluminiscencije

Test bioluminiscencije je široko primjenjena i standardizirana metoda, koja se

koristi za određivanje akutne i hronične toksičnosti pojedinačnih spojeva ili kompleksnih
mješavina. Kada se govori o inhibiciji bioluminiscencije bakterije V. fischeri,
analizirajući rezultate toksičnosti gvajakola i njegovih nitriranih derivata nakon 30 minuta
inkubacijskog perioda možemo zaključiti da su nitrirani derivati sa položajem nitro grupe
na poziciji 4 i 6 mnogo toksičniji u odnosu na ishodišne molekule. 4-nitrogvajakol je oko
četiri puta toksičniji od gvajakola, dok 6-nitrogvajakol oko 2,5 puta toksičniji od
gvajakola. 4,6-dinitrogvajakol je najtoksičniji iz grupe gvajakola, a od svog primarnog
polutanta je toksičniji više od pet puta. Za razliku od nitro derivata gvajakola koji imaju
nitro grupu na položaju 4 ili 6, 5-nitrogvajakol ima približno jednaku toksičnost kao i
gvajakol u inkubacijskom periodu od 30 minuta. Kao i u prethodnom slučaju, nitrirani
derivati siringola i katehola sa položajem nitro grupe na poziciji 4 su višestuko toksičniji
od svojih prethodnika. Tako naprimjer, možemo vidjedi da je 4-nitrosiringol oko deset
puta toksičniji od sirigola, dok je 4-nitrokatehol oko 4,5 puta toksičniji od katehola. Na
toksičnost ispitivanih hemijskih spojeva uveliko utiče broj i položaj nitro grupa na
aromatskom prstenu, što potvrđuje i istraživanje Artemenko i suradnika (68). U našem
slučaju, toksičnost je viša ukoliko se nitro grupa nalazi u položaju 4 u odnosu na položaj
6, odnosno toksičnost je viša ukoliko spoj ima dvije nitro grupe. Osim toga, za većinu
spojeva ne postoji značajna razlika u toksičnosti nakon 15, odnosno 30 minuta
inkubacijskog perioda, osim u slučaju 4-nitrogvajakola. Kod ovih spojeva, toksičnost
nakon 30 minuta inkubacijskog perioda je viša, što znači da ovi spojevi imaju sporiji
mehanizam toksičnog djelovanja, u odnosu na ostale spojeve iz ove grupe.

43
 Ispitivanjem inhibitornog efekta različitih mješavina u svrhu procjene
eventualnog sinergizma ili antagonizma između aromatskih spojeva koji pripadaju istom
biogenom ciklusu, došlo se do različitih rezultata. Istraživanjem Pflieger i Kroflič (60)
ustanovljeno je da mješavina gvajakola i njegovih nitriranih derivata ne dovodi do
značajnijih promjena u toksičnosti prema V. fischeri. U ovom slučaju radi se o aditivnoj
toksičnosti, odnosno nema sinergističnog ili antagonističkog djelovanja. Isto se može reći
i za mješavinu siringola i 4-nitrosirigola, kod kojih nakon oba inkubacijska perioda ne
dolazi do promjena u mehanizmu toksičnosti. Iz ovoga se može zaključiti da
metoksifenoli nastali pirolizom lignina i njihovi nitrirani derivati, u smjesama ne djeluju
sinergistički niti antagonistički, te da je ukupna toksičnost smjese jednaka zbiru
toksičnosti pojedinačnih spojeva. Za razliku od metoksifenola, toksičnost smjese katehola
i 4-nitrokatehola pokazuje drugačije rezultate. Naime, nakon inkubacijskog perioda od
15 minuta nema značajnihih promjena u toksičnosti smjese, međutim, nakon 30 minuta
izlaganja toksičnost smjese se povećava. U ovoj smjesi dolazi do sinergističkog
djelovanja katehola i njegovog nitro derivata, ali da bi došlo do sinergističkog djelovanja
potrebno je duže vrijeme izlaganja.

6.2. Akutni imobilizacijski test na D. magna

Imobilizacijski test na D. magna se pokazao kao najosjetljiviji test za ispitivane

spojeve. EC50 vrijednosti dobijene ovim testom su višestruko niže u odnosu na bilo koji
drugi modelni organizam. Te vrijednosti su oko 10 puta manje u poređenju sa
vrijednostima dobijenim testom inhibicije bioluminiscencije, a u poređenju sa testom
inhibicije korijenja, one su čak oko 40 puta manje. Međutim, značajnija razlika između
ovog i ostalih organizama je u tome što su nitro-derivati ispitivanih spojeva manje
toksični od svojih ishodišnih molekula. Na primjeru gvajakola i njegovih nitro derivata,
može se uočiti da 5-nitrogvajakol i 4,6 dinitrogvajakol imaju nižu toksičnost od samog
gvajakola, ali ta razlika nije velika. Isti slučaj je i sa siringolom i kateholom, te njihovim
nitriranim derivatima. Nižu toksičnost nitro-derivata potvrđuje i istraživanje Kühna i
suradnika (69), u kojem je toksičnost fenola veća od njegovih nitro i trinitro-derivata
ispitanih na vrsti D. magna. Osim toga, toksičnost ovih spojeva ovisi i o grupi kojoj
pripadaju, tako možemo reći da su gvajakoli najtoksičniji, zatim kateholi, a siringoli
najmanje toksični u usporedbi ispitivanih spojeva. Eksperimentalno dobijene vrijednosti

44
u poređenju sa vrijednostima koje previđa ECOSAR su dosta niže, odnosno ispitivani
hemijski spojevi su više toksični u odnosu na predviđene vrijednosti.

6.3. Inhibicija germinacije i rasta korijenja

Budući da se spaljivanje biomase vrlo često dešava kao uništavanje biljnih

ostataka nakon žetve na poljoprivrednim površinama, za očekivati je da se na takvim
površinama mogu naći veće količine fenola i metoksifenola nastalih tim procesom.
Upravo zbog toga pšenica i djetelina mogu poslužiti kao modelni organizmi u procjeni
toksičnosti ovih spojeva. Kada se govori o stopi germinacije, rezultati su pokazali da je
sjeme pšenice dosta otpornije na ispitivane spojeve od sjemena djeteline. Tako na primjer,
u slučaju germinacije sjemena pšenice, možemo reći da sjeme čak i pri najvišim
ispitivanim koncentracijama ima stopu germinacije 87,5 - 100%. Za razliku od pšenice,
djetelina pri najvišim ispitivanim koncentracijama ima 100% inhibiciju germinacije,
odnosno ne dolazi do klijanja, osim u slučaju siringola kod kojeg pri ispitivanoj
koncentraciji od 1 g/l ona iznosi 50%.
Rezultati elongacije korijenja ukazuju na to da toksičnost ispitivanih spojeva ovisi
o biljnoj vrsti. Možemo reći da je kod jedne vrste određeni spoj toksičniji prema pšenici,
dok na djetelini je manje toksičan i obrnuto. Na primjer, pšenica je osjetljivija od djeteline
prema 5-nitrogvajakolu, siringolu i 4-nitrosirigolu, a djetelina je osjetljivija na djelovanje
gvajakola, katehola i 4-nitrokatehola. Mogući razlog različite toksičnosti spojeva prema
različitim biljnim vrstama može biti i drugačije preuzimanje vode i ostalih materija iz
okoline kod monokotiledonih, odnosno dikotiledonih biljaka, ali za dokazivanje te
hipoteze potrebno je izvršiti dodatno istraživanje. Prema istraživanju Isidori i suradnika
(70) fenolni spojevi pokazuju izrazitu toksičnost prema različitim biljnim vrstama. U
svom istraživanju su dokazali toksičnost katehola prema Sorghum bicolor (porodica:
Poaceae)– Siraku, odnosno Crocus sativus (porodica Iridaceae) - šafranu. Osim
navedenog, iz rezultata se može primjetiti da su nitro derivati ispitivanih spojeva
toksičniji u odnosu na primarne spojeve, kada je u pitanju toksičnost prema pšenici
(izuzimajući 4-nitrokatehol), odnosno prema djetelini (izuzimajući 5-nitrogvajakol).
Prema istraživanju Wanga i suradnika (71), aromatski spojevi koji sadrže nitro grupu
mogu izazvati snažnu inhibiciju rasta korijenja Cucumis sativus (porodica:
Cucurbitaceae) – krastavca. Prema njihovom istraživanju, položaj i broj nitro grupa na

45
aromatskom prstenu ima različit efekat na rast korijenja ove biljke. Tako naprimjer, od
nitrofenola koji sadrže jednu nitro grupu najtoksičniji je 4-nitrofenol, zatim 2-nitrofenol,
dok je najmanje toksičan 3-nitrofenol. Dinitrofenol je višestruko toksičniji od
mononitrofenola, pa je tako od 4-nitrofenola toksičniji oko tri puta, dok od 3-nitrofenola
oko osam puta. Snažan inhibitorni efekt ispitivanih spojeva na rast korijena se može uočiti
na slici br. 8. Pri visokom koncentracijama ispitivanih spojeva može se uočiti potpuna
degradacija vrhova korijenja biljaka, čime se onemogućava apsorpcija vode i hranjivih
materija iz okoline, što u konačnosti dovodi do smrti biljaka.

6.4. Letalni test na S. cerevisiae

Za razliku o toksičnosti teških metala prema S. cerevisiae (66), spojevi nastali

pirolizom lignina i njihovi nitro derivati nisu toksični u tolikoj mjeri prema ovom
modelnom organizmu. Iako je letalni test na S. cerevisiae brz i praktičan, on nije pogodan
za evaluaciju toksičnosti ispitivanih spojeva. Nakon inkubacijskog perioda od jednog
sata, čak pri visokim koncentracijama ispitivanih spojeva (do 1000 mg/l), smrtnost ovog
modelnog organizma ne prelazi 45%. Ipak, rezultati pokazuju da među ispitivanim
spojevima, metoksifenoli izazivaju mortalitet 30-35%, dok su kateholi nešto toksičniji od
metoksifenola, s mortalitetom od 37% (katehol) odnosno 44% (4-nitrokatehol). Iako je
ćelijski zid S. cerevisiae kompleksnog sastava (72) veličina ispitivanih molekula je mala,
što znači da njihovo preuzimanje iz medija nije ograničeno. Prema istraživanju Adeboye
i suradnika (73) fenolni spojevi mogu uticati na rast i razvoj, međutim toksičnost fenolnih
spojeva prema S. cerevisiae je ograničena. Inhibitorni efekt spitivanih spojeva ovisi i
prisutnosti različitih funkcionalnih grupa, kao što su metoksi- i hidroksilne grupe, te broj
nezasićenih veza u strukturi spojeva. Osim toga, istraživanje je pokazalo da fenolni
spojevi mogu biti fermentirani, što može biti uzrok smanjene toksičnosti ovih spojeva.
Istraživanje Stratforda i suradnika (74) pokazalo je da S. cerevisiae ima urođenu
sposobnost na toleranciju fenolnih spojeva, što za posljedicu ima smanjen mortalitet
organizma prilikom ispitivanja ovih spojeva.

46
 6.5. ECOSAR

Iako se na primjeru toksičnosti D. magna pokazalo da su previđene vrijednosti

ECOSAR-a više u odnosu na stvarnu toksičnost ispitivanih spojeva, ovi podaci mogu
poslužiti u svrhu procjene toksičnosti na organizme za koje nije moguće doći
eksperimentalnim putem. Naime, budući da su ispitivani hemijski spojevi fotosenzitivni,
a za ispitivanje toksičnosti na zelenim algama (Spirulina sp., C.vulgaris ) i L. gibba je
potrebna konstantna svjetlost, istraživanje ne bi dalo validne rezultate zbog pojave
degradacionih produkata. Na ovaj način se ne bi znalo da li toksičnost prema ovim
modelnim organizmima potiče od ishodišnih molekula ili nastalih degradacionih
produkata, odnosno njihovih mješavina. Kada je u pitanju toksičnost ispitivanih spojeva
za alge, ECOSAR previđa najvišu toksičnost katehola 4,89 mg/l, dok su toksičnost
gvajakola i sirignola višestruko niže, 75,5 mg/l za gvajakol odnosno 119 mg/l za sirignol.
Osim toga, toksičnost nitro derivata je nešto viša, pa tako toksičnost nitrogvajakola 59
mg/l, a nitrosiringola 89 mg/l. Prema procjeni ECOSAR-a, L. gibba je nešto osjetljiviji
organizam od zelenih algi. Toksičnost gvajakola prema ovom organizmu iznosi 57,9 mg/l
a njegovog nitro derivata 35 mg/l, dok sirignol ima skoro dvostuko nižu toksičnost s EC50
vrijednostima od 102,1 mg/l, odnosno 59,8 mg/l za njegov nitro derivat. ECOSAR nema
podataka o toksičnosti katehola prema ovom organizmu. Prediktivni sistemi poput
ECOSARA ne mogu napraviti razliku između izomera budući da se položaj
funkcionalnih grupa se ne uzima u obzir prilikom računanja vrijednosti.

47
7. ZAKLJUČCI

- Ovo istraživanje predstavlja prve ekotoksikološke podatke za gvajakol, siringol i

katehol, nastalih pirolizom lignina, te njihovih potencijalno toksičnih
transformacijskih produkatanastalih nitracijom u troposferi.
- Svi ispitivani spojevi su klasificirani kao štetni ili toksični, a njihova toksičnost
ovisi o modelnom organizmu ka kojem se ispituje.
- Svi ispitivani spojevi su pokazali snažan inhibitorni efekt na bioluminiscenciju V.
fischeri, imobilizaciju D. magna te inhibiciju germinacije i elongacije korijenja T.
repens i T. aestivum.
- Od testova kojima je evaluirana toksičnost ispitivanih spojeva, najosjetljiviji je
akutni imobilizacijski test na D. magna, potom test inhibicije bioluminiscencije
V. fischeri, zatim test inhibicije rasta korijenja, dok je najmanje osjetljiv letalni
test na S. cerevisiae.
- Ispitivanje je pokazalo da toksičnost ispitivanih spojeva nije velika prema S.
cerevisiae, što se može objasniti tolerancijom ovog modelnog organizma na
fenolne spojeve.
- Broj i položaj nitro grupa na benzenovom prstenu uveliko utiče na toksičnost
ispitivanih spojeva.
- Nitrirani produkti su toksičniji prema V. fischeri, te biljkama, dok su na D. magna
manje toksični.
- Ispitivanje toksičnosti mješavina nije pokazalo značajno međusobno djelovanje
mješavina gvajakola i siringola, te njihovih nitriranih derivata, dok je mješavina
sirinola i nitrosiringola pokazala sinergističko djelovanje.
- Ovo istraživanje prva je sveobuhvatna studija koja pruža nova znanja o načinu
djelovanja ispitivanih spojeva na modelnim organizmima. Upotrijebljeni modelni
organizmi pokazali su se kao osjetljivi, pouzdani i ekonomični, stoga trebaju biti
uključeni u daljnjim studijama monitoringa i procjene rizika ispitivanih spojeva
na okoliš i okolišne organizme.

48
8. REFERENCE

1. Seinfeld J, Pandis S. Atmospheric chemistry and physics. Hoboken, NJ: Wiley; 2016.
2. Mannucci P, Harari S, Martinelli I, Franchini M. Effects on health of air pollution: a
narrative review. Internal and Emergency Medicine. 2015;10(6):657-662.
3. Karagulian F, Belis C, Dora C, Prüss-Ustün A, Bonjour S, Adair-Rohani H et al.
Contributions to cities' ambient particulate matter (PM): A systematic review of local
source contributions at global level. Atmospheric Environment. 2015;120:475-483.
4. European Environment Agency. Air quality in Europe 2017. Copenhagen; 2017; 57-
58.
5. Layers of Earth's Atmosphere | UCAR Center for Science Education [Internet].
Scied.ucar.edu. 2015 [pristup 10. decembar 2017.]. Dostupno na:
https://scied.ucar.edu/atmosphere-layers
6. Wesely M. A review of the current status of knowledge on dry deposition.
Atmospheric Environment. 2000;34(12-14):2261-2282.
7. Burkert J. Modelling of tropospheric ozone and radical chemistry. Berlin: Logos-
Verl.; 2004.
8. Geyer A, Alicke B, Konrad S, Schmitz T, Stutz J, Platt U. Chemistry and oxidation
capacity of the nitrate radical in the continental boundary layer near Berlin. Journal
of Geophysical Research: Atmospheres. 2001;106(D8):8013-8025.
9. Brown S, Stutz J. Nighttime radical observations and chemistry. Chemical Society
Reviews. 2012;41(19):6405.
10. Ball S. Atmospheric chemistry at night [Internet]. rsc.org. [pristup 8. decembar
2017.]. Dostupno na: http://www.rsc.org/images/environmental-brief-no-3-
2014_tcm18-237724.pdf
11. Cole J. Biomass Burning : Feature Articles [Internet]. Earthobservatory.nasa.gov.
2001 [Pristup 24. septembar 2017.]. Dostupno na:
https://earthobservatory.nasa.gov/Features/BiomassBurning/
12. Yee L, Kautzman K, Loza C, Schilling K, Coggon M, Chhabra P et al. Secondary
organic aerosol formation from biomass burning intermediates: phenol and
methoxyphenols. Atmospheric Chemistry and Physics Discussions. 2013;13(2):3485-
3532.
13. Ito A, Penner J. Global estimates of biomass burning emissions based on satellite
imagery for the year 2000. Journal of Geophysical Research. 2004;109(D14).
49
14. Kovacic P, Somanathan R. Nitroaromatic compounds: Environmental toxicity,
carcinogenicity, mutagenicity, therapy and mechanism. Journal of Applied
Toxicology. 2014;34(8):810-824.
15. Wood Properties Growth and Structure [Internet]. Treetesting.com. [pristup 1.
decembar 2017.]. Dostupno na:
http://treetesting.com/wood_properties_growth_and_structure.htm.
16. Rowell RM. Handbook of wood chemistry and wood composites London: CRC press;
2005
17. Lebo S, Gargulak J, McNally T. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology:
John Wiley & Sons, Inc.; 2001
18. Glasser W. Classification of Lignin According to Chemical and Molecular Structure.
ACS Symposium Series. 1999; 216-238.
19. Glazer A, Nikaido H. Microbial biotechnology. Singapore: Cambridge University
Press; 2008; 442-443
20. Wittkowski R, Ruther J, Drinda H, Rafiei-Taghanaki F. Formation of Smoke Flavor
Compounds by Thermal Lignin Degradation. In: Teranishi R, Takeoka G, Güntert M,
ed. by. Flavor Precursors. Washington: American Chemical Society; 1992. 232–243.
21. Hawthorne S, Krieger M, Miller D, Mathiason M. Collection and quantitation of
methoxylated phenol tracers for atmospheric pollution from residential wood stoves.
Environmental Science & Technology. 1989;23(4):470-475.
22. Stockwell C, Veres P, Williams J, Yokelson R. Characterization of biomass burning
emissions from cooking fires, peat, crop residue, and other fuels with high-resolution
proton-transfer-reaction time-of-flight mass spectrometry. Atmospheric Chemistry
and Physics. 2015;15(2):845-865.
23. Schauer J, Kleeman M, Cass G, Simoneit B. Measurement of Emissions from Air
Pollution Sources. 3. C1−C29Organic Compounds from Fireplace Combustion of
Wood. Environmental Science & Technology. 2001;35(9):1716-1728.
24. Guaiacol [Internet]. PubChem Open Chemystry Database. [pristup 30. septembar
2017]. Dostupno na: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/guaiacol
25. Crone H. Paracelsus: The Man who Defied Medicine. Melbourne: The Albarello
Press; 2004.
26. Rogers L, Lyon G, Porter F. Spot Test for Vanillylmandelic Acid and Other Guaiacols
in Urine of Patients with Neuroblastoma. American Journal of Clinical Pathology.
1972;58(4):383-387.

50
27. Tisserand R, Young R. Essential Oil Safety: A Guide for Health Care Professionals.
2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2014.
28. Mrak E, Stewart G, Chichester C. Advances in food research. New York: Academic
Press; 1976.
29. Toledo R. Wood smoke components and functional properties. International Smoked
Seafood Conference Proceedings. 2008;:55-61.
30. Maga J, Katz I. Simple phenol and phenolic compounds in food flavor. C R C Critical
Reviews in Food Science and Nutrition. 1978;10(4):323-372.
31. Wan Y, Du Y, Miyakoshi T. Enzymatic catalysis of 2,6-dimethoxyphenol by laccases
and products characterization in organic solutions. Science in China Series B:
Chemistry. 2008;51(7):669-676.
32. Buchner J. Repertorium für die Pharmacie. Nürnberg: J. L. Schrag; 1839.
33. Charrouf Z, Guillaume D. Phenols and Polyphenols from Argania spinosa. American
Journal of Food Technology. 2007;2(7):679-683.
34. Del Signore A, Romeo F, Giaccio M. Content of phenolic substances in
basidiomycetes. Mycological Research. 1997;101(5):552-556.
35. Fiege H, Voges H, Hamamoto T, Umemura S, Iwata T, Miki H et al. Phenol
Derivatives. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. 2000;.
36. Catechol (Pyrocatechol) [Internet]. Washington: United States Environmental
Protection Agency; 2000 [pristup 30. septembar 2017]. Dostupno na:
https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/catechol-
pyrocatechol.pdf
37. Minisci F. Free radicals in biology and environment. Dordrecht: Springer; 2011;409-
423
38. Bolzacchini E, Bruschi M, Hjorth J, Meinardi S, Orlandi M, Rindone B et al. Gas-
Phase Reaction of Phenol with NO3. Environmental Science & Technology.
2001;35(9):1791-1797.
39. Kroflič A, Grilc M, Grgić I. Unraveling Pathways of Guaiacol Nitration in
Atmospheric Waters: Nitrite, A Source of Reactive Nitronium Ion in the Atmosphere.
Environmental Science & Technology. 2015;49(15):9150-9158.
40. Heal M, Harrison M, Neil Cape J. Aqueous-phase nitration of phenol by N2O5 and
ClNO2. Atmospheric Environment. 2007;41(17):3515-3520.
41. Kroflič A, Grilc M, Grgić I. Does toxicity of aromatic pollutants increase under
remote atmospheric conditions?. Scientific Reports. 2015;5(1).

51
42. Kitanovski Z, Čusak A, Grgić I, Claeys M. Chemical characterization of the main
secondary organic aerosol (SOA) products formed through aqueous-phase
photonitration of guaiacol. Atmospheric Measurement Techniques Discussions.
2014;7(4):3993-4032.
43. Mesquita S, Dachs J, van Drooge B, Castro-Jiménez J, Navarro-Martín L, Barata C
et al. Toxicity assessment of atmospheric particulate matter in the Mediterranean and
Black Seas open waters. Science of The Total Environment. 2016;545-546:163-170.
44. Walker C, Sibly R, Hopkin S. Principles of Ecotoxicology. 3rd ed. London: CRC
Press; 2005.
45. Rand G, Petrocelli S. Fundamentals of aquatic toxicology. New York: Hemisphere
Publ.; 1989.
46. May M, Drost W, Germer S, Juffernholz T, Hahn S. Evaluation of acute-to-chronic
ratios of fish and Daphnia to predict acceptable no-effect levels. Environmental
Sciences Europe. 2016;28(1).
47. Ahlers J, Riedhammer C, Vogliano M, Ebert R, Kühne R, Schüürmann G. Acute to
chronic ratios in aquatic toxicity—variation across trophic levels and relationship
with chemical structure. Environmental Toxicology and Chemistry.
2006;25(11):2937.
48. ECO Update [Internet]. epa.gov. [pristup 14. decembar 2017.]. Dostupno na:
https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-09/documents/v2no1.pdf
49. Thouand G, Marks R. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in
Biotechnology - Volume 2. Berlin: Springer; 2014.
50. Fernandez M, Tarazona J. Complementary approaches for using ecotoxicity data in
soil pollution evaluation. New York: Nova Science Publishers; 2009.
51. Ahlers J, Riedhammer C, Vogliano M, Ebert R, Kühne R, Schüürmann G. Acute to
chronic ratios in aquatic toxicity—variation across trophic levels and relationship
with chemical structure. Environmental Toxicology and Chemistry.
2006;25(11):2937.
52. Directive on the approximation of laws, regulations and administrative provisions
relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances - Annex
VI to Consolidated Version of Directive 67/548/EEC. European Union; 1967.
53. Richer D, Williams W. Assessment and management of urban air quality in Europe
Luxemburg: Office for Official Publications of the European Communities; 1998.

52
54. Su L, Zhang X, Yuan X, Zhao Y, Zhang D, Qin W. Evaluation of joint toxicity of
nitroaromatic compounds and copper to Photobacterium phosphoreum and QSAR
analysis. Journal of Hazardous Materials. 2012;241-242:450-455.
55. ISO 11348-2:2007 - Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water
samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 2:
Method using liquid-dried bacteria [Internet]. Iso.org. 2017 [pristup 1. oktobar 2017.].
Dostupno na: https://www.iso.org/standard/40517.html
56. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: Daphnia sp. Acute Immobilisation
Test [Internet]. oecd.org. 2004 [pristup 2. oktobar 2017.]. Dostupno na:
https://www.oecd.org/chemicalsafety/risk-assessment/1948249.pdf
57. Jonker M, Svendsen C, Bedaux J, Bongers M, Kammenga J. Significance testing of
synergistic/antagonistic, dose level–dependent, or dose ratio–dependent effects in
mixture dose–response analysis. Environmental Toxicology and Chemistry.
2005;24(10):2701.
58. Backhaus T, Faust M. Predictive Environmental Risk Assessment of Chemical
Mixtures: A Conceptual Framework. Environmental Science & Technology.
2012;46(5):2564-2573.
59. Scientific Committee on Health and Environmental Risks. Toxicity and Assessment
of Chemical Mixtures. Brussels: European Comission; 2011:23.
60. Pflieger M, Kroflič A. Acute toxicity of emerging atmospheric pollutants from wood
lignin due to biomass burning. Journal of Hazardous Materials. 2017;338:132-139.
61. Lin D, Xing B. Phytotoxicity of nanoparticles: Inhibition of seed germination and root
growth. Environmental Pollution. 2007;150(2):243-250.
62. Cui F, Chai T, Qian L, Wang C. Effects of three diamides (chlorantraniliprole,
cyantraniliprole and flubendiamide) on life history, embryonic development and
oxidative stress biomarkers of Daphnia magna. Chemosphere. 2017;169:107-116.
63. Ding J, Zou H, Liu Q, Zhang S, Mamitiana Razanajatovo R. Bioconcentration of the
antidepressant fluoxetine and its effects on the physiological and biochemical status
in Daphnia magna. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2017;142:102-109.
64. Puckowski A, Stolte S, Wagil M, Markiewicz M, Łukaszewicz P, Stepnowski P et al.
Mixture toxicity of flubendazole and fenbendazole to Daphnia magna. International
Journal of Hygiene and Environmental Health. 2017;220(3):575-582.

53
65. Painting K, Kirsop B. A quick method for estimating the percentage of viable cells in
a yeast population, using methylene blue staining. World Journal of Microbiology &
Biotechnology. 1990;6(3):346-347.
66. Rumlova L, Dolezalova J. A new biological test utilising the yeast Saccharomyces
cerevisiae for the rapid detection of toxic substances in water. Environmental
Toxicology and Pharmacology. 2012;33(3):459-464.
67. Methodology document for the Ecological Structure-Activity Relationship Model
(ECOSAR) Class Program [Internet]. epa.gov. 2012 [pristup 2. novembar 2017.].
Dostupno na: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-
09/documents/ecosartechfinal.pdf
68. Artemenko A, Muratov E, Kuz’min V, Muratov N, Varlamova E, Kuz’mina A et al.
QSAR analysis of the toxicity of nitroaromatics inTetrahymena pyriformis: structural
factors and possible modes of action. SAR and QSAR in Environmental Research.
2011;22(5-6):575-601.
69. Kühn R, Pattard M, Pernak K, Winter A. Results of the harmful effects of selected
water pollutants (anilines, phenols, aliphatic compounds) to Daphnia magna. Water
Research. 1989;23(4):495-499.
70. Isidori M, Lavorgna M, Nardelli A, Parrella A. Model Study on the Effect of 15
Phenolic Olive Mill Wastewater Constituents on Seed Germination and Vibrio
fischeri Metabolism. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005;53(21):8414-
8417.
71. Wang X, Sun C, Wang L, Han S. Quantitative structure-activity relationships:
Comparative inhibition of nitrogen-containing aromatics on germination of Cucumis
sativus. Environmental Toxicology and Chemistry. 2001;20(4):913-916.
72. Klis F. Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae. FEMS
Microbiology Reviews. 2002;26(3):239-256.
73. Adeboye P, Bettiga M, Olsson L. The chemical nature of phenolic compounds
determines their toxicity and induces distinct physiological responses in
Saccharomyces cerevisiae in lignocellulose hydrolysates. AMB Express. 2014;4(1).
74. Stratford M, Plumridge A, Archer D. Decarboxylation of Sorbic Acid by Spoilage
Yeasts Is Associated with the PAD1 Gene. Applied and Environmental Microbiology.
2007;73(20):6534-6542.

54
9. POPIS SLIKA I GRAFIKA

9.1. Slike
1. Slika br. 1.: Slojevi atmosfere i njihov položaj u odnosu na površinu Zemlje
2. Slika br. 2.: Procesi u atmosferi koji se odvijaju noću
3. Slika br. 3.: Jedna od mogućih struktura lignina
4. Slika br. 4.: Struktura gvajakola
5. Slika.br. 5.: Struktura siringola
6. Slika br. 6.: Struktura katehola
7. Slika br. 7.: Predložena reakcijska shema transformacije gvajakola u kiseloj otopini
natrijeva nitrita
8. Slika br. 8.: Hromatogram nastalih nitro produkata gvajakola i produkata velike
molekulske mase pod uslovima simulirane sunčeve svjetlosti
9. Slika br. 9.: Nitro derivati ispitivanih spojeva
10. Slika br. 10.: Pojmovi LC50, LOEC, NOEC u testiranju toksičnosti
11. Slika br.11.: Uređaj LUMIStox 300
12. Slika br. 12.: Inhibicija rasta korijenja pšenice
13. Slika br. 13.: Prikaz odrasle jedinke vodene buhe,Daphnia magna.
14. Slika br. 14.: Žive i mrtve ćelije Saccharomyces cerevisiae

9.2. Grafici

15. Grafik br.1.: EC50 (mg/l) vrijednosti gvajakola i njegovih nitriranih derivata
16. Grafik br. 2.: EC50 (mg/l) vrijednosti siringola i njegovih nitriranih derivata
17. Grafik br. 3.: EC50 (mg/l) vrijednosti katehola i njegovih nitriranih derivata
18. Grafik br. 4.: Toksičnost mješavina
19. Grafici 5, 6, 7.: Inhibicija germinacije sjemena bijele djeteline u odnosu na ispitivanu
koncentraciju metoksifenola i fenola
20. Grafik br. 8.: EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na pšenici i djetelini
21. Grafici 9-14.: Inhibicijske krivulje elongacije korijenja
22. Grafici 15-17.: Inhibijske krivulje ispitivanih spojeva na D. magna
23. Grafik br. 18.: EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na D. magna

55
10.POPIS TABELA

1. Tabela br. 1.:Godišnje srednje vrijednosti atmosferskih polutanata u Europi i Bosni i

Hercegovini
2. Tabela br. 2.: Fizičko-hemijske karakteristike ispitivanih spojeva
3. Tabela br. 3.: Klasifikacija toksičnosti hemikalija
4. Tabela br. 4.: Testni organizmi, završne tačke i vrijeme izlaganja
5. Tabela br.5.: Vrijednosti EC50 (mg/l) na Vibrio fischeri ispitivanih spojeva nakon 15
i 30 minuta inkubacije.
6. Tabela br. 6.: Kalkulacija koncentracija komponenti baziranih na individualnim EC50
7. Tabela br. 7.: EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na pšenici i djetelini
8. Tabela br. 8.: EC50 vrijednosti ispitivanih spojeva na D. magna
9. Tabela br. 9.: Toksičnost ispitivanih spojeva na S. cerevisiae
10. Tabela br. 10.: ECOSAR vrijednosti za gvajakol i nitrogvajakole u mg/l.
11. Tabela br. 11.: ECOSAR vrijednosti za siringol i nitrosiringol u mg/l.
12. Tabela br. 12.: ECOSAR vrijednosti za katehol i nitrokatehol u mg/l.

56
 ANEKS

1. INHIBICIJA BIOLUMINSCENCIJE V.fischeri POJEDINAČNIH

SPOJEVA

1.1. Katehol

Vrijeme izlaganja: 15 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 34,588 50,422 68,613 91,027 120,805 164,429 239,561
2 23,316 36,262 52,023 72,447 100,931 144,843 225,102
3 24,904 38,472 54,894 76,064 105,44 150,489 232,322
Srednja
27,60 41,72 58,51 79,85 109,06 153,25 232,33
vrijednost
SD (σ) 4,98 6,22 7,24 8,04 8,51 8,23 5,90
KV (%) 18,05 14,91 12,37 10,07 7,80 5,37 2,54

Vrijeme izlaganja: 30 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 31,59 42,456 54,060 67,479 84,252 107,301 144,144
2 28,633 43,336 60,806 82,971 113,258 158,958 240,425
3 22,526 31,924 42,45 55,138 71,641 95,285 134,966
Srednja
27,58 39,24 52,44 68,53 89,72 120,51 173,18
vrijednost
SD (σ) 3,77 5,18 7,58 11,39 17,42 27,62 47,70
KV (%) 13,68 13,21 14,46 16,62 19,42 22,92 27,54

1
1.2. 4-nitrokatehol

Vrijeme izlaganja: 15 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 6,454 9,732 13,614 18,524 25,215 35,282 53,116
2 4,161 7,761 12,917 20,616 32,92 54,815 102,137
3 6,115 9,004 12,353 16,513 22,081 30,303 44,594
Srednja
5,58 8,83 12,96 18,55 26,74 40,13 66,62
vrijednost
SD (σ) 1,01 0,81 0,52 1,68 4,55 10,58 25,36
KV (%) 18,12 9,21 3,98 9,03 17,03 26,36 38,06

Vrijeme izlaganja: 30 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 3,982 6,92 10,871 16,454 24,917 39,159 67,994
2 4,68 8,026 12,473 18,692 28,025 43,566 74,65
3 6,326 9,182 12,451 16,464 21,779 29,539 42,849
Srednja
5,00 8,04 11,93 17,20 24,91 37,42 61,83
vrijednost
SD (σ) 0,98 0,92 0,75 1,05 2,55 5,86 13,69
KV (%) 19,67 11,48 6,29 6,12 10,24 15,65 22,15

2
1.3. Siringol

Vrijeme izlaganja: 15 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 34,877 47,905 62,093 78,781 99,983 129,62 177,955
2 32,981 46,711 62,08 80,596 104,668 139,139 196,955
3 26,853 39,275 53,588 71,27 94,818 129,406 189,154
Srednja
31,57 44,63 59,25 76,88 99,82 132,72 188,02
vrijednost
SD (σ) 3,42 3,82 4,01 4,04 4,02 4,54 7,80
KV (%) 10,85 8,55 6,76 5,25 4,03 3,42 4,15

Vrijeme izlaganja: 30 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 34,06 47,93 63,368 81,872 105,813 139,925 196,81
2 33,774 47,897 63,729 82,809 107,646 143,25 203,035
3 26,907 40,307 56,083 75,938 102,86 143,157 204,316
Srednja
31,58 45,38 61,06 80,21 105,44 142,11 201,39
vrijednost
SD (σ) 3,31 3,59 3,52 3,04 1,97 1,55 3,28
KV (%) 10,47 7,90 5,77 3,79 1,87 1,09 1,63

3
1.4. 4-nitrosiringol

Vrijeme izlaganja: 15 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 2,572 3,784 5,118 6,932 9,262 12,701 18,675
2 2,386 3,606 5,086 6,972 9,562 13,488 20,528
3 2,951 4,421 6,152 8,33 11,285 15,707 23,518
Srednja
2,64 3,94 5,45 7,41 10,04 13,97 20,91
vrijednost
SD (σ) 0,24 0,35 0,50 0,65 0,89 1,27 2,00
KV (%) 8,92 8,89 9,08 8,77 8,88 9,11 9,54

Vrijeme izlaganja: 30 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 2,78 4,061 5,536 7,357 9,779 13,334 19,469
2 2,440 3,713 5,232 7,167 9,821 13,842 21,046
3 3,065 4,626 6,476 8,818 12,012 16,822 25,374
Srednja
2,76 4,13 5,75 7,78 10,54 14,67 21,96
vrijednost
SD (σ) 0,26 0,38 0,53 0,74 1,04 1,54 2,50
KV (%) 9,25 9,10 9,21 9,48 9,90 10,49 11,37

4
1.5. 5-nitrogvajakol

Vrijeme izlaganja: 15 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 55,389 77,824 102,757 132,607 171,182 226,078 317,474
2 44,203 63,535 85,464 112,189 147,319 198,215 284,74
3 47,269 68,014 91,57 120,299 158,096 212,901 306,164
Srednja
48,95 69,79 93,26 121,70 158,87 212,40 302,79
vrijednost
SD (σ) 4,72 5,97 7,16 8,39 9,76 11,38 13,57
KV (%) 9,64 8,55 7,68 6,90 6,14 5,36 4,48

Vrijeme izlaganja: 30 minuta Koncentracija (mg/L)

№ testa EC20 EC30 EC40 EC50 EC60 EC70 EC80

1 29,668 46,554 67,215 94,17 131,989 190,663 298,699
2 43,21 60,335 79,261 101,809 130,811 171,882 239,873
3 46,257 65,771 87,692 114,18 148,718 198,331 281,839
Srednja
39,71 57,55 78,06 103,39 137,17 186,96 273,47
vrijednost
SD (σ) 7,21 8,09 8,40 8,24 8,18 11,11 24,73
KV (%) 18,16 14,05 10,77 7,97 5,96 5,94 9,04

5
 2. INHIBICIJA BIOLUMINISCENCIJE V.fischeri MJEŠAVINA

2.1. Mješavina Katehol / 4-nitrokatehol

1 2 3 1 2 3
C C
C(TU) % inhibicije (15 min) % inhibicije (30 min)
CAT 4NC
2,04 0,53 0,03 11,04 7,69 3,25 10,00 10,36 9,47
4,09 1,07 0,06 14,22 13,83 14,82 15,17 16,81 21,79
8,19 2,15 0,13 16,70 16,23 20,83 22,07 23,37 25,27
16,38 4,3 0,25 28,61 29,82 32,34 29,77 30,02 36,05
32,76 8,6 0,5 45,03 45,29 49,76 47,15 50,93 54,97
65,53 17,2 1 74,24 75,53 74,87 82,06 83,31 85,52
131,0 34,4 2 99,39 99,56 99,44 99,77 99,81 99,83
262.1 68,8 4 99,82 99,84 99,99 99,99 99,94 100,00

EC50 0,51 0,47 0,43 0,39 0,34 0,30

EC50
0,4700 0,3433
avg

Osnovni rastvor: mješavina 8 TU (8TU katehola + 8TU 4-

nitrokatehola)
1 TU Katehola = 65.53 mg/L
1 TU 4-nitrokatehola = 17,2 mg/L

6
2.2. Mješavina Siringol / 4-nitrosiringol

1 2 3 1 2 3
C C C
% inhibicije (15 min) % inhibicije (30 min)
SYR 4NS (TU)
2,50 0,24 0,03 -0,64 2,39 -1,14 -0,66 4,01 -1,98
5,01 0,48 0,06 0,48 4,40 4,25 1,62 5,44 4,32
10,02 0,97 0,13 8,30 15,29 10,80 8,3 15,29 10,8
20,05 1,94 0,25 23,72 31,33 27,01 23,72 31,33 27,01
40,1 3,89 0,5 46,45 50,03 50,81 46,45 50,03 50,81
80,21 7,78 1 75,32 74,57 71,50 75,32 74,57 71,5
160,4 15,56 2 91,45 91,16 91,75 91,45 91,16 91,75
320,8 31,12 4 98,99 99,15 98,77 98,99 99,15 98,77

EC50 0,52 0,46 0,51 0,51 0,47 0,50

EC50
0,4967 0,4933
avg

Osnovni rastvor: mješavina 8 TU (8TU Siringola + 8TU 4-

nitrosiringola)
1 TU Siringol = 80,21 mg/L
1 TU 4-nitrosiringol = 7,78 mg/L

7
 3. D. magna IMOBILIZACIJSKI TEST

3.1. Gvajakol
1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
0,5 20 20 20 40
1 40 40 20 40
2,5 60 60 60 40
3,5 80 100 80 100
5 100 100 100 100

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 29,93
Top 101,3
LogIC50 0,4372
HillSlope 6,729
IC50 2,736
Span 71,37
Std. Error
Bottom 3,438
Top 6,297
LogIC50 0,02471
HillSlope 2,388
Span 7,283
95% Confidence Intervals
Bottom 22,65 to 37,22
Top 87,95 to 114,6
LogIC50 0,3848 to 0,4895
HillSlope 1,666 to 11,79
IC50 2,425 to 3,087
Span 55,93 to 86,81
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 16
R square 0,9203
Absolute Sum of Squares 1497
Sy.x 9,673
Number of points
Analyzed 20

8
3.2. 5-nitrogvajakol
1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
25 80 80 80 100
10 60 80 60 80
5 60 60 60 60
1 40 20 20 20
0,1 0 20 0 0

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 0,9542
Top 97,45
LogIC50 0,5137
HillSlope 0,9094
IC50 3,263
Span 96,50
Std. Error
Bottom 7,964
Top 16,75
LogIC50 0,1853
HillSlope 0,3461
Span 22,21
95% Confidence Intervals
Bottom -15,93 to 17,84
Top 61,94 to 133,0
LogIC50 0,1208 to 0,9065
HillSlope 0,1756 to 1,643
IC50 1,321 to 8,063
Span 49,41 to 143,6
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 16
R square 0,9294
Absolute Sum of Squares 1326
Sy.x 9,104

Number of points
Analyzed 20

9
3.3. 4,6-dinitrogvajakol
1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
25 100 100 100 80
10 80 100 80 80
5 60 60 60 40
2,5 60 40 60 20
1 20 20 20 0
0,1 0 20 0 0

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 3,429
Top 104,5
LogIC50 0,5987
HillSlope 1,297
IC50 3,969
Span 101,1
Std. Error
Bottom 6,771
Top 13,34
LogIC50 0,1193
HillSlope 0,4214
Span 16,97
95% Confidence Intervals
Bottom -10,70 to 17,55
Top 76,69 to 132,3
LogIC50 0,3498 to 0,8476
HillSlope 0,4182 to 2,176
IC50 2,238 to 7,041
Span 65,67 to 136,5
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 20
R square 0,8958
Absolute Sum of Squares 3001
Sy.x 12,25

Number of points
Analyzed 24

10
3.4. Siringol
1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
1 20 0 20 0
5 20 40 20 40
10 60 60 40 60
25 80 80 100 60
50 100 100 100 100
100 100 100 100 100

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom 116,6
Top -1,434
LogIC50 1,057
IC50 11,42
Span -118,0
Std. Error
Bottom 6,649
Top 6,868
LogIC50 0,1178
Span 7,265
95% Confidence Intervals
Bottom 102,8 to 130,4
Top -15,72 to 12,85
LogIC50 0,8124 to 1,303
IC50 6,492 to 20,07
Span -133,1 to -102,9
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 21
R square 0,9263
Absolute Sum of Squares 2199
Sy.x 10,23
Number of points
Analyzed 24

11
3.5. 4-nitrosiringol
1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
25 100 100 100 80
10 60 60 60 40
5 20 20 40 40
2,5 20 20 20 20
1 0 0 20 20

log(agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 6,802
Top 153,6
LogEC50 1,255
HillSlope 1,249
EC50 17,98
Span 146,8
Std. Error
Bottom 10,25
Top 113,5
LogEC50 0,5392
HillSlope 0,8395
Span 121,9
95% Confidence Intervals
Bottom -14,93 to 28,53
Top -87,14 to 394,3
LogEC50 0,1117 to 2,398
HillSlope -0,5311 to 3,029
EC50 1,293 to 249,9
Span -111,7 to 405,2
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 16
R square 0,9285
Absolute Sum of Squares 1423
Sy.x 9,432
Number of points
Analyzed 20

12
3.6. Katehol

1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
25 100 100 100 100
10 100 100 100 100
7,5 100 80 80 80
5 80 60 60 60
2,5 20 40 40 20
1 0 20 20 0
0,1 0 0 20 0

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 6,286
Top 103,9
LogIC50 0,6104
HillSlope 2,485
IC50 4,078
Span 97,66
Std. Error
Bottom 3,593
Top 4,669
LogIC50 0,03659
HillSlope 0,4260
Span 6,374
95% Confidence Intervals
Bottom -1,129 to 13,70
Top 94,31 to 113,6
LogIC50 0,5349 to 0,6859
HillSlope 1,606 to 3,364
IC50 3,427 to 4,852
Span 84,51 to 110,8
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 24
R square 0,9552
Absolute Sum of Squares 1900
Sy.x 8,898

Number of points
Analyzed 28

13
3.7. 4-nitrokatehol
1 2 3 4
Koncentracija
% imobilizacije
(mg/L)
0 0 0 0 0
1 0 0 20 20
5 40 20 20 20
7,5 40 60 60 60
10 60 40 60 60
15 80 80 80 80
25 100 100 100 100
50 100 100 100 100

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 8,946
Top 104,4
LogIC50 0,9600
HillSlope 2,251
IC50 9,120
Span 95,50
Std. Error
Bottom 4,770
Top 5,202
LogIC50 0,03817
HillSlope 0,4325
Span 7,787
95% Confidence Intervals
Bottom -0,8994 to 18,79
Top 93,71 to 115,2
LogIC50 0,8812 to 1,039
HillSlope 1,359 to 3,144
IC50 7,607 to 10,93
Span 79,42 to 111,6
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 24
R square 0,9372
Absolute Sum of Squares 1934
Sy.x 8,977
Number of points
Analyzed 28

14
 4. INHIBICIJA GERMINACIJE T. Repens

Gvajakol

mg/L % germinacije Mediana 1 kvartal 3 kvartal

Kontrola 80 90 90 90 90 87,5 90
0,1 90 80 80 60 80 75 82,5
10 80 90 90 90 90 87,5 90
100 90 100 60 80 85 75 92,5
500 70 70 70 80 70 70 72,5
1000 0 0 0 0 0 0 0

5-nitrogvajakol

mg/L % germinacije Mediana 1 kvartal 3 kvartal

Kontrola 100 90 80 80 85 80 92,5
0,05 70 90 90 80 85 77,5 90
0,5 60 60 90 60 60 60 67,5
5 80 30 80 60 70 52,5 80
50 80 60 60 50 60 57,5 65
500 0 0 0 0 0 0 0

Siringol

mg/L % germinacije Mediana 1 kvartal 3 kvartal

Kontrola 80 90 80 70 80 77,5 82,5
0,01 70 90 60 80 75 67,5 82,5
10 50 90 80 70 75 65 82,5
100 70 70 80 90 75 70 82,5
500 60 60 50 60 60 57,5 60
1000 60 50 50 50 50 50 52,5

4-nitrosiringol

mg/L % germinacije Mediana 1 kvartal 3 kvartal

Kontrola 90 100 90 100 95 90 100
1 90 80 70 80 80 77,5 82,5
10 80 70 70 50 70 65 72,5
100 90 50 40 40 45 40 60
250 40 50 40 40 40 40 42,5
500 0 0 0 0 0 0 0

15
Katehol

mg/L % germinacije Mediana 1 kvartal 3 kvartal

Kontrola 90 100 90 80 90 87,5 92,5
0,1 70 100 30 90 80 60 92,5
10 80 70 50 70 70 65 72,5
100 40 50 50 80 50 47,5 57,5
500 0 0 0 0 0 0 0
1000 0 0 0 0 0 0 0

4-nitrokatehol

mg/L % germinacije Mediana 1 kvartal 3 kvartal

Kontrola 100 80 90 80 85 80 92,5
0,1 90 70 70 70 70 70 75
10 60 70 60 70 65 60 70
100 20 20 0 0 10 0 20
500 0 0 0 0 0 0 0
1000 0 0 0 0 0 0 0

5. INHIBICIJA GERMINACIJE T. Aestivum

Germinacija sjemena pšenice – Triticum aestivum, pri najvišim ispitivanim

koncentracijama svih spojeva iznosi 87,5-100%, stoga nisu navedene vrijednosti za
pojedinačne spojeve

16
 6. INHIBICIJA ELONGACIJE KORJENJA

6.1. Gvajakol
Trtiticum aestivum Trifolium repens
Koncentracija Mediana (mm) Mediana (mm)
1 2 3 4 1 2 3 4
Kontrola 138 155,5 132 124,5 35 39 26,5 36
(ddH20)
1 g/L 44 17 4 6 0 0 0 0
0,5 g/L 65 49 59 53,5 6 8 8 7
0,1 g/L 151,5 167 103 127,5 20 17,5 18 17,5
0,01 g/L 119,5 158,5 146 174,5 28 37 26 33
0,0001 g/L 144,5 119 162 130 24 20 40 29

Triticum aestivum

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom -1,459
Top 144,2
LogIC50 2,615
HillSlope -2,125
IC50 412,0
Span 145,7
Std. Error
Bottom 34,75
Top 7,148
LogIC50 0,1199
HillSlope 1,321
Span 38,03
95% Confidence Intervals
Bottom -75,13 to 72,21
Top 129,1 to 159,4
LogIC50 2,361 to 2,869
HillSlope -4,925 to 0,6756
IC50 229,5 to 739,7
Span 65,06 to 226,3
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 16
R square 0,8970
Absolute Sum of Squares 6409
Sy.x 20,01
Number of points
Analyzed 20
17
Trifolium repens

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom -7,154
Top 29,97
LogIC50 2,423
HillSlope -0,9779
IC50 265,1
Span 37,12
Std. Error
Bottom 15,99
Top 2,146
LogIC50 0,4657
HillSlope 0,5809
Span 16,95
95% Confidence Intervals
Bottom -41,05 to
Top 26,75
25,42 to
LogIC50 34,52
1,436 to
HillSlope 3,411
-2,209 to
IC50 0,2536
27,30 to
Span 2574
1,195 to
Goodness of Fit 73,05
Degrees of Freedom 16
R square 0,8852
Absolute Sum of Squares 360,3
Sy.x 4,746

Number of points
Analyzed 20

18
6.2. 5-nitrogvajakol
Trtiticum aestivum Trifolium repens
Koncentracija Mediana (mm) Mediana (mm)
1 2 3 4 1 2 3 4
Kontrola 200 209,5 194,5 216 32 39,5 40 41,5
(ddH20)
500 mg/L 76 52 68,5 73 0 0 0 0
50 mg/L 163,5 158,5 167 156 30 24 27 33
5 mg/L 203 187 206,5 193 34,5 16 33 25,5
0,5 mg/L 205,5 176 177 183,5 32 39,5 40 41,5
0,05mg/L 205,5 210,5 195 218 32 42 43 33

Triticum aestivum

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom 14,85
Top 198,2
LogIC50 2,302
IC50 200,5
Span 183,4
Std. Error
Bottom 22,56
Top 3,709
LogIC50 0,1616
Span 21,59
95% Confidence Intervals
Bottom -32,75 to 62,45
Top 190,4 to 206,1
LogIC50 1,961 to 2,643
IC50 91,46 to 439,7
Span 137,8 to 228,9
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 17
R square 0,9528
Absolute Sum of Squares 2488
Sy.x 12,10

Number of points
Analyzed 20

19
Trifolium repens

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom -25,04
Top 34,93
LogIC50 2,555
IC50 359,3
Span 59,96
Std. Error
Bottom 28,14
Top 1,923
LogIC50 0,4722
Span 27,39
95% Confidence Intervals
Bottom -84,42 to 34,34
Top 30,87 to 38,98
LogIC50 1,559 to 3,552
IC50 36,24 to 3563
Span 2,180 to 117,7
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 17
R square 0,8411
Absolute Sum of Squares 679,7
Sy.x 6,323

Number of points
Analyzed 20

20
6.3. Siringol
Trtiticum aestivum Trifolium repens
Koncentracija Mediana (mm) Mediana (mm)
1 2 3 4 1 2 3 4
Kontrola 175 197 198 179,5 38 35,5 43 34
(ddH20)
1000 mg/L 32,5 28 29 32,5 5 8 6 7
500 mg/L 75 80,5 79,5 81,5 12 14 15 13
100 mg/L 125 127 117 127,5 32 34 32 34
10 mg/L 188,5 181,5 187 199 39 38 37 37,5
0,1 mg/L 190 207 205 205 40 41 38 41

Trtiticum aestivum

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom 14,62
Top 199,4
LogIC50 2,239
IC50 173,5
Span 184,8
Std. Error
Bottom 10,10
Top 4,663
LogIC50 0,09453
Span 9,917
95% Confidence Intervals
Bottom -6,688 to 35,92
Top 189,5 to 209,2
LogIC50 2,040 to 2,439
IC50 109,6 to 274,6
Span 163,8 to 205,7
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 17
R square 0,9717
Absolute Sum of Squares 2389
Sy.x 11,85

Number of points
Analyzed 20

21
Trifolium repens

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom -12,20
Top 39,80
LogIC50 2,728
IC50 535,0
Span 52,00
Std. Error
Bottom 3,872
Top 0,5603
LogIC50 0,07828
Span 3,706
95% Confidence Intervals
Bottom -20,37 to -4,027
Top 38,62 to 40,99
LogIC50 2,563 to 2,894
IC50 365,8 to 782,6
Span 44,18 to 59,82
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 17
R square 0,9890
Absolute Sum of Squares 40,74
Sy.x 1,548
Number of points
Analyzed 20

22
6.4. 4-nitrosiringol
Trtiticum aestivum Trifolium repens
Koncentracija Mediana (mm) Mediana (mm)
1 2 3 4 1 2 3 4
Kontrola 168 164,5 147 163 32 38 38 42
(ddH20)
500 mg/L 46,5 39,5 49,5 46,5 0 0 0 0
250 mg/L 74,5 83,5 77 84 19 15 18,5 21
100 mg/L 103,5 107,5 111,5 106,5 25 25 26,5 28,5
10 mg/L 138 148,5 146 137,5 31,5 30 30 35
1 mg/L 192,5 180,5 186,5 199,5 41 40 37 38

Trtiticum aestivum

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom 22,21
Top 174,6
LogIC50 2,079
IC50 119,8
Span 152,4
Std. Error
Bottom 16,55
Top 6,073
LogIC50 0,1594
Span 15,84
95% Confidence Intervals
Bottom -12,70 to 57,13
Top 161,8 to 187,4
LogIC50 1,742 to 2,415
IC50 55,24 to 259,9
Span 119,0 to 185,8
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 17
R square 0,9281
Absolute Sum of Squares 3617
Sy.x 14,59
Number of points
Analyzed 20

23
Trifolium repens

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom 9,208
Top 36,73
LogIC50 2,131
IC50 135,2
Span 27,52
Std. Error
Bottom 8,392
Top 1,327
LogIC50 0,3240
Span 8,001
95% Confidence Intervals
Bottom -8,919 to 27,33
Top 33,86 to 39,60
LogIC50 1,431 to 2,831
IC50 26,97 to 677,2
Span 10,24 to 44,80
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 13
R square 0,8689
Absolute Sum of Squares 126,2
Sy.x 3,116

Number of points
Analyzed 16

24
6.5. Katehol
Trtiticum aestivum Trifolium repens
Koncentracija Mediana (mm) Mediana (mm)
1 2 3 4 1 2 3 4
Kontrola 125 136 204 174 41 40 42 40,5
(ddH20)
1000 mg/L 28 32,5 30 30 0 0 0 0
500 mg/L 34,5 38 38,5 36 0 0 0 0
100 mg/L 97,5 110,5 106 106,5 16,5 12 21 13,5
10 mg/L 188 153 174,5 170 35 37 38 36
0,1 mg/L 201 197 188,5 189 47 36,5 36 47

Trtiticum aestivum

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom 5,207
Top 192,7
LogIC50 2,034
HillSlope -0,9213
IC50 108,1
Span 187,5
Std. Error
Bottom 12,49
Top 4,195
LogIC50 0,08388
HillSlope 0,1440
Span 14,71
95% Confidence Intervals
Bottom -21,27 to 31,68
Top 183,8 to 201,6
LogIC50 1,856 to 2,212
HillSlope -1,227 to -0,6160
IC50 71,81 to 162,9
Span 156,3 to 218,7
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 16
R square 0,9882
Absolute Sum of Squares 1073
Sy.x 8,190
Number of points
Analyzed 20

25
Trifolium repens

log(inhibitor) vs. response -- Variable slope (four parameters)

Best-fit values
Bottom -3,403
Top 41,35
LogIC50 1,869
HillSlope -1,110
IC50 73,89
Span 44,75
Std. Error
Bottom 2,796
Top 1,697
LogIC50 0,08576
HillSlope 0,2565
Span 3,764
95% Confidence Intervals
Bottom -9,329 to 2,524
Top 37,75 to 44,95
LogIC50 1,687 to 2,050
HillSlope -1,653 to -0,5658
IC50 48,61 to 112,3
Span 36,77 to 52,73
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 16
R square 0,9714
Absolute Sum of Squares 182,2
Sy.x 3,375
Number of points
Analyzed 20

26
6.6. 4-nitrokatehol
Trtiticum aestivum Trifolium repens
Koncentracija Mediana (mm) Mediana (mm)
1 2 3 4 1 2 3 4
Kontrola 160,5 169 165,5 137 20,5 36 33 25
(ddH20)
10 g/L 15 23 22 24 0 0 0 0
5 g/L 22 12 24 20 0 0 0 0
1 g/L 13,5 35 44 43 0 0 0 0
0,5 g/L 39 39 32 35 0 0 0 0
0,1 g/L 95,5 82,5 110,5 129,5 28 15 0 0
0,01 g/L 184 203,5 156,5 179 38,5 32 35,5 36
0,0001 g/L 164 159 146,5 158 50 36 38 32
0,000001 g/L 189 133,5 227 178,5 36,5 33 48,5 41

Trtiticum aestivum

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom 14,76
Top 176,5
LogIC50 2,085
IC50 121,7
Span 161,8
Std. Error
Bottom 6,495
Top 6,046
LogIC50 0,1130
Span 8,367
95% Confidence Intervals
Bottom 1,480 to 28,04
Top 164,2 to 188,9
LogIC50 1,854 to 2,316
IC50 71,47 to 207,1
Span 144,7 to 178,9
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 29
R square 0,9299
Absolute Sum of Squares 10957
Sy.x 19,44
Number of points
Analyzed 32

27
Trifolium repens

log(inhibitor) vs. response (three parameters)

Best-fit values
Bottom -2,765
Top 40,10
LogIC50 1,727
IC50 53,30
Span 42,87
Std. Error
Bottom 4,404
Top 2,445
LogIC50 0,2107
Span 4,732
95% Confidence Intervals
Bottom -12,06 to 6,528
Top 34,94 to 45,26
LogIC50 1,282 to 2,171
IC50 19,15 to 148,3
Span 32,88 to 52,85
Goodness of Fit
Degrees of Freedom 17
R square 0,8545
Absolute Sum of Squares 915,1
Sy.x 7,337

Number of points
Analyzed 20

28
 7. LETALNI TEST NA Saccahromyces cerevisiae

Gvajakol C=1 g/L 5-nitrogvajakol C=500 mg/L

Živih Mrtvih Ukupno % Živih Mrtvih Ukupno %

mrtvih mrtvih
71 48 119 40,3 71 34 105 32,4
90 52 142 36,6 81 42 123 34,1
96 56 152 36,8 56 29 85 34,1
71 51 122 41,8 49 27 76 35,5
86 59 145 40,7 67 46 113 40,7
414 266 680 39,12 324 178 502 35,5

116 53 169 31,4 172 81 253 32,0

100 51 151 33,8 93 39 132 29,5
86 37 123 30,1 145 72 217 33,2
123 52 175 29,7 160 78 238 32,8
134 65 199 32,7 152 82 234 35,0
559 258 817 31,58 722 352 1074 32,8

171 89 260 34,2 161 76 237 32,1

151 67 218 30,7 153 80 233 34,3
159 80 239 33,5 123 52 175 29,7
146 65 211 30,8 134 65 199 32,7
109 56 165 33,9 125 68 193 35,2
736 357 1093 32,66 696 341 1037 32,9

Srednja 34,45 Srednja 33,71

vrijednost vrijednost
SD 4,08 SD 1,52

29
 Katehol C=1g/L 4-nitrokatehol C=1g/L

Živih Mrtvih Ukupno % Živih Mrtvih Ukupno %

mrtvih mrtvih
77 46 123 37,4 56 46 102 45,1
79 34 113 30,1 58 44 102 43,1
65 41 106 38,7 55 40 95 42,1
48 29 77 37,7 58 37 95 38,9
89 53 142 37,3 46 33 79 41,8
358 203 561 36,2 273 200 473 42,3

98 62 160 38,8 63 55 118 46,6

75 45 120 37,5 57 43 100 43,0
102 63 165 38,2 68 55 123 44,7
69 55 124 44,4 70 62 132 47,0
71 52 123 42,3 42 38 80 47,5
415 277 692 40,0 300 253 553 45,8

101 56 157 35,7 58 52 110 47,3

98 58 156 37,2 54 40 94 42,6
82 53 135 39,3 49 41 90 45,6
108 59 167 35,3 68 57 125 45,6
93 51 144 35,4 66 42 108 38,9
482 277 759 36,5 295 232 527 44,0

Srednja 37,57 Srednja 44,02

vrijednost vrijednost
SD 2,14 SD 1,73

30
 Siringol C=1g/L

Živih Mrtvih Ukupno % mrtvih

68 34 102 33,3
72 29 101 28,7
79 36 115 31,3
84 39 123 31,7
88 33 121 27,3
391 171 562 30,4

76 30 106 28,3
59 31 90 34,4
67 22 89 24,7
54 18 72 25,0
52 19 71 26,8
308 120 428 28,0

77 33 110 30,0
67 31 98 31,6
62 31 93 33,3
55 26 81 32,1
71 33 104 31,7
332 154 486 31,7

Srednja 30,05
vrijednost
SD 1,85

31