Cristina Cuesta Bravo

Caterina Reurer Cardona

Marina Zafra Salcedo
20 de noviembre de 2017

Informe práctica:
Evaluación de la actividad de antioxidantes de polifenoles de
algas marinas
Resumen
Los antioxidantes son compuestos químicos que usan los organismos para evitar la oxidación
de las biomoléculas por la acción de los radicales libres que se forman consecuencia del
metabolismo. Estos radicales son sustancias muy reactivas que pueden producir alteraciones
en el ADN así como otros cambios en las células que se relacionan con el envejecimiento e
incluso con algunas enfermedades.
Por todas estas razones es interesante la producción de compuestos antioxidantes que se usan
muchas veces como aditivos alimentarios o como suplementos en el ámbito farmacéutico ya
que previenen el desgaste y envejecimiento celular excesivo que se produce sobretodo en
situaciones con alta demanda energética como por ejemplo bajo condiciones de estrés.
Las algas marinas pueden ser una buena fuente de antioxidantes ya que presentan de forma
natural gran cantidad de polifenoles con este efecto gracias a que viven en ambientes con
condiciones altamente oxidativas y lo han desarrollado como respuesta evolutiva.

Introducción y objetivos
El objetivo de esta práctica es extraer los polifenoles de diferentes algas marinas, cuantificarlos
y medir su actividad antioxidante en cada caso. Para cuantificar los polifenoles vamos a usar
el método de Folin-Ciocalteu y para medir su actividad antioxidante usamos el método del
DPPH.
En este caso vamos a comparar la concentración y la actividad antioxidante de los polifenoles
comparando los géneros de algas pardas marinas: Fucus y Laminaria.

Material y métodos
I) Extracción de polifenoles de algas pardas:

Pesamos en una balanza de precision unos 3-4g de nuestro alga correspondiente, previamente
desecada y troceada con un mortero. Al troceado le añadimos agua y metanol a partes iguales
(1:1) , 20 mL de cada uno hasta homogeneizar. Y se mantiene 24h en agitación en la nevera
para posteriormente medir el volumen del extracto final.

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II) Fundamento del método Folin-Ciocalteu y determinación de la concentración de
polifenoles en el extracto algal.
El ensayo nos permite determinar la concentración de compuestos fenólicos en muestras de
origen vegetal .Dichos compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a
pH básico, tornándose en una coloración azulada que por espectrofotometría a 760 nm
puede ser determinada. Este reactivo contiene una mezcla de wolframato sódico
(C2H3NaO2) y molibdato sódico (Na2MoO4 ) en ácido fosfórico (H3PO4)  y reacciona con
los compuestos fenólicos presentes en la muestra. El ácido fosfomolibdotúngstico, formado
por las dos sales en el medio ácido: sales de tungsteno y molibdeno (Antolovich et al. 2002),
(Jiménez et al. 2012), al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color
azul intenso, cuya intensidad es la que medimos para evaluar el contenido en polifenoles
(Figura 2).

La reacción que se produce al ser redox actúa también como medida de la actividad
antioxidante. Como los polifenoles presentes en la muestra se oxidan está pasará a tener un
color azul característico que presenta  un máximo de absorción a 765 nm, y que se cuantifica
por espectrofotometría en base a una recta patrón a diferentes soluciones de floroglucinol.

A continuación, para evitar posibles interferencias, tratamos con PVPP
(polivinilpolipirrolidona) de manera que la diferencia de absorbancias debe de reflejar la
concentración real de polifenoles en nuestra muestra.

La polivinilpolipirrolidona es un polímero poli (1-2-oxo 1-pirrolidiniletileno)   que se ha
reticulado para darle propiedades de insolubilidad. Se presenta como un polvo de color claro,
insoluble en el agua y en los solventes orgánicos e insoluble en los ácidos minerales fuertes y
los alcalinos.

La PVPP, a veces denominado falsa proteína, tiene una afinidad muy fuerte por los
polifenoles de manera que estos quedan fijados en la muestra. por lo tanto, la absorción que
tenga la muestra es un indicador del índice de polimerización.

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En medio alcalino absorbe selectivamente los compuestos fenólicos no polimerizados y
oxidables por formación de puentes de hidrógeno entre el grupo hidroxilfenólico y el enlace
amida de la PVPP. Actúa sobre catequinas, ortodifenoles y proantocianidinas,
algoantoncianos y pigmentos amarillos mientra que no afecta a polifenoles no flavonoideos.

Descripción experimental
Llevamos los 30 mL tomados previamente de la muestra a pH ácido 3.5-4.0 con ácido acético
glacial. De los 4 tubos de ensayo que tendremos, la mitad (200mL y 400mL) los forramos con
papel metálico y los ponemos a incubar en oscuridad mientras que a la otra mitad (200mL y
400mL) se le añadirá PVPP en función de 15mg/mL de extracto.

Por último someteremos ambas fracciones a la reacción de Folin- Ciocalteu, para ello
añadimos 0.5mL del reactivo Folin- Ciocalteu  y 1.5mL de Na2CO3 al 20% y se enrasa hasta
10 mL. Todas ellas, forradas con papel metálico, se mantienen en oscuridad durante
aproximadamente una hora y posteriormente por espectrofotometría determinamos la
concentración de polifenoles como bien se ha explicado en el apartado anterior.


III) Ensayo de la actividad antioxidante
Para la determinación cuantitativa se utilizó el método del radical libre DPPH, el cual reduce
el radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) en la 2,2-difenil-1-pricril hidrazina por la
acción antioxidante de compuestos que contienen grupos -OH y que decoloran dicho
reactivo.
Preparación de la curva de calibración: Para la curva de calibración se utilizó una disolución
DPPH a 0.1 mM en metanol de la cual se preparan cinco disoluciones de un volumen de 10
ml de concentraciones (0.02,0.04,0.06,0.08,0.1 mM respectivamente). La absorbancia a 517
nm fue determinada en un espectrofotómetro ultravioleta-visible. Introdujimos 2 mL de la
disolución del DPPH 0.1 mL, le añadimos el extracto algal y se midió la absorbancia cada 5
minutos durante 35 minutos y la decoloración fue comparada con una solución que contenía
la misma proporción 1:1 (v/v) de etanol y DPPH de manera que pudiéramos determinar el
tiempo en que la concentración de DPPH se reduce a la mitad (t1/2) y el porcentaje de
inhibición a los 30 minutos. Si  la disminución de la absorción es muy rápida realizamos una
dilución apropiada del extracto. Previamente preparamos un blanco con solo 10 ml disolvente
para calibrar el espectrofotómetro.
Con los datos obtenidos en las medidas de espectrofotometría realizamos una recta para
obtener la concentración del radical de manera que: [DPPH]= (a*Abs517)+b
El porcentaje de inhibición a los 30 minutos será calculado como [Ao-Ae/Ao]x 100. Donde
Ao es la absorbancia sin extracto y Ae es la absorbancia con extracto.

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Resultados
En primer lugar calculamos la concentración de polifenoles, para hacerlo hemos medido la
absorbancia de las muestras a 760nm y usamos la recta patrón y=13,05x+0,65 (con
r2=0,996) para poder interpolar la cantidad de polifenoles en la muestra (extracto). La
concentración de polifenoles será la diferencia entre la concentración de la muestra B (con
PVPP) y la A (sin PVPP) porque este compuesto se une de forma específica a los polifenoles
dejando solamente la absorbancia correspondiente a las moléculas interferentes.
Determinación de polifenoles en el extracto de alga (Fucus)
Muestra: Abs a 760nm Resultado al
interpolar (mg/ml)

A: alga +agua/metanol (color oscuro) 2,06 27,533

B: alga+ agua/metanol + PVPP (color 0,40 5,87
claro)

Determinación de polifenoles en el extracto de alga (Laminaria)

Muestra: Abs a 760nm Resultado al
interpolar (mg/ml)

A: alga +agua/metanol (color oscuro) 1,15 15,6575

B: alga+ agua/metanol + PVPP (color 0,23 3,6515
claro)

Para saber la concentración de polifenoles por gramo de alga debemos aplicar la dilución que
hemos hecho al extracto. Vamos a multiplicar por 10 ya que hemos diluido 1ml de extracto
en 10 ml de disolución total (reactivo de Folin-Ciocalteu), Na2CO3 al 20%, extracto y agua
destilada). Además debemos tener en cuenta que al principio disolvimos 4g de alga seca en
40ml de agua:metanol, por lo tanto:
Para Fucus:
A: 27,53mg/ml x 10 x 10ml/4mg = 688,25mg (polifenoles+moléculas interferentes)/g alga
B: 5,87mg/ml x 10 x 10ml/4mg = 146,75mg (moléculas interferentes)/g alga
Por lo tanto la concentración de polifenoles en Fucus será:
688,25mg (polif.+mol. inter.)/g alga - 146,75mg (mol. inter.)/g alga= 541,5mg/g alga
Para Laminaria:
A: 15,6575mg/ml x 10 x 10ml/4mg = 391,44mg (polifenoles+moléculas interferentes)/g alga
B: 3,6515mg/ml x 10 x 10ml/4mg =91,287mg (moléculas interferentes)/g alga
Por lo tanto la concentración de polifenoles en Laminaria será:
391,44mg (polif.+mol. inter.)/g alga - 91,287mg (mol. inter.)/g alga= 300,15mg/g alga

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En segundo lugar vamos a determinar la posible actividad antioxidante de los polifenoles
extraídos de cada muestra, para ello usamos DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil) ya que este
compuesto permite medir su absorbancia a 517nm y determinar su concentración en base a
ello. Los tubos control tienen extracto B (con PVPP) por lo tanto los polifenoles estan
inhibidos, todos tienen DPPH Hemos obtenido las siguientes tablas de resultados en cada
caso, midiendo la absorbancia cada 5 minutos durante media hora:

Ensayo de actividad antioxidante (Fucus)

Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

1. Control 200µL 0,28 0,38 0,19 0,15 0,13 0,20 0,23 0,17

2. Control 400µL 0,27 0,25 0,21 0,22 0,18 0,18 0,17 0,19

3. Alga + agua/ 1,19 1,04 0,97 0,93 0,99 1,10 0,84 0,89
metanol (1:1) +
DPPH 200µL

4. Alga + agua/ 1,20 1,13 0,92 0,85 0,62 0,57 0,55 0,51
metanol (1:1) +
DPPH 400µL

En este caso, sustituyendo la absorbancia en la recta patrón y=16x+0,09 con (r2=0,996)

obtenemos los siguientes datos: (concentración mM)

Muestras Fucus T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

1. Control 200µL 4,57 6,17 3,13 2,49 2,17 3,29 3,77 2,81

2. Control 400µL 4,41 4,09 3,45 3,61 2,97 2,97 2,81 3,13

3. Alga + agua/ 19,13 16,73 15,61 14,97 15,93 17,69 13,53 14,33
metanol (1:1) +
DPPH 200µL

4. Alga + agua/ 19,29 18,17 14,81 13,69 10,01 9,21 8,89 8,25
metanol (1:1) +
DPPH 400µL

1,2

0,9
Absorbancia 517nm

1.Control 1
0,6 2. Control 2
3. Problema 1
4. Problema 2

0,3

0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tiempo (cada 5 min) !5
El tiempo de reducción de DPPH es el tiempo que tardan los antioxidantes en reducir la
concentración de DPPH a la mitad de la inicial, por lo tanto:
- En la muestra 3, con una concentración inicial de DPPH de 19,13 mM no se llega a reducir
a la mitad (aproximadamente 9,56) en los 35 minutos que medimos.
- En la muestra 4, con una concentración inicial de 19,29 mM de DPPH se alcanza la mitad
al rededor del tiempo 5 (25 minutos) cuando es 9,21 mM.
Finalmente calculamos el porcentaje de inhibición a los 30 minutos, sabiendo que la
absorbancia del DPPH es de 1,2, el porcentaje de inhibición en cada caso es:
% inhibición muestra 3 = (1,2-0,84)/1,2 x 100 = 30%
% inhibición muestra 4 = (1,2-0,55)/1,2 x 100 = 54,17%

Hacemos lo mismo para Laminaria:

Ensayo de actividad antioxidante (Laminaria)

Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

1. Control 200µL 1,3 1,3 1,2 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1

2. Control 400µL 1,2 1,1 1 1 1 1 1 1

3. Alga + agua/ 1,15 1 0,9 0,86 0,81 0,79 0,75 0,73

metanol (1:1) +
DPPH 200µL

4. Alga + agua/ 0,96 0,86 0,72 0,61 0,55 0,51 0,47 0,41
metanol (1:1) +
DPPH 400µL

Sustituyendo la absorbancia en la recta patrón y=16x+0,09 con (r2=0,996) obtenemos los

siguientes datos: (concentración mM)

Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Laminaria

1. Control 200µL 20,89 20,89 19,29 17,69 17,69 17,69 17,69 17,69

2. Control 400µL 19,29 17,69 16,09 16,09 16,09 16,09 16,09 16,09

3. Alga + agua/ 18,49 16,09 14,49 13,85 13,05 12,73 12,09 11,77
metanol (1:1) +
DPPH 200µL

4. Alga + agua/ 15,45 13,85 11,61 9,85 8,89 8,25 7,61 6,65
metanol (1:1) +
DPPH 400µL

!6
 1,3

0,975
Absorbancia 517nm

1. Control 1
2. Control 2
0,65
3. Problema 1
4. Problema 2

0,325

0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
Tiempo (cada 5 min)

Nota: Las gráficas están hechas con los datos de la absorbancia aunque estos datos son equivalentes a los de
concentración por lo que igualmente se ve la tendencia.

El tiempo de reducción de DPPH es el tiempo que tardan los antioxidantes en reducir la

concentración de DPPH a la mitad de la inicial, por lo tanto:
- En la muestra 3, con una concentración inicial de DPPH de 18,49 mM no se llega a reducir
a la mitad (aproximadamente 9,245) en los 35 minutos que medimos.
- En la muestra 4, con una concentración inicial de 15,45 mM de DPPH se alcanza la mitad
al rededor del tiempo 6 (30 minutos) cuando es 7,61 mM.
Finalmente calculamos el porcentaje de inhibición a los 30 minutos, sabiendo que la
absorbancia del DPPH es de 1,2, el porcentaje de inhibición en cada caso es:
% inhibición muestra 3 = (1,2-0,73)/1,2 x 100 = 39%
% inhibición muestra 4 = (1,2-0,41)/1,2 x 100 = 65,83%

Fucus Laminaria
Discusión
En primer lugar vemos que hay una diferencia considerable
600
entre la concentración de polifenoles en ambos géneros de algas,
en el caso de Laminaria la concentración es de unos 300,15 mg/g
450
de alga mientras que en Fucus es mucho mayor rondando los
541,5mg/g de alga. Por lo tanto a priori Fucus puede ser una
300
buena fuente de polifenoles, al menos mejor que Laminaria
porque con la misma cantidad de alga podemos obtener más
150
cantidad de sustancia de interés. Debemos tener en cuenta que
el metanol concentra los polifenoles por lo que es probable que
0
los datos obtenidos sean más elevados que los reales. Concentración de polifenoles

!7
En cuanto a la actividad antioxidante de estas algas, al representar las gráficas vemos que los
controles no se mantienen lineales como deberían ya que al tener PVPP los polifenoles se
encuentran inhibidos, aunque se aprecia que la variación de concentración de DHPP es
mucho menor.

Fucus 200µL Fucus 400µL Laminaria 200µL Laminaria 400µL

20

15

10

0
0' 5' 10' 15' 20' 25' 30' 35'

Si nos fijamos en el tiempo de reducción del DPPH en cada caso vemos que en Fucus es
menor (25’) es decir tarda menos que Laminaria (30’) en reducir a la mitad la concentración
inicial de sustrato. En cambio si nos fijamos en el porcentaje de inhibición a los 30 minutos, el
porcentaje es el esperado ya que en ambos casos la muestra problema con 400ml de extracto
de alga inhibe en un mayor porcentaje el DPPH aunque no llega a ser el doble que sería lo
esperado. Además vemos que Laminaria tiene mayores porcentajes de inhibición a los 30
minutos.

Fucus Laminaria
Porcentaje de inhibición
70

52,5

35

17,5

0 !8
200µL 400µL
En conclusión vemos que a pesar de que Fucus tiene casi el doble de polifenoles que Laminaria
el porcentaje de inhibición del DPPH a los 30 minutos nos muestra que es Laminaria la que
tiene más actividad antioxidante, es decir que en principio es mejor extraer los polifenoles de
Laminaria pero se deberían hacer estudios más exhaustivos.

Bibliografía:
• Vidal A., Silva de Andrade-Wartha ER., de Oliveirae Silva, AM., Pavan, R., Lima, A.,
Fallarero, A., Batista, AE., Mancini-Filho, J. Actividad antioxidante y polifenoles de las
algas marinas Halimeda opuntia y Halimeda monile. ARS Pharmaceutica, vol 50, nº1;
24-31; 2009.
• Vidal, A., Motldome, M., Mancini-Filho, J., Fallarero, A., Midori, M., Brandao, L., Lapa,
A. Actividad antioxidante y ácidos fenólicos del alga marina Bryothamnion triquetrum (S.
G. Gmelin) Howe. Revista Brasileira de Ciencias Farmaceúticas, vol 37, nº 3, 2001.

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