Evolução de enzimas glicolíticas ​Por MG RosSMAN

Departamento de Ciências Biológicas, Purdue University, West Lajayette, Indiana 47907, EUA
Os requisitos para a glicólise são examinados em relação a outros processos metabólicos essenciais
nos organismos mais primitivos. A construção de enzimas mais complexas a partir de blocos de
construção de domínios primitivos é avaliada em relação às enzimas glicolíticas. É dada especial
atenção à evolução do domínio de ligação a NAD nas desidrogenases e ao domínio de ligação a
nucleótidos frequentemente observado. É feita uma tentativa de diferenciar entre convergência e
divergência de domínios frequentemente observados. Consideração é dada à relação estrutura-função
desses domínios e ao desenvolvimento da estrutura quaternária em fases posteriores da evolução.
Também é dada atenção à evolução da adaptação estrutural aextremos
ambientescomo meio de diferenciar entre funções essenciais e modificações específicas.

INTRODUÇÃO

Três modos para a evolução das enzimas foram sugeridos de tempos em tempos. O primeiro é o
desenvolvimento independente de classes, cada uma catalisando diferentes tipos de reação (por
exemplo, transferência de hidrogênio, transferência de fosfato, isomerização), seguida pela gradual
especialização de enzimas dentro de uma classe. O segundo é o desenvolvimento independente de vias
bioquímicas com todos os membros de uma determinada via relacionados uns com os outros. A
terceira é o desenvolvimento independente de um grupo de classes de enzimas inter-relacionadas pela
necessidade de se ligar um cofator comum ou similar.
Em apoio à primeira dessas hipóteses, Waley (1969) sugeriu que a preservação da conformação da
cadeia polipeptídica é de primordial importância na evolução das enzimas. Ele deriva essa premissa
observando que (1) o processo evolutivo consiste na substituição gradual de aminoácidos na cadeia
polipeptídica, (2) a conformação da cadeia polipeptídica é determinada em grande parte ou
inteiramente pela seqüência, e (3) existem rigorosos requisitos para o dobramento da sequência linear
numa conformação estável compacta. Yeas (1974), em uma linha similar, sugeriu que o mecanismo
para a evolução das vias metabólicas modernas envolvia a especialização de um conjunto menor de
enzimas primordiais que tinha uma especificidade muito mais ampla. Essas idéias são apoiadas pela
sugestão de que o tradução próprio processo deve ter evoluído de algo mais primitivo e menos preciso
(Woese 1967, p. 179). Isso teria necessariamente levado à produção de famílias de proteínas
intimamente relacionadas, que, como um todo, teriam uma especificidade ampla, embora os membros
individuais possam ter sido altamente específicos (Yeas, 1974; Woese, 1965).
A segunda possibilidade foi apoiada por Horowitz (1945). Ele postulou que as vias biossintéticas
evoluíram de maneira inversa, um passo de cada vez, assumindo que o primeiro organismo existia em
um ambiente rico no produto final, assim como os potenciais intermediários de uma determinada via.
Além disso, Horowitz (1965) sugeriu que todas as enzimas envolvidas em uma dada via evoluíram
uma da outra. Waley (1969), embora admita que este é um esquema plausível para a evolução das
vias, se opõe à ideia de que as enzimas de uma dada via têm uma origem comum. A principal
suposição de Horowitz de que todos os intermediários metabólicos estavam no meio ambiente
também foi criticada (Yeas, 1974).
A terceira possibilidade foi considerada por Waley (1969). Watts (1965) apontou que um sexto de
todas as enzimas conhecidas requer ATP. Além disso, várias outras coenzimas são estruturalmente
relacionadas ao ATP. Com base nessas características comuns, Waley (1969) sugeriu que

FIGURE 1. General scheme for the evolution of enzymes according to Waley (1969).

as enzimas correspondentes podem estar relacionadas. Além disso, ele sugere que a fosfoquinase
geral, postulada por Haldane (1965) como a única enzima requerida pelo organismo original para a
produção de polipeptídeos e polinucleotídeos, foi o ancestral dessas classes de enzimas (figura 1).
Essa sugestão é consistente com a ideia de que as enzimas primitivas têm ampla especificidade.
Baltscheffsky (1974) chegou ao mesmo conceito considerando o potencial redox requerido para
derivar processos metabólicos essenciais sob variadas condições da Terra. Assim, ele sugere que
proteínas de ferro e heme não heme, bem como dependentes de flavina e NAD, enzimas podem ter
uma origem comum.
Todas as sugestões acima são consistentes com a visão de que as altamente específicas atuais enzimas
provavelmente evoluíram de formas ancestrais de especificidade muito mais ampla porgenes
duplicação de mutação subsequente. Felizmente, a determinação da estrutura das polipeptídicas
dobras pode, em grande parte, suportar e fornecer detalhes às generalizações acima. No entanto, antes
que o assunto da estrutura possa ser prosseguido, é necessário considerar aspectos da organização dos
polipeptídeos.

DOMÍNIOS COMO BLOCOS DE EDIFÍCIOS EVOLUTIVOS

A hierarquia estrutural implícita nos termos estrutura primária, secundária, terciária e quaternária é
bem conhecida. Similarmente, o termo 'domínio' é muito usado para descrever unidades estruturais
dentro de um polipeptídeo, mas raramente foi claramente definido. De fato, uma definição precisaé
não totalmente possível. No entanto, algumas ou todas as propriedades a seguir podem ser atribuídas a
domínios.

1. Sequências de aminoácidos homólogas podem ser encontradas no polipéptido ou numa

molécula diferente.
2. Estruturas semelhantes (de pelo menos dois elementos estruturais secundários consecutivos) são
encontradas no
mesmo polipeptídeo ou em moléculas diferentes.
3. Os domínios dentro de um polipeptídeo estão espacialmente separados um do outro, e podem,
portanto,
muitas vezes ser enzimaticamente clivados um do outro se houver resíduos adequados disponíveis na
região da 'charneira'
.
4.Uma função especial pode ser associada a estruturas de domínio específicas, como a nucleotídeos
ligação de ou polissacarídeos.
5. O centro ativo de moléculas está na interface entre os domínios.

Nem todas essas propriedades precisam ser aplicadas simultaneamente. Por exemplo, a quimotripsina
tem dois domínios de estrutura similar, mas nenhuma função individual pode ser atribuída a qualquer
um dos domínios, violando assim a condição 4. Houve tentativas de definir domínios usando apenas o
terceiro critério acima (Wetlaufer 1973; Wetlaufer et al. Al. 1976; Crippen 1978). Outras

FIGURA 2. Representação diagramática da topologia da cadeia polipeptídica similar na (a) cadeia J3

da hemoglobina,
(b) citocromo c551 e (c) citocromo b5 • A estrutura comum contém a maior parte da ligação ao heme
ambiente de corresponde ao exon central da globins. De Argos e Rossmann (1979).

(Levitt & Chothia, 1976) atribuíram domínios de maneira bastante intuitiva. Embora nenhuma única
respostas já obtida pela aplicação dos critérios qualitativos acima, eles, no entanto, atingirão
o óbvio intuitivamente.
Blake (1979) sugeriu que a integridade do domínio é preservada por sua codificação dentro de exons,
pelo menos em eucariotos. Isto é suportado, por exemplo, pelo padrão de dobramento helicoidal
comum observado em globina, citocromo c551 e citocromo b5 (figura 2), que tem uma ligação heme
função de (Craik et al. Ig8o) e corresponde ao exon médio do beta cadeia globina (Argos & Rossmann
I979) · Uma vez que os domínios podem, assim, ser o resultado de um desenvolvimento genético
independente, eles também podem representar a base para o dobramento de proteínas. Além disso, a
fusão gênica de uma variedade de exons, correspondendo a domínios com funções simples, dará
origem a umasofisticada enzima(Rossmann & Liljas I974)

DOMÍNIOS EM ENZIMAS GLICOLÍTICAS

Tentativas de classificações taxonômicas de proteínas ainda são primitivas (cf. Levitt e Chothia, 1976;
Sternberg e Thornton, 1977; Richardson, 1977). No entanto, todos eles dependem de um
reconhecimento intuitivo de domínios. A variedade de domínios expressos pelas proteínas glicolíticas
é extremamente limitada (figura 3). De facto, todas as estruturas conhecidas de enzimas glicolíticas
são da classe taxonómica 'beta-alfa-beta' descrita por Levitt & Chothia. Além disso, todos eles contêm
domínios remanescentes da folha plana, de seis filamentos, paralela, de folha plissada, domínio de
ligação a NAD nas desidrogenases (figura 4) ou do 'barril TIM' de oito filamentos.
Uma inspecção inicial da figura 3 pode provocar a noção de que a glicólise evoluiu de um
FIGURA 3. simplificação grosseira da variedade de domínios em estruturas de enzimas glicolíticas
conhecidos. Mostrado também são os
principais pesquisadores de cada enzima. Referências primárias a seus trabalhos não foram incluídas.

FIGURA 4. Desenho esquemático do domínio de ligação a NAD em LDH.

enzima glicolica geral baseada nos domínios muito limitados. No entanto, este conceito quebra
quando se reconhece que numerosas outras enzimas, não envolvidas na glicólise, também têm
domínios semelhantes. Por exemplo, o rhodanês (Ploegman et ai. 1978) também contém dois
domínios ficar dispostos de tal modo que as extremidades carboxi das folhas beta tendem a frente a
frente. Talvez ainda mais significativamente, a malato desidrogenase, uma enzima do ciclo do ácido
cítrico, é muito semelhante à lactato desidrogenase (LDH).
No entanto, algumas generalizações grosseiras podem ser feitas.
1. Existe uma tendência para aquelas enzimas que requerem que os nucleótidos como cofactores
possuam pelo
menos um domínio de folha plissada, paralela e beta. O nucleotídeo liga-se invariavelmente àcarboxi
extremidade desta folha.
2. Há uma tendência para as enzimas que não necessitam de cofatores de nucleotídeos terem
“barris paralelos de oito filamentos”. O substrato fosforilado liga-se invariavelmente à
extremidade carboxi desta estrutura de folha.
3. Existe uma tendência para que as quinases contenham dois "domínios" planares, paralelos, com
camadas plissadas,
com as suas extremidades carboxi voltadas uma para a outra. O substrato tende a se ligar entre os
domínios.
Os resultados de Steitz (Anderson et al. 1979; Pickover et al. 1979) sobre o requisito funcional dosdo
lóbulo
movimentos nas quinases estão claramente relacionados a essas propriedades estruturais.
4. As desidrogenases contêm, invariavelmente, um domínio de folha plissada, paralela e beta, e um
domínio catalítico. A classificação taxonômica deste último pertence invariavelmente à'alfa + beta'
Levitt
classe& Chothia.
Estas observações sugerem que a evolução enzimática procede pelo desenvolvimento independente de
grupos de classes de enzimas, inter-relacionadas pela necessidade de se ligar a um cofator ou substrato
comum. Portanto
, faz pouco sentido considerar a evolução da via glicolítica sozinha.
Em vez disso, seu desenvolvimento deve estar intimamente relacionado com outras funções essenciais
nos primeiros biológicos desenvolvimentos. Como os domínios evoluíram em suas funções, as
enzimas em diferentes vias metabólicas foram derivadas pela fusão casual de genes adequados de
domínios selecionados.

Possível origem dos domínios básicos encontrados em enzimas glicolíticas

Richardson (1976) e Sternberg e Thornton (1976) mostraram que adestro

estrutura de crossover(figura 5) é um tema frequentemente recorrente nas dobras beta-alfa-beta.
Ambos
argumentam a favor disto representando uma dobra super-secundária estável (Rao & Rossmann
1973). A importância das estruturas beta-alfa-beta para a ligação de nucleotídeos foi apontada por
Rossmann et al. (1974) e Ohlsson et al. (1974), mas foi Hol et al. (1978) que sugeriram que esta
estrutura particular pode ter propriedades úteis para a ligação de fosfatos.
A recente publicação de Shoham e Steitz (1980) faz este ponto muito fortemente. Eles descrevem a
ligação do ATP à hexoquinase no domínio catalítico. Suas observações concordam bem com a
previsão de Rossmann & Argos (1977) baseada em uma comparação dada hexoquinase estrutura com
o domínio de ligação de NAD da LDH, particularmente no que diz respeito às Pa e P13
posições(tabela 1). Duas estruturas consecutivas de um cruzamento são, de longe, as repetições mais
comuns em paralelas folhas(Richardson, 1977). Isto tem sido por vezes referido como a ligação de
mononucleótidos dobra de(Rao & Rossmann 1973) como tais dobras ligam-se a AMP e NMN no
domínio ligação de NAD dede LDH (figura 6). Duas dobras de mononucleótidos em conjunto podem
formar um, plano, de seis filamentos, domínio em folha plissadoparalelizado por beta, ou um cano
beta paralelo de oito filamentos (figura 7). Assim, os dois tipos principais de domínio encontrados em
enzimas glicolíticas podem representar diferentes combinações de entidades similares.

CONVERGÊNCIA E DIVERGÊNCIA

A discussão precedente assumiu tacitamente um processo de evolução divergente de uma ou de

algumas enzimas ancestrais usadas para a glicólise e outros processos metabólicos essenciais na
maioria dos casos.
Figura 5:

(a) Uma conexão cruzada destra de ± 2x; (b) uma conexão cruzada de ± 2x com a mão esquerda. A
direção não é indicada para o fio pulado, pois ele pode ser paralelo ou antiparalelo aos outros. De
Richardson (1976).

TABELA 1. DIFERENÇAS DOS VALORES OBSERVADOS E PREVISTOS NA LIGAÇÃO

DO ATP AO DOMÍNIO CATALÍTICO DA HEXOCINASE

procariotos primitivos. A possibilidade de convergência para dobras funcionais e estáveis

também deve ser considerada. Obviamente, a formação de ex-hélices ocorre porque elas são uma
dobra especialmente estável. A ocorrência de ex-hélices em numerosas estruturas proteicas não
implica divergência de alguma proteína ex-helicoidal ancestral. A presença de oito hélices sucessivas
dispostas no espaço como na globina, entretanto, é uma estrutura suficientemente complexa e rara que
sua ocorrência em mais de uma estrutura sugere imediatamente "desenvolvimento de um comum
precursor genético" (Perutz et al., 1960). Como, então, é possível diferenciar entre Convergência e
divergência?
A menos que haja um registro histórico claro, todas essas diferenciações devem depender de
probabilidades.
Seus cálculos são baseados na contagem de caracteres semelhantes e diferentes. Quanto maior o

FIGURA 7. O domínio de ligação a NAD e a subunidade de isomerase de fosfato de triose contêm,

cada um, aproximadamente duas dobras de ligação a mononucleótidos.
TABELA 2. CRITÉRIOS PARA A AVALIAÇÃO DE EQ.UIVALÊNCIAS ESTRUTURAIS
(Os três primeiros exemplos representam padrões bem documentados com relação aos quais
outras comparações podem ser calibradas.)

proporção de caracteres semelhantes dentro do organismo ou molécula total, maior a probabilidade

de uma relação evolutiva divergente. Tais considerações foram usadas por Schulz e Schirmer
(1974) e Sternberg e Thornton (1976) para calcular a probabilidade de convergência de várias
estruturas de ligação de nucleotídeos. Uma abordagem mais abrangente foi tomada por Rossmann
e Argos (1977), que comparam o arranjo espacial de cada aminoácido entre pares de
proteínas. Eles derivam uma variedade de critérios para estimar a similaridade molecular dependente
em parte
do número de resíduos topologicamente equivalentes, o número de resíduos não-alinhaveis e,
portanto, a freqüência e o tamanho das inserções e deleções. Algumas dessas estimativas são
mostradas na
tabela 2. Os padrões de similaridade são dados em termos da comparação entre os alfa. e beta
cadeias de hemoglobina, lisozima de fago e de clara de ovo de galinha, e os domios NAD de
LDH e gliceraldeo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Estes podem ser contrastados com a
comparação entre os dois domínios 'plano, folha pregueada beta' em hexoquinase (HK1,
HK2), entre esses domínios em fosfoglicerato quinase (PGK1, PGK2) e entre cada um
destes domínios e o domínio NAD em LDH. . É aparente que a semelhança da estrutura
entre os domínios de folha plissados ​paralelos, planos e paralelos em pelo menos algumas das enzimas
glicolíticas é da
mesma ordem que entre as duas lisozimas diferentes. Análises semelhantes entre triose
fosfato isomerase e piruvato quinase foram realizadas por Levine et al. (Eu 978). Uma
análise detalhada de todas as semelhanças e diferenças sugeridas pela figura 3 ainda não foi
realizada.

TABELA 3. MUDANÇA DE BASE MÍNIMA POR CÓDON (mbcc) PARAESTRUTURALMENTE

EQUIVALENTES
RESÍDUOS
(Os resíduos que se sobrepõem com maior precisão são também aqueles resíduos com maior
similaridade de aminoácidos.)
A semelhança de dobra entre enzimas glicolíticas é muito maior do que a homologia da sequência de
aminoácidos Isso pode ser interpretado como uma perda de memória da sequência original, mantendo
a dobra aproximada, durante a evolução divergente, ou a falta de requisitos de sequência semelhantes
para a evolução convergente. Sempre que alguma semelhança de similaridade de aminoácidos pode
ser reconhecida então estes podem agir como personagens para determinar a similaridade. É instrutivo
que em alguns casos (tabela 3) a mudança mínima de base por codon (mbcc) está bem abaixo do
aleatório (aleatório é aproximadamente 1 .4 mbcc) para aqueles resíduos que possuem aestrutural mais
precisa equivalência. Assim, a estrutura pode ser utilizada para alinhamento para identificar
segmentos polipeptídicos que possam ter homologia de sequência.

OS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO NAD EM DESIDROGENASES

Os domínios de ligação de NAD nas desidrogenases são estruturas suficientemente semelhantes em

topologia, em função e na sequência de aminoácidos, de modo que uma história evolutiva divergente é
moderadamente provável. Estas estruturas, portanto, representam uma oportunidade para estudar
relações divergentes para enzimas de função semelhante, mas que se estendem além das exigências da
glicólise sozinha.
A Figura 8 mostra, por exemplo, os resultados dos alinhamentos das sequências de aminoácidos para
os secundários elementos estrutura é beta-A e alfa-B. Também são apresentados os alinhamentos de
outras estruturas beta-alfa-beta. É imediatamente claro que a glicina na primeira posição de otB é
universalmente conservada. Deve-se concluir que esta é uma necessidade de dobrar e pode, portanto,
ser o resultado da evolução convergente. No entanto, a conservação de outros aminoácidos entre os
domínios de ligação a NAD está significativamente abaixo do aleatório e abaixo de outras estruturas
desse tipo (tabela 3). Quatro resíduos explicitamente conservados nos domínios de ligação de NAD
conhecidos, como uma exigência de dobragem ou de função (tabela 4). A função do Asp (por
exemplo, resíduo LDH 53) que liga o O-2 '
 TABELA 4. RESÍDUOS INVARIANTES NOS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO NAD DE
ALCOOLIDALOGENASE DE LDH, GAPDH E FÍGADO (LADH)

da adenina ribose em NAD é de particular interesse. Um resíduo numa posição estruturalmente (mas
não topologicamente) equivalente da di-hidrofolato redutase é uma arginina em que 0-2 ' é substituído
por um fosfato, proporcionando assim especificidade para NADP (Matthews et al. 1978).

EVOLUÇÃO RECENTE

A comparação de aminoácidos em vez de dobrar dá orientação a eventos evolutivos recentes,,

digamos durante os últimos 109 anos, para a aceitação bastante lenta de eventos mutacionais em
glicolíticas enzimas. A estrutura tridimensional é uma medida útil apenas para eventos mais antigos,
em que as sequências de aminoácidos não mostram correlação significativa, mas onde a topologia de
polipeptídeo ainda pode ser reconhecivelmente semelhante. Por outro lado, há pouca alteração
estrutural durante relativamente períodos de tempo curtos, enquanto as diferenças de aminoácidos
podem fornecer uma medida sensível de eventos evolutivos.
A formação de oligômeros deve depender da forma superficial e das cargas de seus componentes
monômeros. Por isso, a estrutura quaternária relaciona-se com dobras terciárias específicas. Os
agregados vistos hoje devem necessariamente ter sucesso na evolução das partes componentes. Uma
análise da aminoácidos conservação depara GAPDH tetramérica é mostrada na tabela 5, onde será
visto que o maior grau de conservação ocorre para os resíduos no centro ativo. Os resíduos nas
superfícies de contato subunidade são menos conservados que os resíduos centrais ativos, porém mais
que a média da molécula completa. Resultados semelhantes são encontrados para LDH tetramérica
(Even toff et al.
1977)

TABELA 5 ANÁLISE DA CONSERVAÇÃO DE RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS EM

TETRAMÉRICO

As mudanças de sequência mais rápidas ocorrem como resultado de pressão seletiva para alterar a
pressão ambiental no organismo. Ambientes extremos, como alta concentração de sal ou temperaturas
anormalmente baixas ou quentes, podem fornecer algumas informações sobre a natureza de tais
mudanças. Mais uma vez, o trabalho com algumas enzimas glicolíticas, em particular a LDH e a
GAPDH, nos deu a maior quantidade de informações disponíveis sobre esses tópicos. Uma análise de
várias destas sequências (Argos et ai., 979) para enzimas termicamente estáveis ​mostra a preferência
de certos aminoácidos sobre outros (figura 9). Estes podem estar relacionados com várias
propriedades físicas da proteína (tabela 6), tais como a estabilização de estruturas de hélice,
aumentando a hidrofobicidade interna e melhorando a organização interna de resíduos de embalagem.

CONCLUSÕES

Um estudo das enzimas na via glicolítica forneceu informações não apenas sobre as restrições
mecânicas impostas a cada enzima por sua estrutura, mas também sobre a evolução dessas enzimas. É
claro que não havia uma enzima glicolítica geral primordial, nem uma série de quinases específicas
primordiais, mutases, etc. A evolução é dependente do uso de domínios com funções simples a partir
dos quais são construídas as enzimas em muitos processos metabólicos.
Se tais domínios são o resultado da convergência em direção a estruturas estáveis ​de função simples
ou a divergência de alguns domínios básicos antigos devem ser investigados à medida que mais dados
se tornam disponíveis. A evolução subsequente de enzimas formadas é controlada por requisitos como
agregação oligomérica e condições ambientais.

FIGURA 9. Direção das trocas preferidas observadas. As setas apontam da proteína mesofílica para a
termofílica. Os números indicam a classificação do significado para a troca dada. De Argos et al.
(1979).

TABELA 6. BENEFÍCIO DE DETERMINADAS TROCAS DE AMINOÁCIDOS A DIVERSAS

PROPRIEDADES FÍSICAS NA ESTABILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

Sou grato à minha assistente, Sharon Wilder, por sua diligente ajuda na preparação deste
manuscrito, aos organizadores desta Reunião de Discussão por seu convite para apresentar este
artigo, e aos Institutos Nacionais de Saúde (conceder nº GM 10704). e a National Science
Foundation (concessão nº PCM78-16584) para apoio financeiro.