Cuantificación del contenido de azúcares reductores

XIII Congreso de Fitomejoramiento:

Contribuyendo al sostenimiento de la vida a través del fitomejoramiento
6 - 8 de noviembre, Corpoica, Tibaitatá – Mosquera, Cundinamarca

Cuantificación del contenido de azúcares

reductores y no reductores y su asociación genética con marcadores
SNPs en Solanum tuberosum grupo Phureja
(Resultados preliminares)

Diana Duarte-Delgado, Luz Patricia Restrepo, Ajjamada Kushalappa y Teresa Mosquera

 Introducción

Incremento en la Cambios en los hábitos

demanda de alimentos de consumo a nivel
procesados (FAO, 2009) mundial (FAO, 2009)

Oportunidad: Papa criolla

(Solanum tuberosum grupo Phureja)

Incrementar valor
agregado

Contribuir a la seguridad
alimentaria en
comunidades vulnerables
Cultivar de papa criolla para Problema: contenido
procesamiento en hojuela: de azúcares reductores
necesita desarrollo

Werij et al., 2012

Contenido de azúcares reductores

 Reacción de Maillard

Reductores No reductores

amino acid
Degradación del almidón en células de almacenamiento

Nader, 2011
Cultivar de papa criolla para Problema: contenido
procesamiento en hojuela: de azúcares reductores
necesita desarrollo

Werij et al., 2012

Contenido de azúcares reductores

Calidad de procesamiento en hojuela: rasgo

complejo
 Basic science Application

Genome structure The molecular basis of Precision breeding

and evolution complex traits
Diagnostic markers
Association studies for population-based
MAS

Biodiversity, Engineering
haplotypes agronomic traits
Genomic *omics
sequencing
Candidate genes R-gene cloning

Function maps for

Markers for
Comparative maps pathogen resistance
introgression
and tuber traits
breeding

Molecular maps Ch. Gebhardt

MPIZ
Mapeo por asociación

Phenotypic
trait

Balding, 2006
Cuello de botella…
 Pregunta de investigación
¿Cuáles regiones del genoma de papa se asocian al contenido de
azúcares reductores y no reductores en una población natural de
Solanum tuberosum grupo Phureja, al emplear marcadores SNPs
distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes
candidatos?
 Objetivo General
Explorar la variación alélica de Solanum
tuberosum grupo Phureja y su
asociación genética con contenidos de
azúcares reductores y no reductores
 Objetivos específicos

1.Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares

reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la
técnica de HPLC.

2.Caracterizar fenotípicamente la Colección Central Colombiana

(CCC) de grupo Phureja y otros genotipos por su contenido de
azúcares.

3.Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores

y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente
por el genoma y en regiones de genes candidatos.
 Materiales y métodos
Ajustes para el análisis
del contenido de
azúcares

• Agua
• Doble tratamiento con MeOH Métodos de extracción de
• MeOH con carbón activado azúcares
• MeOH con reflujo

Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex

 
Detector: Índice de refracción Shodex Condiciones cromatográficas
Columna: Aminex HPX 87H 300   mm x 7.8 mm
Fase movil: Ácido sulfúrico 10 mM

4 Cultivares comerciales
Aproximación GWAS:
Metodología GBS Caracterización
Mapeo por fenotípica del 8 accessiones IPK
contenido de German Germplasm Bank
Asociación
10 genes candidatos: azúcares :
Diseño y amplificación de Latice rectangular triple
110 accessiones Colección
primers
Central Colombiana (CCC)
Identificación de SNPs
 Materiales y métodos
Ajustes para el análisis
del contenido de
azúcares

• Agua
• Doble tratamiento con MeOH Métodos de extracción de
• MeOH con carbón activado azúcares
• MeOH con reflujo

Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex

 
Detector: Índice de refracción Shodex Condiciones cromatográficas
Columna: Aminex HPX 87H 300   mm x 7.8 mm
Fase móvil: Ácido sulfúrico 10 mM

4 Cultivares comerciales
Aproximación GWAS:
Metodología GBS Caracterización
Mapeo por fenotípica del 8 accessiones IPK
contenido de German Germplasm Bank
Asociación
azúcares :
10 genes candidatos:
Diseño y amplificación Latice rectangular triple
110 accessiones Colección
de Primers Central Colombiana (CCC)
Identificación de SNPs
 Resultados
Objetivo específico 1
Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no
reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC.

•  Condiciones cromatográficas:

Condiciones cromatográficas  

Temperatura de la columna   18°C  

Temperatura del detector   35°C  
Fase móvil   Ácido sulfúrico 10mM  
Fase de almacenamiento   Ácido sulfúrico 5mM  
Fase de limpieza   Acetonitrilo 2,5% en ácido sulfúrico 5mM  
Flujo   0,3ml/min  
Volumen de inyección   20 µl  
Tiempo por muestra   35 min  
•  Selección de la metodología para extracción de azúcares: Análisis
de un DCA y pruebas de Tukey

Concentración promedio
Método  
sacarosa (ppm)  

Agua (Cunningham et al., 1988)   2566,22 a  

Doble tratamiento con MeOH (Karkacier et al., 2003)   4925,64 c  
MeOH con carbón activado (Marangoni et al., 1997)   3479,68 ab  
MeOH con reflujo (Arevalo & Sastoque, 1999)   4322,76 b  
•  Validación del método de cuantificación

Límite de Límite de
% de Recuperación
detección (ppm) cuantificación (ppm)
Glucosa 4 5 111.47
Fructosa 2 3 103.10
Sacarosa 2 2 96.13

  Reproducibilidad   Repetibilidad   Linealidad  

  Promedio (ppm)  CV (%)  Promedio (ppm)   CV (%)   Promedio R²   SD  
Glucosa 40.08   1.21   52.06   4.61   0.9998   0.00015  
Fructosa 40.42   0.83   41.33   3.67   0.9997   0.00021  
Sacarosa 40.41   0.72   40.49   4.44   0.9997   0.00016  
 Cromatogramas de patrones y de tubérculo crudo

a. b.

a. Cromatograma de patrones en mezcla b. Cromatograma de Col 102

 Cromatogramas para azúcares en tubérculo crudo

a. b.

Cromatogramas de genotipos contrastantes a. Col 52 b. IPK-170031

Objetivo específico 3

Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no

reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma
y en regiones de genes candidatos.

Genes candidatos seleccionados para diseño de primers

Gen Candidato Función Cromosoma

InvGE Apoplastic invertase IX
Pain-1 Vacuolar acid invertase III
Stp23 Plastidic starch phosphorylase III
StpL Plastidic starch phosphorylase V
AGPaseS-a ADP-glucose pyrophosphorylase I
SssI Soluble starch synthase III
GWD Glucan-water dikinase V
UGPase UDP-glucose pyrophosphorylase XI
Sps Sucrose phosphate synthase VII
G6pdh Glucose-6-phosphate dehydrogenase II
Degradación del almidón en células de almacenamiento

Nader, 2011
 Conclusiones y perspectivas
•  Se ha ajustado una metodología cromatográfica precisa,
reproducible y repetible para la cuantificación de azúcares en
tubérculos de grupo Phureja.

•  Los resultados obtenidos revelan variabilidad en el contenido de

azúcares de genotipos de grupo Phureja.

•  Una vez se cuenten con los datos fenotípicos completos, el análisis

de asociación será llevado a cabo a partir de SNPs con el propósito
de identificar regiones genómicas con influencia en la calidad de
fritura, en este importante grupo de papas cultivadas para
Colombia.
 Seguridad Alimentaria y Nutrición
El  mejoramiento  de  la  producción  de  papa  como  contribución  a  la  seguridad    
alimentaria  en  comunidades  nativas  en  Colombia  

Agradecimientos

Contrato de acceso al recurso genético RGE0069

Grupo: Genética de rasgos de interés agronómico

Proyecto desarrollado con el apoyo financiero del International Development Research Centre (IDRC), www.idrc.ca, y el Gobierno de Canadá, a través del Department of
Foreign Affairs, Trade and Development Canada (DFATD), Canada, www.international.gc.ca
¡Gracias por su atención!