UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
ENZIMOLOGÍA

INFORME DE LABORATORIO #4

RODRIGO ÁVALOS

ACUÑA MARÍA JOSE

SANMARTÍN KERLY
TROYA LORENA
VITERI VELA ANDREA

NRC 3292

5 DE ENERO DEL 2017

1. Tema: Efecto del pH sobre la actividad enzimática de la ureasa

 2. Objetivos:
General:
● Evaluar el efecto del pH sobre la actividad enzimática de la ureasa.
Específicos:
● Calcular del rango de pH en el que el enzima es activo y su valor de pH óptimo.
● Determinar las velocidades de reacción en cada uno de los pH.

3. Introducción.

El pH, se define claramente como la medida de la naturaleza ácida o alcalina de una solución.
Para ser más precisos, el pH indica la concentración de los iones de hidrógeno disueltos (H+)
en una solución en particular. Un aumento o una disminución en el pH, cambia la
concentración de los iones en la solución. Estos iones alteran la estructura de las enzimas, y a
veces, del sustrato, ya sea debido a la formación de los enlaces adicionales o la rotura de los
enlaces ya existentes (Veana, Aguilar, & Rodriguez, Invertasa del genero aspergillus y su
impacto biotecnológico, 2011).

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;
imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos
grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las
proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación
será la más adecuada para la actividad catalítica, este es el llamado pH óptimo. La mayoría de
los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por
encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad (Veana,
Aguilar, & Rodriguez, Invertasa del genero aspergillus y su impacto biotecnológico, 2011).

En la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas, sus velocidades dependen del pH de
la solución donde se origina, es decir cada enzima tienen una máxima actividad a un
determinado pH, como se puede ver en la figura 1, que en el caso de que disminuye será
porque su solución se torna más ácida o más básica que su pH óptimo, (Sadava, Heller, &
Otros, 2009). La mayoría de proteínas sólo es activa dentro de un estrecho rango de pH, que
comúnmente es de 5 a 9, esto es consecuencia de los efectos del pH sobre una combinación
de factores como la unión del sustrato a la enzima, la actividad catalítica de la enzima, la
ionización del sustrato o también la variación de la estructura proteica (Voet & Voet, 2006).
 Figura 1. pH incide en la actividad de las enzimas

Obtenido de: La ciencia de la Biología (2009)

En lo que respecta a la ionización de los grupos carboxilos, amino y otros del sustrato
o de la enzima; en el caso de soluciones básicas o neutras, los grupo carboxilo liberan 𝐻+ ,
convirtiéndose en grupos carboxilato de carga negativa, asi mismo los grupos amino aceptan
𝐻+ en soluciones neutras o ácidas, de manera que se convierten en grupos con carga positiva
(Sadava, Heller, & Otros, 2009).

La ureasa es aquella enzima que cataliza la hidrólisis de la urea a dióxido de carbono

y amoniaco, esta se la puede encontrar principalmente en semillas, microorganismos e
invertebrados (Lorenc, 2010). En las plantas, la ureasa es un hexámero –consiste en seis
cadenas idénticas- y se encuentra en el citoplasma. En bacteria, consiste en dos o tres
subunidades diferentes (Ainsworth, 2008). Para su activación, la ureasa necesita unir dos
iones de níquel por subunidad. El pH óptimo de la ureasa es ±6,5 (Primo, 2007).

4. Procedimiento.
- Se rotuló 10 tubos de ensayo de la siguiente manera: 1, 1B, 2, 2B, 3, 3B, 4, 4B, 5, 5B,

6, 6B.

- Se virtió 2,5 mL del sustrato (urea 0,25 M) en cada uno de los tubos.
 - A los tubos se los añade 3,5 mL de las soluciones con los siguientes pH: pH 4,5 en los

tubos 1 y 1B; pH 5 en los tubos 2 y 2B; pH 6 en los tubos 3 y 3B; pH 7,2 en los tubos

4 y 4B; pH 8,5 en los tubos 5 y 5B; pH 10 en los tubos 6 y 6B.

- Posteriormente, se agregaron 5 gotas de HgHCl al contenido de cada blanco (Los

tubos etiquetados con la letra B).

- Se mezcló adecuadamente y se colocó a los tubos a baño María a 50°C durante 5

minutos.

- A continuación se añadió 0,3 mL de la solución enzimática de ureasa a todos los

tubos, enseguida se colocó los tubos a baño María nuevamente a 50°C durante 30

minutos aproximadamente.

- Posteriormente, se agregaron 5 gotas de HgHCl a los tubos en los que ocurre la

reacción (los tubos que no tienen la letra B).

- Se rotuló 10 erlenmeyers de 50 mL de la siguiente manera: 1, 1B, 2, 2B, 3, 3B, 4, 4B,

5, 5B, 6, 6B.

- Se midieron 4mL de la solución de cada tubo y se los colocó en el erlenmeyer

correspondiente.

- A continuación se añadió 10 gotas de la solución indicadora a cada erlenmeyer, luego

se llenó la bureta con HCl 0,1 M.

- Finalmente se titularon todas las soluciones de los erlenmeyers.

5. Resultados.
a. Volumen de NaOH consumidos por las soluciones con diferentes pH

Tabla 1. Datos obtenidos de la cantidad de NaOH consumidos por las soluciones con
diferentes pH
 Número de mL NaOH mL NaOH mL NaOH reales
Tubo de pH (Solución (Solución (Reaccionar con
Ensayo Blanco) Reacción) NH2OH)

1 4,5 2,6 2,3 0,3

2 5,0 4,2 3,4 0,8

3 6,0 2,2 2 0,2

b. Volumen de HCl consumidos por las soluciones con diferentes pH

Tabla 2. Datos obtenidos de la cantidad de HCl consumidos por las soluciones con
diferentes pH

Número de mL HCl mL HCl mL HCl reales

Tubo de pH (Solución (Solución (Reaccionar con
Ensayo Blanco) Reacción) NH2OH)

4 7,2 1 11,8 -10,8

5 8,5 12,9 8,8 4.1

6 10,0 13,6 11,9 1.7

c. Velocidades de la reacción de Hidrólisis a diferentes pH

 Velocidaddereacción=ΔVolumen(mL)*[Urea(mL)]/2*Volumendesolución a
titular(mL)*tiempo (min)

Tabla 3. Velocidad de reacción

pH Velocidad de reacción
(mmol de urea hidrolizado/min/mL)

4,5 3,13*10−4

5,0 8,33*10−4

6,0 2,08*10−4

7,2 -0,01

8,5 4,27*10−3

10,0 1,77*10−3

Elaborado por Acuña María José (2017)

6. Discusión.
Según Cifuentes (2001), el pH óptimo de la ureasa es neutro, mientras que los pHs ácidos o
alcalinos disminuyen la actividad enzimática. Basándose en los resultados de la tabla 3. se
pudo comprobar que en pH ácidos la velocidad de reacción fue menor que en pHs básico mas
a ph de 7.2 el cual es casi un pH neutro se obtuvo un dato atípico.

Almanza (2009), argumenta que los metales pesados como el plomo, cobre mercurio o zinc
pueden inhibir la actividad enzimática debido a la reacción con residuos de aminoácidos
como la cisteína. Estos metales pueden surgir de los tejidos vegetales utilizados para la
extracción, del material de vidrio sucio, del agua destilada o de los reactivos químicos
empleados y en nuestro ensayo el HgCl2 tuvo un efecto inhibitorio sobre la actividad de la
ureasa.

7. Conclusiones.
8. Bibliografía.
Ainsworth, C. (2008). Locking the cradle. Science in School .
Almanza, P., (2009). Aplicación foliar de niquel Aplicación foliar de níquel en
Cucurbita ficifolia Bouché para producción de ureasa. Tunja. Obtenido de:
https://revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/view/11328
Cifuentes,B., (2001). Efectos de pH y la temperatura sobre la inactivación de ureasa
por ácido L-usnico. Facultad de Biología Universidad Complutense. Madrid.
Obtenido de:
www.rjb.csic.es/jardinbotanico/ficheros/documentos/.../Anales_35(1)_353_3
59.pdf
Lorenc, A. (09 de 02 de 2010). La investigación de la acción de la ureasa. Obtenido
de Science in School: http://www.scienceinschool.org/es/2008/issue9/urease
Primo, E. (2007). Actividad Enzimática. En E. Primo, Química Orgánica Básica y
Aplicada (pág. 1020). Valencia: REVERTE.
Sadava, Heller, & Otros. (2009). La ciencia de la Biología . Buenos Aires:
panamericana.
Voet, D., & Voet, J. (2006). Efectos del pH. En D. Voet, & J. Voet, Bioquímica
(págs. 502-503). Buenos Aires: panamericana.
Veana, F., Aguilar, N., & Rodriguez, R. (2011). Invertasa del genero aspergillus y su
impacto biotecnologico.