A.

ESPECTROFOTOMETRÍA
La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una
sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de
la solución muestra, basándose en la Ley de Beer-Lambert. Esta medición también puede
usarse para medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia.
En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona
del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en
este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un
haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como
función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles
e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia
química.
La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro
electromagnético, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm,
por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible
del espectro.
A. LEYES FUNDAMENTALES

El método espectrofotométrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de Lambert y Ley de
Beer.

1.- Ley de Lambert:

Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo, la
disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio, lo
que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida disminuye exponencialmente al
aumentar aritméticamente el espesor del medio absorbente (Fig. 2):

La siguiente relación matemática da cuenta de esta ley: P / Po= e –kb

Po: Intensidad de la luz incidente
P: Intensidad de la luz transmitida
b: Espesor del medio absorbente
k: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la
luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza del medio.

2.- Ley de Beer:

La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al aumentar

aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a través de
un medio homogéneo (Fig. 3).

La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuació:

P / Po = e -k’c
Donde:
Po: Intensidad de la luz incidente
P: Intensidad de la luz transmitida
c: Concentración de la solución
k,:Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la
luz incidente, de la concentración de la solución, y frecuentemente, de la naturaleza del
medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

log Po / P = a b c ó A=abc
A = log Po / P = - log T
Donde :
a: Absortividad
b: Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentración de la solución
P/Po= T: Transmitancia

B. ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA

Los términos absorbancia y transmitancia son definidos a continuación

TRANSMITANCIA (T): Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una
muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente como
la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

T = P / Po = 10-abc ó %T = 100 P / Po

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida por la muestra y

la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar puede ser el líquido (solvente) en
que esta disuelta la muestra, aire, blanco analítico (solución que contiene todos los
componentes de la solución problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida
arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de este estándar no es necesariamente 100%, es
necesario especificar el estándar con el cual la muestra es comparada.
ABSORBANCIA(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una
sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la
transmitancia.T, transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia expresada
como porcentaje.

A=-logT=2-log%T

Pero: T=P/Po=10-abc

Luego: A=-logP/Po=-log10-abc

A=abc

Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la concentración, donde a es
una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las
unidades de b y c. Si la concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la
cubeta b en centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar (𝛏). Luego
𝐴 = 𝜉𝑏𝑐

Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la muestra
problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la referencia debe poseer un porcentaje
de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.
C. SELECCIÓN DE LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en la cual la
absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y recibe la denominación de Lambda
máximo (λmax). Para seleccionar el λmax., se hace un espectro de absorción o curva espectral,
y que consiste en una gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de
concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el λmax.
(Fig.4).

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera que
absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan
en la zona visible del espectro electromagnético (380 a 800nm). En el caso de sustancias no
coloreadas, las mediciones se realizan en la región ultravioleta del espectro electromagnético
(200 a 380nm).
D. CURVA DE CALIBRACIÓN
Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una muestra problema,
es el método de la curva de calibración. Esta curva de calibración es una gráfica que relaciona
la concentración de al menos cinco soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con
la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (𝜆𝑚á𝑥 ) (Fig. 5).

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta dicha recta a
través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos cuadrados, la cual relaciona la
absorbancia y la concentración de un analito. La siguiente ecuación matemática corresponde
a dicha función:
𝐴 = 𝑚𝑐 + 𝑛 …. (Ecuación 1)
Donde:
 A: Absorbancia
 n: Intercepto de la recta
 m: Pendiente de la recta y que corresponde entre absortividad a de la muestra y el
espesor b de la cubeta.
Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor en la gráfica o se
reemplaza en la ecuación (1), para obtener el valor de concentración del analito. La
concentración de la solución problema debe estar comprendida en el rango de concentración
que comprende la curva de calibración. Si la concentración de la solución problema es menor
que la concentración del estándar más diluido, debe usarse el método de adición estándar, que
consiste en adicionar un volumen determinado de un estándar concentrado a la solución
problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las obtenidas
para la curva de calibración. En el caso contrario, si la concentración del analito es mayor que
la concentración del estándar más concentrado la solución problema deberá ser diluida.
Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima absorbancia
(λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener mayor sensibilidad y
precisión al hacer las mediciones.
La medición de la absorbancia de la solución problema debe hacerse a la misma longitud de
onda que fue hecha la curva de calibración.

PARTE EXPERIMENTAL
 Se tiene 100 ml de solución de KMnO4 66mg/L.
 En base a esta solución patrón prepararemos 1/5, 2/5, 3/5, 4/5 de la concentración patrón
en un volumen de 25mL.

 Debido que la longitud de onda se mantiene constante a diferentes concentraciones,

tomamos como dato la longitud de onda óptima que se halló en la primera práctica: 520
nm.
 Vertemos una solución en la celdilla unidad para que sea medida, previamente calibrada
y así respectivamente para todas.
 Tomar como dato la absorbancia y el porcentaje de transmitancia a la concentraciones
indicadas en el segundo punto
  Con esta curva determinaremos la concentración de las soluciones problema que nos
brindaran bajo los nombres Ax, Bx y Cx.

DATOS EXPERIMENTALES
𝝀𝒎á𝒙 = 𝟓𝟐𝟎 𝒏𝒎
C(ppm) A
13.2 0.543
26.4 1.135
39.6 1.68
52.8 2.224

𝝀𝒎á𝒙 = 𝟓𝟐𝟎 𝒏𝒎
C(ppm) A
Ax 0.675
Bx 2.336
Cx 1.710

TRATAMIENTO DE DATOS
1. Hallar el volumen que se debe añadir a la solución patrón 66mg/L para obtener 1/5, 2/5, 3/5,
4/5 de la concentración patrón en un volumen de 25mL.
a. C1=1/5(66mg/L)=13.2mg/L
13.2𝑚𝑔/𝐿
𝐶1 = = 8.35𝑥10−5 𝑚𝑜𝑙/𝐿
158.04𝑥103 𝑚𝑔/𝑚𝑜𝑙
 𝐶1 𝑉1 = 𝐶𝑎 𝑉𝑎
13.2𝑚𝑔/𝐿𝑥25𝑚𝐿 = 66𝑚𝑔/𝐿𝑥𝑉𝑎
𝑉𝑎 = 5𝑚𝐿
b. C2=2/5(66mg/L)=26.4mg/L
26.4𝑚𝑔/𝐿
𝐶2 = = 1.67𝑥10−4 𝑚𝑜𝑙/𝐿
158.04𝑥103 𝑚𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝐶2 𝑉2 = 𝐶𝑏 𝑉𝑏
26.4𝑚𝑔/𝐿𝑥25𝑚𝐿 = 66𝑚𝑔/𝐿𝑥𝑉𝑏
𝑉𝑏 = 10𝑚𝐿
c. C3=3/5(66mg/L)=39.6mg/L
39.6𝑚𝑔/𝐿
𝐶3 = = 2.51𝑥10−4 𝑚𝑜𝑙/𝐿
158.04𝑥103 𝑚𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝐶3 𝑉3 = 𝐶𝑐 𝑉𝑐
39.6𝑚𝑔/𝐿𝑥25𝑚𝐿 = 66𝑚𝑔/𝐿𝑥𝑉𝑐
𝑉𝑐 = 15𝑚𝐿
d. C4=4/5(66mg/L)=52.8mg/L
52.8𝑚𝑔/𝐿
𝐶4 = 3
= 3.34𝑥10−4 𝑚𝑜𝑙/𝐿
158.04𝑥10 𝑚𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝐶4 𝑉4 = 𝐶𝑑 𝑉𝑑
52.8𝑚𝑔/𝐿𝑥25𝑚𝐿 = 66𝑚𝑔/𝐿𝑥𝑉𝑑
𝑉𝑑 = 20𝑚𝐿
2. A partir de los datos de la siguiente tabla obtenemos el siguiente gráfico:

C(mM) A
0.0835 0.543
C(mM) VS. A
0.167 1.135 2.5

0.251 1.68
2
0.334 2.224
1.5
A

0.5

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
C(mM)
Por Regresión lineal obtenemos la siguiente ecuación lineal:
1
𝐴 = 6.6883 𝑚𝑀 𝐶 − 0.0015 …. (ec. i)

Se sabe que:
𝐴 = 𝜉. 𝑏. 𝐶 … (ec. ii)
Hallar el valor de 𝝃; si b=1cm, relacionando la ec. i y ii.
6.6883 = 𝜉. 𝑏
6.6883𝑐𝑚−1 . 𝑚𝑀−1 = 𝜉
Otra forma de hallar el valor de 𝝃
𝑨
𝝃=
𝒃. 𝑪
𝟎. 𝟓𝟒𝟑
𝝃𝟏 = = 𝟔. 𝟓𝟎𝟑
𝟏𝒄𝒎. 𝟎. 𝟎𝟖𝟑𝟓𝒎𝑴
𝟏. 𝟏𝟑𝟓
𝝃𝟐 = = 𝟔. 𝟕𝟗𝟔
𝟏𝒄𝒎. 𝟎. 𝟏𝟔𝟕𝒎𝑴
𝟏. 𝟔𝟖
𝝃𝟑 = = 𝟔. 𝟔𝟗𝟑
𝟏𝒄𝒎. 𝟎. 𝟐𝟓𝟏𝒎𝑴
𝟐. 𝟐𝟐𝟒
𝝃𝟒 = = 𝟔. 𝟔𝟓𝟗
𝟏𝒄𝒎. 𝟎. 𝟑𝟑𝟒𝒎𝑴
𝝃𝟏 + 𝝃𝟐 + 𝝃𝟑 + 𝝃𝟒
𝝃̅ =
𝟒
𝝃̅ = 𝟔. 𝟔𝟔𝟐𝟖𝒄𝒎−𝟏 . 𝒎𝑴−𝟏
3. A partir de la ec. i podemos hallar el valor de la concentración Ax, Bx y Cx.,teniendo en
cuenta la siguiente tabla:

𝝀𝒎á𝒙 = 𝟓𝟐𝟎 𝒏𝒎
C(mM) A
Ax 0.675
Bx 2.336
Cx 1.710

a. Hallando la concentración de Ax:

𝐴 = 6.6883𝐶𝐴 − 0.0015
0.675 + 0.0015
𝐶𝐴 =
6.6883
𝐶𝐴 = 0.101𝑚𝑀
 b. Hallando la concentración de Bx:
𝐴 = 6.6883𝐶𝐵 − 0.0015
2.336 + 0.0015
𝐶𝐵 =
6.6883
𝐶𝐵 = 0.349𝑚𝑀

c. Hallando la concentración de Cx:

𝐴 = 6.6883𝐶𝐶 − 0.0015
1.710 + 0.0015
𝐶𝐶 =
6.6883
𝐶𝐶 = 0.256𝑚𝑀

4. Hallar la concentración de Ax, Bx y Cx a partir de la siguiente ecuación:

𝐶𝑆𝑇𝐴𝑁𝐷
𝐶 = 𝐴𝑃𝑅𝑂𝐵 𝑥
𝐴𝑆𝑇𝐴𝑁𝐷

ANEXOS
PROBLEMAS:
1. Estándares de Cobre, dando cumplimiento a Lambert – Beer.

C(mg/L) 0.04 0.10 0.16 0.20 0.40 0.80 1.20

%T 96 90.6 84.7 81.4 66.1 47.3 35.8

Si la muestra presenta %T= 62.5; Determinar mg/L de Cu+2 en la muestra.

A=-log%T, entonces:

A1=-log0.96=0.017728767
 C(mg/L) A
0.04 0.017728767
0.1 0.042871802
0.16 0.07211659
0.2 0.089375595
0.4 0.179798541
0.8 0.325138859
1.2 0.446116973

C(mg/L) VS. A
0.5
0.45 y = 0.3726x + 0.0132
0.4
0.35
0.3
0.25
A

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
C(mg/L)

Por regresión lineal la ecuación sería:

𝐿
𝐴 = 0.3726 𝑚𝑔 𝐶 + 0.0132 …. (ec.1)

Hallar la concentración (mg/L), Cuando el %T=62.5,

A=-log0.625=0.2041199

A partir de la ec. 1 hallamos la concentración:

𝐴 − 0.0132
𝐶= 𝑚𝑔/𝐿
0.3726
0.2041199 − 0.0132
𝐶= 𝑚𝑔/𝐿
0.3726

𝐶 = 0.5124𝑚𝑔/𝐿

2. De la siguiente tabla. Determinar la concentración (M) de la muestra de Fe+2 en agua

residual, teniendo en cuenta:
a. %T=20.4
b. %T=52.5
Completamos la tabla, hallando el valor de A, con la siguiente ecuación: A=-log%T.

C(M) %T A
2 62.4 0.20481541
4 39.8 0.40011693
6 26.0 0.58502665
8 17.6 0.75448733
10 12.3 0.91009489

C(M) VS. A
1
0.9 y = 0.0882x + 0.0414
0.8
0.7
0.6
0.5
A

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
C(M)

Por regresión lineal obtenemos la siguiente ecuación:

𝐴 = 0.0882𝑀−1 𝐶 + 0.0414 …. (ec.2)

a) Hallar la concentración (mg/L), Cuando el %T=20.4,

A=-log0.204=0.69037

A partir de la ec. 2 hallamos la concentración:

𝐴 − 0.0414
𝐶= 𝑀
0.0882

0.69037 − 0.0414
𝐶= 𝑀
0.0882

𝐶 = 7.3579𝑀

b) Hallar la concentración (mg/L), Cuando el %T=52.5,

A=-log0.525=0.27984

A partir de la ec. 2 hallamos la concentración:

 𝐴 − 0.0414
𝐶= 𝑀
0.0882

0.27984 − 0.0414
𝐶= 𝑀
0.0882

𝐶 = 2.7034𝑀