Reseptor dopamin berkontribusi terhadap

neurotoksisitas yang diinduksi paraquat pada Drosophila

ABSTRAK
Paparan jangka panjang terhadap stresor oksidatif lingkungan, seperti herbisida paraquat (PQ), telah
dikaitkan dengan perkembangan penyakit Parkinson (PD), gangguan pergerakan neurodegeneratif yang
paling sering. Paraquat dengan demikian sering digunakan dalam lalat buah Drosophila melanogaster
dan model hewan lainnya untuk mempelajari PD dan degenerasi neuron dopaminergik (DN) yang
menjadi ciri penyakit ini. Di sini, kami menunjukkan bahwa reseptor dopamin (DA) seperti D1, DAMB,
secara aktif berkontribusi pada kegagalan sistem saraf pusat cepat (SSP) yang disebabkan oleh PQ saat
terbang. Pertama, kami menemukan bahwa peningkatan jangka panjang dalam sintesis DA neuronal
mengurangi ekspresi DAMB dan melindungi terhadap neurotoksisitas PQ. Kedua, penurunan yang
berhubungan dengan usia yang mencolok pada resistensi PQ pada lalat dewasa muda berkorelasi
dengan augmentasi ekspresi DAMB. Peningkatan penuaan terkait dalam kerentanan stres oksidatif ini
tidak diamati pada mutan defisiensi DAMB. Ketiga, inaktivasi target reseptor ini dalam neuron
glutamatergik (GN) secara nyata meningkatkan kelangsungan hidup Drosophila yang terpajan pada PQ
atau neurotoxiclevels DA, sedangkan, sebaliknya, ekspresi berlebih DAMB pada sel-sel ini membuat
lalat lebih rentan terhadap kedua senyawa. Keempat, mutasi pada reseptor Drosophila ryanodine (RyR),
yang menghambat peningkatan sitosol Ca21 yang diinduksi aktivitas, juga sangat meningkatkan
resistensi PQ. Akhirnya, kami menemukan bahwa overekspresi DAMB pada populasi neuronal spesifik
menghambat perkembangan lalat dan bahwa stimulasi in vivo baik DN atau GN meningkatkan
kerentanan PQ. Ini menyarankan suatu model untuk potensiasi mediasi DA dari neurotoksisitas yang
diinduksi PQ. Studi lebih lanjut dari pensinyalan DAMB di Drosophila dapat memiliki implikasi untuk
pemahaman yang lebih baik tentang gangguan neurodegeneratif terkait DA pada manusia.

PENGANTAR
Stres oksidatif, yaitu akumulasi yang tidak terkendali dari spesies oksigen reaktif, memainkan peran
sentral dalam penuaan dan penyakit manusia yang berkaitan dengan usia utama seperti kanker (1), gagal
jantung (2), sindrom neurodegeneratif (3,4) dan, khususnya, Parkinson penyakit (PD) (5-8). Penyakit
Parkinson adalah kelainan gerakan multifaktorial yang dihasilkan dari disfungsi dan hilangnya neuron
dopaminergik (DN) di substansia nigra pars compacta otak tengah (SNPC) (9-11). Tidak ada
pengobatan yang diketahui saat ini yang dapat menghentikan atau memperlambat perkembangan
neurodegenerasi pada gangguan ini. Penyakit Parkinson dan penyakit terkait umumnya bersifat
sporadis, yaitu tanpa heritabilitas yang jelas, tetapi kasus keluarga telah dijelaskan. Beberapa dari 15
gen PARK yang mutasinya menyebabkan berbagai bentuk Parkinson terbukti terlibat dalam kontrol
kualitas mitokondria dan jalur stres oksidatif (7,12). Oksidasi dopamin (DA) itu sendiri, atau
metabolitnya, menghasilkan radikal reaktif dan quinonesthat
dapat merusak sel dan berinteraksi dengan protein yang berhubungan dengan PD (13-15).
Ini dikombinasikan dengan fitur fisiologis DN SNPC termasuk entri Ca2 + yang menonjol melalui
saluran tipe-L, dapat menjelaskan kerentanan spesifik dari sel-sel ini dalam PD (6,16,17).

Studi epidemiologi manusia menunjukkan paparan jangka panjang terhadap generator radikal bebas
lingkungan, seperti herbisida paraquat (PQ, 1,1 d -dimethyl-4 - 4 b -bipyridinium) atau insektisida
rotenone, merupakan faktor risiko pengembangan PD. (18–21). Meskipun mekanisme molekuler
sitotoksisitas PQ dan rotenone tampak berbeda dan belum sepenuhnya terbentuk secara in vivo (22-24),
mereka diketahui meningkatkan produksi ion superoksida oleh mitokondria dan menghasilkan
kerusakan oksidatif (23,25,26). Kedua neurotoksikan ini dengan demikian telah sering digunakan untuk
meniru PD dan mempelajari defisit motorik yang diinduksi stres oksidatif dan neurodegenerasi
dopaminergik dalam model hewan seperti tikus (22,27-31) dan Drosophila (32-38). Melatonin,
pemulung radikal hidroksil yang kuat, secara efisien melindungi lalat terhadap pestisida ini (32,39).
Dalam Drosophila, DA adalah neuromodulator esensial dan prekursor molekul yang diperlukan
untuk pengerasan dan pigmentasi kutikula eksternal (40,41). DA dilepaskan dari fly neuronsinteracts
dengan reseptor DA yang ditambah G protein spesifik, baik dari subtipe D1 atau D2 (42,43), termasuk
D11 seperti DDA1 dan DAMB, yang memainkan peran kunci dalam gairah dan memori (44,45). Di
sini, kami menunjukkan bahwa ekspresi berlebih jangka panjang dari DA-mensintesis enzim tirosin
hidroksilase (TH) dalam sistem saraf memperpanjang kelangsungan hidup lalat dewasa yang
dipabukkan dengan PQ, dan kami memberikan bukti bahwa peningkatan resistensi PQ dihasilkan dari
regulasi turun dari Reseptor DAMB. Selain itu, penambahan ekspresi DAMB tampaknya mendasari
peningkatan terkait kerentanan usia PQ pada lalat dewasa muda. Ini menunjukkan bahwa pensinyalan
DA memodulasi resistensi stres oksidatif dalam sistem saraf Drosophila. Dari ini dan hasil lebih lanjut,
kami mengusulkan model untuk neurotoksisitas PQ di mana gangguan SSP akan dihasilkan dari efek
penguatan sendiri dari stres oksidatif yang diinduksi PQ dan sinyal Ca2 + intraseluler berbahaya yang
dimediasi oleh overaktivasi reseptor DA.

HASIL
Ekspresi TH jangka panjang melindungi terhadap neurotoksisitas PQ
Kelangsungan hidup Drosophila betina tipe liar yang diberi makan dengan 20 mM PQ yang dilarutkan
dalam larutan sukrosa 2% paling banyak 72 jam, dengan 60% lalat tampaknya mati setelah 24 jam
(Gambar 1A). Karena PQ diet sangat menghambat asupan makanan pada lalat (46), kami sebagai
alternatif menerapkan obat langsung ke notum anterior Drosophila dewasa yang dipenggal, dekat
dengan tali saraf ventral (VNC), untuk memotong pemberian makan dan penyerapan saluran
pencernaan. Lalat tanpa kepala bertahan hingga 3 hari ketika dikonservasi dalam lingkungan yang
lembab pada 258C. Mereka mempertahankan postur berdiri yang normal, respons yang benar dan kuat,
dan mereka dapat merespon stimulasi mekanik atau farmakologis dengan perawatan dan penggerak
yang terkoordinasi (47-50). Kami mengamati bahwa kematian terjadi lebih cepat ketika PQ diterapkan
langsung ke VNC, dibandingkan dengan konsumsi oral. Aplikasi tunggal 5-setetes 20 atau 80 mM PQ
yang diencerkan dalam larutan Ringer membunuh 60-70% lalat yang dipenggal dalam 6 dan 2 jam,
masing-masing (Gbr. 1B). Tidak ada perbedaan signifikan dalam kerentanan PQ yang diamati di antara
berbagai strain kontrol dalam kondisi ini (Bahan Tambahan, Gambar. S1). PQ yang tertelan
menginduksi perubahan morfologis karakteristik DN otak, yang badan selnya menjadi lebih kecil dan
membulat, menyarankan masuknya sel-sel ini ke dalam apoptosis, seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 1C untuk kluster PPL2. Perubahan serupa dalam morfologi neuron sebelumnya dijelaskan
untuk kelompok PAL, PPL1, dan PPM2 (33). Penerapan langsung PQ juga mengubah struktur neuron
dopaminergik dalam VNC, yang menyebabkan, setelah 2 jam, terjadi penurunan atau kehilangan varises
aksonal yang parah, yang biasanya tersebar luas di neuropil ganglion lalat yang tidak diobati (Gbr. 1D
dan E).
Dalam Drosophila, seperti pada mamalia, enzim TH secara khusus diperlukan untuk produksi DA di
CNS (41) (Bahan Tambahan, Gbr. S2). Untuk menguji efek peningkatan biosintesis pada kerentanan
PQ, kami mengekspres genom Drosophila TH (DTHg) dari tahap akhir embrionik dan setelahnya di
DNs, di bawah kendali transkripsi dari driver TH-GAL4 (51). Resistensi dari TH.THg ini terbang ke
keracunan PQ secara signifikan ditingkatkan dibandingkan dengan tipe liar, yang mengarah ke
peningkatan tingkat kelangsungan hidup pada 24 jam setelah konsumsi obat dan 2 jam setelah aplikasi
langsung ke VNC (Gambar 2A dan B). Karena neuron serotonergik mengekspresikan dopa
decarboxylase (Ddc), enzim kedua dalam jalur biosintesis DA (Bahan Tambahan, Gambar S2), ekspresi
ektopik DTHg dapat memaksa sel-sel ini untuk menghasilkan DA. Secara mengejutkan, ekspresi TH
secara selektif dalam neuron serotonergik dengan driver TRH-GAL4 juga menghasilkan perlindungan
yang signifikan terhadap PQ (Gambar 2A dan B). Tingkat kelangsungan hidup TRH yang tertelan PQ.
THG terbang pada 24 jam dua kali lipat dari tipe liar (Gambar 2A). Dengan demikian, peningkatan
resistensi PQ pada lalat dewasa dapat dihasilkan dari peningkatan term-panjang dalam sintesis DA baik
dalam DNs atau dalam neuron serotonergik, menunjukkan bahwa faktor penting untuk proteksi neuron
bukanlah level DA dalam DN melainkan jumlah DA yang dilepaskan dalam CNS
Peningkatan toleransi PQ berkorelasi dengan down-regulasi DAMB reseptor DA
Dirilis DA berinteraksi dengan reseptor membran spesifik. Kami menguji apakah interaksi ini berperan
dalam kontrol neurotoksisitas PQ. Antagonis reseptor DA diaplikasikan bersama dengan PQ ke tali
saraf Drosophila yang dipenggal. Penerapan SKF-83959 atau SKF-83566, dua antagonis spesifik dari
subtipe reseptor D1, secara nyata meningkatkan resistensi lalat terhadap PQ. Sembilan puluh menit
setelah aplikasi PQ, tingkat kelangsungan hidup lalat tanpa kepala meningkat sekitar dua kali lipat di
hadapan antagonis ini dibandingkan dengan kontrol yang diobati dengan PQ saja (Gambar 2C).
Sebaliknya, eticlopride, antagonis spesifik reseptor D2 yang sebelumnya terbukti efektif pada
Drosophila (47), tidak memiliki efek signifikan pada toksisitas PQ (Gambar 2C). Oleh karena itu,
antagonis reseptor D1 DA dapat secara efisien melindungi terhadap keracunan PQ di Drosophila.

Gambar 1. Letaritas yang diinduksi paraquat dan perubahan morfologis neuron Drosophila DA. (A dan
B) Tingkat kelangsungan hidup Drosophila tipe liar Canton-S baik diberi makan dengan larutan sukrosa
yang mengandung PQ (konsumsi makanan) (A) atau setelah aplikasi 5-s obat yang diencerkan dalam
larutan Ringer ke VNC dari lalat yang dipenggal kepala. (aplikasi langsung) (B). Konsentrasi PQ adalah
sebagai berikut: 0 (lingkaran tertutup), 20 (kuadrat terbuka), atau 80 mM (kuadrat tertutup). (C) Struktur
DNs otak dari Drosophila tipe liar diberi makan selama 24 jam pada larutan sukrosa yang mengandung
PQ (kontrol, panel atas) atau 20 mM PQ (panel bawah). Otak sedang dibedah dan diwarnai dengan
antibodi anti-TH. Gambar-gambar menunjukkan bagian dari gugus neuronal 2 (PPL2) posterior
dorsolateral posterior. Badan sel dopaminergik lalat yang diobati dengan PQ tampak lebih kecil dan
lebih bulat dengan nukleus yang menyusut. (D dan E) VNC seluruh-mount dari Drosophila yang
dipenggal dibedah 2 jam setelah aplikasi 5-detik dari Ringer's saja (kontrol) (D) atau 80 mM PQ (E)
dan kemudian di-immunostained untuk TH. Proyeksi confocal dikonversi menjadi gambar negatif untuk
meningkatkan visibilitas. Variasi akson DN yang tersebar luas di VNC lalat kontrol tampaknya jauh
berkurang ukurannya atau hilang (98,4 + 0,005%) pada VNC yang diobati dengan PQ. Skala bar: (C)
10 mm, (D dan E) 50 mm.

Gambar 2. Down-regulasi reseptor DA DAMB melindungi Drosophila terhadap stres oksidatif yang
diinduksi PQ. (A) Tingkat kelangsungan hidup lalat tipe liar yang diberi makan selama 24 jam dengan
sukrosa ditambah 20 mM PQ, dibandingkan dengan TH-GAL4; UAS-DTHg terbang overexpressing
TH di DNs (TH.THg), dan TRH-GAL4; UAS-DTHg terbang ektopik mengekspresikan TH dalam
neuron serotonergik (TRH.THg). (B) Tingkat kelangsungan hidup lalat yang dipenggal genotipe yang
sama seperti pada (A) 2 jam setelah aplikasi 5-detik dari 80 mM PQ yang dilarutkan dalam Ringer ke
VNC. (C) Efek antagonis reseptor DA. Tingkat kelangsungan hidup lalat yang dipenggal dipantau 1
jam 30 menit setelah aplikasi singkat setetes larutan Ringer yang mengandung PQ saja (kontrol) atau
PQ plus antagonis D1 SKF-83959 atau SKF-83566, atau D2 antagonis eticlopride. Perlindungan
diamati dengan antagonis spesifik-D1. (D) Kerentanan PQ dari mutan DA reseptor D1-seperti
dipenggal. Sedangkan tingkat kelangsungan hidup dumb2 sebanding dengan tipe liar, strain Damb1
menunjukkan resistensi yang lebih tinggi terhadap PQ. (E) Kelangsungan hidup Damb1 utuh terbang
setelah konsumsi PQ juga meningkat dibandingkan dengan tipe liar. Dalam (A) - (E), nilai dinormalisasi
dengan tingkat kelangsungan hidup rata-rata kontrol tipe liar. (F – H) TH berlebih menurunkan tingkat
transkrip DAMB pada lalat dewasa. (F) RT-PCR dari RNA kepala (30 siklus amplifikasi) menunjukkan
tingkat transkrip DAMB yang lebih rendah, dibandingkan dengan tipe liar, setelah overekspresi TH
jangka panjang dalam neuron dopaminergik (TH.THg) atau serotonergik (TRH.THg), dan mereka
absen dalamDamb1mutant. Analisis kepadatan produk RT-PCR (G) atau eksperimen PCR waktu-nyata
(H) menghasilkan hasil kuantitatif yang serupa

Dua reseptor mirip D1 dikenal di Drosophila: dDA1 dan DAMB. Kami menentukan resistensi PQ dari
Damb1, mutan DAMB nol yang layak, dan dumb2, mutan dDA1 hipomorfik (Gbr. 2D). Setelah 2 jam
keracunan PQ, tingkat kelangsungan hidup lalat Damb1 yang dipenggal ditemukan 2,5 kali lebih tinggi
daripada lalat jenis Canton S (CS) liar. Sebaliknya, kelangsungan hidup lalat dumb2 mirip dengan CS.
Lalat Damb1 juga jauh lebih tahan daripada tipe liar ketika keracunan PQ dilakukan oleh konsumsi
makanan (Gbr. 2E). Efek perlindungan-stres yang sebanding dari inaktivasi DAMB dan DA jangka
panjang yang ditingkatkan menunjukkan bahwa ekspresi DAMB dapat diubah dengan cara kompensasi
oleh TH overexpression. Untuk menguji hipotesis ini, kami mengukur tingkat transkrip DAMB pada
kepala lalat dewasa yang mengekspresikan TH secara berlebihan dalam neuron dopaminergik atau
serotonergik: lalat transgenik ini menunjukkan penurunan regulasi ekspresi DAMB hingga 30% dari
tipe liar, dan tidak ada mRNA DAMB yang terdeteksi pada Mutan Damb1 (Gbr. 2F – H). Dua set
percobaan independen menggunakan teknik yang berbeda, yaitu. analisis kepadatan produk RT-PCR
(Gambar 2G) dan PCR waktu-nyata (Gambar 2H), menunjukkan hasil kuantitatif yang serupa. Ini
memperkuat kesimpulan bahwa DAMB diatur ke bawah pada lalat dewasa ketika TH diekspresikan
berlebihan dalam neuron dopaminergik atau serotonergik dan bahwa transkripsi DAMB tidak ada pada
mutan Damb1 (seperti juga ditunjukkan pada Gambar. 4B). Dengan demikian, berbagai perawatan atau
mutasi yang mengakibatkan inaktivasi atau down-regulasi DAMB, baik aplikasi antagonis D1, mutasi
DAMB atau augmentasi jangka panjang dari sintesis DA, semua mengarah pada efek umum
peningkatan toleransi PQ. Oleh karena itu, pensinyalan DAMB tampaknya berkontribusi secara
signifikan terhadap neurotoksisitas yang diinduksi PQ pada Drosophila.

Gambar 4.DAMB diekspresikan dalam GNS dari VNC. (A) Sketsa sel sintesis Glu- (lingkaran hijau)
dan DA- (lingkaran merah) di VNC. Daerah yang sesuai dengan ganglia toraks (tho) dan neuromel
abdomen yang menyatu (abd) ditandai. Lingkaran mewakili badan sel saraf. Kotak abu-abu
menunjukkan daerah diperbesar dalam panel (C) dan (D), dan kotak putus-putus melakukan hal yang
sama untuk panel (E) dan (G). (B) Percobaan RT-PCR (40 siklus) menunjukkan bahwa DAMB
diekspresikan baik di kepala maupun toraks lalat jenis Canton-S liar dan tidak ada di kedua jaringan
dalam mutan Damb1. (C) Adanya imunoreaktivitas DAMB pada VNC dewasa lalat tipe liar. DAMB
diekspresikan terutama dalam sel-sel sel saraf yang mungkin berhubungan dengan neuron motorik yang
melepaskan Glu. (D) Tidak ada imunoreaktivitas DAMB yang terdeteksi di VNC

Gambar 5. Tidak aktifnya DAMB di GN meningkatkan toleransi PQ. (A dan B) Kelangsungan hidup
dari dipenggal (A) dan utuh (B) terbang pada 2 dan 48 jam, masing-masing, setelah paparan PQ. Tingkat
kelangsungan hidup lebih besar untuk VGlut-GAL4; UAS-DAMB-IR Drosophila (VGlut.DAMB-IR),
yang menyatakan DAMB mengganggu RNA (IR) dalam GN dibandingkan dengan lalat kontrol yang
membawa satu salinan VGlut-GAL4 atau UAS-DAMB-IR saja. (C) Kelangsungan hidup TH-GAL4
yang dipenggal; UAS-DAMB-IR terbang (TH.DAMB-IR) yang mengekspresikan DAMB IR dalam
DNs, sebaliknya, mirip dengan kontrol. (D) kerentanan PQ dari VGlut-GAL4; UAS-DAMB terbang
(VGlut.DAMB) yang overexpress DAMB di GNsis secara signifikan meningkat dibandingkan dengan
kontrol. (EandF) Efek stimulasi in vivo dari neuron yang melepaskan Glu atau DA pada resistensi PQ.
(E) Kelangsungan hidup VGlut-GAL4 yang dipenggal; UAS-dTrpA1 (VGlut.dTrpA1) Drosophila yang
diinkubasi selama 2 jam pada 318C di hadapan PQ berkurang dibandingkan dengan lalat kontrol yang
diperlakukan serupa yang membawa satu salinan VGlut-GAL4 atau UAS-dTrpA1 saja. (F) Percobaan
yang sama seperti pada D dengan TH-GAL4; UAS-dTrpA1flies (TH.dTrpA1). Stimulasi jangka pendek
dari DN juga secara nyata meningkatkan neurotoksisitas PQ. Di semua panel, nilai dinormalisasi
dengan tingkat kelangsungan hidup rata-rata dari masing-masing kontrol regangan UAS

Inaktivasi DAMB melindungi terhadap neurotoksisitas DA

Setelah paparan PQ, DAMB dapat diaktifkan secara berlebihan oleh sejumlah besar DA yang
kemungkinan akan dilepaskan dari DN yang rusak oleh PQ, sehingga mengganggu kelangsungan hidup
Drosophila di bawah tekanan oksidatif. Sebagai tes lebih lanjut dari hipotesis ini, kami menerapkan
berbagai pengenceran DA langsung ke kabel saraf Drosophila yang dipenggal tanpa adanya PQ.
Menariknya, kadar DA 0,10 mM ditemukan mematikan dalam kondisi ini dengan cara yang tergantung
pada dosis, dengan usia rata-rata 45 menit pada 50 mM DA (Gambar 6A). Di sini sekali lagi, galur
mutan Damb1 secara nyata lebih tahan daripada tipe liar terhadap toksisitas DA (Gambar 6B): tingkat
kelangsungan hidup Damb1 Drosophila 2 jam setelah paparan 35 mM DA adalah 1,7 kali lebih tinggi
daripada lalat jenis liar yang diperlakukan sama dan ditutup. untuk tingkat kelangsungan hidup dari
jenis liar yang tidak diobati. Mirip dengan hasil percobaan yang dilakukan dengan PQ (Gambar 5A dan
B), kami menemukan bahwa penargetan inaktivasi DAMB oleh RNAi di GNs dan ekspresi berlebih
DAMB di GNs, masing-masing, meningkatkan dan menurunkan kelangsungan hidup Drosophila 2 jam
tanpa kepala setelah paparan DA (paparan DA) ( Gbr. 6C dan D). Hal ini menunjukkan bahwa
neurotoksisitas DA pada Drosophila sebagian disebabkan oleh aktivitas berlebih DAMB pada GN.

Penurunan Ca21 sitosol melindungi terhadap neurotoksisitas PQ Karena aktivasi DAMB dapat
meningkatkan cAMP sitosol dan Ca2 +, kami mencoba untuk menentukan utusan kedua mana yang
dapat terlibat dalam efek merugikan yang diinduksi oleh reseptor DA di bawah tekanan oksidatif. Untuk
meningkatkan level cAMP dalam sel, kami menerapkan PQ bersama dengan forskolin dan IBMX ke
trunk lalat yang dipenggal. Dibandingkan dengan kontrol hanya dengan PQ, kami menemukan bahwa
resistensi lalat dengan level cAMP yang lebih tinggi meningkat (Gbr.7A). hasil setuju dengan
pandangan bahwa cAMP umumnya memiliki efek perlindungan saraf dalam sistem saraf (38,60-62).
Ini menunjukkan bahwa cAMP mungkin tidak mengambil bagian dalam pensinyalan neurotoksik yang
dipicu oleh reseptor DAMB.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5E dan F, kami telah menemukan bahwa meningkatkan tingkat
kationin neuron menggunakan saluran dTRPA1 sehingga ia lebih rentan terhadap PQ, dengan alasan
peran Ca2 + dalam neurotoksisitas PQ. Untuk menguji secara terbalik untuk efek pengurangan Ca2 +
intraseluler, kami menentukan resistensi PQ dari mutan heterozigot dari reseptor ryanodine tunggal
(RyR) dalam lalat, RyR16 (63). Saluran reseptor Ryanodine adalah mediator utama peningkatan
aktivitas yang diinduksi dalam Ca2 + sitosolik (64,65), dan mutasi RyR16 sebelumnya terbukti
menekan neurotoksisitas Ab dalam model Drosophila penyakit Alzheimer (66). Menariknya, kami
menemukan bahwa lalat mRRRR16 secara nyata resisten terhadap paparan PQ, pada tingkat yang
sebanding dengan mutan Damb1 (Gbr. 7B). Ini menunjukkan bahwa RyR adalah komponen jalur
kematian sel yang diinduksi PQ dan menunjukkan bahwa DAMB berkontribusi terhadap toksisitas PQ
setidaknya sebagian dengan meningkatkan tingkat Ca2 + sitosolik dalam neuron

DISKUSI
Target neuronal PQ dalam Drosophila Paraquat telah lama digunakan dalam Drosophila dan spesies
lain untuk mempelajari mekanisme resistensi stres oksidatif dan untuk memodelkan penuaan atau PD
(26,33,39,53,67-73). Keuntungan dari senyawa ini termasuk kelarutan dalam air, kemampuannya untuk
melintasi batas pencernaan dan darah - otak dan kemampuannya untuk dengan cepat menghasilkan
oksigen reaktif dan spesies nitrogen, yang menyebabkan kerusakan oksidatif. Di Drosophila, PQ
umumnya diberikan dengan memberi makan selama 1-2 hari (74). Namun, obat ini sebelumnya terbukti
memiliki efek anorexigenik yang kuat pada lalat (46). Di sini, kami memperkenalkan teknik alternatif
untuk paparan PQ, yaitu aplikasi langsungnya ke anterior notum Drosophila yang dipenggal. Sediaan
aktif yang berperilaku seperti itu digunakan dalam pekerjaan sebelumnya untuk studi farmakologis
amina biogenik (47-49,75,76).
Metode ini memungkinkan PQ untuk menyebar cepat ke VNC, sehingga menghindari penggunaan
larutan sukrosa dan saluran pencernaan penyerapan dan juga meminimalkan waktu untuk eksperimen
karena kematian terjadi beberapa jam setelah obat singkat (5-s) aplikasi. Kekhawatiran potensial adalah
bahwa otak dan lainnya. bagian-bagian SSP yang terletak di kepala juga bersifat oksidatif
rusak setelah konsumsi PQ dan tidak ada dalam pemenggalan lalat. Meskipun ada kemungkinan bahwa
jaringan kepala berkontribusi pada PQ kerentanan di seluruh lalat, kami selalu menemukan hasil yang
serupa secara kualitatif dalam tes kelangsungan hidup ketika membandingkan konsumsi PQ dan
aplikasi langsung untuk hewan yang dipenggal, seperti yang ditunjukkan di sini dalam Gambar 1, 2 dan
5. Ini menunjukkan bahwa kedua metode dapat digunakan dengan percaya diri untuk menganalisis
neurotoksisitas PQ efek. Karena PQ adalah faktor risiko lingkungan untuk PD (18,77) yang
menyebabkan hilangnya SNPC DNs selektif dalam model hewan (78-80), penting untuk menyelidiki
hubungan antara toksisitas yang diinduksi PQ dan sistem dopaminergik saraf. Kerentanan selektif dari
neuron SNPC terhadap faktor PD diperkirakan muncul sebagian dari sifat pro-oksidan DA dan
metabolitnya (13-15,17). Ini menunjukkan bahwa peningkatan kadar DA dalam neuron harus
meningkatkan kerentanan PQ. Menariknya, penelitian sebelumnya di Drosophila menunjukkan bahwa
mutasi yang meningkatkan level DA memiliki efek sebaliknya, menyebabkan peningkatan toleransi
PQ, sedangkan mutasi yang mengurangi DA pools meningkatkan kerentanan lalat (33). Di sini, kami
menemukan bahwa peningkatan sintesis DA pada neuron, dengan mengekspresikan gen TH secara
berlebihan selama pengembangan lalat, memperpanjang toleransi PQ baik setelah uji coba maupun
aplikasi langsung dari toksin. Neurotoksisitas yang diinduksi oleh PQ tampaknya menjadi penyebab
utama kematian pada Drosophila yang mendahului kegagalan organ sistemik yang lebih lambat.
Anehnya, efek perlindungan serupa diamati ketika Sintesis DA meningkat baik di dopaminergik atau
di neuron serotonergik, menunjukkan bahwa faktor penting untuk mediasi DA perlindungan saraf
adalah jumlah DA yang dilepaskan dari waktu ke waktu dalam ruang ekstraseluler daripada tingkat DA
di dalam DN. Konsisten dengan interpretasi ini, dilaporkan bahwa lalat yang terlalu banyak
mengekspresikan transporter monoamine vesikular di DNs, cara genetik untuk meningkatkan pelepasan
DA, menunjukkan peningkatan resistensi terhadap PQ (36).
Kami kemudian mengumpulkan serangkaian bukti yang setuju dengan hipotesis ini dan
berdebat untuk keterlibatan reseptor DA dalam kerentanan PQ (Gambar 2 dan 3): (1) Toleransi PQ
ditingkatkan di hadapan antagonis reseptor DA, (2) peningkatan sintesis DA pada neuron yang
meregulasi DAMB reseptor DA seperti D1, (3) mutan yang kekurangan DAMB lebih toleran terhadap
PQ daripada lalat tipe liar, dan (4) Ekspresi DAMB diperlukan untuk penurunan terkait resistensi PQ
terkait usia yang terjadi selama 2 minggu pertama kehidupan dewasa. Pengamatan terakhir ini
menunjukkan, cukup menarik, bahwa ekspresi reseptor DA mendasari perubahan terkait penuaan dalam
kerentanan stres oksidatif pada lalat dewasa muda. Secara keseluruhan, hasil ini mengarah pada
kesimpulan bahwa DAMB secara signifikan berkontribusi terhadap neurotoksisitas PQ dan bahwa
jumlah DA yang dirilis dalam jangka panjang dalam CNS mengontrol resistensi Drosophila PQ dengan
memodulasi ekspresi reseptor ini.
Di sisi lain, kami juga menyajikan bukti bahwa peningkatan mendadak DA ekstraseluler yang
dipicu oleh keracunan PQ akut pada lalat naif secara langsung berkontribusi terhadap kematian. Rilis
DA yang diinduksi PQ tidak dapat didemonstrasikan di sini karena ukurannya yang kecil dan
aksesibilitas yang rendah dari CNS Drosophila dewasa. Namun, hal ini ditunjukkan pada mamalia (lihat
di bawah) dan disarankan oleh perubahan morfologis cepat DN pada lalat yang mabuk PQ (Gbr. 1). Di
sini, kami memberikan dua argumen yang mendukung hipotesis ini. Pertama, stimulasi jangka pendek
DN dengan aktivasi dTRPA1 pada lalat dewasa SSP sangat memperburuk efek merugikan PQ (Gambar
5F). Kedua, paparan singkat lalat tanpa kepala ke level DA sebesar 0,10 mM, dengan tidak adanya PQ,
sudah cukup untuk memicu kematian progresif pada jam-jam berikutnya (Gambar 6A). Eksperimen ini
menunjukkan bahwa peningkatan mendadak dalam level DA ekstraseluler adalah neurotoksik pada
Drosophila. Menariknya, lalat mutan Damb1 tampak jauh lebih rentan terhadap toksisitas DA daripada
lalat tipe liar (Gambar 6B), seperti halnya dengan kerentanan PQ. Ini menunjukkan bahwa sebagian
besar hasil neurotoksisitas DA dari aktivasi DAMB. Oleh karena itu, PQ terutama dapat menargetkan
DN, menyebabkan DA ekstraseluler abnormal, yang kemudian akan memperburuk kerusakan oksidatif
dengan mengaktifkan kembali reseptor DAMB yang terletak di terminal saraf neuron tetangga.

Karena mutan Damb1 tanpa kepala juga kurang rentan terhadap toksisitas PQ, kami mencari
keberadaan reseptor DAMB di VNC. DAMB memang diekspresikan dalam subtipe neuronal dalam
jaringan ini, termasuk neuron motor glutamatergik (Gbr. 4C –G). Kami juga menemukan bahwa
proyeksi glutamatergic tersebar luas di neuropil VNC dan sering terletak dekat dengan varitas
dopaminergik (Gbr. 4H-M), seperti bahwa ketika sejumlah besar DA dilepaskan, difusi dapat
memastikan bahwa reseptor DAMB yang dinyatakan dalam GN terlalu aktif. Dengan demikian, kami
menunjukkan bahwa inaktivasi DAMB oleh RNAi yang ditargetkan ke GNs sebagian melindungi lalat
terhadap toksisitas yang diinduksi PQ dan DA, menunjukkan bahwa aktivasi DAMB dalam sel-sel ini
berkontribusi terhadap efek merugikan dari senyawa-senyawa tersebut (Gambar 5A dan B dan 6C). .
Kesimpulan ini diperkuat oleh fakta bahwa, sebaliknya, overexpressing DAMBin GNs
meningkatkan kerentanan terhadap PQ atau DA (Gambar 5D dan 6D). Sesuai dengan hasil ini, laporan
lain menunjukkan peran sentral untuk GN dalam kerentanan Drosophila PQ. Dengan demikian, ekspresi
target baik superoksida dismutase manusia, SOD1, atau protein heat shock mitokondria, Hsp22, dalam
neuron motor glutamatergic secara signifikan meningkatkan kelangsungan hidup Drosophila setelah
keracunan PQ (68,81).

Mekanisme potensiasi yang dimediasi DAMB

kerentanan PQ

Bagaimana overaktifasi DAMB dapat memicu kegagalan dan kematian SSP di bawah paparan
PQ? Diketahui bahwa peningkatan Ca2 + sitosolik pada neuron dapat memediasi atau mempotensiasi
efek merusak dari stres oksidatif dan eksitotoksisitas (82-84). Salah satu kemungkinan, oleh karena itu,
adalah bahwa pensinyalan DAMB pada lalat yang mabuk keracunan PQ secara abnormal meningkatkan
Ca2 + sitosol dan level cAMP dalam neuron yang mengekspresikan reseptor, yang menyebabkan
pelepasan Glu dan neurotransmitter yang menyimpang dan meningkatkan defek eksitotoksik (85,86).
Dengan demikian, kami sebelumnya menunjukkan bahwa lalat dengan kemampuan buffering Glu
berkurang lebih rentan terhadap paparan PQ (85). Hipotesis ini juga setuju dengan pengamatan baru
yang dilaporkan di sini, mis. lokalisasi DAMB di GNS dari VNC, the
meningkatkan kerentanan PQ terhadap lalat di mana GN distimulasi dengan saluran kation
dTrpA1 (Gbr. 5E) dan resistensi yang mencolok dari reseptor ryanodine yang mutan terhadap
neurotoksisitas PQ (Gbr. 7B). Level Ca2 + sitosolik yang meningkat muncul, oleh karena itu, menjadi
komponen penting dari efek neurotoksik PQ dalam Drosophila dan dapat menyebabkan pelepasan Glu
yang menyimpang. Sebaliknya, peningkatan level cAMP tampaknya bersifat neuroprotektif pada
kondisi yang sama (Gambar 7A). Namun, lebih banyak percobaan diperlukan sebelum kita dapat
menyimpulkan bahwa aktivasi pensinyalan cAMP yang dimediasi DAMB tidak berperan dalam
neurotoksisitas PQ. Akhirnya, kami juga melaporkan bahwa ekspresi berlebih DAMB pada semua
neuron atau dalam subpopulasi neuron spesifik, yaitu sel dopaminergik atau kolinergik, dengan tidak
adanya PQ, menangkap perkembangan lalat selama langkah-langkah terakhir metamorfosis (Tabel 1),
menunjukkan bahwa pensinyalan DAMB dapat berupa dengan sendirinya berpotensi neurotoksik.
Dapat dicatat bahwa efek mematikan yang sebanding sebelumnya dilaporkan setelah ekspresi
panneuronal dari reseptor Drosophila adenosine yang juga mengaktifkan pensinyalan cAMP dan
kalsium (87). Alasan mengapa ekspresi berlebih DAMB pada tipe sel lain, seperti GN, neuron
serotonergik, dan sel glial, tidak memiliki efek yang merugikan pada kelangsungan hidup lalat masih
belum terurai.
Data lebih lanjut dari literatur mendukung hipotesis eksitotoksisitas dari tindakan PQ. Dalam
Drosophila, mutan hipomorfik dari methuselah (mth), gen yang mengkode reseptor protein-g G
pengikat peptida, memiliki umur rata-rata yang meningkat dan peningkatan resistensi terhadap berbagai
stres, termasuk PQ makanan (53,88). Menariknya, membangkitkan pelepasan Glu dari neuron motorik
pada mutan ini berkurang 50% karena berkurangnya area sinaptik dan kepadatan vesikel sinaptik (89).
Penurunan kemampuan pelepasan Glu tersebut dapat menjadi keuntungan dalam kondisi stres oksidatif
dengan menunda penghinaan eksitotoksik. Dalam sistem lain, yaitu striatum tikus yang bergerak bebas,
ditunjukkan bahwa dosis PQ secara dependen meningkatkan kadar Glu dan DA ekstraseluler.
Peningkatan kadar DA ekstraseluler berlangsung selama 24 jam setelah pengobatan PQ. Bukti
farmakologis menunjukkan bahwa eflux Glu yang distimulasi PQ memulai serangkaian reaksi
eksitotoksik yang akhirnya menyebabkan kerusakan terminal dopaminergik striatal (90).