Professional Documents
Culture Documents
(mineralisasi) yang berasal dari limbah industri, penguraian pakan yang tidak dikonsumsi,
tinja, ekskresi ikan, dan memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Kami menyelidiki peran bakteri heterotrof yang digunakan sebagai antibakteri terhadap
patogen dalam budidaya ikan. Penelitian ini dilakukan dari Januari hingga Maret 2017.
Filogenit bakteri yang diisolasi ditentukan dengan analisis urutan 16S rDNA. Uji
sp.) Tiga isolat (Dm5, Dm6 dan Dm4) menunjukkan zona penghambatan tinggi yang
diklasifikasikan ke dalam kategori kuat dengan rata-rata dari 10,5 hingga 11,8 mm menuju V.
alginolitycus. Isolat lain diklasifikasikan ke dalam kategori sedang dan lemah. Berdasarkan
analisis DNA bakteri heterotrofik yang diisolasi dari perairan laut kawasan industri dan
salinitas rendah perairan muara diidentifikasi dua belas bakteri, dan semuanya memiliki
tingkat homologi tertinggi untuk Bacillus sp., Satu isolat memiliki kemiripan dengan
Enterobacter cloacae, isolat lain untuk Clostridium cetobutylicum. Sebagian besar bakteri
terisolasi diperoleh dari perairan kawasan industri karena menerima banyak nutrisi yang
1. Perkenalan
Perairan laut Dumai adalah salah satu perairan laut Sumatera yang sangat padat dengan
navigasi, aktivitas industri, dan kesibukan penduduk di sekitar pantainya. Kegiatan ini
tampaknya menjadi kontributor utama dari bahan organik dan anorganik, menyebabkan
polusi ke muara sungai. Banyak proses fisik, aktivitas industri dan transportasi antropogenik
dan kelautan [1] mempengaruhi konsentrasi senyawa kimia organik dan anorganik yang
mempengaruhi distribusi dan aktivitas bakteri. Pada dasarnya, mikroorganisme laut sangat
beragam seperti yang ada di darat. Organisme yang dapat diklasifikasikan sebagai mikroba
intomarine adalah protista, cyanobacteria, bakteri, jamur dan virus. Mikroorganisme ini
memiliki peran penting dalam proses yang terjadi di kolom air laut [2]. Faktanya, bakteri
adalah organisme yang sebagian besar jumlahnya dan penyebarannya dibandingkan dengan
bahwa air telah tercemar oleh limbah. Secara umum, bakteri bersifat fakultatif dan
peran penting dalam siklus biogeokimia dalam ekosistem akuatik karena kemampuannya
menguraikan dan meremineralisasi bahan organik menjadi bahan anorganik sederhana, yang
mengandung nutrisi untuk fitoplankton, perifiton, dan mikroflora air lainnya. Dengan
demikian, aktivitas bakteri di perairan laut sangat penting [3]. Keberadaan bakteri
heterotrofik sangat dipengaruhi oleh masuknya bahan organik dari muara sungai ke perairan
laut Dumai. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri
heterotrof menggunakan sekuens 16S rDNA, dan menganalisis kemampuannya sebagai agen
antibakteri terhadap bakteri patogen di mulut Sungai Mesjid dan perairan laut Dumai,
Provinsi Riau.
2. Bahan dan Metode Penelitian dilakukan dari Januari hingga Maret 2017. Sampel
dikumpulkan dari empat stasiun dengan salinitas berbeda, yaitu muara Sungai Mesjid, dan
perairan laut kawasan industri di Dumai, Provinsi Riau. Bakteri heterotrofik diisolasi di
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau,
sedangkan proses pemurnian dan pengurutan DNA dilakukan oleh Pangkalan Pertama
Malaysia yang dikirim oleh PT. Genetika Science Indonesia, Jakarta Barat.
Bakteri diisolasi pada medium Nutrient agar (NA, Merck, Cat.No. 1.05450.0500).
Untuk kultur isolasi DNA bakteri heterotrofik ditanam dalam 4 mL medium Luria-Bertani
cair (LB) pada suhu 37oC selama 24 jam [4]. Kultur kemudian dipindahkan ke 1,5 mikrotube
mL dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm (putaran per menit) pada 4oC selama 2
menit. Supernatan dibuang, pelet dikeringkan dan dilarutkan dalam 40 μL larutan buffer Tris-
terbalik 3-5 kali, dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, 50 μL
10% natrium dodesil sulfat (SDS) ditambahkan, campuran diputar dengan lembut (20 rpm)
selama 5-10 menit dalam rotator rotator. Setelah itu, 550 V of Phenol: Chloroform: Isoamyl
alcohol (25:24:1) was added to the mixture, and the mixture was further rotated gently (20
rpm) for 10 minutes. The mixture was then centrifuged at 7.000 rpm for 10 minutes. The
upper aqueous phase was transferred to a new microtube, and an equal volume of
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) was added to the tube. The mixture was gently rotated (20
rpm) in rotamix rotator for 10 minutes. The mixture was then centrifuged at 7.000 rpm for 10
minutes. The upper aqueous phase was transferred to a new microtube and 3 M sodium
acetate was added (40% volume) to the aqueous phase. Two times volume of 99% cold
alcohol was then added to this solution to precipitate the DNA, and the solution was chilled at
-20oC for 30 minutes. The precipitated DNA was centrifuged at 13.000 rpm and 4oC for 10
minutes, and the supernatant was discarded. The DNA pellet was washed in 1 mL 70% cold
ethanol and centrifuged for another 10 minutes at 13.000 rpm and 4oC. The supernatant
discarded, resulting DNA pellet was then air dried. The pellet was dissolved in 40 μLTE-
buffer (pH 8) and 2.5 μL of RNAse solution were added and homogenized using vortex
mixer and incubated at 37oC for 1 hour. Finally, the DNA of probiotic candidate bacteria was
bakteri probiotik sebagai templat, dan menambahkan 23 μL H2O, 4 μL dari 10x Taq
universal yang terdiri dari primer primer yang terdiri dari primer primer. 24F
pemanasan selama 2 menit pada 94oC, diikuti oleh 30 siklus denaturasi selama 1 menit pada
94oC, anil selama 40 detik pada 50oC, dan perpanjangan untai selama 1 menit pada 72oC.
2.2. Pemurnian fragmen PCR DNA Setelah reaksi PCR, DNA yang diperoleh
dipisahkan dalam gel Agarose 1% dengan elektroforesis. Pita DNA PCR dimurnikan dari gel
Agarose menggunakan Geneaid® Gel / PCR DNA Extractment Fragmen Kit dengan
2.3. Sequencing, BLAST dan analisis filogenetik. Produk PCR yang dimurnikan diurutkan
dengan ABI 3130 XL Genetic Analyzer Applied Biosystem. Sequencing dilakukan di First
Base Malaysia, dari PT. Genetika Science Indonesia, Jakarta Barat. Analisis BLAST
dilakukan dengan menggunakan alat dan data Bank Gen yang diakses di
Pohon filogenetik dihasilkan menggunakan alat yang disediakan oleh CLUSTAL W, dan
pohon divisualisasikan menggunakan program MEGA versi 0.5. Data yang diperoleh dari
isolasi dan identifikasi bakteri heterotrof, dan aktivitas melawan bakteri patogen (Vibrio
algynolyticus, Aeromonas hydrophila dan Pseudomonas sp.) Disajikan dalam bentuk tabel
dan gambar.
3. Hasil dan Diskusi 3.1. Pengukuran Kualitas Air Sampel air dikumpulkan dari empat
stasiun, dan masing-masing stasiun pengambilan sampel ditentukan di tiga lokasi yang
jaraknya 50 m (Gambar 1). Pada saat yang sama, parameter kualitas air diukur. Data
parameter kualitas air disajikan pada Tabel 1. Kondisi pengukuran kualitas air adalah sebagai
berikut: sampel dikumpulkan dari pukul 08:00 sampai 14:00; Nilai pH berkisar antara 6,5
‰; suhu air 27-30oC, dan kisaran kecepatan saat ini adalah 0,13-0,34 m / s (Tabel 1). Daerah
ini terletak di bagian timur pulau Sumatera yang berseberangan dengan pulau Rupat. Kota
Dumai terletak di pantai timur pulau Sumatera. Kawasan ini secara terintegrasi
membudidayakan ikan komoditas ekspor utama seperti kerapu, kakap putih, kepiting, dan
bawal melalui fungsi restorasi kawasan mangrove. Dumai juga memiliki pelabuhan yang
dapat difungsikan sebagai area transit untuk bepergian ke negara-negara tetangga, seperti
Singapura dan Malaysia. Selain itu, perairan laut Dumai dianggap sebagai tempat kegiatan
industri bagi beberapa perusahaan seperti Pertamina UP II Dumai, PT. Dermaga Patra, PT.
Chevron Pasifik Indonesia, PT. Sarana Sawitindo, dan kilang minyak sawit Bukit Kapur
3.2. Isolasi bakteri Setelah dikultur dan dimurnikan berulang kali, 14 isolat bakteri yang
berbeda dipilih berdasarkan karakter morfologi dari masing-masing koloni bakteri, dan
kemampuan untuk menghasilkan antibakteri terhadap bakteri patogen. Isolat tersebut adalah
DM1, DM2, DM3, DM4, DM5, DM6, DM7, DM8, DM9, DM10, DM11, DM12, DM13 dan
DM14. Karakteristik morfologi dari isolat tersebut adalah stasiun 1, 2, 3 dan 4 adalah 10 10,
20 ‰, 25 ‰ dan 30 ‰, masing-masing; suhu air 27-30oC, dan kisaran kecepatan saat ini
adalah 0,13-0,34 m / s (Tabel 1). Daerah ini terletak di bagian timur pulau Sumatera yang
berseberangan dengan pulau Rupat. Kota Dumai terletak di pantai timur pulau Sumatera.
Kawasan ini secara terintegrasi mengembangkan wilayah pesisirnya sebagai wilayah
produktif untuk menumbuhkan dan membudidayakan ikan komoditas ekspor utama seperti
kerapu, kakap putih, kepiting, dan bawal melalui fungsi restorasi kawasan mangrove. Dumai
juga memiliki pelabuhan yang dapat difungsikan sebagai area transit untuk bepergian ke
negara-negara tetangga, seperti Singapura dan Malaysia. Selain itu, perairan laut Dumai
dianggap sebagai tempat kegiatan industri bagi beberapa perusahaan seperti Pertamina UP II
Dumai, PT. Dermaga Patra, PT. Chevron Pasifik Indonesia, PT. Sarana Sawitindo, dan kilang
yang bervariasi dari diverges ke putih, putih kekuningan, dan bahkan merah (DM12). Bentuk
koloni bervariasi mulai dari bulat, tidak beraturan, dan bahkan seperti karang. Adapun
perbatasan, ada juga berbagai suka melambai halus dan tidak teratur. Permukaan koloni
beragam bahkan, lega, dan bergelombang. Ini menunjukkan bahwa koloni memang berbeda
3.2. Antagonisme isolat bakteri Hasil uji antagonisme yang dilakukan dalam rangkap tiga
disajikan pada Tabel 3. Setiap isolat bakteri memiliki kemampuan untuk menghambat
pertumbuhan bakteri patogen, ditunjukkan oleh penampilan zona bening di sekitar cakram
kertas. Ada tiga isolat (DM4, DM5 dan DM6) menunjukkan daya hambat terkuat dari zona
bening 10,5-11,8 mm terhadap V. algynolyticus (Tabel 3). Tiga isolat bakteri lainnya
menunjukkan zona bening terbesar menuju patogen A. hydrophila adalah DM14, DM8 dan
DM 5 dengan zona bening 5,8-7,8 mm (Tabel 3). Mengenai patogen Pseudomonas sp., Tiga
isolat (DM1, DM 11 dan DM 13), menunjukkan zona bening 6,5-7,6 mm (Tabel 3).
Menurut Pratama [5] ketika diameter zona hambat lebih dari 20 mm, klasifikasi
respon dari penghambatan pertumbuhan bakteri akan menjadi intens. Selain itu, ketika
diameter zona hambat berada pada kisaran 10-20 mm, klasifikasi respons dari hambatan
pertumbuhan bakteri masih dikategorikan intens. Namun, ketika diameter zona hambat hanya
sekitar 5-10 mm, respons medium penghambatan pertumbuhan bakteri, dan jika kurang dari 5
mm, responsnya akan lemah. Untuk menyimpulkan, penelitian ini menemukan hanya ada tiga
isolat bakteri. yang tidak berdaya terhadap patogen V.algynoliticus, dan sisanya
menunjukkan respons sedang dan lemah. Uji antimikroba dari bakteri yang diisolasi dari
perairan Dumai menunjukkan bahwa satu isolat potensial (DM11) dalam menghambat bakteri
pada level sedang dibandingkan dengan 13 isolat lainnya . Sementara itu, mengisolasi
isolat DM14 menunjukkan zona bening terbesar terhadap A. hydrophila (7,8 mm), dan
akhirnya, isolat DM1 memiliki zona bening terbesar menuju Pseudomonas sp. (7,5 mm)
seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3. Bakteri heterotrofik menghambat bakteri patogen (V
bacteriocin, atau asam organik tertentu. Temuan ini sesuai dengan Verschuere et al. [6] yang
mencatat bahwa populasi mikroba sebenarnya dapat melepaskan bahan kimia yang memiliki
kapasitas bakterisidal atau bakteriostatik, yang dapat mencegah pertumbuhan bakteri lain
beberapa faktor, seperti produksi antibiotik, bakteriosin, siderophore, lysozim, protease, dan
hidrogen peroksida. Selain itu, juga dapat mempengaruhi pH media dengan menghasilkan
asam organik tertentu. Agen antibakteri seperti asam laktat dan bakteriosin yang terkandung
oleh bakteri probiotik mampu menghambat perkembangan bakteri patogen [7]. Hal ini terjadi
karena agen antibakteri dapat menurunkan atau menurunkan pH, sehingga bakteri patogen
Beeneva et al. [9] melakukan penelitian pada bakteri heterotrofik di beberapa perairan laut,
dan menemukan 68,9% isolat dari zona beriklim sedang dan 56,76% strain Vietnam
menunjukkan aktivitas antimikroba. Strain yang menunjukkan aktivitas terbesar berasal dari
daerah tropis.
Dari elektroforesis yang ditunjukkan pada Gambar 3, ukuran PCR berlangsung untuk 1500
bp. Ukuran besar ini adalah sebagai hasil yang diharapkan dari gen rRNA 16-an. Sabdono
menyatakan bahwa isolasi isolat bakteri yang memiliki pita tunggal mengungkapkan bahwa
primer yang digunakan adalah spesifik untuk diterapkan untuk memperkuat 16S rRNA
bakteri. Amplifikasi 16S rRNA telah menjadi standar untuk mempelajari filogenetik dan
keanekaragaman mikroorganisme laut. Dari analisis sekuens isolat bakteri yang telah Blasted
pada Tabel 4, ditemukan bahwa ada beberapa bakteri memiliki tingkat lebih tinggi
dibandingkan dengan jenis bakteri lain. Ada kemungkinan hubungan yang erat dari masing-
masing isolat seperti isolat DM1 yang memiliki tingkat homologi 97% untuk strain ASK16
Bacillus cereus, DM2 menunjukkan tingkat homologi 96% untuk strain AC Bacillus
toyonensis, OPR1150Xg dari DM3 memiliki tingkat homologi 94% untuk strain F1 -
8B.pseudomycoides. Selanjutnya, asosiasi juga terjadi pada DM4 yang memiliki tingkat
homologi 97% untuk menyaring SBFW51 Bacillus cereus, DM5 memiliki tingkat homologi
97% untuk strain OPP5 3-2 Bacillus cereus, DM6 memiliki tingkat homologi 96% terhadap
strain SBFW5S Bacillus cereus, dan DM7 yang memiliki tingkat homologi 97% terhadap
onensis dengan tingkat homologi 95% dan memiliki panjang basis 1541bp. Ini menyiratkan
bahwa tingkat homologi hanya serupa pada tingkat genus dan berbeda pada tingkat spesies.
Berdasarkan penelitian B. spora pembentuk toyonensis, layak digunakan sebagai unsur aktif
Aditif TOYOCERIN. Gagasan ini didukung dengan baik oleh Jimenez et al., [10]
panjang dasar 1609bp. Secara implisit, tingkat homologinya identik hanya sampai tingkat
genus tetapi tidak pada tingkat spesies. Sebagaimana dicatat oleh Pant et al., [11], B. subtilis
terlihat seperti batang dan memiliki kemampuan untuk menyusun endospore. Bakteri ini juga
berperan dalam sektor kesehatan untuk menghasilkan antibiotik bacitracin, dan di sektor
industri untuk memproduksi bacterialamylase atau bahan lain yang dapat memodifikasi
ekstrak, kertas lem, dan melepaskan lem untuk tekstil. Bakteri B. subtilis dapat ditemukan di
sungai atau sedimen laut [12]. Kemudian, isolat DM10 dikenal karena sifatnya yang mirip
dengan strain Enc-3 Enterobacter cloacae dengan tingkat homologi 99% dan 1469 bp. Ini
menunjukkan bahwa tingkat homologi diidentifikasi sampai tingkat spesies. Menurut Lina et
al. [13] Enterobacter cloacae hidup di lingkungan yang beragam, baik di darat maupun di air
(tanah dan sisa makanan). Jenis ini hidup sebagai mikroflora commensal di dalam usus
manusia dan hewan, dan memainkan peran mendasar sebagai patogen bagi tanaman dan
serangga.
acetobutylicum, memiliki tingkat homologi 96% dan panjang basis 1542 bp. Tidak seperti
DM10, tingkat homologi serupa hanya sampai tingkat genus. Clostridium acetobutylicum
adalah bakteri komersial, milik genus Clostridium. Bakteri ini adalah Gram positif seperti
batang dan sebagian besar ditemukan di daratan, diduga juga dapat ditemukan dalam
berbagai keadaan. Menurut Logan dan Devos [14], Clostridium acetobutylicum dapat
ditemukan di tanah, sedimen sungai, sumur, usus, kotoran sapi, anjing dan kotoran manusia.
Bacillus cereus ada pada isolat DM12 dan DM13. Homologi isolat DM13 mirip dengan strain
4PLGES B. cereus dengan homologi 99% dan panjang basis 756 bp. Dengan kata lain,
tingkat homologi serupa hingga tingkat spesies. Sementara itu, homologi isolat F mirip
dengan strain ML267 B. cereus dengan tingkat homologi 96% dan panjang 1517 bp. Mirip
Habitat utama B. cereus adalah lingkungan dan saluran pencernaan. Air dan tanah memiliki
fungsi signifikan bagi bakteri ini dalam mencemari makanan. Bakteri ini juga dapat
menempel pada sepatu, pakaian, kulit atau melalui udara dan debu [15]. Menurut Khetan
[16], bakteri B. cereus adalah salah satu agen patogen yang memiliki potensi besar untuk
dimanfaatkan sebagai kontrol biologis. Bakteri ini memiliki inang khusus yang tidak
berbahaya bagi musuh alami hama dan organisme non-target lainnya, yang mudah terputus-
putus oleh lingkungan, dan patogenisitasnya dapat ditingkatkan dengan menggunakan teknik
rekayasa genetika. Bakteri B. cereus adalah bakteri probiotik yang memiliki kemampuan
untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti Vibrio sp dan Aeromonas sp [17
Isolat DM14 memiliki kemiripan homologis dengan strain C17 B. thuringiensis dengan
tingkat homologi 97% dan panjang dasar 1546 bp. Tingkat homologisnya identik sampai
tingkat spesies. B. Bakteri thuringiensis adalah bakteri heterotrof yang hidup di lingkungan
yang baik dan mapan. Seperti yang dinyatakan oleh Lantang dan Runtuboi (2012), B.
thuringiensis ada di alam alami dan juga dapat ditemukan di berbagai habitat, seperti tanah,
air, dan lumpur. B. thuringiensis dapat menghasilkan 2 jenis toksin: toksin kristal (Kristal,
Cry) dan toksin sitolitik (sitolitik, Cyt). Cyttoxin dapat memperkuat toksin Cry sehingga
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengisolasi dan memurnikan bakteriosin dari
Bacillus sp yang dihasilkan oleh B. cereus, dan toksin yang dihasilkan oleh B. thuringiensis
[19].
Dari hasil akhir, dapat dipahami bahwa empat belas bakteri isolat heterotrofik yang didapat
dari perairan laut Dumai adalah genus dari bakteri Bacillus. Bakteri Bacillus, Bifidobacteria,
Pseudomonas, Lactobacillus dan Micrococcus genus telah terbukti bermanfaat dan dapat
tinggal di dalam dan di luar organisme normal, dan juga diyakini sebagai bakteri probiotik
yang menguntungkan [20]. Bakteri juga dianggap memiliki kemampuan dalam menghambat
di sekitar disk. Ini juga ditunjukkan dalam penelitian yang dilakukan oleh Suwardi [21].
Bakteri yang menghasilkan antimikroba adalah Bacillus sp., A1 dan A2. Untuk mengetahui
koloni memiliki bentuk lingkaran dengan ukuran sedang dan permukaan cembung. Warna
koloni itu putih dan ujungnya rata. Selanjutnya, dari pewarnaan Gram dan bakteri BA1 dan
BA2, sifat-sifat morfologis diperoleh. Bakteri muncul sebagai sel bakteri batang dan
memiliki sifat Gram positif (ungu). Seperti pada pewarnaan spora, BA1 dan BA2
diidentifikasi memiliki bentuk oval di tengah-tengah bakteri. Russell et al, [22] melakukan
penelitian di perairan pedalaman menggunakan teknik RNA 16-an dan menemukan bahwa 3
bakteri mampu bernafas nitrat dan oksigen. Kultur mewakili anggota filum kelimpahan,
memungkinkan untuk studi lebih lanjut tentang faktor-faktor panas bumi yang berdampak
Dari analisis BLAST, pohon filogenetik dibuat. Pohon tersebut berfungsi untuk
menghubungkan simpul dan dianggap sebagai unit taksonomi, seperti akar spesies atau
genetrees adalah bagian tertua dari semua organisme yang dianalisis. Urutan Allignment
sampel dari database Bank Gen dilakukan dengan menggunakan program Mega 0.6 dan
Clustal W (Gambar 2). Mayoritas dari 14 isolat yang diamati memiliki hubungan khusus
dengan Bacillus yang berbeda dari satu isolat ke isolat lainnya. Misalnya, isolat DM1 dan
DM2 memiliki hubungan yang lebih dekat. Sebaliknya, isolat DM12, DM5, DM14, DM10
dan DM11, memiliki hubungan terdekat dengan Bacillus sp. Namun, semua isolat memiliki
4. Kesimpulan Dari hasil penelitian, dapat diidentifikasi bahwa keempat isolat bakteri
heterotrof memang memiliki hubungan dengan Bacillus sp. Semua isolat memiliki homologi
lebih dari 90%. Selain itu, empat belas bakteri heterotrof memiliki kemampuan untuk
menghambat pertumbuhan bakteri patogen untuk ikan. Dalam tes antagonisme, zona
penghambatan yang ditunjukkan oleh isolat DM5, DM6, dan DM4 paling tinggi terhadap
V.alginolyticus. Sementara itu, isolat lain memiliki zona hambat sedang dan lemah. Isolate
DM11 adalah isolat terbaik dalam menghambat pertumbuhan tiga bakteri patogen, V.
5. Pengakuan Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Kementerian Teknologi Riset
dan Pendidikan Tinggi, untuk mendanai penelitian ini sesuai dengan Hibah Kompetensi No.